Предполагаемые биологические функции На основе их свойств

Предполагаемые биологические функции
На основе их свойств in vitro по переносу липидов и связыванию ацильных цепей, предположение о
вовлеченности ЛПБ во многие аспекты функционирования клеток, в которых перемещение липидов
предположительно играет важную роль, такие как: биогенез и оборот мембран, кажется логичным. Эта
гипотеза была представлена в нескольких обзорах (Arondel V. et al., 1990; Kader J.C., 1993; Kader J.C. et
al., 1982; Yamada M., 1992). Тем не менее, факт внеклеточной локализации ЛПБ делает эту гипотезу
противоречивой. На основе наружного расположения, а также других свойствах, открытых позже, были
предложены другие роли данных белков.
Образование кутина и эмбриогенез
Ряд исследователей (Sterk P. et al., 1991) предложили гипотезу о вовлечении ЛПБ в секрецию или
отложение внеклеточных липофильных веществ, включая кутин, которую аргументированно
доказывали. В соответствии с данной теорией, ЛПБ переносят ацильные мономеры, необходимые для
биосинтеза кутина. Это подтверждают различные факты:
1. ЛПБ в основном расположены в клеточной стенке и секретированы;
2. Экспрессия генов ЛПБ и накопление продуктов обнаружены на высоком уровне в переферийных
слоях клетки, включая эпидермис;
3. ЛПБ, особенно в молодых листьях, где кутин накопляется наиболее активно, в основном
сосредоточены в поверхностном парафине (Pyee J. et al., 1995);
4. ЛПБ способны связываться с ацильными цепями (Hendriks T. et al., 1994; Meijer E.A. et al., 1993).
Таким образом, теория кутина выглядит весьма убедительно. Тем не менее, еще предстоит обосновать
либо антисмысловым методом, либо при изучении ацероферных мутантов A. thaliana, дефектных по их
эпикутикулярному парафину (Jenks M.A. et al., 1995). Со ссылкой на эту теорию, также предполагали,
что ЛПБ участвует в отложении липофильных веществ в цветковых органах: венчике (Kotilainen M. et
al., 1994), стебле и нектарниках (Thoma S. et al., 1994), пыльниках (тапетуме и пыльце), где происходит
биосинтез спорополенина (Foster GD. et al., 1992).
Открытие, что ЛПБ секретируется в среду эмбриогенными клеточными культурами, навело на мысль о
новой роли данных белков в соматическом эмбриогенезе (Sterk P. et al., 1991). ЛПБ могут быть
вовлечены на первых ступенях эмбриогенеза путем участия в образовании защитного слоя вокруг
молодого зародыша (зиготического или соматического). Высокая экспрессия гена ЛПБ в молодом
эмбрионе (Sterk P. et al., 1991; Thoma S. et al., 1994) соответствует данной гипотезе.
Защитные реакции против патогенов
Неожиданные антибиотические свойства ЛПБ были обнаружены при исследовании растительных
белков на их способность ингибировать рост грибных и бактериальных патогенов (Molina A. et al., 1993;
Terras F.R.G. et al., 1992).
Было показано, что некоторые ЛПБ-подобные белки, очищенные из листьев ячменя, или ЛПБ,
выделенные из листьев кукурузы, ингибируют рост бактериальных патогенов и грибов (Molina A. et al.,
1993). Это свойство было подтверждено выделением из клеточной стенки листьев A. thaliana или
шпината ЛПБ-подобных белков (Segura A. et al., 1993). Синергическое действие на грибы имеет место,
когда ЛПБ сочетаются с тионинами (Molina A. et al., 1993). Клонирование трех антипатогенных белков
ячменя позволило изучить индукцию соответствующих генов. Уровни всех м-РНК были значительно
выше, когда листья ячменя инокулировали с грибами (Molina A. et al., 1993). Похожая антигрибная
активность была описана для 9 кДа основного белка, очищенного из семени редиса, и
характеризующегося высокой гомологией с ЛПБ в его N-концевом участке. Этот белок способен
ингибировать in vitro рост некоторых грибов. В парафинах брокколи было обнаружено 9 белков,
способных ингибировать рост грибов (Pyee J. et al., 1994).
Можно сделать вывод, что антигрибная активность различна среди патогенов, и что схема экспрессии
генов ЛПБ в ответ на инфицирование растения ячменя патогенами довольно сложна. Идея защитного
белкового экрана, предложенная рядом исследователей (Garcia-Olmedo F. et al., 1995), потдвержается
тем фактом, что ЛПБ накапливаются у поверхности тканей в концентрациях намного превышающих
необходимые для ингибирования многих патогенов in vitro. Стоит отметить, что ЛПБ-подобный белок
секретируется в среду в суспензии риса в ответ на воздействие ацетиловой кислотой, известной как
индуктор инициации защитных процессов (McGee T.P. et al., 1994).
Тем не менее, пока не известно, как именно ЛПБ ингибирует рост патогенов. Из-за высокой
изоэлектрической точки ЛПБ могут действовать на мембраны как пермеабилизирующие агенты. То
факт, что ЛПБ являются индуцируемыми белками, может быть обусловлен тем, что биосинтез кутина
обычно возбуждается патогенной инфекцией.
Симбиоз
Другие взаимоотношения между растениями и бактериями – это клубеньковая инициация в корнях
бобовых с поседующим взаимодействием с симбиотическими бактериями, такими как Rhizobium. На
первых стадиях инфицирования происходит соединение Rhizobium с корневыми волосками, которое
выражается в растяжении и скручивании волосков, что способствует проникновению бактерий. ДНК,
кодирующее ЛПБ-подобный белок, был отобран из библиотеки сДНК, сконструированной на основе
корней Vigna unguiculata, инокулировавшихся 1 и 4 дня с Rhizobium (Krause A. et al., 1994). После
инокуляции с Rhizobium уровни мРНК в корневых волосках возросли. Поскольку ЛПБ-подобные копии
отсутствовали в продифференцированных клубеньках, был сделан вывод, что ген ЛПБ был
кратковременно экспрессирован в ходе развития клубенька.
Адаптация растений к различным условиям окружающей среды
Важная область исследования биологов растений – изучение способности растений модифицировать
их метаболизм и развитие в ответ на изменения окружающей среды, включая изменения температуры,
влажности и солености. Интересна характеристика генов, вовлеченных в процесс акклиматизации, в
том числе к высокой или низкой температуре или к дефициту воды. Поиск генов, индуцируемых в
стрессовых условиях, привело к характеристике генов, кодирующих ЛПБ-подобные белки. Одним из
таких исследований было изучение реакции ячменя на низкие температуры (Hughes M.A. et al., 1992;
White A. et al., 1994). Некоторые гены, индуцированные низкотемпературной обработкой, кодируют
ЛПБ-подобные белки и также индуцируются при обработке абсцизовой кислотой (ABA), которая
оказывает аналогичное действие на гены, индуцируемые низкой температурой или недостатком влаги
(Hughes M.A. et al., 1992). Хотя все эти гены и индуцируются холодом, существуют сортовые различия
генов семейства ЛПБ ячменя в их реакции на низкую температуру. Например, один ген (blt 4.1) повышал
экспрессию на холоде в зимней культуре, но не повышал в весенней (White A. et al., 1994). В других
сортах ячменя не было обнаружено индукции экспрессии трех генов ЛПБ в качестве ответа на действие
холода или других факторов (недостатка влаги, действия салицилатом), и только небольшое
повышение экспрессии было отмечено при действии NaCl или ABA.
Выделение нескольких геномных клонов ячменя привело к изучению регуляторных элементов.
Предполагаемый элемент (GTACGTGG), который образуется в ответ на АВА (ABRE), и
низкотемпературный элемент (ACACGTCA) – были обнаружены среди ЛПБ генов ячменя (White A. et
al., 1994). Было установлено, что другой ген ЛПБ регулируется ауксином (нафталенуксусной кислотой)
при формировании элементов древесных сосудов у Z. elegans (Ye Z.H. et al., 1993).
Другой ответ генов ЛПБ – на недостаток влаги или соленость. У томатов экспрессируется ген,
кодирующий ЛПБ-подобные белки, особенно в стебле, только когда на растение действуют NaCl,
маннитолом, АВА или высокой температурой (Hughes M.A. et al., 1992). Другой ген, имеющий лишь
отдаленную гомологию с ЛПБ, экспрессируется у ячменя также в ответ на недостаток влаги (Plant A.L. et
al., 1991). Также были открыты и другие гены в корне и стебле ячменя, экспрессируемые при
воздействии "сухого" стресса (White A. et al., 1994).
Таким образом, ответ генов ЛПБ на развитие растения или действие факторов окружающей среды,
является комплексным, поэтому необходима дополнительная информация, чтобы определить степень
участия этих белков в процессах адаптации растений к некоторым стрессовым условиям. Тем не менее,
все эти условия – недостаток влаги, низкие температуры или соленость – связаны с осушением (или
жидкостным стрессом). Поскольку ЛПБ участвуют в накоплении кутина, индукция генов ЛПБ при
условиях, приводящих к обезвоживанию, кажется логичным. Промотор гена ltp1 из A. thaliana содержит
последовательности, гомологичные предполагаемым регуляторным элементам генов в
фенилпропаноидном пути биосинтеза, и последовательностям элементов, которые были обнаружены в
промоторах стресс-индуцируемых генов (Thoma S. et al., 1994).
PROPOSED BIOLOGICAL ROLES
On the basis of their in vitro properties of transferring lipids and binding acyl chains, the suggestion that LTPs could be involved
in many aspects of cell function where movement of lipids is thought to be important, such as membrane biogenesis and turnover,
was a logical one. This hypothesis has been presented in several reviews (2, 50, 52, 124). However, the fact that LTPs are located
extracellularly made this hypothesis inconsistent. On the basis of this external location as well as on novel properties discovered
in recent years, other roles have been suggested.
Cutin Formation and Embryogenesis
The hypothesis of the group of de Vries (105), which suggests that LTPs are involved in the secretion or deposition of
extracellular lipophilic material, including cutin, has been argued convincingly in recent years. According to this theory, LTPs
carry acyl monomers necessary for the biosynthesis of cutin. Different facts support this. 1. LTPs are mainly located in the cell
wall and are secreted. 2. LTP gene expression and LTP gene products accumulation was detected in high levels in peripheral cell
layers, including epidermis. 3. LTPs, particularly in young leaves where cutin deposition is active, are mainly concentrated in the
surface wax (88). 4. LTPs are able to bind acyl chains (42, 69).
The “cutin theory” thus seems highly convincing. However, it remains to be validated, either with an antisense approach or by
studying eceriferum mutants in A. thaliana affected in their epicuticular wax (49). In relation to this theory, LTPs were also
supposed to participate in the deposition of lipophilic material in floral organs: corolla (58), stigma and nectaries (111), and
anther (tapetum and pollen), where sporopollenin biosynthesis occurs (32).
The finding that LTP is secreted into the medium of embryogenic cell cultures suggested a new role for LTP in somatic
embryogenesis (105). LTP could be involved in the early steps of embryogenesis by participating in the formation of a protecting
layer around the young embryo (zygotic or somatic). The high LTP gene expression in young embryos (105, 111) is in agreement
with this hypothesis.
Defense Reactions Against Pathogens
The unexpected antibiotic properties of LTP were discovered by screening plant proteins for their ability to inhibit the growth of
fungal and bacterial pathogens (72, 110).
Several LTP-like proteins purified from barley leaves or an LTP isolated from maize leaves were shown to inhibit the growth of
a bacterial pathogen and a fungus (72). This was confirmed by the isolation of LTP-like proteins from cell-wall preparations from
the leaves of A. thaliana or spinach (96). A synergistic effect against the fungus occurred when the LTPs were combined with
thionins (72). The cloning of three barley antipathogen proteins allowed the study of the induction of the corresponding genes.
All LTP mRNA levels were significantly increased when the barley leaves were inoculated with a fungus (71). A similar
antifungal activity has been described for a 9-kDa basic protein purified from radish seeds and exhibiting a high sequence
homology with LTP in its N-terminal end (110). This protein is able to inhibit in vitro the growth of several fungi. In broccoli, the
wax 9 protein was found to inhibit the growth of a fungus (89).
It can be concluded that the antifungal activity of LTPs varies between pathogens and that the pattern of expression of LTP genes
in response to infection of barley plants by pathogens is rather complex (33). The idea of a defense-protein shield, suggested by
Garcia-Olmedo et al (33), is supported by the fact that LTPs were found, at least for some isoforms, to be accumulated at the
tissue surface at much higher concentrations than those required to inhibit many pathogens in vitro. It is interesting to note that an
LTP-like protein is secreted into the medium of rice suspension culture sinresponse to a treatment by salicylic acid known as an
elicitor to induce pathogen defense processes (67).
However, we do not yet know how LTPs inhibit the growth of the pathogens. Because of their high isoelectric point, LTPs may
act as membrane permeabilizing agents. The fact that LTPs are induced could be due to the fact that cutin biosynthesis is
generally stimulated by pathogen infection.
Symbiosis
Another relationship between bacteria and plants is the nodule initiation in legume roots following interaction with symbiotic
bacteria such as Rhizobium. An early stage of the infection occurs in the root hairs to which Rhizobium binds and results in
elongation and curling of the root hair that facilitates the penetration of the bacteria. A cDNA, coding for an LTP-like protein, has
been isolated from a cDNA library constructed from RNA of Vigna unguiculata roots one and four days after inoculation with
Rhizobium (59). The mRNA levels increased in root hairs after inoculation with Rhizobium. Because LTP-like transcripts are
absent from differentiated nodules, it was concluded that the LTP gene was transiently expressed during nodule development.
Adaptation of Plants to Various Environmental Conditions
An important domain of research for plant biologists is the study of the ability of plants to modify their metabolism and
development in response to changes in the environment, including changes involving temperature, drought, and salt stress. It is of
interest to characterize genes involved in acclimation to low or high temperatures or to shortage of water. The search for
stress-induced genes has led to the characterization of genes encoding LTP-like proteins. One example is the low-temperature
response studied in barley (46, 122). Several genes induced by cold treatment code for LTP-like proteins and are also induced by
a treatment of abscisic acid (ABA), which is common with genes induced by low temperature or drought (46). Although all these
genes are induced by cold, there are varietal differences in the response of the barley LTP gene family to low temperature. For
example, one gene (blt 4.1) was upregulated by low temperature in the winter cultivars but not in a spring cultivar (122). In other
barley varieties, no induction was observed for the expression of three LTP genes in barley because of cold or other factors
(drought, salicylate), and only a moderate increase was observed because of NaCl or ABA.
The isolation of several genomic clones in barley has led to a study of the regulatory elements. A putative ABA-responsive
(ABRE) element (GTACGTGG) and a low-temperature responsive element (ACACGTCA) were found in the barley LTP genes
(122). Another LTP gene was found to be regulated by auxin (naphtaleneacetic acid) during tracheary element formation in Z.
elegans (127).
Other LTP genes respond to salt stress or drought stress. In tomato, a gene encoding an LTP-like protein is expressed, specifically
in stems, only when plants are treated with NaCl, mannitol, ABA, or high temperature (46). Another gene, only partially
homologous to LTP, was also induced by drought in barley (86). Other genes were found to be expressed in the roots and stems of
drought-stressed barley plants (122).
The response of LTP-genes to developmental and environmental signals is thus complex, and additional information is needed to
determine the involvement of these proteins in the adaptation of plants to several stresses. However, all these
conditions—drought, cold, and salt stresses—are related to desiccation or water stress. If LTPs are involved in cutin deposition,
the induction of LTP genes by conditions leading to desiccation seems logical. The promoter regions of the ltp1 gene from A.
thaliana contain sequences homologous to putative regulatory elements of genes in the phenylpropanoid biosynthetic pathway
and sequence elements that have been found in the promoters of stress-induced genes (111).