На правах рукописи АВДИЕНКО Ирина Николаевна ОПТИМИЗАЦИЯ ТЕРАПИИ БОЛЬНЫХ АТОПИЧЕСКИМ ДЕРМАТИТОМ С ПРИМЕНЕНИЕМ УЛЬТРАФИОЛЕТОВОГО ИЗЛУЧЕНИЯ ДЛИНОЙ ВОЛНЫ 350-400 НМ 14.01.10 – Кожные и венерические болезни Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва-2011 Работа выполнена в отделе дерматологии Федерального государственного учреждения «Государственный научный центр дерматовенерологии Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи» Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор КУБАНОВ Алексей Алексеевич Официальные оппоненты: доктор медицинских наук ВОЛНУХИН Владимир Анатольевич доктор медицинских наук, профессор ЛЬВОВ Андрей Николаевич Ведущая организация: Российский университет дружбы народов, г. Москва Защита диссертации состоится «___» ____________ 2011 г. в 12 часов 00 минут на заседании Диссертационного совета Д 208.115.01 при Федеральном государственном дерматовенерологии учреждении Федерального «Государственный агентства по научный центр высокотехнологичной медицинской помощи» по адресу: 107076, г. Москва, ул. Короленко, д. 3, стр. 6. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «ГНЦД Росмедтехнологий». Автореферат разослан «___» _______________ 2011 года. Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат медицинских наук Наталия Константиновна Иванова 2 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ДИССЕРТАЦИИ Актуальность проблемы Атопический дерматит (АтД) является хроническим рецидивирующим заболеванием кожи и представляет серьезную проблему для здравоохранения в связи с неуклонным ростом заболеваемости как на территории Российской Федерации, так и за рубежом (Балаболкин И.И. с соавт., 1999; Скрипкин Ю.К. с соавт., 1999; Кривонос О.В. с соавт., 2009; Asher M.I. et al., 2006). Этиология АтД остается до конца не изученной. В патогенезе дерматоза, согласно современным представлениям, важную роль играют иммунные нарушения, характеризующиеся изменением соотношения Т-хелперов 2 типа (Т-х2) и 1 типа (Т-х1), приводящие к формированию в коже хронического воспаления с образованием в очагах поражения клеточных инфильтратов (Leung D.Y. et al., 2004; Darsow U. et al., 2009). Применяемые в клинической практике медикаментозные методы терапии при среднетяжелом и тяжелом течении АтД недостаточно эффективны и не позволяют добиться ремиссии заболевания (Балаболкин И.И. с соавт., 1999; Скрипкин Ю.К. с соавт., 1999; Akdis C.A. et al., 2006; BuBmann C. et al., 2009). К эффективным методам лечения АтД относятся некоторые методы ультрафиолетовой терапии: фотохимиотерапия, узкополосная средневолновая ультрафиолетовая терапия с длиной волны 311 нм (Каламкарян А.А. с соавт., 1986; Горячева Т.А., 2010; von Kobyletzki G. et al., 1999; Krutmann J., 2000; Valkova S. et al., 2004). Однако, их применение ограничено из-за наличия ряда противопоказаний и/или развития побочных эффектов (Каламкарян А.А. с соавт., 1986; Krutmann J., 2000; Ring J. et al., 2006; Kunisada M. et al., 2007). В зарубежной литературе имеются публикации об эффективности использования в лечении больных АтД среднетяжелого и тяжелого течения заболевания дальней длинноволновой ультрафиолетовой терапии (УФА-1 терапия) - ультрафиолетового излучения УФА-1 диапазона с длиной волны 340400 нм (Krutmann J. et al., 1998; Dittmar H.C. et al., 2001; Dawe R.S., 2003; Polderman M.C., 2006; Rombold S. et al., 2008; Gambichler T., 2009;). В этих исследованиях клинический эффект достигался, в основном, при лечении пациентов высокими разовыми дозами излучения (130 Дж/см2), под влиянием которых в коже индуцируется апоптоз CD4+ лимфоцитов (Morita A. et al., 1997). Однако, безопасность применения таких больших доз УФА-1 излучения, в частности, канцерогенный потенциал и риск фотостарения кожи, окончательно не установлена. В экспериментальных исследованиях показано, что облучение лысых мышей альбиносов Skh-hr1 высокими дозами УФА-1 света может приводить к возникновению плоскоклеточного рака кожи (Sterenborg H.J., van der Leun J.C., 1990; Runger T.M., 1999). О возможности использования низких и средних доз УФА-1 излучения в литературе имеются лишь единичные сообщения. Работ, посвященных изучению влияния низких и средних доз ультрафиолетового излучения длиной волны 340-400 нм на субпопуляционный состав лимфоцитов в периферической 3 крови больных АтД и показатели иммунного воспаления в коже, нами не обнаружено. Все вышеперечисленное обуславливает актуальность, а также цель и задачи настоящего исследования. Цель исследования Оценить эффективность применения ультрафиолетового излучения УФА1 диапазона с длиной волны 350-400 нм в терапии больных атопическим дерматитом среднетяжелого и тяжелого течения и его влияние на показатели клеточного иммунитета в периферической крови и очагах поражения кожи. Задачи исследования 1. Оценить клиническую эффективность применения низких и средних доз ультрафиолетового излучения УФА-1 диапазона с длиной волны 350-400 нм в терапии больных атопическим дерматитом со среднетяжелым и тяжелым течением заболевания. 2. Провести сравнительное изучение эффективности медикаментозной терапии больных и лечения с применением ультрафиолетового излучения длиной волны 350-400 нм. 3. Изучить субпопуляционный состав лимфоцитов в периферической крови и биоптатах пораженной кожи больных, а также его изменения в процессе проводимого лечения. 4. Исследовать в биоптатах кожи больных уровень экспрессии γ-интерферона до и после курса ультрафиолетовой терапии. Научная новизна Установлена высокая эффективность применения низких и средних доз ультрафиолетового излучения УФА-1 диапазона с длиной волны 350-400 нм в терапии больных атопическим дерматитом среднетяжелого и тяжелого течения, а также хорошая переносимость данного метода лечения. Дана сравнительная оценка терапии больных атопическим дерматитом с использованием ультрафиолетового излучения длиной волны 350-400 нм и медикаментозными средствами, показавшая более высокую эффективность фототерапии. Получены новые данные о механизмах терапевтического действия ультрафиолетового излучения длиной волны 350-400 нм при атопическом дерматите. Выявлено ингибирующее влияние данного ультрафиолетового спектра на кожно-ассоциированные Т-хелперы и экспрессию γ-ИФН в очагах поражения. Уменьшение содержания Т-хелперов в пораженной коже коррелирует с регрессом клинических симптомов заболевания. 4 Установлено отсутствие негативного влияния ультрафиолетового излучения УФА-1 диапазона на показатели клеточного иммунитета в периферической крови пациентов. Практическая значимость Внедрение в клиническую практику метода терапии больных атопическим дерматитом среднетяжелого и тяжелого течения с применением ультрафиолетового излучения длиной волны 350-400 нм позволит повысить эффективность лечения, уменьшить частоту развития побочных эффектов и снизить количество назначаемых системных и наружных лекарственных средств. 1. Основные положения, выносимые на защиту Терапия с применением низких и средних доз ультрафиолетового излучения УФА-1 диапазона с длиной волны 350-400 нм является эффективным методом лечения больных атопическим дерматитом со среднетяжелым и тяжелым течением заболевания. 2. Облучение пациентов ультрафиолетовым светом длиной волны 350-400 нм не оказывает влияния на показатели клеточного иммунитета в периферической крови больных атопическим дерматитом, за исключением снижения относительного содержания В-лимфоцитов. 3. Терапия с применением низких и средних доз ультрафиолетового излучения УФА-1 диапазона оказывает супрессивное действие на кожноассоциированные Т-хелперы, уровень которых значительно повышен в очагах атопического дерматита, по сравнению с кожей здоровых лиц. 4. Ультрафиолетовое излучение длиной волны 350-400 нм вызывает уменьшение продукции γ-интерферона в коже больных атопическим дерматитом, что способствует, таким образом, подавлению иммунного воспаления в очагах поражения. Апробация работы Основные положения доложены и обсуждены на II Всероссийском конгрессе дерматовенерологов (Санкт-Петербург, 2007), III Всероссийском конгрессе дерматовенерологов (Казань, 2009), научно-практической конференции ФГУ «ЦНИКВИ Росздрава» (Москва, 2008; 2009). Внедрение результатов исследования Результаты исследования используются в практической работе ФГУ «ГНЦД Росмедтехнологий», клинике кожных и венерических болезней ГОУ ВПО «Саратовский государственный медицинский университет им. В.И. Разумовского» Росздрава. 5 Публикации По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ, из них три в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ. Структура и объем работы Диссертация изложена на 109 страницах печатного текста, состоит из введения, обзора литературы, глав, содержащих описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка использованной литературы. Работа иллюстрирована 19 таблицами и 20 рисунками. Список литературы содержит 153 печатные работы, из них 41 отечественных и 112 зарубежных авторов. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материал и методы исследования Всего в исследование было включено 102 участника, из них 81 больной АтД (45 женщин и 36 мужчин в возрасте от 18 до 60 лет) и 23 здоровых добровольца. Средний возраст пациентов составил 29,7±10,9 лет, длительность заболевания варьировала от 18 до 42 лет. Среднее значение индекса SCORAD до лечения равнялось 69,9±12,1. В исследование включали пациентов старше 18 лет, имеющих среднетяжелое или тяжелое течение АтД. Критериями исключения из исследования служили: 1) непереносимость ультрафиолетового излучения, а также наличие заболеваний, имеющих противопоказания к ультрафиолетовой терапии; 2) наличие в анамнезе или на момент включения в исследование новообразований кожи или внутренних органов; 3) предраковые заболевания кожи и внутренних органов; 4) соматические заболевания в стадии декомпенсации; 5) инфекционные заболевания, в т.ч. туберкулез; 6) субфебрилитет любой этиологии; 7) беременность. В каждом случае диагноз атопического дерматита устанавливался на основании жалоб пациента, анамнеза заболевания, клинической картины и результатов лабораторных исследований. Формулировка диагноза осуществлялась на основании рекомендаций ВОЗ, Международной классификации болезней 10–го пересмотра (раздел № 20), введенной в действие на территории Российской Федерации с 01.01.99 (приказ МЗ РФ от 27 мая 1997 №170), Российского национального согласительного документа по атопическому дерматиту с учетом возрастного периода, распространенности патологического процесса и его степени тяжести. Больным проводили общеклиническое обследование, включавшее: осмотр, физикальное исследование, общий анализ крови, биохимический анализ крови, общий анализ мочи. Для исключения противопоказаний для проведения ультрафиолетовой терапии каждый из пациентов, включенных в исследование, был консультирован терапевтом, эндокринологом и окулистом, женщины - дополнительно гинекологом 6 Все больные АтД были разделены на две группы: основную и группу сравнения. Основную группу составили 62 больных АтД, получавшие лечение ультрафиолетовым излучением УФА-1 диапазона с длиной волны 350-400 нм. С учетом возможностей используемой аппаратуры в работе проведено исследование эффективности дальнего длинноволнового ультрафиолетового излучения в диапазоне 350-400 нм. Процедуры проводили с использованием ультрафиолетовой кабины «Waldmann UV-7001К» (Herbert Waldmann GmbH & Co, Германия), с лампами F85/100W-TL10R, которые генерируют излучение длиной волны 350-400 нм с максимумом эмиссии при длине волны 370 нм. Помимо УФА-1 терапии, по показаниям назначали медикаментозное лечение: антигистаминные препараты, стабилизаторы мембран тучных клеток, - наружно - кортикостероидные препараты (на ограниченные участки кожи площадью не более 9%), кремы и пасты, содержащие нафталан, ихтиол, увлажняющие и смягчающие средства. В группу сравнения были включены 19 больных АтД в возрасте от 21 до 56 лет, которым проводилась медикаментозная терапия: антигистаминные препараты, инфузии 0,9% раствора натрия хлорида, реамберина, инъекции 30% раствора натрия тиосульфата. Для купирования обострения заболевания 4 больным (21,1%) применяли системные кортикостероидные препараты в инъекционной форме: дипроспан 1 мл в/м однократно или преднизолон 30-90 мг в/в 2-3 инъекции с последующей отменой. Двенадцати больным (63,2%) проведено 4-6 процедур фильтрационного плазмафереза. Наружная терапия включала топические глюкокортикостероидные препараты, кремы и пасты, содержащие нафталан, ихтиол, увлажняющие смягчающие кремы. Оценку тяжести АтД проводили с использованием индекса SCORAD (Scoring of Atopic Dermatitis – количественная оценка атопического дерматита). Для его расчета определяли площадь поражения кожного покрова, интенсивность кожного процесса и субъективные симптомы (нарушение сна и выраженность зуда). Площадь поражения кожного покрова оценивали в баллах, используя правило «девятки» или правило «ладони». Интенсивность кожного процесса определяли, оценив следующие 6 клинических симптомов: эритему, отек/папулезные элементы, корки/мокнутие, экскориации, лихенификацию, сухость кожи. Каждый из перечисленных признаков оценивался визуально и пальпаторно на участке кожи, где он был наиболее выражен, по 4-х балльной шкале: 0 баллов - симптом отсутствует, 1 – симптом слабо выражен, 2 – симптом выражен умеренно, 3 – симптом резко выражен. Оценку сухости кожи проводили на участках непораженной кожи. Полученные баллы суммировали. Таким образом, интенсивность кожного процесса могла варьировать от 0 до 18 баллов. Оценка таких признаков, как нарушение сна и выраженность зуда кожи, проводилась пациентом субъективно после предварительного подробного объяснения врача. Пациенту предлагали оценить выраженность кожного зуда и нарушения сна за последние трое суток. Для каждого исследуемого признака использовалась шкала с делениями от 0 до 10. Ноль баллов соответствовало 7 критерию «отсутствия признака», а 10 баллов – «максимальной степени выраженности признака». Пациент указывал на шкале точку, соответствующую степени выраженности каждого признака. Полученные результаты суммировали. Таким образом, указанные выше субъективные признаки могли быть оценены в баллах от 0 до 20. Расчет индекса SCORAD проводили по следующей формуле: A B +7 + C, 5 2 где А – площадь поражения кожи в процентах; В – сумма балов интенсивности клинических проявлений АтД; С – сумма баллов субъективно оцениваемых признаков АтД. Значение индекса SCORAD могло варьировать от 0 до 103. Числовое значение индекса SCORAD, равнявшееся менее 15, соответствовало легкой степени тяжести клинических проявлений АтД, от 15 до 40 – средней степени тяжести заболевания. При значении индекса SCORAD более 40 степень тяжести клинических проявлений дерматоза считали тяжелой. Определение индекса SCORAD проводили до назначения лечения и после его окончания. Основным показателем, по которому оценивалась клиническая эффективность дальней длинноволновой ультрафиолетовой терапии, являлась динамика индекса SCORAD после проведенного курса лечения. Снижение индекса SCORAD после лечения на 80% и более, по сравнению с исходной величиной, рассматривали как клиническое выздоровление, на 30-80% - как улучшение. Отсутствие эффекта от проводимой терапии констатировали при снижении индекса SCORAD менее, чем на 30%. У 15 больных АтД (8 мужчин и 7 женщин), получавших лечение ультрафиолетовым излучением УФА-1 диапазона, проведены цитофлуометрические исследования основных субпопуляций лимфоцитов в периферической крови и иммуногистохимические исследования количества CD4+ и CD8+ лимфоцитов, а также γ-интерферона (γ-ИФН) в пораженной коже. Возраст обследуемых больных варьировал от 19 до 34 лет. В периферической крови больных до и после терапии исследовано содержание Т-лимфоцитов (CD3+CD19-), В-лимфоцитов (CD3-CD19+), Тхелперов (CD3+CD4+), цитотоксических Т-лимфоцитов (CD3+CD8+), Тлимфоцитов с функцией натуральных киллеров (CD3+CD16+/56+), натуральных киллеров (CD3-CD16+/56+), Т-активированных лимфоцитов (CD3+HLA-DR+). Группу сравнения составили 16 здоровых добровольцев, сопоставимых по полу и возрасту с обследуемой группой. Кровь для исследования забирали в утренние часы (между 9 и 10 часами) из периферической вены в области локтевой ямки, в количестве 2 мл самотеком в пробирку с этилендиаминтетрауксусной кислотой (ЭДТА). Полученные образцы крови хранили при комнатной температуре и подвергали дальнейшему анализу не позднее, чем через 3 часа от момента забора крови. Индекс SCORAD = 8 Обработку образцов проводили согласно протоколу, рекомендованному фирмой Beckman Coulter (США), с использованием следующих типов моноклональных антител: CD45/14, IgG1-FITC/IgG-PE, CD3/CD19, CD3/CD4, CD3/CD8, CD3/HLA-DR, CD3/CD(16+56). В ходе работы проводили подсчет абсолютного (количество клеток в 1 микролитре) и относительного (процентное содержание) количества изучаемых субпопуляций лимфоцитов и их соотношений. Для иммуногистохимического исследования забор биоптатов кожи у больных до лечения проводили из эритематозно-сквамозных очагов поражения, после завершения лечения – из участков кожи, располагавшихся рядом с местом предыдущей биопсии. В качестве контроля использовали биоптаты кожи, полученные от 7 здоровых лиц, не имевших признаков заболевания кожи. Пол и возраст наблюдаемых пациентов и лиц контрольной группы статически не различались. Полученные биоптаты кожи фиксировали в 10% растворе формалина, заливали в парафиновые блоки, из которых изготавливали срезы, толщиной 5 мкм. Срезы растягивали на предметных стеклах с полилизиновым покрытием. Для проведения иммуногистохимической реакции срезы кожи инкубировали при комнатной температуре с моноклональными антителами СD4, CD8 (Novocastra Lab. LTD, Великобритания), готовыми к употреблению, и антителами γ-ИФН (Abbiotec LLC, США) в рабочем разведении 1:200 согласно протоколам, прилагаемым к используемым антителам. Для визуализации иммуногистохимической реакции использовали стрептавидинбиотиновую систему («Novocastra» RTU, Novocastra Lab. LTD, Великобритания). Препараты докрашивали гематоксилином и заключали под покровное стекло. Изучение полученных препаратов проводили в световом микроскопе «Leica DM 4000B», для документирования результатов исследования использовали цифровую камеру «Leica DFC 320». В эпидермисе количество CD4+ и CD8+ лимфоцитов определяли из расчета на 100 клеток базального слоя, оценку уровня экспрессии γ-ИФН осуществляли по наличию или отсутствию положительно окрашенных клеток. В дерме подсчет количества CD4+ и CD8+ лимфоцитов, а также γ-ИФН+ клеток в очагах поражения проводили в 5 полях зрения, равных по площади 0,3 мм2. Затем для каждого препарата рассчитывали средние значения абсолютного содержания клеток. По всем показателям рассчитывали разность между значениями до и после окончания лечения, которую обозначали греческой буквой «дельта» (Δ). Статистический анализ. При статическом анализе использовали пакеты статистических программ «Microsoft Excel» (версия 2000 г.), «Sigma Stat» (версия 3.1) и «Statistica 5.0». Для параметрического анализа использовали парный и непарный t-критерий Стьюдента. Анализ динамики показателей в группах после лечения выявляли с помощью парного непараметрического метода Уилкоксона. Для оценки достоверности межгрупповых различий применяли непарный непараметрический метод анализа Манн-Уитни. Различия по частоте встречаемости признака между группами больных определяли при 9 помощи метода χ2 либо точного критерия Фишера. Корреляционный анализ проводили с применением критерия Спирмена. Данные представляли при нормальном распределении в виде «среднее значение ± стандартное отклонение», при ненормальном распределении в виде «медиана [25, 75 процентили]». Различия считали достоверными при р<0,05. Результаты исследования Изучение эффективности применения ультрафиолетового излучения УФА-1 диапазона с длиной волны 350-400 нм у больных АтД среднетяжелого и тяжелого течения. Среднее значение индекса SCORAD в основной группе до начала лечения составило 71,3±11,2 (минимальное значение 44,1, максимальное – 93,4), в группе сравнения - 65,6±14,2 (минимальное значение - 40,3, максимальное – 92,4) (табл. 1). Процедуры дальней длинноволновой ультрафиолетовой терапии проводили 4-5 раз в неделю. Облучение начинали с разовой дозы 5-10 Дж/см2 с учетом фототипа кожи, степени загара и индивидуальной чувствительности больного к ультрафиолетовому свету. При каждой последующей процедуре дозу облучения увеличивали на 5-10 Дж/см2. Максимальная разовая доза облучения равнялась 20-40 Дж/см2. Таблица 1 Клиническая характеристика больных атопическим дерматитом Клинический показатель Основная группа Группа сравнения р (n=62) (n=19) Пол, муж/жен 28/34 8/11 0,098 Возраст, лет (Ме [Q1;Q3]) 25 [22;31] 29 [25,3;35,6] 0,074 Индекс SCORAD (M±sd) 71,3±11,2 65,6±14,2 0,072 Количество процедур, проведенных на курс лечения, варьировало от 11 до 28. Среднее значение данного показателя составило 18,9±4,4 процедур. Средняя курсовая доза ультрафиолетового излучения равнялась 395,7±125,3 Дж/см2 (минимальное и максимальное значения - 155 и 670 Дж/см2), медиана 390 [312,5; 466,25] Дж/см2. В основной группе после завершения курса УФА-1 полный или частичный регресс кожных проявлений АтД наблюдали терапии у 59 из 62 больных (95,2%). Клиническое выздоровление было достигнуто у 31 больных (50,0%), улучшение – у 28 больных (45,2%). У 3 пациентов (4,8%) эффект от проводимого лечения отсутствовал. Среднее значение индекса SCORAD снизилось в результате УФА-1 терапии с 71,3±11,2 до 16,4±9,9 (в 4,3 раза, по сравнению с исходным, р<0,001; рис. 1). В группе сравнения, получавшей медикаментозное лечение, клиническое выздоровление зарегистрировано у 1 больного (5,3%), улучшение – у 18 10 (94,7%). Индекс SCORAD снизился в процессе лечения с 65,6±14,2 до 28,2±11,4 (в 2,3 раза, по сравнению с исходным значением, р<0,001). При сравнении исследуемых групп после лечения процент снижения индекса SCORAD оказался статически достоверно ниже в основной группе больных, получавших УФА-1 терапию (73±21,3%), чем в группе сравнения (60,5±14,4%; р<0,001). p<0,001 p<0,001 Рис.1 Средние значения индекса SCORAD у пациентов с атопическим дерматитом до начала лечения и после его окончания в основной группе и в группе сравнения. Больные основной группы в зависимости от тяжести заболевания были разделены на две подгруппы: со среднетяжелым и тяжелым течением АтД. Подгруппа больных со среднетяжелым течением АтД состояла из 32 человек (11 мужчин и 21 женщина). Индекс SCORAD до начала курса УФА-1 терапии, в среднем, был равен 65,5±10,8. Подгруппа больных с тяжелым течением АтД включала 30 человек (17 мужчин и 13 женщин). Индекс SCORAD до начала курса УФА-1 терапии в данной подгруппе составил в среднем 77,6±8,2. После завершения курса УФА-1 терапии индекс SCORAD у больных со среднетяжелым течением АтД статистически достоверно снизился (в 4,8 раза,) и составил 13,6±8,1 (до лечения - 65,5±10,8), а у больных с тяжелым течением заболевания - в 3,9 раза и равнялся 19,8±11,0 (до лечения - 77,6±8,2, рис. 2). 11 В основной группе пациенты с положительным терапевтическим эффектом (59 из 62 больных, включенных в исследование) были распределены на две подгруппы в зависимости от величины изменения индекса SCORAD после проведенного лечения. Подгруппу улучшения (1 подгруппа) составили больные (28 человек), у которых после курса УФА-1 терапии наблюдали клиническое улучшение течения заболевания, т.е. индекс SCORAD снизился от 30 до 80% от исходной величины и его значения были выше 16. р<0,001 p<0,001 Рис. 2. Средние значения индекса SCORAD у пациентов со среднетяжелым и тяжелым течением атопического дерматита до начала лечения и после его окончания. В подгруппу клинического выздоровления (2 подгруппа) вошёл 31 пациент, у которых после лечения наблюдали клиническое выздоровление, т.е. индекс SCORAD снизился на 80% и более от исходной величины и его значения были ниже 16. p<0,001 p<0,001 12 Рис. 3. Динамика средних значений индекса SCORAD у пациентов с атопическим дерматитом в зависимости от эффективности УФА-1 терапии. Пациенты подгрупп улучшения и клинического выздоровления были сопоставимы по полу, возрасту, длительности заболевания, исходным значениям индекса SCORAD, количеству проведенных сеансов и величинам максимальной и кумулятивной доз УФА-1 терапии. После проведенного лечения как в подгруппе клинического выздоровления (с 70,8±11,1 до 9,4±3,5), так и в подгруппе улучшения (с 71,3±11,9 до 24,2±8,9)наблюдали снижение индекса SCORAD соответственно в 7,5 и 2,9 раза (р<0,001; рис. 3). В ходе проведения настоящего исследования ни у одного из пациентов не было зарегистрировано серьёзных побочных эффектов (в том числе, эритемы и пузырей), возникновение которых потребовало бы отмены УФА-1 терапии. Среди побочных эффектов у 23 больных (38,3%) наблюдали усиление сухости кожи, которое корригировали более частым использованием смягчающих и увлажняющих средств. Отдаленные результаты лечения оценены через 1 год после окончания курса УФА-1 терапии у 28 больных. До лечения длительность ремиссий у данной группы больных, в среднем, составляла 5,1±2,8 недель, после курса УФА-1 терапии она возрастала до 26,7±18,2 недель (р<0,001). Изучение иммунологических показателей в периферической крови больных до и после терапии с применением ультрафиолетового излучения длиной волны 350-400 нм. До лечения у больных АтД, в отличие от здоровых добровольцев, обнаружено статистически достоверное увеличение относительных величин Влимфоцитов (CD3-CD19+) и Т-хелперов (CD3+CD4+), а также снижение процентного содержания натуральных киллеров (CD3-CD16+/56+) и Т13 лимфоцитов с функцией естественных киллеров (CD3+CD16+/56+) (табл. 2). Различий в соотношении Т-хелперов к цитотоксическим Т-лимфоцитам в группах больных и здоровых лиц не установлено (2,0±0,5 и 1,6±0,6, соответственно, р=0,099). При изучении абсолютных величин показателей клеточного иммунитета у больных АтД выявлено статически достоверное уменьшение содержания Тлимфоцитов с функцией естественных киллеров (CD3+CD16+/56+) и натуральных киллеров (CD3-CD16+/56+), по сравнению с аналогичными показателями у здоровых добровольцев. Под действием лечения в периферической крови больных выявлено статически достоверное снижение относительного количества В-лимфоцитов (CD3-CD19+). Другие изучаемые показатели динамике не подвергались (табл. 3). Среди 15 пациентов АтД, у которых был произведен забор крови для изучения субпопуляций лимфоцитов в периферической крови, после проведенного курса лечения с применением УФА-1 излучения у 7 человек наблюдалось клиническое улучшение, у 8 – клиническое выздоровление. При сравнении показателей клеточного иммунитета у больных в подгруппах клинического выздоровления и клинического улучшения статистически достоверных различий как до начала терапии, так и после ее завершения не было обнаружено. Таблица 2 Показатели клеточного иммунитета в периферической крови больных атопическим дерматитом и здоровых добровольцев (M±sd) Субпопуляция лимфоцитов B-лимфоциты (CD3-CD19+) T-лимфоциты (CD3+CD19-) T-хелперы (CD3+CD4+) Цитотоксические T-лимфоциты (CD3+CD8+) T-лимфоциты с функцией естественных киллеров (CD3+CD16+/56+) Активированные T-лимфоциты (CD3+HLA-DR+) Натуральные киллеры Относительные величины, % Больные Контрольр1 АтД ная группа (n=15) (n=16) Абсолютные величины, клеток/мкл Больные АтД Контрольр2 (n=15) ная группа (n=16) 12,8±2,9 10,1±3,7 0,033* 221,6±76,9 191,6±103,5 0,37 76,8±6,9 72,4±12,4 0,231 1326,8±337,6 1308,3±465,8 0,90 50,0±5,0 45,0±6,3 0,02* 861,3±216,4 824,5±289,4 0,70 25,6±5,6 29,3±6,0 0,19 455,6±148,1 508,1±177,9 0,38 3,8±1,5 6,7±4,2 0,017* 63,6±26,3 115,7±70,0 0,011* 6,7±3,6 4,8±2,3 0,098 - - - 7,5±4,3 12,6±4,2 0,002* 125,6±78,0 237,2±124,1 0,006* 14 (CD3-CD16+/56+) Примечание. * - различия статистически достоверны. Изучение динамики содержания CD4+ лимфоцитов, CD8+ лимфоцитов и экспрессии γ-интерферона в биоптатах кожи больных атопическим дерматитом под влиянием терапии с применением ультрафиолетового излучения длиной волны 350-400 нм. В эпидермисе здоровых лиц CD4+ и CD8+ лимфоциты отсутствовали, реакция с моноклональными антителами к γ-ИФН была отрицательной. В дерме выявляли единичные в поле зрения Т-хелперы и цитотоксические Тлимфоциты, между коллагеновыми волокнами обнаруживали единичные γИФН+ клетки. В эпидермисе больных АтД до лечения выявляли единичные CD4+ и CD8+ лимфоциты. При иммунофенотипировании с моноклональными антителами к γ-ИФН наблюдалась положительная реакция в базальном, шиповидном и зернистом слоях. В роговом слое реакция была отрицательной. В дерме больных CD4+ и CD8+ лимфоциты, а также γ-ИФН+ клетки располагались периваскулярно и в воспалительных инфильтратах. Таблица 3 Показатели клеточного иммунитета в периферической крови больных атопическим дерматитом до и после терапии (M±sd) Субпопуляция лимфоцитов B-лимфоциты (CD3-CD19+) T-лимфоциты (CD3+CD19-) T-хелперы (CD3+CD4+) Цитотоксические T-лимфоциты (CD3+CD8+) T-лимфоциты с функцией естественных киллеров (CD3+CD16+/56+) Активированные T-лимфоциты (CD3+HLA-DR+) Натуральные киллеры (CD3-CD16+/56+) Относительные величины, % До лечения После р1 лечения Абсолютные величины, клеток/мкл До лечения После р2 лечения 12,7±2,9 10,7±3,6 0,046* 76,8±6,9 75,6±15,1 0,77 1326,8±337,6 1415,7±407,5 0,36 50,0±5,0 49,7±7,0 0,80 861,3±216,4 930,2±224,8 0,35 26,5±5,6 26,8±6,3 0,89 455,6±148,1 501,7±153,3 0,14 3,8±1,5 4,9±3,0 0,094 63,6±26,3 90,1±64,4 0,10 6,7±3,6 7,4±3,8 0,42 - - - 7,5±4,3 6,6±3,9 0,31 125,6±78,0 116,9±60,9 0,54 221,6±76,9 Примечание. * - различия статистически достоверны. 15 220,9±90,4 0,46 Статистический анализ выявил достоверное увеличение количества CD4+ лимфоцитов в дерме больных АтД, по сравнению с контрольной группой (23 [13,4;32,7] и 3,2 [1,9;4,1] соответственно; р<0,001), а также γ-ИФН+ клеток (25 [20,5;41,1] и 0 [0;0,2] соответственно; р<0,001). Различия содержания CD8+ лимфоцитов в дерме больных и здоровых лиц были недостоверны (7,8 [3,6;13,7] против 4 [3,7;4,7] соответственно; р=0,084, рис. 4). После проведенного лечения в эпидермисе больных сохранялись единичные CD4+, CD8+ и γ-ИФН+ клетки. У 8 пациентов положительная реакция на γ-ИФН сохранялась в кератиноцитах верхних рядов шиповатого и зернистого слоев. В базальном и нижних рядах шиповатого слоя эпидермиса у этих больных γ-ИФН в кератиноцитах не выявлялся. В дерме после лечения сохранялись положительно окрашенные CD4+ и CD8+ лимфоциты, а также γИФН+ клетки, которые располагались как периваскулярно, так и в составе инфильтратов. При сравнении показателей до и после лечения в целом по группе обследованных больных (n=15) статистически достоверных изменений содержания в дерме CD4+ лимфоцитов, CD8+ лимфоцитов, а также γ-ИФН+ клеток не выявлено. Вместе с тем, при корреляционном анализе установлена прямая корреляционная связь (r=0,54, p=0,039) между уменьшением количества CD4+ лимфоцитов - Т-хелперов (ΔТх) в коже и величины индекса SCORAD (ΔSCORAD). р<0,001 р<0,001 Рис. 4. Содержание CD4+ и CD8+ лимфоцитов, а также γ-ИФН+ клеток в дерме больных атопическим дерматитом и здоровых добровольцев (Me [Q1;Q3]). Среди 15 пациентов АтД, у которых был произведен забор биоптатов кожи для иммуногистохимического исследования, после проведенного курса лечения с применением УФА-1 излучения у 7 человек наблюдалось клиническое улучшение, у 8 – клиническое выздоровление. 16 При анализе результатов иммуногистохимических исследований у больных подгрупп клинического выздоровления и улучшения в биоптатах, взятых до лечения, различий по количеству CD4+, CD8+, γ-ИФН+ клеток не установлено. После курса лечения в подгруппе клинического выздоровления выявлено статически значимое снижение содержания CD4+лимфоцитов в дерме (с 23,2 [15,3;36,0] до 19,0 [6,2;20,3]; р=0,009). Количество CD8+ лимфоцитов, также как и количество γ-ИФН+ клеток, после проведенного лечения достоверно не изменялось. В подгруппе клинического улучшения после лечения статистически значимой динамики изучаемых иммуногистохимических показателей не обнаружено. Кроме того, установлено, что после курса лечения в биоптатах пациентов, у которых наблюдали клиническое выздоровление, количество γ-ИФН+ клеток оказалось статистически достоверно меньше (в 1,8 раза), чем в подгруппе больных с улучшением (соответственно 20,9 [18,6;27,0] и 37,3 [33,7;51,5]; р=0,004). В биоптатах этих пациентов после терапии выявлено также более низкое, чем в подгруппе улучшения, содержание CD4+ лимфоцитов (соответственно 19,0 [6,2; 20,3] и 23,0 [18,7; 41,5]. Однако различия были статистически не значимыми (р=0,052). Количество CD8+ лимфоцитов в подгруппах клинического выздоровления (9,5 [6,9;11,8]) и улучшения (12,2 [10,1; 13,4]) статически достоверно не различалось. ВЫВОДЫ 1. Терапия низкими (5-20 Дж/см2) и средними (30-40 Дж/см2) дозами ультрафиолетового излучения УФА-1 диапазона с длиной волны 350-400 нм является эффективным методом лечения больных атопическим дерматитом среднетяжелого и тяжелого течения. Положительный терапевтический эффект наблюдается у 95,2% пациентов (клиническое выздоровление - у 50,0%, улучшение - у 45,2%). В результате лечения тяжесть кожного процесса (при оценке индекса SCORAD) уменьшается, в среднем, в 4,3 раза (р<0,001), а продолжительность ремиссии возрастает в 5,2 раза (р<0,001), по сравнению с исходными величинами. 2. Эффективность терапии больных атопическим дерматитом с применением ультрафиолетового излучения длиной волны 350-400 нм превосходит эффективность лечения медикаментозными средствами (уровень различий по проценту снижения индекса SCORAD р<0,001). Особенностью метода УФА-1 терапии является отсутствие серьезных побочных эффектов, свидетельствующее о его хорошей переносимости. 3. Терапия ультрафиолетовым излучением длиной волны 350-400 нм не вызывает изменений показателей клеточного иммунитета в периферической крови больных, за исключением уменьшения относительного количества В-лимфоцитов. У пациентов, достигших в процессе лечения клинического выздоровления, данный вид лечения приводит к существенному снижению содержания Т-хелперов (CD4+ лимфоцитов) в очагах поражения (р=0,009), что свидетельствует об 17 иммуносупрессивном действии УФА-1 излучения на кожноассоциированные Т-лимфоциты. Установлена прямая корреляционная связь (r=0,54, p=0,039)между уменьшением количества Т-хелперов (ΔТх) в коже и величины индекса SCORAD (ΔSCORAD). 4. В пораженной коже больных атопическим дерматитом в отличие от здоровых добровольцев регистрируется достоверное увеличение экспрессии γ-интерферона в дерме, указывающее на наличие хронического иммунного воспаления. В процессе лечения у больных с клиническим выздоровлением выявляется более выраженная положительная динамика содержания γ-ИФН+ клеток в коже (р=0,004), по сравнению с пациентами, достигшими улучшения кожного процесса, что свидетельствует об участии данного цитокина в механизмах действия УФА-1 излучения. 1. ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ Терапия ультрафиолетовым излучением УФА-1 диапазона с длиной волны 350-400 нм показана больным атопическим дерматитом среднетяжелого и тяжелого течения. 2. Рекомендуемая начальная доза облучения составляет 5-10 Дж/см2. Разовую дозу увеличивают при каждой последующей процедуре на 5-10 Дж/см2 до максимального значения 20-40 Дж/см2. 3. На курс лечения назначают 15-30 процедур с режимом облучений 4-5 раз в неделю. Количество процедур определяется для каждого пациента индивидуально с учетом динамики клинических проявлений заболевания. СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Авдиенко И.Н. Эффективность дальней длинноволновой ультрафиолетовой терапии у больных атопическим дерматитом/ И.Н. Авдиенко, А.А. Кубанов// Вестник дерматологии и венерологии. – 2009. №3. – С. 61-63. 2. Авдиенко И.Н. Применение дальнего длинноволнового ультрафиолетового излучения у больных атопическим дерматитом/ И.Н. Авдиенко, А.А. Кубанов// Тезисы научных работ II Всероссийского конгресса дерматовенерологов. – Санкт-Петербург, 2007. – С. 31. 3. Авдиенко И.Н. Эффективность применения ультрафиолетового излучения УФА-1 диапазона (320-400 нм) у больных атопическим 18 дерматитом/ И.Н. Авдиенко, А.А. Кубанов// Тезисы научных работ III Всероссийского конгресса дерматовенерологов. – Казань, 2009. – С. 28. 4. Авдиенко И.Н. Влияние дальней длинноволновой ультрафиолетовой терапии на динамику показателей клеточного иммунитета периферической крови больных атопическим дерматитом до и после лечения/ И.Н. Авдиенко, А.А. Кубанов// Тезисы научных работ III Всероссийского конгресса дерматовенерологов. – Казань, 2009. – С. 28. 5. Кубанова А.А. Интегральный подход к наружной терапии атопического дерматита/ А.А. Кубанова, Д.В. Прошутинская, Л.В. Текучева, И.Н. Авдиенко// Вестник дерматологии и венерологии. – 2010.-№1. – С. 20-26. 6. Авдиенко И.Н. Влияние низких и средних доз ультрафиолетового излучения УФА-1 диапазона длиной волны 350-400 нм на показатели иммунного воспаления в коже больных атопическим дерматитом/ И.Н. Авдиенко, А.А. Кубанов// Вестник дерматологии и венерологии. – 2011.№1. – С.48-56. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ АтД атопический дерматит γ-ИФН гамма-интерферон Т-х1 лимфоциты Т-хелперы 1 типа Т-х2 лимфоциты Т-хелперы 2 типа УФА-1 ультрафиолетовое излучение дальнего длинноволнового диапазона с длиной волны 340-400 нм CD4+ лимфоциты Т-хелперы CD8+ лимфоциты цитотоксические Т-лимфоциты SCORAD Scoring of Atopic Dermatitis ΔSCORAD разность между значениями индекса SCORAD до и после окончания лечения ΔТх разность между количеством Т-хелперов до и после окончания лечения 19