ХАРРАСОВА АЛИНА АГЛЯМОВНА района ГО г.Уфа РБ Научные руководители:

ХАРРАСОВА АЛИНА АГЛЯМОВНА
МБОУ СОШ № 101 с углубленным изучением экономики Демского
района ГО г.Уфа РБ
Научные руководители:
Юсупова В.М., учитель биологии высшей категории, МБОУ СОШ № 101
Ямалеева А.А., доктор биологических наук, профессор БГУ,
Усачев С.А., аспирант кафедры биохимии БГУ
«ИЗУЧЕНИЕ ЛЕКТИНОВ ТРУТОВЫХ ГРИБОВ»
Актуальность
практический
данного
интерес
исследования:
как
средство,
миколектины
обладающее
представляют
противомикробной,
противовирусной и иммуностимулирующей активностью.
Цель: изучение лектинов трутовых грибов
Задачи:
1. выделить миколектины из исследуемых трутовых грибов
2. определить количество белков в трутовых грибах методом Лоури
3. определить их наибольшую гемагглютинирующую активность с
эритроцитами первой группы крови в зависимости от видовой
принадлежности грибов
Содержание:
Обычные антибиотики малоэффективны при вирусных заболеваниях и
потребность в новых средствах очень высока. Антивирусные свойства
препаратов на основе грибов заключены в способности ингибировать
активность вирусных ферментов, биосинтез вирусных нуклеиновых кислот или
абсорбцию и внедрение вирусов в материнские клетки. В значительной степени
этому
соответствуют
лектины,
являющиеся
сложными
белками,
обнаруженными в большинстве исследованных низших и высших грибах.[2,3].
Лектины — (от лат. lego — выбираю), белки, обладающие свойством
специфично и обратимо связывать углеводы или их остатки в биополимерах.
Одним из свойств лектинов является их способность к реакции
гемагглютинации с эритроцитами. Связано это с тем, что они обладают
углеводной специфичностью к определенным рецепторам эритроцита. На
поверхности эритроцита имеются олигосахаридные цепи, состоящие из
моносахаридов.
Различные
моносахара,
соединяясь
в
определенную
последовательность, образуют олигосахарид, который присоединяется одним
концом к белковой молекуле, погруженной в липидный матрикс мембраны.
Олигосахариды мембранных белков служат своеобразными лигандами для
связывания с лектинами, вызывая разнообразные эффекты в процессах
функционирования
определенными
лектинами
[1].
мембраны.
углеводными
Для
При
этом,
остатками
изучения
процесс
происходит
биохимической
взаимодействия
с
с
определенными
активности
и
общей
характеристики лектинов на начальных этапах научного поиска применяется,
прежде всего, реакция гемагглютинации с эритроцитами различных групп
крови, что позволяет сделать вывод не только о содержании лектинов в
исследуемом грибе, но и о степени их биологической активности.
Объект исследований: трутовые грибы
Методика исследований
Для выделения лектинобогащенных экстрактов навески грибов массой 1
г, измельчались, суспензировались и заливались ацетатным буфером (рН 3,8), с
последующим выдерживанием на холоде при 4
о
С в течение 12 часов, и
центрифугированием при 3000 об/мин — 15 мин. Далее использовалась
надосадочная жидкость. После, содержание лектинов в исследуемых грибах
определялось методом Лоури. Активность лектинов выявлялась реакцией
гемагглютинации с эритроцитами первой группы крови.
Колориметрический
метод
определения
белка
по
Лоури
основан на реакции циклических аминокислот белков с реактивом Фолина,
дающей синее окрашивание; применяют для определения белка в растворах с
концентрацией от 10 до 100 м кг.
ХОД РАБОТЫ: К 0,4 мл раствора белка добавляют 2 мл реактива С. Смесь
перемешивают и через 10 минут приливают к ней 0,2 мл рабочего раствора E.
Интенсивность окраски определяют на ФЭКе с красным светофильтром через
30 мин. Количество белка находят по калибровочной кривой. Для построения
калибровочной кривой 20 мг чистого белка ( в пересчете на абсолютной сухой
вес) растворяют в 100 мл 0,1 н NaOH (1 мл содержит 0,2 мг белка) и в 10
мерных колбах на 25 мл вносят 0,125; 0,25; 0,5; 1,25; 1,875; 2,5; 3,125; 3,75;
4,375; 5,00 мл стандартного раствора белка и доводят водой до метки,
перемешивают и из каждой колбы берут по 0,4 мл для определения белка по
указанной прописи. По полученным данным вычерчивают калибровочную
кривую .
Оборудование: Фотоэлектроколориметр, круглодонная колба на 2-2,5л с
обратным холодильником со шлифом, склянки для реактивов на 1 л, 0,5 л,
плоскодонные колбы на 2л, 0,5 л, 100 мл, пробирки градуированные на 10 мл ,
градуированные пипетки , микробюретки.
Реактивы: Вольфрамат натрия (Na2WoO4*2Н2O), молибдат натрия , фосфорная
кислота H3PO4, концентрированный HCI (плотность -1,19 ),бромная вода ,
Na2CO3 0,1 н; NaOH;
5%-ный раствор CuSO4*5H2O; 1%-ный раствор
сегнетовой соли ,чистые препараты белков (альбумин, глобулин ,казеин
другие.).
1. Реактив А-2% раствор Na2CO3 в 0,1 н NaOH.
2. Реактив Б-0,5% CuSO4*5H2O в 1% растворе двухзамещенного виннокислого
калия или натрия ( K2C4H4O6 ; Na2C4H4O6).
3. Раствор С – опытный раствор , готовят смешивая реактивы А и Б в
соотношении 50:1 по объему ( годен в течения дня ).
4.Реактив Е (Фолина ).
5.Чистые препараты белков ( альбумина , глобулина , казеин и другие ).
Метод определения активности лектинов-реакция гемагглютинации (РГА)
основан на способности лектинов агглютинировать эритроциты крови, на
поверхности которых находится широкий набор углеводов, принадлежащих к
гликопротеинам.
Подготовка эритроцитов. Для
предотвращения свертывания крови к ней
добавляли 3,5% раствор цитрата натрия. Эритроциты трижды отмывали 0,9%ным раствором хлорида натрия при 1000 об/мин по 10 минут.
Постановка РГА. Для проведения РГА использовали 2%- ный
раствор
эритроцитов.В микротитратор Такачи наносили фосфатно-солевой буфер (рН
7,4) по 50 мкл. Затем, в первые лунки
наносили исследуемый
раствор и
наносили во вторую лунку. Затем, в третью и т.д., получив, таким образом,
разведение экстракта
соответственно
в 2,4, 8, 16 и т. д. раз. Тщательно
перемешивая содержимое каждой лунки, наносили 2 %-ный раствор отмытых
эритроцитов крови человека. Результат определили через
10
часов. Если
эритроциты собирались одной точкой на дне лунки, считали, что агглютинации
нет. Если они располагались сплошным слоем на дне лунки – гемагглютинация
положительная.
Результаты собственных исследований.
Белки были выделены из следующих трутовых грибов: Трутовик
Эксидия
железистая, Феллодон
окаймленный, Трихаптум
по
реакции
сросшийся, Постия
опаленный,
вяжущая, Трутовик
еловый. Анализ лектиновой активности проводился
гемагглютинации
с
эритроцитами
первой
групповой
принадлежности крови, взятой у практически здоровых волонтеров. По
результатам определения количества лектинов по методу Лоури, в исследуемых
грибах содержится большое количество белков, включая лектины (Трутовик
опаленный 0,01 мг/ г сухого вещества, Эксидия железистая 0,1 мг/ г сухого
вещества, Феллодон сросшийся 0,47 мг/г сухого вещества, Постия вяжущая 0,4
мг/г сухого вещества, Трутовик окаймленный 0,32 мг/ г сухого вещества,
Трихаптум еловый 0,17 мг/ г сухого вещества).
В исследуемых грибах обнаружена высокая активность лектинов.
Показано, что лектиновая активность в реакциях гемагглютинации зависит от
видовой принадлежности грибов, что связано с различным химическим
строением
рецепторов
клеток
и
объясняется
различной
углеводной
специфичностью данных грибов.
Анализ результатов и выводы:
1.По результатам исследования в шести видах трутовых грибов было
обнаружено большое количество белков. Наибольшее количество белков было
выделено из Трихаптума елового ( 0,85 мг/ г сухого вещества)
2.В связи с тем, что белки выделялись при рН=3,8 ацетатным буфером, можно с
уверенностью сказать, что основным составом белков в трутовых грибах
являются лектины.
3.После проведенной реакции гемагглютинации с эритроцитами человека была
зафиксирована высокая активность лектинов в трутовых грибах.
4.Наибольшая лектиновая активность нами обнаружена в Эксидии железистой
(титры 1:512)
В результате проведённого эксперимента
подтвердилась гипотеза о
возможности применения лектинов данных грибов в медицинской практике.
Практическое значение: результаты наших исследований
можно
считать первым этапом для дальнейшего изучения биохимических свойств
лектинов трутовых грибов в перспективе их применения в медицинской
практике.
Область внедрения: медицина
Наличие личных публикаций в печатных изданиях, электронные
публикации, участие в грантах – не имею
Список использованных источников:
1. Игнатов В. В. Углеводузнающие белки – лектины //Соросовский
образовательный журнал, №2, 1997.
2. Корсун В. Ф., В. М. Лахтин, Е. В. Корсун, А. Мицконас Фитолектины, М.,
Издательство: «Практическая Медицина», 2007. — 288с.
3. Ямалеева А. А. Лектины растений и их биологическая роль. — Уфа: Изд-во
Башк. ун-та, 2001. — 204 с.