двадненко ольга викторовна стрептококкоз крупного рогатого
реклама
На правах рукописи ДВАДНЕНКО ОЛЬГА ВИКТОРОВНА СТРЕПТОКОККОЗ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА В КРАСНОДАРСКОМ КРАЕ 06.02.02. – ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук г. Краснодар 2014 1 Работа выполнена на кафедре микробиологии, эпизоотологии и вирусологии в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Кубанский государственный аграрный университет» Научный руководитель: доктор ветеринарных наук, профессор, заслуженный работник сельского хозяйства РФ, лауреат премии Правительства РФ в области науки, заведующий кафедрой микробиологии, эпизоотологии и вирусологии ФГБОУ ВПО «Кубанский государственный аграрный университет» Шевченко Александр Алексеевич Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук, заведующий лабораторией эпизоотологии ГНУ «Краснодарский НИВИ» Пруцаков Сергей Владимирович кандидат ветеринарных наук, заведующая отделом ветеринарно-санитарной экспертизы ФГБУ «Краснодарская межобластная ветеринарная лаборатория» Марченко Татьяна Витальевна Ведущая организация: ФГБОУ ВПО «Ставропольский государственный аграрный университет» Защита диссертации состоится « 5 » сентября 2014 г. в 10:00 часов на заседании диссертационного совета Д 220.038.07 при ФГБОУ ВПО «Кубанский государственный аграрный университет» по адресу: 350044, г. Краснодар, ул. Калинина, 13. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте ФГБОУ ВПО «Кубанский государственный аграрный университет» http://www.kubsau.ru Автореферат разослан «__» _________ 2014 года и размещен на официальном сайте ВАК при Министерстве образования и науки России http://www.vak2.ed.gov.ru и на сайте ФГБОУ ВПО «Кубанский государственный аграрный университет» http://www.kubsau.ru Ученый секретарь диссертационного совета И.А. Родин 2 1. Общая характеристика Актуальность темы. Животноводство является важной отраслью народного хозяйства. Однако успешное развитие животноводства сдерживает возникновение и распространение в хозяйствах инфекционных болезней. У крупного рогатого скота среди бактериальных и вирусных инфекций чаще регистрируют: инфекционный ринотрахеит, рото- короновирусные инфекции, парагрипп-3, эшерихиоз, сальмонеллез, стрептококкоз, псевдомоноз, стафилококкоз и другие. Эти болезни наносят выраженный экономический ущерб, который складывается из падежа, снижения продуктивности животных и денежных затрат на проведение лечебных и профилактических мероприятий (Бурова Л.А., 2000; Есепенок В.А., 2006; Шевченко А.А. с соавт., 2009; Черных О.Ю., 2010). В последнее время в животноводстве получили распространение факторные инфекционные болезни, в этиологии которых основная роль принадлежит условно-патогенным микроорганизмам, в том числе и стрептококкам. Стрептококкоз – инфекционная болезнь животных разных видов, в основном молодняка, вызываемая патогенными стрептококками. При остром течении болезнь характеризуется септицемией, у новорожденных – омфалитом, при подостром и хроническом течении - поражением органов пищеварения, респираторной системы, глаз, суставов и т.д. У взрослых коров отмечаются аборты, метриты и маститы. Летальность молодняка может достигать 70%. Возбудитель патогенен и для человека. Стрептококки наносят хозяйствам колоссальный ущерб. При анализе данных, полученных из литературных источников, видна вся важность стрептококков и в развитии маститов (Брагина Э.П., 1972), и энтерококковой инфекции у телят (Панин А.Н., 1992), и при развитии эндометритов у коров (Турченко А.Н., 1999, 2001). Надежной защитой поголовья от инфекционных болезней является вакцинопрофилактика. Применение вакцин в хозяйствах способствует уменьшению стрессовых ситуаций у прививаемых животных, снижает трудозатраты и способствует созданию напряженного иммунитета в сжатые сроки (Вачугов В.И., 1989). Многие исследователи полагают, что инактивированные вакцины, произведённые из штаммов микроорганизмов, выделенных в эпизоотическом очаге, обладают высокой специфичностью, иммуногенностью и способствуют созданию напряженного иммунитета 3 (Маннапова Р.Т., 1998; Шевченко Л.В., 2008; Шевченко А.А. с соавт., 2009; Черных О.Ю., 2010). Изучение инфекционных заболеваний крупного рогатого скота, разработка эффективных средств для защиты животных, совершенствование мероприятий по профилактике и ликвидации данных болезней имеет важное значение для ветеринарии. Цель и задачи исследований. Цель исследований – изучить особенности эпизоотического процесса в животноводческих хозяйствах на территории Краснодарского края. Изучить клинические симптомы и патологоанатомические изменения при стрептококкозе крупного рогатого скота, разработать систему эффективных мероприятий для профилактики и ликвидации данного заболевания. Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи: Провести изучение нозологического профиля бактериальных инфекций крупного рогатого скота за 2004-2013 гг. на территории Краснодарского края, и определить удельный вес стрептококкоза в нем; провести эпизоотологический мониторинг по стрептококкозу крупного рогатого скота в животноводческих хозяйствах на территории Краснодарского края за последние 10-ть лет; провести изучение территориальных границ, возрастных особенностей, сезонности стрептококкоза крупного рогатого скота; изучить клинические симптомы и патоморфологические изменения у животных при стрептококкозе крупного рогатого скота; выявить источники и главные причины распространения стрептококкоза крупного рогатого скота на территории хозяйств Краснодарского края; разработать инактивированную противострептококковую вакцину для использования в комплексе противоэпизоотических мероприятий для крупного рогатого скота; провести изучение иммунобиологических свойств созданной противострептококковой вакцины для крупного рогатого скота; разработать комплекс профилактических и ликвидационных мероприятий при стрептококкозе крупного рогатого скота для животноводческих предприятий Краснодарского края. Научная новизна. Впервые было проведено изучение эпизоотической ситуации по инфекционным болезням бактериальной этиологии у крупного рогатого скота на территории Краснодарского края. В нозологическом профиле установлено место, удельный вес, территориальные границы, возрастные 4 особенности, сезонность, заболеваемость, характер проявления эпизоотического процесса, превалентность, инцидентность, клинические симптомы, патологоанатомические изменения при стрептококкозе крупного рогатого скота. Разработана и применена технология по производству новой инактивированной противострептококковой вакцины для крупного рогатого скота, изучены её свойства, в том числе и иммуногенность. Были апробированы и внедрены в ветеринарную практику рекомендации, включающие мероприятия по профилактике и ликвидации стрептококкоза крупного рогатого скота в условиях животноводческих предприятий Краснодарского края. Научная новизна проведённой работы подтверждена двумя патентами на изобретение (№ 2406532, № 2406533). Теоретическая и практическая значимость. На основании выдвинутых теорий, а так же данных, полученных в ходе проведённой работы, в том числе и в производственных условиях, были разработаны и предложены для использования в ветеринарии: - система противоэпизоотических мероприятий, в которую включён эпизоотологический, бактериологический, серологический мониторинг, диагностика, проведение мероприятий по предупреждению, и при возникновении - по ликвидации стрептококкоза крупного рогатого скота на животноводческих предприятиях Краснодарского края; - «Рекомендации по диагностике, профилактике и ликвидации стрептококкоза крупного рогатого скота» (2014); - создана новая противострептококковая вакцина для крупного рогатого скота, которая предложена для применения в крае; - разработан и утвержден в установленном порядке проект нормативнотехнической документации на производство и применение новой вакцины против стрептококкоза крупного рогатого скота. Вакцина производится на ФГУП «Армавирская биофабрика»; - подготовлены учебные пособия «Диагностика стафилококкозов и стрептококкозов» (2013), «Профилактика и мероприятия по ликвидации стрептококкоза животных» (2013). Основные положения диссертации, выносимые на защиту: 1. Нозологический профиль по инфекционным болезням крупного рогатого скота на территории Краснодарского края за 2004-2013 гг., удельный вес стрептококкоза в нем имел тенденцию к увеличению; 5 2. Особенности эпизоотического процесса при стрептококкозе: факторы возникновения, распространения, превалентность, инцидентность, сезонность, заболеваемость у крупного рогатого скота на территории Краснодарского края; 3. Клинические симптомы и патологоанатомические изменения при стрептококкозе крупного рогатого скота в Краснодарском крае имеют свои особенности; 4. Применение новой инактивированной противострептококковой вакцины способствует улучшению эпизоотической обстановки в хозяйствах, неблагополучных по стрептококкозу крупного рогатого скота. Реализация результатов исследований. Результаты исследований: комплекс противоэпизоотических мероприятий, включающий систему диагностики, профилактики, ликвидации стрептококкоза у крупного рогатого скота в животноводческих хозяйствах на территории Краснодарского края. Рекомендации по проведению диагностических и профилактических мероприятий, в случае возникновения стрептококкоза у крупного рогатого скота в Краснодарском крае, используются государственным управлением ветеринарии Краснодарского края при планировании и проведении противоэпизоотических мероприятий. Новая эффективная безвредная вакцина предложена для применения в крае. Использование в ветеринарной практике на территории Краснодарского края системы профилактических мероприятий может способствовать сохранению поголовья крупного рогатого скота и оздоровлению его от стрептококкоза. Результаты проведённой работы, в том числе и подготовленные учебные пособия: «Диагностика стафилококкозов и стрептококкозов», «Профилактика и мероприятия по ликвидации стрептококкоза животных», применяются в учебном процессе на кафедре микробиологии, эпизоотологии и вирусологии факультета ветеринарной медицины Кубанского госагроуниверситета, в государственных ветеринарных учреждениях и животноводческих предприятиях края. Апробация работы. Отчёт о полученных в ходе проведённой работы данных был представлен на всероссийских и международных научнопрактических конференциях (г. Горки, республика Беларусь, 2010 г.; г. Владимир, 2013г.; г. Покров, 2014 г.; г. Краснодар, 2009-2014 гг.); на заседаниях ученого совета Кубанского государственного аграрного университета (г. Краснодар, 2008-2014 гг.); на студенческих научных конференциях факультета 6 ветеринарной медицины Кубанского государственного аграрного университета (г. Краснодар, 2010-2014 гг.). Публикации. По теме диссертации было опубликовано 10 научных работ. Из них 3 напечатаны в журналах, которые рекомендованы ВАК РФ. Кроме статей опубликованы два учебных пособия и рекомендации. Структура и объем работы. Изложение диссертационной работы представлено на 141 странице компьютерного текста и включает следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, собственные исследования, обсуждение результатов исследований, выводы, практические предложения, список использованной литературы, состоящий из 135 источников, 30 из которых принадлежат зарубежным авторам, и приложения. В работу включены иллюстрации, в том числе 35 рисунков, 10 таблиц. 2.Материалы и методы исследований Диссертационная работа выполнялась в период с 2009 по 2013 гг. на базе кафедры микробиологии, эпизоотологии и вирусологии ФГБОУ ВПО «Кубанский государственный аграрный университет» в соответствии с утверждённой темой, государственный регистрационный номер № 01201153629, ГБУ «Кропоткинская краевая ветеринарная лаборатория», в хозяйствах Краснодарского края, в ФГУП «Армавирская биофабрика». Работа с лабораторными животными проводились в условиях вивария ГБУ «Кропоткинская зональная ветеринарная лаборатория» и ФГУП «Армавирская биофабрика». Исследования на крупном рогатом скоте осуществлялись в ЗАО САФ «Искра» Тимашевского района, ЗАО «Родник» Тихорецкого района, ООО «Сфера» Кореновского района Краснодарского края. Из 928 голов крупного рогатого скота, подвергнутых клиническому обследованию, было выявлено 596 больных животных. При осуществлении работы провели 45 патологоанатомических вскрытий трупов павших животных, отобрали пробы и произвели 195 бактериологических исследований, 89 тестов по серотипированию и 110 биохимических тестов. В ходе работы выделили 112 культур микроорганизмов рода Streptococcus. Для изучения эпизоотологии стрептококкоза крупного рогатого скота изучили статистические данные учета, отчетности и статистических обзоров государственного управления ветеринарии Краснодарского края, ГБУ «Кропоткинская краевая ветеринарная лаборатория» за период (2004-2013 гг.). 7 Для выполнения исследований использовали основные методики эпизоотологических исследований согласно «Методическим указаниям по эпизоотологическому исследованию» (1982) и некоторые методы современной диагностики. Патогенность возбудителей, исследования на реактогенность, иммуногенность и безвредность вакцин, проведение пассажей, титрование проводили на 250 белых беспородных мышах, массой 16-18 г (Мurium). Влияние вакцинных штаммов и биопрепаратов на организм животных оценивали визуально после введения инактивированных антигенов. Клиническое течение болезни и её исход исследовали у телят в возрасте от 1 до 120 дней и у взрослого поголовья на фермах хозяйств. В ходе наблюдения у животных измеряли температуру тела, частоту пульса и дыхания. Лабораторные исследования на стрептококкоз проводили согласно «Методическим указаниям по лабораторной диагностике стрептококкоза животных», утвержденных 25.09.1990 г. ГУВ СССР, с использованием набора антистрептококковых группоспецифических сывороток и стандартных групповых антигенов для реакции преципитации НПО «АКВАПАСТ», г. СанктПетербург; биохимические тест-системы фирмы «Pliva-Lachema Diagnostika». Чехия. Патогенность микроорганизмов рода Streptococcus определяли на белых мышах массой 16-18 г. путём внутрибрюшинного введения. При гибели 2-х из 3-х мышей в течение 5 дней культуру считали патогенной. Производственные испытания разработанных нами опытных серий вакцин проводили в хозяйствах Краснодарского края. Использовали реактивы, диагностикумы, наборы, тест-системы: формалин технический с содержанием формальдегида не менее 36% (ГОСТ-1625-61); гидроокись алюминия (ГОА, с 6% сухого остатка); парфюмерное масло Marcol – 52. Безвредность и полноту инактивации разработанных вакцин проверяли на белых мышах массой 16–18 г. путем подкожного введения. Иммуногенность вакцин оценивали по проценту выживаемости (защиты) вакцинированных белых мышей после заражения вирулентными возбудителями стрептококкоза в летальных дозах. Титр антител в сыворотке крови крупного рогатого скота выявляли через 21-28 суток после иммунизации, а далее только у 5% животных спустя 60, 90, 180, 270 суток после проведённой вакцинации. Патологоанатомические и гистологические исследования осуществляли по принятым методам. При вскрытии трупов отбирали кровь из сердца, печень, 8 селезенку, головной мозг и трубчатую кость. При поражении дыхательной системы - кусочки легкого, взятые на границе здоровой и пораженной тканей, средостенные лимфатические узлы, при артритах ‒ синовиальную жидкость. Обработку цифровых материалов проводили на персональном компьютере IBM с использованием пакета статистических программ «Microsoft», «Microsoft Word» и «Microsoft Excel». 3. Результаты собственных исследований 3.1. Эпизоотическая обстановка по бактериальным инфекционным болезням крупного рогатого скота в Краснодарском крае По данным, полученным из отчётов ГБУ «Кропоткинская краевая ветеринарная лаборатория», мы смогли изучить и проанализировать динамику заболеваемости крупного рогатого скота инфекционными болезнями в Краснодарском крае за период с 2004 по 2013гг. Анализу подверглись и результаты собственных исследований (количество, видовой состав культур микроорганизмов). Было установлено, что в Краснодарском крае за последние 10 лет регулярно фиксировались случаи заболевания крупного рогатого скота разными бактериальными инфекционными болезнями. Среди 14 зарегистрированных инфекций доминировали эшерихиоз и стрептококкоз (рис. 1). Злокачественный отек Стрептококкоз 1,8% 16,4% Сибирская язва 0,05% Эмфизематозный карбункул 0,2% Туберкулез 0,2% Эшерихиоз 50% Стафилококкоз 11,4% Сальмонеллез 3,8% Псевдомоноз 14,1% Пастереллез 0,7% Некробактериоз 0,3% Инфекционная энтеротоксемия 0,5% Лептоспироз 0,05% Бруцеллез 0,5% Рисунок 1 – Нозологический профиль инфекционной бактериальной патологии крупного рогатого скота (2004-2013 гг.) 9 проценты В течение 10-ти последних лет удельный вес стрептококкоза в нозологическом профиле составлял около 30,0% (рис. 2). Таким образом, эшерихиоз и стрептококкоз в инфекционной патологии крупного рогатого скота в Краснодарском крае играют решающую роль и наносят скотоводству значительный экономический ущерб. Далее изучили превалентность вспышек стрептококкоза у крупного рогатого скота за последние 10 лет. За этот период зарегистрировали 2321 вспышку заболевания на фермах разного типа в 20 районах Краснодарского края. С 2004-2007 гг. превалентность вспышек стрептококкоза в хозяйствах края имела тенденцию к увеличению, с 2008-2013 гг. наблюдалось снижение вспышек заболевания. Связано это и со снижением численности поголовья животных, а так же с выполнением ветеринарно-санитарных мероприятий в хозяйствах края. 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% 2004 822 2005 701 2006 650 2007 833 2008 470 2009 365 2010 424 2011 1373 2012 1273 2013 535 стрептококкоз 371 236 258 392 145 186 250 154 215 235 прочие Рисунок 2 – Удельный вес стрептококкоза среди бактериальных инфекций крупного рогатого скота в Краснодарском крае (2004-2013 гг.) Ежегодные совокупные показатели инцидентности вспышек сопровождались ростом и характеризовались эпизоотическим типом, что подтверждается широтой превалентности заболевания (20 административных районов территории края), высокой частотой заноса возбудителя на фермы, длительностью периода неблагополучия (10 лет). Из 48 административных районов края наибольшая инцидентность вспышек стрептококкоза у крупного рогатого скота за время наблюдения 10 регистрировалась в 8-ми: в Кавказском - 34%, Ейском - 18%, Кущевском - 8%, Тимашевском - 6%, Лабинском, Славянском и Павловском районах - по 5%, г. Краснодаре - 4%, в других оставшихся районах - от 1 до 2% (рис. 3). Вспышки заболеваемости крупного рогатого скота стрептококкозом регистрировали в течение всего года, но чаще - в зимний (13,7-20,3%) и весенний (4,0-17,3%) периоды. Это связано с циркуляцией высоко патогенного возбудителя, переменчивой погодой, обилием осадков, что ведёт к повышению влажности воздуха, нарушением требований по кормлению, содержанию животных. В связи с этим отмечается снижение естественной резистентности организмов животных, они становятся подверженными воздействию различных видов микроорганизмов, в том числе и стрептококков. Распространению болезней способствует несанкционированная реализация продуктов животноводства, несвоевременное проведение ветеринарно-санитарных мероприятий. Для снижения эпизоотической напряженности по инфекционным болезням необходимо разрабатывать и строго выполнять противоэпизоотические мероприятия. Важна своевременная диагностика и вакцинация восприимчивых животных. Северский 2% Тимашевский Тихорецкий г. Краснодар 6% 2% 4% 0% Славянский 5% Армавир 2% Брюховетский 1% Выселковский 2% Ейский 18% Отрадненский 1% Павловская 5% Новопокровский 1% Ленинградский 1% Лабинский 5% Кущевский 8% Курганинский 1% Крымский 2% Кавказский 34% Каневской 1% Кореновской 1% Рисунок 3 – Территориальное распространение стрептококкоза в районах Краснодарского края (2004-2013 гг.). 11 При изучении вспышек эпизоотий стрептококкоза крупного рогатого скота в хозяйствах Краснодарского края за период с 2004 по 2013 гг. выделялись 10 разных видов патогенных стрептококков: Str. pneumoniae, Str. septicum, Str. pyogenes, Str. uberis, Str. bovis, Str. vestibularis, Str. zooepidemicus, Str. salivarus, Str. mutans, Str. gallolyticus, доминировал Str. pneumoniae. К стрептококкозу восприимчивы все возрастные группы крупного рогатого скота: с 1-10 дней - 37%, с 10-20 дней - 33%, в 20-60 дней - 14%, в 60120 дней - 10%, взрослые - 6% (рис. 4). Взрослые животные заболевают реже молодых, но чаще они являются бактерионосителями. 60-120 дн 10% 20-60 дн 14% взрослые 6% 1-10 дн 37% 10-20 дн 33% Рисунок 4 – Возрастная восприимчивость крупного рогатого скота к стрептококкозу в Краснодарском крае Наблюдаемая превалентность стрептококкоза на значительной территории Краснодарского края в течение длительного периода времени, персистенция возбудителя среди разных возрастных групп крупного рогатого скота, свидетельствуют о формировании энзоотичной зоны. 3.2. Диагностика, симптомы, патологоанатомические и гистологические изменения при стрептококкозе крупного рогатого скота Диагностику стрептококкоза проводили комплексно, основываясь на эпизоотологических, клинических, патологоанатомических данных и результатах лабораторной диагностики. Лабораторная диагностика включала проведение бактериологических исследований: выделение возбудителя от больных и павших животных, выделение чистой культуры возбудителя при посеве на питательные среды и биопробой, определение биохимической активности с использованием 12 микробиологического анализатора Мультискан, серогрупповой принадлежности стрептококков и титра антител в сыворотке крови в реакции преципитации (РП) в капиллярах по общепринятой методике. При изучении клинических признаков стрептококкоза у крупного рогатого скота установили, что чаще болеет молодняк, начиная с первых дней жизни, наиболее восприимчивы телята от 10 до 60 дней. Течение болезни может быть сверхострым, острым, подострым и хроническим. При сверхостром течении температура тела повышалась до 40 - 42°С, отмечали слабость, серознокатаральный конъюнктивит и ринит, одышку, аритмичный пульс, цианоз слизистых оболочек, и перед смертью - выделение из ноздрей пенистой жидкости из-за отека легких. Летальность телят - до 70%. Острое течение характеризовалось высокой температурой, обильным слезотечением и катарально-гнойными истечениями из ноздрей. Аппетит отсутствовал. У отдельных новорожденных телят воспалялся пупочный канатик (омфалит). При нарастающей слабости животные погибали с превалирующими признаками септицемии через 1 - 2 дня. Летальность телят достигала 60%. Подострое течение у животных проявлялось самыми разнообразными симптомами: поражение органов дыхания, пищеварения, суставов. При хроническом течении отмечали прогрессирующее истощение, угнетение, дерматиты, абсцессы на теле, поражения конечностей, маститы, эндометриты и др., температура тела колебалась в пределах физиологической нормы. У коров отмечали снижение удоев, в молоке регистрировали увеличение количества соматических клеток. При патологоанатомическом вскрытии трупов крупного рогатого скота при стрептококкозе у телят в возрасте 1-4 месяцев наблюдали серозно-катаральную и геморрагическую пневмонию (35%), спленит (7 %), серозно-катаральный и геморрагический гастроэнтерит (8%), гепатит (25%), артриты (10%), миокардит (5%). У взрослых животных - серозно-катаральную и геморрагическую пневмонию (29%), артрит (10%), серозно-катаральный и геморрагический гастроэнтерит (8%), поражения венчика копыт (9%), воспаление межкопытной щели (7%), пододерматиты (9%), дерматиты (5%), абсцессы (3%), маститы (12%), эндометриты (8%). При гистологическом исследовании в препарате печени отмечали зернистую дистрофию, в препарате сердца кровоизлияния между мышечными волокнами, в препарате легкого - признаки серозно-катаральной и геморрагической пневмонии. 3.3. Выделение, идентификация культур стрептококков, циркулирующих в организме крупного рогатого скота 13 Выделение стрептококков, изучение культуральных, морфологических, ферментативных, патогенных и антигенных свойств проводили в ГБУ «Кропоткинская краевая ветеринарная лаборатория» согласно «Методическим указаниям по лабораторной диагностике стрептококкоза животных», утвержденных 25.09.1990 г. ГУВ СССР, «Методическим указаниям по бактериологической диагностике смешанных кишечных инфекций» (Москва, 2000) с использованием биохимических тест-систем фирмы «Pliva-Lachema Diagnostika»: ENTEROtest 24, NEFERMtest 24, EN-COCCUStest, STREPTOtest 16. Для исследования использовали патологический материал от больных и павших животных: свежие трупы телят, трубчатую кость, долю печени с желчным пузырем, селезенку, почку, сердце, перевязанное лигатурой у аорты, брыжеечные лимфоузлы, головной мозг. Для прижизненной диагностики исследовали фекалии, кровь. Из патматериала готовили мазки-отпечатки, окрашивали по Граму и микроскопировали под иммерсионной системой микроскопа. При микроскопии наблюдали мелкие кокки в виде цепочек и расположенные попарно, окрашенные в фиолетовый цвет. Для изучения культуральных свойств возбудителя стрептококкоза делали высевы из патматериала в мясо-пептонный бульон (МПБ) с добавлением глюкозы до 0,2%ной конечной концентрации и 10% инактивированной сыворотки лошади, в чашки Петри с мясо-пептонным агаром (МПА) с добавлением глюкозы до 0,2%ной конечной концентрации и 5% дефибринированной крови кролика. Инкубирование проводили в термостате при 37˚С 18-20 часов. В МПБ рост культуры характеризовался диффузным помутнением, в чашках Петри с кровяным МПА наблюдали рост мелких, росинчатых, слегка мутноватых с ровными краями колоний, окруженных зеленоватой зоной гемолиза. Для дифференциации микроорганизмов рода Streptococcus от рода Stahpylococcus использовали каталазную пробу. Для предварительной идентификации стрептококков и энтерококков полученную бактериальную культуру высевали в пробирки с 10%, 40% желчи, с 6,5% хлористого натрия, с углеводами (раффинозой, сорбитом, маннитом), в дальнейшем учитывали рост в жидкой среде и гемолиз на МПА с кровью. В пробирках с 10% желчи отмечали просветление среды, что говорило о лизисе культуры микроорганизмов. Была отмечена ферментация маннита. Серогрупповую принадлежность стрептококков определяли в реакции преципитации (РП) в капиллярах по известной методике. Патогенность подтверждали биопробой на молодых беспородных белых мышах. 14 Таким образом, нами из 112 исследованных культур микроорганизмов от крупного рогатого скота в Краснодарском крае были изучены морфологические, тинкториальные, культуральные, биохимические и серологические свойства 10 видов стрептококков, среди которых преобладал Str. pneumoniae. Этот штамм использовали в дальнейшей работе. 3.4. Разработка технологии изготовления и контроля инактивированной вакцины против стрептококкоза крупного рогатого скота При культивировании штамма Str. pneumoniae на мясо-пептонном и глюкозо-сывороточном бульонах накопление микробных клеток составило не менее 10 млрд м.к./см3. Для получения бактериального сырья использовали мясопептонный бульон (МПБ), обогащенный глюкозой, который позволил получать не менее 4•109 м. к./см3 по оптическому стандарту ГИСК им. Тарасевича. Для изготовления опытных серий ГОА-формолвакцины штамм Str. рneumoniae освежали в пробирках с МПБ биофабричного производства с добавлением раствора глюкозы до 1%-ной концентрации, рН 7,2-7,4. Культивирование в термостате проводили при 37ºС в течение 18-20 ч. Оценку чистоты роста исследовали на МПА, МПБ, средах Эндо и Плоскирева, КиттаТароцци, агаре и бульоне Сабуро, окрашиванием по методу Грама. Матровую расплодку выращивали во флаконах емкостью 250 мл, в которые вносили по 80100 мл МПБ с добавлением глюкозы до 1%-ной концентрации, рН 7,2-7,4 и 1-2 мл освеженной культуры исследуемого возбудителя с концентрацией не менее 4•109 микробных клеток. Культивировали посевы в термостате при 37ºС 18–20 часов. Оценку чистоты роста проводили на МПА, МПБ, средах Китта-Тароцци, агаре и бульоне Сабуро, окрашиванием по методу Грама. Баксырье нарабатывали в 3–5литровых бутылях, содержащих МПБ с добавлением глюкозы до 1,0%-ной конечной концентрации и 5–10% матровой расплодки культуры возбудителя. Выращивали баксырье в термостате при 37ºС в течение 18–20 часов, рН 7,2–7,4. Контроль чистоты роста исследовали на питательной среде МПА с добавлением 5% дефибринированной крови кролика, МПБ, среде Китта-Тароцци, агаре и бульоне Сабуро, окрашиванием по методу Грама. Далее выращенную баккультуру, с концентрацией микробных клеток не менее 4•109 м. к./см3 возбудителя, инактивировали внесением формалина в 0,30,5%-ной конечной концентрации в течение 48–96 часов при температуре +22 ºС и +37ºС. Контроль полноты инактивации оценивали высевом бакмассы на питательные среды МПА, МПБ, Китта-Тароцци, среду Сабуро, или биопробой на белых мышах массой 16-18 г. В итоге разработали режимы инактивации штамма Str. рneumoniae, основанные на совместном действии раствора 15 формалина в 0,4%-ной концентрации и температуры 22±2°С – 3-4 суток и 37±2°С – 2-3- суток. Далее инактивированную бакмассу стандартизировали путем разбавления ее физиологическим раствором до концентрации не менее 4•109 м. к./см3. После чего вносили адъювант – 6%-ый гидрат окиси алюминия до 20% к объему и выдерживали с ним в течение 12-20 часов при температуре 20-25°С. 3.4.1. Изучение иммунологических свойств вакцины против стрептококкоза крупного рогатого скота в экспериментальных и производственных условиях По разработанной нами технологии были изготовлены опытные серии вакцины: серия №1 – гидроокисьалюминиевая (ГОА) формолвакцина против стрептококкоза крупного рогатого скота; серия № 2 – формолвакцина с масляным адъювантом; серия № 3 – формолвакцина без адъюванта. На следующем этапе определили оптимальную иммунизирующую дозу формолвакцины против стрептококкоза для лабораторных мышей. На каждую дозу вакцины брали по 4 животных массой 16-18г и иммунизировали однократно внутримышечно, с последующим заражением через 14 дней животных культурой штамма Str. pneumoniae. Оптимальная доза составила 109м.к./см3, обеспечившая 100%-ную защиту вакцинированных животных. Иммунологические свойства опытных серий инактивированной вакцины оценивали на белых мышах. На каждую серию вакцины брали по 10 животных массой 16-18 г., которых вакцинировали внутримышечно однократно в дозе 0,5 см³ с последующим заражением привитых и не иммунизированных животных летальной дозой Str. pneumoniae, которая составила 200 млн. м.к./см³. Наблюдали за животными в течение 30 дней. Через 14 суток после иммунизации ГОА-формолвакциной формировался иммунитет, обеспечивший 80%-ную защиту животных от штамма Str. pneumoniae, без адъюванта – 60%. У иммунизированных формолвакциной с масляным адъювантом наблюдали хромоту в течение 2–3 дней, защита животных от стрептококкоза составила 60%. Через 14 суток после двукратной иммунизации белых мышей ГОАформолвакциной в дозе - 0,5 см³, формировался иммунитет, обеспечивающий 100%-ную защиту животных против штамма Str. pneumoniae. Вакцину против стрептококкоза крупного рогатого скота проверяли по следующим показателям: внешнему виду (цвет, отсутствие посторонних примесей, нарушение укупорки, наличие трещин флаконов), стерильности, безвредности, полноте инактивации, иммуногенности. Вакцина представляет 16 собой жидкость светло-желтого цвета с рыхлым осадком, который при встряхивании легко разбивается в гомогенную взвесь, без примесей. Проверку на контаминацию вакцины бактериальной микрофлорой осуществляли по ГОСТ 28085-89 путем высева ее на питательные среды (МПБ, МПА, бульон и агар Сабуро, Китта-Тароцци) и культивирования их в течение 10 суток при 37°С в условиях термостата. Рост микрофлоры отсутствовал. Оценку вакцины на безвредность и полноту инактивации осуществляли на 5 белых мышах массой 16–18 г. путём подкожного введения. Все белые мыши оставались живыми и здоровыми в течение опыта (10 суток), поствакцинальных осложнений не наблюдалось. Для проверки иммуногенности вакцины 10 белых мышей массой 16– 18 г подкожно иммунизировали в дозе 0,5 см3 двукратно, а 10 животных не вакцинировали. Через 14 дней после ревакцинации всех животных внутрибрюшинно заражали штаммом Str. pneumoniae в летальной дозе. Вакцину принято считать иммуногенной при выживании не менее 8 из 10 вакцинированных и гибели 8 из 10 контрольных белых мышей в течение 10 суток после заражения. Эффективность предложенного метода контроля подтверждена при производстве 3 опытных серий вакцины. 3.4.2. Изучение эффективности вакцины против стрептококкоза крупного рогатого скота в производственных условиях Испытания инактивированной вакцины против стрептококкоза крупного рогатого скота проводили в хозяйствах Тимашевского, Тихорецкого и Кореновского районов Краснодарского края. Для этого нами были изготовлены две опытные серии вакцины. В каждом хозяйстве иммунизировали по 100-700 голов крупного рогатого скота разного возраста внутримышечно двукратно. Доза для коров составила 5,0 см3, для телят в возрасте 7 дней, 1,0 месяца – 1,52,0 см3 . Наблюдение за животными вели в течение 9 месяцев. Степень напряжённости иммунитета оценивали по титру антител в сыворотке крови у вакцинированных животных через 30 дней и у 5% животных через 9 месяцев после ревакцинации в (РП) реакции преципитации в капиллярах к штамму Str. pneumoniae по общепринятой методике. Таблица 1 – Иммуногенность и безвредность вакцины против стрептококкоза крупного рогатого скота в производственных условиях № Наименование Кол-во Доза Сохранность Иммуногенность п/п хозяйства жив-х в в см3 (титр антител) опыте Забо через через 17 1. 2. ЗАО САФ «Искра» Тимашевского района ЗАО «Родник» Тихорецкого района телята 40 гол в возрасте 7-8 дней телята 40 гол в возрасте 30 дней телята 30 гол в возрасте 7-8 дней телята 30 гол в возрасте 30 дней первая доза 1,5 вторая доза 2,0 первая доза 1,5 вторая доза 2,0 первая доза 1,5 вторая доза 2,0 первая доза 1,5 вторая доза 2,0 лело (гол.) 2 % 30 сут 270 сут 95,4 1:161:64 1:161:32 1 96,7 1:321:128 1:161:64 4 86,7 1:161:64 1:161:32 3 90,0 1:321:128 1:161:64 Из данных таблицы 1 видно, что у привитых двукратно телят, спустя 14 дней после ревакцинации формировался иммунитет, обеспечивающий 91,0%ную защиту у телят в возрасте 7-8 дней и 93,3%-ную защиту у телят в возрасте 30 дней. Титр специфических антител в сыворотке крови вакцинированных животных через 9 месяцев к штамму Str. рneumoniae был в пределах в 1:16-1:64. У коров, через 14 суток после ревакцинации формировался иммунитет, обеспечивающий защиту более 90%. Титр антител через 30 суток колебался в пределах 1:16 – 1:128, а через 9 месяцев составлял 1:16-1:64 (табл. 2). Таблица 2 – Иммунобиологические свойства вакцины против стрептококкоза крупного рогатого скота в производственных условиях № Наименование Кол-во Доза Сохранность Иммуногенность п/ хозяйства жив-х в см3 (титр антител) п в опыте колчерез через (гол) во % 30 сут 270 сут (гол) 18 1. 2. 3. ЗАО САФ «Искра» Тимашевского района ЗАО «Родник» Тихорецкого района ООО «Сфера» Кореновского района коров 700 первая и вторая – 5,0 691 98,5 1:161:64 1:161:32 200 первая и вторая – 5,0 первая и вторая – 5,0 185 92,5 1:161:64 1:161:32 93 93,0 1:161:128 1:161:64 100 При испытании ГОА-формолвакцины против стрептококкоза крупного рогатого скота в ЗАО САФ «Искра» Тимашевского района в период эпизоотии было иммунизировано 700 коров. Применение вакцины позволило остановить эпизоотию заболевания. Вакцина безвредна и иммуногена. 3.5. Разработка ветеринарных мероприятий по профилактике и ликвидации стрептококкоза крупного рогатого скота В доступной литературе нет рекомендаций о проведении мероприятий по ликвидации стрептококкоза крупного рогатого скота при его возникновении в хозяйствах, поэтому они были разработаны нами. Данные мероприятия основываются на комплексном подходе: диагностика, мероприятия по профилактике, мероприятия по ликвидации заболевания. Диагноз на стрептококкоз в хозяйстве ставится комплексно: на основании результатов эпизоотологического исследования, клинических симптомов, патологоанатомических изменений и результатов бактериологического исследования патматериала от больных и павших животных (выделение возбудителя). Эпизоотологические показатели: широкая превалентность, инцидентность и восприимчивость всех возрастных групп животных; устойчивость во внешней среде; круглогодичная опасность заражения; источник заражения - корма, больные, переболевшие животные и бактерионосители; обширный эпизоотический очаг. Заболевание протекает в сверхострой, острой, подострой и хронической формах. Патологоанатомические изменения у телят в возрасте 1-4 месяцев: серозно-катаральная и геморрагическая пневмония, спленит, серозно19 катаральный и геморрагический гастроэнтерит, гепатит, артриты, миокардит. У взрослых животных: серозно-катаральная и геморрагическая пневмония, артриты, серозно-катаральный и геморрагический гастроэнтерит, поражения венчика копыт, воспаление межкопытной щели, пододерматиты, дерматиты, абсцессы, маститы, эндометриты. Лабораторная диагностика стрептококкозов основана на результатах бактериоскопического, бактериологического, биологического и серологического исследований. Дифференциальная диагностика: стрептококкоз дифференцируют от сальмонеллёза, энтерококкоза, листериоза, эшерихиоза на основании результатов бактериологического исследования. Мероприятия по профилактике 1. Мероприятия по профилактике стрептококкоза крупного рогатого скота в животноводческих хозяйствах Краснодарского края включают комплекс зоогигиенических, ветеринарно-санитарных, технологических и других действий, направленных на понижение обсеменённости животноводческих помещений фермы, на повышение естественной резистентности организмов животных, на предотвращение заражения новорожденного молодняка от матери и в период выращивания через окружающие объекты (корм, воду и т.д.). При этом необходимо учитывать особенности содержания животных в каждом хозяйстве. Для недопущения заражения новорожденных телят, стельных коров и молодняк нужно иммунизировать соответствующими вакцинами, согласно наставлению по применению. Для повышения резистентности молодняка одновременно с вакцинами можно использовать: а) иммуномодуляторы (вестин, Т- и В-активин, тимозин, тимулин, тимопоэтин, поливедрин, полиоксидонин, и др.).Вводят препараты при иммунизации, однократно или двукратно, согласно инструкции по применению. б) нормальные сыворотки крови, которые инъецируются подкожно или внутримышечно. Доза препарата составляет 0,7 мл на 1 кг массы тела животного один раз в сутки 2-3 дня; г) пробиотики (бифацидобактерин, бифидумбактерин, лактацин и др.). Применяются препараты согласно наставлению. 20 2. Руководители, а так же специалисты и рабочие хозяйств и предприятий, складов, связанных с приёмом, транспортировкой и переработкой животных и животноводческого сырья, владельцы животных должны строго соблюдать и выполнять ветеринарно-санитарные требования для хозяйств и ферм, связанных с животноводством. 3. Ветеринарные специалисты животноводческих организаций (ферм, коопераций, госветсети) обязаны: 3.1. Проводить мониторинг состояния животных в обслуживаемой зоне. 3.2. Организовать плановую профилактическую иммунизацию крупного рогатого скота противострептококковыми вакцинами, особого внимания требуют животные, содержащиеся вокруг холодильников, базов, сырья, перерабатывающих предприятий. Мероприятия по ликвидации При установлении диагноза на стрептококкоз крупного рогатого скота администрация района (города) в порядке, предусмотренном Федеральным законом РФ «О ветеринарии», по представлению главного ветеринарного врача района (города) выносит решение об объявлении хозяйства (фермы), населенного пункта неблагополучными по стрептококкозу крупного рогатого скота и устанавливает ограничения. В решении указывают границы эпизоотического очага болезни, неблагополучного пункта, угрожаемой зоны, а также определяют основные мероприятия по ликвидации болезни в неблагополучном пункте и профилактике в угрожаемой зоне. По условиям ограничений в неблагополучном пункте запрещают: ввоз и вывоз крупного рогатого скота, продуктов их убоя, шкур, инвентаря и кормов; перегруппировку крупного рогатого скота; организацию мероприятий, связанных со скоплением крупного рогатого скота; торговлю крупным рогатым скотом, продуктами их убоя, шкурами; заготовку и скармливание крупному рогатому скоту травы и сена из мест, где находились больные или имелись трупы этих животных. В неблагополучном хозяйстве (ферме) проводят: точный учет всего поголовья крупного рогатого скота; используют сыворотку против стрептококкоза, а затем через 10-14 дней проводят вакцинацию этого поголовья; проводят тщательную механическую очистку и дезинфекцию животноводческих ферм, выгульных дворов, оборудования и помещений, где содержались животные; шкуры от крупного рогатого скота из неблагополучных хозяйств дезинфицируют в процессе их технологической обработки согласно 21 действующей инструкции по дезинфекции шкур. Молодняк, переболевший стрептококкозом, содержат отдельно в течение 2 мес. Снятие ограничений. 1. Хозяйство (пункт) объявляют благополучным через 15 дней после последнего случая выздоровления или падежа животного, а так же после поголовной вакцинации крупного рогатого скота и заключительных ветеринарносанитарных мероприятий. 2. Ввоз крупного рогатого скота в пункт и зону, ранее считавшиеся неблагополучными, разрешается только после вакцинации против стрептококкоза крупного рогатого скота в хозяйствах-поставщиках, которые обязаны сделать об этом соответствующую запись в ветеринарном документе. 3. Ответственность за проведение ветеринарно-санитарных, технологических, зоотехнических, организационно-хозяйственных мероприятий возлагается на руководителя хозяйства, а за проведение противоэпизоотических и лечебных мероприятий – на ветеринарных специалистов. Выводы 1. В ходе проведённых исследований была изучена эпизоотическая обстановка по бактериальным инфекциям крупного рогатого скота на территории Краснодарского края. Было установлено, что она является напряжённой. За 2004-2013 гг. на животноводческих фермах края были зарегистрированы инфекционные болезни, наносящие значительный экономический ущерб: эшерихиоз, заболеваемость которым составила 50%, стрептококкоз - 16,4%, псевдомоноз - 14,1%, стафилококкоз - 11,4%, сальмонеллез - 3,8%, злокачественный отек - 1,8%, пастереллез - 0,7%, инфекционная энтеротоксемия - 0,5%, бруцеллез - 0,5%, некробактериоз - 0,3%, туберкулез и эмфизематозный карбункул - по 0,2%, лептоспироз и сибирская язва - по 0,05%. 2. В нозологическом профиле бактериальных болезней КРС в Краснодарском крае преобладает эшерихиоз и стрептококкоз. За 2004-2013 гг. неблагополучными по стрептококкозу КРС являлись 20 районов края. Превалентность стрептококкоза имела выраженные регионарные особенности, чаще болезнь регистрировалась в 8 районах: в Кавказском - 34%, Ейском - 18%, Кущевском - 8%, Тимашевском - 6%, Лабинском, Славянском и Павловском районах по 5%, г. Краснодаре - 4%, в других оставшихся районах - 1 - 2%. 3. В скотоводческих хозяйствах нашего края чаще выделялись 10 патогенных видов микроорганизмов рода Streptococcus. Это Str. pneumoniae, Str. septicum, Str. pyogenes, Str. uberis, Str. bovis, Str. vestibularis, Str. zooepidemicus, Str. sali22 varus, Str. mutans, Str. gallolyticus, преобладал Str. pneumoniae. Проведено изучение тинкториальных, морфологических, биологических, антигенных свойств вида Str. pneumoniae. 4. Крупный рогатый скот всех возрастов восприимчив к стрептококкозу, однако, более подвержен молодняк, возраст которого от 1 - до 60 дней (33-37%). Превалентность и инцидентность вспышек болезни чаще отмечается в зимний (13,7-20,3%) и весенний (4,0-17,3%) периоды. У взрослых животных чаще регистрируют хроническую форму, однако отмечается и бактерионосительство. Эпизоотический процесс при стрептококкозе КРС характеризуется развитием эпизоотий. 5. Протекает болезнь сверхостро, остро, подостро и хронически. При любом течении отмечают вялость, угнетение, понижение аппетита, пневмонии, септицемию, конъюнктивиты, артриты, энтериты, у новорожденных часто развиваются омфалиты, заболеваемость составляет 40-75%, летальность у телят до 70%. У взрослых животных наблюдаются дерматиты, воспаление венчика, межкопытной щели, пододерматиты, маститы, эндометриты и др. 6. При проведении патологоанатомических вскрытий трупов 1-4-хмесячных телят, которым прижизненно был поставлен диагноз стрептококкоз, отметили наличие признаков серозно-катаральной и геморрагической пневмонии (35%), гепатита (25%), спленита (4%), миокардита (6%), серозно-катарального и геморрагического гастроэнтерита (10%), артритов (10%). У взрослых животных также были отмечены: серозно-катаральная, геморрагическая пневмония (29%), серозно-катаральный и геморрагический гастроэнтерит (8%), артриты (10%), кроме этого, были отмечены и другие признаки: пододерматиты (9%), маститы (12%), поражения копытного венчика (9%), воспаление межкопытной щели (7%), эндометриты (8%), дерматиты (5%), абсцессы (3%). 7. Были разработаны различные режимы для подавления патогенности микроорганизмов штамма Str. рneumoniae путём инактивации. В качестве инактиватора использовался 0,4% раствор формалина. При применении температурного режима - 37°С (±2°С) и раствора формалина, полная инактивация исследуемой культуры отмечалась через 2-3 суток; инактивация при 22°С (±2°С) отмечалась на 3-4 сутки. При применении данных режимов была отмечена полная инактивация при сохранении иммуногенности. 8. В ходе проведённых исследований, включая и лабораторные и производственные испытания, инактивированная противострептококковая вакцина для КРС была признана безвредной, стабильной, высокоиммуногенной. В результате её двукратного применения, спустя 14 суток после ревакцинации, 23 было отмечено формирование активного иммунитета, защита против вирулентного возбудителя штамма Str. рneumoniae составила более 80%. Вакцина вводится внутримышечно, период между инъекциями равен 7 – 14 суток. Доза для коров 5,0 см3, для 1,0-1,5-месячных телят – 1,5-2,0 см3. 9. Рассчитана высокая экономическая эффективность от применения разработанной вакцины для борьбы со стрептококкозом КРС, и равна – 303 рубля на 1 рубль затрат. Практические предложения 1. Для применения в ветеринарной практике была предложена новая инактивированная противострептококковая вакцина для КРС, выпуск вакцины освоен на ФГУП «Армавирская биофабрика». 2. Разработаны и изданы «Рекомендации по диагностике, профилактике и ликвидации стрептококкоза крупного рогатого скота в Краснодарском крае». 3. Изданы учебные пособия «Диагностика стафилококкозов и стрептококкозов», «Профилактика и мероприятия по ликвидации стрептококкоза животных», которые используются при планировании противоэпизоотических мероприятий, и для повышения квалификации специалистов ветеринарной отрасли, и в учебном процессе студентов. Список опубликованных работ по теме диссертации 1. Двадненко, О.В. Биологические свойства стрептококков, выделенных у крупного рогатого скота в Краснодарском крае / О.В. Двадненко, А.А. Шевченко // Актуальные проблемы интенсивного развития животноводства: сборник научных трудов МСХ и продовольствия Республики Беларусь, Главное управление образования науки и кадров учреждение образования «Белорусская государственная с/х академия». – Горки: БГСХА, 2010. - Вып. 13. ч. 2. - С. 332338. 2. Двадненко, О.В. Основные свойства, выделенных стрептококков от крупного рогатого скота в Краснодарском крае / О.В. Двадненко, Р.Е. Брилев, А.А. Шевченко // Научный журнал. Университет. Наука, идеи и решения. - №1. – Краснодар: КубГАУ, 2010. - С. 49-52. 3. Двадненко, О.В. Инфекционные болезни крупного рогатого скота в Краснодарском крае / О.В. Двадненко, А.А. Шевченко // Опыт сотрудничества в области экологии, лесного хозяйства, ветеринарной медицины и охотоведения: материалы 2-ой междунар. науч.-практ. конф. - Краснодар: КубГАУ, 2011. - С. 61-63. 24 4. Двадненко О.В. Изучение нозологического профиля инфекционных болезней крупного рогатого скота в Краснодарском крае / О.В. Двадненко, А.А. Шевченко // Сборник научных трудов. Студенчество и наука. - Краснодар: КубГАУ, 2012. - №8. - том №1. - С. 102-105. 5. Шевченко, А.А. Эпизоотологические особенности инфекционных болезней крупного рогатого скота в Краснодарском крае / А.А. Шевченко, О.В. Двадненко // Тр. / КубГАУ. - Краснодар: КубГАУ, 2012. - № 2 (35). - С. 365– 367. 6. Шевченко, А.А. Распространение стрептококкоза крупного рогатого скота в Краснодарском крае и совершенствование профилактики / А.А. Шевченко, О.Ю. Черных, Л.В. Шевченко, О.В. Двадненко // «Веткорм», ветеринария и кормление. - М: - 2013. - №5.- С. 57-58. 7. Шевченко, А.А. Изучение распространения и совершенствование специфической профилактики стрептококкоза крупного рогатого скота / А.А. Шевченко, О.Ю. Черных, Л.В. Шевченко, О.В. Двадненко // Тр. / КубГАУ. Краснодар: КубГАУ, 2013 - №6 (45) - С.198-200. 25
