материалы к занятию по теме "Белки..."
advertisement
ЗАКОНСПЕКТИРУЙТЕ ЭТОТ МАТЕРИАЛ И ЗАПОЛНИТЕ ТАБЛИЦЫ, ИСПОЛЬЗУЯ УЧЕБНИКИ ИЛ И МАТЕРИАЛ ИХ ЭЛЕКТРОННЫХ УЧЕБНИКОВ Основная литература: 1. Биохимия : учебник / под ред. Е. С. Северина. - 5-е изд., испр. и доп. - М. : ГЭОТАРМедиа, 2014. - 768 с. : ил. http://www.studentlibrary.ru Список полезных web-страниц Наглядная биохимия/ Я. Кольман, К.- Г. Рем, - Москва “Мир” 2000 http://www.chem.msu.su/rus/teaching/kolman/index.htm Биохимия: Учеб. для вузов, Под ред. Е.С. Северина., 2003 http://www.biochemistry.ru/biohimija_severina/B5873Content.html Биологическая химия под ред. Е.С. Северина, 2011 г (новая редакция учебника с упражнениями, тестами и задачами для студентов специальности Лечебное дело и Фармация) http://biochemistry.ru/Biologicheskajahimija2011/#/1/ Очень полезный ресурс, в котором представлен хороший лекционный материал http://biokhimija.ru/lekcii-po-biohimii.html ♦◊♦ Тема: Белки. Белки (протеины) – высокомолекулярные азотсодержащие органические соединения, играют важную роль в построении живой ткани и в осуществлении процессов жизнедеятельности. Особенности структуры и наличие ряда уникальных свойств обеспечивают функционирование белков как одного из основных материальных носителей жизни. Представление о структуре, физико-химических свойствах и биологических функциях белков являются теоретической основой изучения всех последующих разделов биологической химии. Строение и функции белков. Методы качественного и количественного анализа белков. Используя лекции и учебники по биохимии, изучите химический состав, строение, уровни организации белковой молекулы, биологические функции белков, письменно ответьте на вопросы в тетради. Используйте таблицу 1 и рисунок 1. Таблица 1. № Задание Указания к выполнению № задания 1 2 3 1. Вспомните структуру и 1. Напишите общую формулу свойства аминокислот, α-аминокислоты. Как аминокислотный состав классифицируются белков. аминокислоты по строению бокового радикала? Напишите формулы аминокислот с неполярным радикалом. Напишите формулы αаминокислот с полярными, но незаряженными радикалами, с полярными анионогенными радикалами, с полярными катионногенными радикалами.В виде каких частиц находятся αаминокислоты в водных растворах при нейтральном значении рН? Напишите формулы трипептидов: а) пролилглицил-аланин; б) лизилфенилаланил-серин. Приведите формулы кислого, основного и нейтрального трипептидов. 1. Вспомните функциональное многообразие белков – белки ферменты, белкирецепторы, транспортные белки, антитела. 3.Перечислите группы простых белков, охарактеризуйте их биологическую роль. 4. Перечислите группы сложных белков, охарактеризуйте их биологическую роль. охарактеризуйте функции 2. Изучите организации молекулы. небелковой части (лиганда). Приведите примеры важнейших хромопротеидов, отметьте их биологическую роль. Какова функция липопротеинов плазмы крови? Перечислите основные группы липопротеинов сыворотки крови, отметьте клиническое значение определения липопротеинов в сыворотке крови. Зарисуйте схему строения биомембран как липопротеинового бислоя. Приведите примеры наиболее распространенных фосфопротеинов и охарактеризуйте их биологическую роль. уровни 1. Дайте определение белковой первичной структуры белка. Какая основная связь стабилизирует первичную структуру? Дайте определение конформации и нативной конформации полипептидной цепи. Дайте определение понятию «конформационная лабильность белков», ее значение. Дайте определение вторичной структуры. Какие формы вторичной структуры встречаются в природных белках? За счет каких связей стабилизируются конформации α-спирали? Аминокислотные радикалы каких α-аминокислот способствуют образованию αспирали? Для какой формы вторичной структуры полипептидной цепи характерны межцепочечные водородные связи? Дайте определение понятия «третичная структура» полипептидной цепи. Какие связи обеспечивают стабильность третичной структуры полипептидной цепи? Между какими группами может возникнуть гидрофобное взаимодействие? Между аминокислотными остатками каких αаминокислот возникает дисульфидная связь? Покажите на примере. Как располагаются полярные радикалы аминокислотных остатков при формировании третичной структуры полипептидной цепи в водной среде? Каковы основные факторы, определяющие трехмерную структуру белка? Какие белки называют гомологичными? Каков характер взаимосвязи между уровнями организации белковой молекулы и ее биологической активностью? Дайте определение четвертичной структуре белка. Какие связи стабилизируют четвертичную структуру белка? Что такое протомеры белковой молекулы? 3. Изучите методы 1. Какие методы гидролиза исследования первичной белка Вы знаете? структуры белка. 2. В чем суть хроматографического анализа. Приведите классификацию хроматографических методов. 3. Приведите примерную последовательность операций 4. Ознакомьтесь с методами установления вторичной, третичной и четвертичной структуры белка. 5. Изучите, какими методами можно определить количественное содержание белка и аминокислот в биологических объектах. ПОЛНЫЙ ГИДРОЛИЗ РЕНТГЕНОСТРУКТУРНЫЙ АНАЛИЗ, ЭЛЕКТРОННАЯ МИКРОСКОПИЯ РАЗДЕЛЕНИЕ И ИДЕНТЕФИКАЦИЯ СМЕСИ АМИНОКИСЛОТ МЕТОДОМ ХРОМАТОГРАФИИ 1-Й ЭТАП – ОПРЕДЕЛЕНИЕ АМИНОКИСЛОТНОГО СОСТАВА при установлении первичной структуры белка. 4. Продумайте, какое практическое значение для медицины имеют исследование аминокислотного состава и первичной структуры белков. 1.Перечислите и охарактеризуйте методы, позволяющие изучить вторичную, третичную и четвертичную структуру белка. 1.Сформулируйте принцип количественного определения белка биуретовым методом. 3.Выпишите границы содержания белка в сыворотке крови в физиологичеких условиях и приведите примеры заболеваний, сопровождающихся гипо- и гиперпротеинемией. 2-Й ЭТАП – ФРАГМЕНТАЦИЯ ПОЛИПЕПТИДА ПЕРВИЧНАЯ СТРУКТУРА ИЗБИРАТЕЛЬ НЫЙ ГИДРОЛИЗ ВТОРИЧНАЯ СТРУКТУРА ОЛИГОПЕПТИДЫ ТРЕТИЧНАЯ СТРУКТУРА ОПРЕДЕЛЕНИЕ АМИНОКИСЛОТНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ЧЕТВЕРТИЧНАЯ СТРУКТУРА УСТАНОВЛЕНИЕ УНИКАЛЬНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ВСЕЙ ПОЛИПЕПТИДНОЙ ЦЕПИ 3-Й ЭТАП ДЕГРАДАЦИЯ ОЛИГОПЕПТИДОВ ПО ЭДМАНУ СОСТАВЛЕНИЕ КАРТ ПЕРЕКРЫВАЮЩИХСЯ ПЕПТИДОВ Рисунок 1. Графологическая структура «Качественный анализ – установление структуры белка» Обучающие задачи Задача 1.Будет ли одинаковой интенсивность окраски, полученной в реакции с биуретовым реактивом, для 100 молекул альбумина (Mr 64000 D) и 100 молекул иммуноглобулина G (Mr 175000D)? В чем заключается принцип биуретовой реакции? Ответ. С биуретовым реактивом реагируют пептидные группы белков – образуется хелатный комплекс фиолетового цвета. По сравнению с иммуноглобулинами, альбумин содержит меньше остатков аминокислот, так как имеет меньшую молекулярную массу, следовательно, интенсивность окраски раствора альбумина будет меньше. Задача 2.Подавляющее большинство протеиногенных аминокислот дают синее окрашивание с нингидрином, а пролин и оксипролин – желтое. Объясните это различие, принимая во внимание химизм нингидриновой пробы и особенности структуры протеиногенных аминокислот. Ответ. Нингидрин является специфичным реагентом для аминокислот, тогда как пролин и оксипролин являются иминокислотами. С -аминокислотами нингидрин реагирует по следующей схеме: нингидрин α - аминокислота O C O OH C 1000C + H2N C OH -3H2O OH C CH R O O O C C C N O + C C C O OH продукт реакции сине-фиолетового цвета (светопоглощение в области 550-570 нм) CO2 + R C H альдегид Физико-химические свойства белков. При подготовке к занятию следует изучить обратимые и необратимые методы осаждения белков, их физико-химические свойства согласно таблице 2 и рисунку 2. Таблица 2. № Задание Указания к выполнению № задания 1 2 3 1. Изучите 1. Какие физико-химические растворимость осаждаемость белков. 2. Изучите электрические свойства белков. и свойства белков обусловливают их растворимость? Чем обусловлена различная растворимость глобулярных и фибриллярных белков? Перечислите факторы, определяющие растворимость белков. 2.Охарактеризуйте особенности белковых растворов. В чем суть нефелометрического определения содержания белка? 3. Приведите два основных фактора стабилизации белка в растворе. 4. В чем суть явления высаливания? 5. Приведите примеры практического использования высаливания. 6. Дайте определение явлению денатурации. Приведите классификацию видов денатурации. 7.Объясните механизм денатурирующего действия температуры, солей тяжелых металлов, спиртов, фенолов. 8. Приведите примеры практического использования денатурации белков. 1.Напишите схему диссоциации карбоксильной группы и аминогруппы в составе белка. 2.Выпишите два основных фактора, определяющих заряд белковой молекулы. 3.Напишите, что называется изоэлектрической точкой. Каковы свойства белков в изоэлектрическом состоянии? В какой среде будет находиться изоэлектрическая точка альбуминов и гистонов? БЕЛОК В РАСТВОРЕ СТАБИЛИЗИРУЮТ 2 ФАКТОРА – ЗАРЯД И ГИДРАТНАЯ ОБОЛОЧКА МЕТОДЫ ОСАЖДЕНИЯ ВЫСАЛИВАНИЕ ДЕНАТУРАЦИЯ ДЕГИДРАТАЦИЯ И НЕЙТРАЛИЗАЦИЯ ЗАРЯДА БЕЛКОВЫХ ЧАСТИЦ НАРУШЕНИЕ ВТОРИЧНОЙ, ТРЕТИЧНОЙ И ЧЕТВЕРТИЧНОЙ СТРУКТУРЫ БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ СОХРАНЯЕТСЯ БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ УТРАЧИВАЕТСЯ Рисунок 2. Графологическая структура «Методы осаждения белка» Примеры обучающих задач Задача 1.Сделайте предположение об аминокислотном составе впервые выделенного пептида, принимая во внимание следующие экспериментальные данные: -пептид не обладает электрофоретической подвижностью в щелочной среде (рН 9,8); -при электрофорезе в кислой среде (рН5,6) движется к катоду; -не дает окрашивания при обработке концентрированной азотной кислотой (ксантопротеиновая проба отрицательна). Задача 2.Многие патологические состояния могут сопровождаться изменением рН мочи. Например, для цистита характерна щелочная реакция мочи. Объясните, почему при анализе мочи на содержание белка, в частности при осаждении белков кипячением, необходимо контролировать рН и, если необходимо, доводить его до слабокислой реакции? Задача 3.Белок, синтезируемый in vivo, принимает биологически активную конформацию. В то же время, при синтезе белка in vitro не всегда удается получить функционально активный белок, даже при отсутствии сбоев, ошибок в первичной структуре. Объясните этот феномен. Эталоны ответов на задачи Задача 1.Аминокислотный состав пептида отличается высоким содержанием диаминомонокарбоновых кислот – лизина и аргинина, в то же время, в структуре пептида отсутствуют ароматические и гетероциклические аминокислоты - фенилаланин, тирозин, гистидин и триптофан, дающие положительную ксантопротеиновую реакцию. В частности, тирозин с концентрированной азотной кислотой реагирует по следующей схеме: O2N HO CH COOH HNO3 HO CH2 NH3 COOH NH3 желтая окраска O2N NaOH O CH COONa NH2 оранжевая окраска Задача 2.В сильнокислой и щелочной среде осаждению белков препятствует заряд (отрицательный в кислой и положительный в щелочной). Поэтому, если рН исследуемой мочи не соответствует слабокислой реакции, можно получить ложно отрицательный результат. Задача 3.В живой клетке процесс укладки синтезируемой полипептидной цепи - фолдинг регулируется особыми белками шаперонами. Эти белки контролируют формирование стабильной и биологически активной конформации, предотвращая образование из полипептидной цепи неспецифических клубков и агрегатов, а также участвуют в доставке белков к субклеточным мишеням. Методы выделения и очистки белков № № 1 1. 2. Задание 2 Изучите методы выделения индивидуальных белков. Таблица 3. Указания к выполнению задания 3 1. Перечислите методы фракционирования белков, позволяющие получить индивидуальный белок. 2. Кратко сформулируйте, на каких физикохимических свойствах основаны перечисленные методы. Изучите, почему 1.Выпишите способы определения белки обладают молекулярной массы белков. свойствами коллоидов. 3. 4. 5. 2.Перечислите данные, подтверждающие высокую молекулярную массу белков. 3.Чем можете подтвердить способность белков образовывать коллоидные растворы? 5.Охарактеризуйте принцип метода диализа. Какое практическое значение имеет диализ? Вспомните 1. Вспомните механизм возникновения электрические электрического заряда. Что такое свойства белков. изоэлектрическая точка? 2.Охарактеризуйте явление электрофореза белков. Запомните виды электрофореза. 3.Укажите факторы, от которых зависит скорость перемещения белковых молекул в поле постоянного электрического тока. 4. Напишите, на какие фракции разделяют белки сыворотки крови при электрофорезе на бумаге. Выпишите протеинограмму – соотношение белковых фракций - здорового ребенка и взрослого человека. 5. Изучите возможности электрофоретического разделения белков на полиакриламидном геле, принцип диск-электрофореза и его значение для разделения белков сыворотки крови. Повторите 1. Выясните, чем определяется растворимость растворимость белков, и какие факторы стабилизируют белков. белковую молекулу в растворе. Изучите метод 1.Выпишите классификацию методов хроматографии хроматографического разделения белков по белков. механизму разделения и технике проведения. Сформулируйте принцип метода адсорбционной, ионнообменной, афинной, и распределительной хроматографии. Кратко опишите процедуру гель-фильтрации и газожидкостной хроматографии. ГОМОГЕНИЗАЦИЯ БИОЛОГИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА ЭКСТРАКЦИЯ БЕЛКОВ ФРАКЦИОНИРОВАНИЕ БЕЛКОВ ВЫСАЛИВАНИЕ ХРОМАТОГРАФИЯ ЭЛЕКТРОФОРЕЗ КРИСТАЛЛИЗАЦИЯ ИНДИВИДУАЛЬНЫЙ БЕЛОК ОЧИСТКА ОТ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ ПРИМЕСЕЙ ДИАЛИЗ ГЕЛЬХРОМАТОГРАФИЯ УЛЬТРАЦЕНТРИФУГИРОВАНИЕ Рисунок 3. Графологическая структура «Выделение и очистка белков» Примеры обучающих задач Задача 1.При электрофорезе на бумаге белков сыворотки крови больного Р.С. получили следующие результаты: альбумины-48,5%, α1глобулины-12,6%, α2-глобулины-7,3%, β-глобулины-14,8%, γ-глобулины16,8%. Выделите изменения, обнаруженные в белковом спектре крови больного и рассчитайте величину белкового коэффициента, если общее содержание белка в крови у данного больного составляло 62 г/л. Задача 2.Необходимо разделить смесь белков, содержащую церрулоплазмин (Mr151000, ИЭТ 4,4), β-лактоглобуллин (молекулярная масса 150000, ИЭТ 6,3) и γ-глобулин (молекулярная масса 37100, ИЭТ 5,2). Предложите методы разделения смеси этих белков. В какой последовательности будут выделяться эти белки из смеси? Эталоны ответов на задачи Задача 1.Снизилось процентное содержание альбуминов (в норме альбумины составляют 55,4-78,9%), повысилось содержание α1- и βглобулинов. Белковый коэффициент снижен и составляет 0,93. Альбуминов в сыворотке крови больного содержится 30 г/л, глобулинов – 32 г/л. Задача 2.Для отделения β-лактоглобулина, значительно отличающегося по величине молекулярной массы, можно использовать метод гель-фильтрации. Для разделения церрулоплазмина и γ-глобулина, имеющих различные значения ИЭТ, целесообразно использовать электрофорез.
