ИЗУЧЕНИЕ АНТИМИКОБАКТЕРИАЛЬНОГО ДЕЙСТВИЯ КОМПЛЕКСА ПРИРОДНЫХ ЦИТОКИНОВ И ПРОТИВОМИКРОБНЫХ ПЕПТИДОВ.
advertisement
1 На правах рукописи Гвоздева Юлия Викторовна ИЗУЧЕНИЕ АНТИМИКОБАКТЕРИАЛЬНОГО ДЕЙСТВИЯ КОМПЛЕКСА ПРИРОДНЫХ ЦИТОКИНОВ И ПРОТИВОМИКРОБНЫХ ПЕПТИДОВ. 14.03.09. – клиническая иммунология, аллергология Автореферат на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва 2010 2 Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Российский Государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию». Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор Леонид Васильевич Ковальчук Научный консультант: доктор биологических наук, профессор Лариса Николаевна Черноусова Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор доктор медицинских наук, профессор Иван Генрихович Козлов Михаил Александрович Владимирский Ведущая организация: Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова Российской академии медицинских наук. Защита диссертации состоится «25» октября 2010 года в 14.00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.072.05 при ГОУ ВПО РГМУ Росздрава по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д.1. С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГОУ ВПО РГМУ Росздрава по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д.1. Автореферат разослан «24» сентября 2010г. Ученый секретарь диссертационного совета кандидат медицинских наук, доцент Т.Е. Кузнецова. 3 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ. Актуальность исследования. В настоящее время туберкулез приобретает все большее значение среди инфекционных заболеваний, приводящих к летальному исходу, что во многом связано с увеличением лекарственно устойчивых штаммов. Туберкулез вызывают патогенные бактерии Mycobacterium tuberculosis при определенных условиях, и прежде всего, при снижении эффективности функционирования иммунной системы. M.tuberculosis как внутриклеточные патогены, способны выживать и размножаться в фаголизосомах макрофагов, уклоняясь от защитных иммунных механизмов. Развитие устойчивости микобактерий туберкулеза к основным противотуберкулезным препаратам является острой проблемой, диктующей необходимость разработки новых подходов к лечению туберкулеза, заключающихся как в прямом воздействии на возбудителя, так и опосредованном, через активацию внутриклеточных механизмов подавления микобактерий туберкулеза. В последние годы большое внимание уделяют роли противомикробных пептидов (ПМП) в реакциях врожденного иммунитета. Известно, что ПМП служат первичной защитой от патогенов. В литературе описано более 1000 таких пептидов [Кокряков В.Н., 2007, Brogden K.A., 2005]. Они включают в себя молекулы многих тканей и клеток позвоночных, беспозвоночных растений и грибов. У млекопитающих охарактеризованы такие ПМП, как дефенсины, кателицидины и другие. Особое место среди кателицидинов занимают катионные ПМП свиньи нейтрофильного происхождения – протегрины. Протегрины впервые были открыты отечественными учеными во главе с Кокряковым В.Н [Кокряков В.Н., 1999]. ПМП вызывают прямое ингибирование метаболических процессов и нарушение целостности клеточной мембраны [Brogden K.A., 2005]. В работах зарубежных исследователей продемонстрировано антимикобактериальное действие ПМП. Роберт Лерер показал угнетение роста M.tuberculosis при воздействии ПМП (дефенсинов, выделенных из нейтрофилов человека и 4 кролика, и протегринов свиньи) [R. I. Lehrer, Miyakawa Y., 2009]. Другие ученые исследовали прямое действия α–дефенсина человека (HNP–1) на M.tuberculosis H37Rv и опосредованное в культуре зараженных макрофагов крысы. Результаты выявили бактерицидное действие в отношении M.tuberculosis [Sharma S., I. Verma, G.K. Khuller, 2000]. В связи с этим антимикобактериальное нам действие представлялось комплекса важным природных изучить цитокинов и противомикробных пептидов (препарат суперлимф). Препарат суперлимф (молекулярная масса до 35 кД) представляет собой комплекс природных цитокинов: интерлейкинов (ИЛ–1, ИЛ–2, ИЛ–6), фактора некроза опухоли α (ФНО–α), фактора, ингибирующего миграцию макрофагов (МИФ), трансформирующего фактора роста (ТФРβ). Наряду с цитокинами, в низкомолекулярной фракции суперлимфа идентифицированы пептиды, подобные катионным противомикробным пептидам – протегринам. В экспериментах in vitro было показано прямое антибактериальное действие суперлимфа в отношении Staphylococcus аureus, Escherichia coli, Streptococcus pyogenes [Ковальчук Л.В., Ганковская Л.В., Мороз А.Ф. и др., 2004],[Ковальчук Л.В., Ганковская Л.В., Аведова Т.А. и др., 2006], а также противовирусное действие в отношении вируса простого герпеса [Ковальчук Л.В., Лавров В.Ф., Ганковская Л.В. и др., 2005]. Цель исследования. Изучение действия комплекса природных цитокинов и противомикробных пептидов (препарат суперлимф) на M.tuberculosis и на макрофаги, инфицированные M.tuberculosis. Задачи исследования. 1. Выбор модели для изучения активности комплекса природных цитокинов и противомикробных пептидов. 2. Изучение действия комплекса природных цитокинов и противомикробных пептидов на рост штаммов M.tuberculosis с различной чувствительностью к противотуберкулезным препаратам в модели in vitro. 5 3. Оценка in vitro цитотоксического действия комплекса природных цитокинов и противомикробных пептидов на интактные макрофаги мыши. 4. Изучение влияния комплекса природных цитокинов и противомикробных пептидов на рост M.tuberculosis H37Rv, фагоцитированных макрофагами, в модели ex vivo. 5. Изучение влияния комплекса природных цитокинов и противомикробных пептидов на рост лекарственно-устойчивых M.tuberculosis, фагоцитированных макрофагами, в модели ex vivo. 6. Оценка протективной активности комплекса природных цитокинов и противомикробных пептидов в отношении макрофагов, инфицированных M.tuberculosis ex vivo. Научная новизна. В работе впервые в одной модели проведено изучение влияния комплекса природных цитокинов и противомикробных пептидов (препарат суперлимф) на рост M.tuberculosis с различной чувствительностью к противотуберкулезным препаратам и на макрофаги, инфицированные M.tuberculosis. Впервые показано ингибирующее действие препарата суперлимф на рост in vitro лабораторного вирулентного штамма M.tuberculosis H37Rv. Впервые выявлено, что обработка макрофагов суперлимфом до инфицирования микобактериями туберкулеза, приводит к снижению роста чувствительного штамма M.tuberculosis H37Rv и штамма M.tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью, фагоцитированных макрофагами, а также уменьшает цитопатогенный эффект, оказываемый ими на макрофаги. Действие КПЦ и ПМП на микобактерии туберкулеза опосредуется двумя путями. Прямой антимикобактериальный эффект обусловлен низкомолекулярной фракцией, содержащей протегрин–подобные пептиды. Основой другого механизма является регуляция функции макрофагов, фагоцитировавших микобактерии туберкулеза. В этом случае бактерицидная активность фагоцитов стимулируется цитокинами, что приводит к усилению 6 выработки ими активных форм кислорода и азота, продукции аутологичных цитокинов, способствуя, таким образом, разрушению патогенов. Полученные результаты расширяют представления о механизмах врожденного иммунного ответа на микобактерии туберкулеза. Что может служить основой для разработки новых методов иммунокоррекции на основе противомикробных пептидов и цитокинов. Практическая значимость. Практическая значимость работы определяется важностью поиска новых лекарственных средств на основе биотехнологических продуктов для лечения туберкулезной инфекции. Изучение влияния КПЦ и ПМП на модели макрофагов, инфицированных микобактериями туберкулеза, позволит лучше понять механизмы протективного иммунного ответа на возбудителя болезни. Полученные данные об антимикобактериальном эффекте препарата суперлимф обосновывают клиническую перспективность этого лекарственного средства. Положения, выносимые на защиту. 1. Сочетание экспериментов in vitro и ex vivo позволяет оценить активность препарата не только в отношении возбудителя туберкулеза, но и определить действие, оказываемое им на эффекторные клетки, играющие центральную роль в противотуберкулезной защите. 2. Комплекс природных цитокинов и противомикробных пептидов при воздействии in vitro и ex vivo ингибирует рост M.tuberculosis H37Rv. Степень угнетения роста зависит от дозы препарата. Максимальный эффект оказывает препарат в концентрации 5 мкг/мл. 3. На рост штамма M.tuberculosis с МЛУ комплекс природных цитокинов и противомикробных пептидов оказывает ингибирующее влияние только на микобактерии, фагоцитированные макрофагами в модели ex vivo. 4. Комплекс природных цитокинов и противомикробных пептидов не оказывает цитотоксического действия на интактные МФ и проявляет протективный эффект в отношении МФ, инфицированных M.tuberculosis, снижая цитопатогенный эффект микобактерий на МФ. 7 5. Антимикобактериальная активность МФ повышается при предварительной 24–часовой инкубации (до инфицирования) с комплексом природных цитокинов и противомикробных пептидов, что подтверждается снижением подавляющей рост концентрации препарата до 1 мкг/мл в отношении чувствительного штамма M.tuberculosis H37Rv и появлением ингибирующего эффекта на рост M.tuberculosis с МЛУ. Внедрение результатов исследования. Результаты исследований внедрены в учебный процесс на кафедре иммунологии ГОУ ВПО Российского Государственного медицинского университета Росздрава. Апробация работы. Диссертация апробирована на совместной научной конференции кафедры иммунологии, кафедры эндокринологии, отдела иммунологии ГОУ ВПО «РГМУ Росздрава», отдела микробиологии Центрального научно- исследовательского института туберкулеза РАМН 24 июня 2010 г. Материалы диссертационной работы докладывались на научных заседаниях кафедры иммунологии и отдела иммунологии ГОУ ВПО «РГМУ Росздрава», на заседаниях секции микробиологии и иммунологии туберкулеза Московского отделения Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2007), на 4 конгрессе Международного союза борьбы против туберкулеза и легочных болезней (Латвия, Рига, 2007), на 20 европейском конгрессе клинической микробиологии и инфекционных болезней (Австрия, Вена, 2010г.). Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ, в том числе 2 в журналах, рекомендуемых ВАК Российской Федерации. Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 100 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, 4 глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, практических рекомендаций 8 и списка литературы, включающего 11 отечественных и 124 зарубежных источников. Диссертация иллюстрирована 10 таблицами и 13 рисунками. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования. Изучение антимикобактериального действия комплекса природных цитокинов и противомикробных пептидов на рост M.tuberculosis проводили в модели in vitro (на агаризированной среде Дюбо и в жидкой питательной среде RPMI 1640) и в модели ex vivo при воздействии КПЦ и ПМП на перитонеальные макрофаги мышей. В работе использовали лабораторный вирулентный штамм M.tuberculosis H37Rv, чувствительный к противотуберкулезным препаратам и клинический штамм M.tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью CN37 из музея ЦНИИТ РАМН. Исследования выполнены на мышах инбредной линии C57Bl/6. В эксперименте использовались 60 мышей, весом 21–24 грамма, в возрасте 2–4 месяцев. Концентрацию M. tuberculosis определяли 2 методами: 1) На агаре Дюбо (Difco) при посеве 10-кратных разведений исходной суспензии культуры M. tuberculosis подсчитывали число микроколоний на 4 день культивирования. Концентрацию M.tuberculosis в суспензии выражали числом колониеобразующих единиц M. tuberculosis на 1мл среды (КОЕ/мл). 2) Методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Для определения КОЕ M.tuberculosis методом ПЦР использовали стандартную панель ДНК, соответствующую определенному количеству КОЕ M. tuberculosis (Рис.1). Макрофаги выделяли из перитонеального экссудата мышей С57BL/6 через 5-6 дней после внутрибрюшинного введения 2 мл 3% пептона. Для удаления других клеток осуществляли адгезию макрофагов на пластиковых чашках Петри и многократную отмывку оставшихся в среде клеток. Прикрепившиеся к пластику макрофаги переводили из монослоя в суспензию раствором Версена. Макрофаги предварительно инкубировали с КПЦ и ПМП в течение суток. Инфицирование макрофагов M.tuberculosis проводили в плоскодонных 96-луночных планшетах в среде RPMI 1640 (Sigma) c 5% 9 эмбриональной телячьей сывороткой без антибиотиков в термостате в атмосфере 5% СО2, в соотношении 1 МФ и 5 клеток M.tuberculosis (1 х 105 кл/мл : 5 х 105 КОЕ/мл). КПЦ и ПМП использовали в концентрациях 0,1, 1,0 и 5 мкг/мл. Рис.1. Подсчет количества КОЕ микобактерий с помощью ПЦР в режиме реального времени. А. Кинетические кривые зависимости накопления продукта амплификации от цикла амплификации. Б. Стандартная кривая для подсчета КОЕ M.tuberculosis H37Rv. 10 Оценку роста микобактерий туберкулеза проводили на 7 день с помощью ПЦР в режиме реального времени по накоплению продуктов амплификации (тест–система ДНК М.tuberculosis–M.bovis «ДНК–Технология») и выражали в десятичном логарифме числа КОЕ (lgКОЕ). ДНК выделяли с помощью набора «Проба НК» (ДНК–Технология). Амплификация и детекция результатов проводилась на термоциклере с оптическим модулем Bio-Rad IСycler IQ4. Стандартные кривые построены в зависимости накопления ПЦР–продукта от числа КОЕ M.tuberculosis с помощью программного обеспечения “Bio–Rad”. Стандартная кривая использовалась в дальнейшем для количественного определения содержания КОЕ M.tuberculosis в исследуемом образце. Цитотопатогенный эффект M.tuberculosis на макрофаги оценивали по высвобождению из поврежденных макрофагов в культуральную среду фермента лактатдегидрогеназы (ЛДГ) с помощью набора Promega's CytoTox 96® (Promega) согласно инструкции. Процент специфического лизиса вычисляли по формуле: % специфич. лизиса Аэксп . Асреды ( Атотал. Aкорр. ) 1,1 ( АМФспонт. Асреды ) где: Аэксп. - средняя оптическая плотность в лунках с МФ + суперлимф Aсреды - средняя оптическая плотность в лунках с культуральной средой Атотал - средняя оптическая плотность в лунках с МФ полностью разрушенными в результате добавления 0,8% Тритона X100 Акорр. - средняя оптическая плотность в лунках с культуральной средой + Тритон Х100 АМФспонт. - средняя оптическая плотность лунках с МФ 11 Для изучения воздействия препарата в жидкой питательной среде RPMI 1640 на микобактерии туберкулеза и макрофаги проведено три варианта экспериментов. Первый вариант опытов заключался в прямом воздействии препарата суперлимф на микобактерии туберкулеза. При втором варианте опытов одновременно инфицировали макрофаги и вносили в культуру препарат суперлимф. Третий вариант предусматривал предварительную инкубацию интактных макрофагов с препаратом суперлимф в течение 24 часов и последующее заражение макрофагов микобактериями туберкулеза. В качестве контроля использовали: – интактные макрофаги; – макрофаги, обработанные суперлимфом (контроль цитотоксичности препарата); – макрофаги, зараженные микобактериями туберкулеза (определение инфекционной активности); – микобактерии туберкулеза без препарата (контроль). Для контроля эффективности использованных тест–систем использовали рифампицин (5мкг/мл) как активный стандартный препарат в отношении микобактерий туберкулеза. Оценку влияния суперлимфа на рост M.tuberculosis на агаризированной среде Дюбо проводили колориметрическим методом по нитратредуктазной активности микобактерий туберкулеза с использованием реактива Грисса на 10 день после посева микобактерий. Все измерения выполнены в трипликатах. Для оценки статистической значимости различий средних величин применяли параметрический критерий Стьюдента. Статистический анализ проводили с помощью программного обеспечения “Bio–Rad” и “MS Office Excel”. Результаты выражали как среднее арифметическое для анализируемой 12 группы показателей ± стандартное отклонение. Различия между показателями считали статистически значимыми при р < 0,05. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 1.Изучение антимикобактериального действия комплекса природных цитокинов и противомикробных пептидов на рост M.tuberculosis in vitro. 1.1. Влияние суперлимфа на рост M.tuberculosis H37Rv на агаризированной среде Дюбо. На первом этапе работы был проведен эксперимент по изучению антимикобактериального действия препарата на рост чувствительного лабораторного штамма M.tuberculosis H37Rv колориметрическим методом на агаризированной среде Дюбо. Рост оценивали по окрашиванию среды при добавлении реактива Грисса на 10 день после посева микобактерий в 24х– луночные планшеты. В эксперименте использовали суперлимф в концентрациях 200, 100, 50, 25, 12,5, 6,25 мкг/мл и контрольные препараты рифампицин в концентрациях 100, 50, 25, 12,5, 6,25 3 мкг/мл и изониазид в концентрациях 16, 8, 4, 2, 1, 0,5 мкг/мл. После автоклавирования готовую среду Дюбо остужали до 55С, добавляли стерильный бычий сывороточный альбумин и олеат натрия и затем препараты. После чего вносили суспензию одиночных микобактериальных клеток H37Rv на среду Дюбо. Через 10 дней готовили водный раствор реактива Грисса и закапывали реактив в лунки планшетов. О росте микобактерий на среде с препаратами и в контрольных лунках судили по окрашиванию среды в розово-красный цвет. Данный метод позволяет определять наличие микобактерий с использованием нитратредуктазной активности МБТ в качестве критерия их роста. Культуры микобактерий туберкулеза, обладающие положительной редуктазной активностью, характеризуются способностью редуцировать нитраты в нитриты. В качестве индикатора разложения нитрата калия используется стандартный реактив Грисса в виде водного раствора. При закапывании реактива Грисса на среду с микобактериями происходит его 13 взаимодействие с образовавшимися нитритами и поверхность среды окрашивается в розово-красный цвет. Результаты проведенного эксперимента показали, что в лунках с M.tuberculosis H37Rv без препаратов отмечался рост культуры. В контрольных лунках с противотуберкулезными препаратами рифампицином и изониазидом рост микобактерий отсутствовал. В лунках с исследуемым препаратом во всех концентрациях замечено окрашивание среды в розово-красный цвет, что свидетельствовало об отсутствии антимикобактериального эффекта на микобактерии туберкулеза. Рис.2А Рис.2В Рис.2. Детекция роста M.tuberculosis H37Rv колориметрическим методом при воздействии суперлимфа и контрольных препаратов рифампицина (R) и изониазида (H) in vitro на среде Дюбо А. Рост M.tuberculosis H37Rv на среде Дюбо без препаратов. В. Рост M.tuberculosis H37Rv на среде Дюбо с различными концентрациями суперлимфа и контрольных препаратов. Проанализировав полученные данные, мы предположили, что отсутствие антимикобактериального эффекта может быть связано с термолабильностью препарата суперлимф, т.к. температура среды Дюбо при внесении препарата составляла около 55С. Поэтому представилось целесообразным проводить дальнейшие работы по изучению влияния комплекса природных цитокинов и противомикробных пептидов на M.tuberculosis в жидкой питательной cреде, не требующей 14 нагревания до высоких температур в процессе приготовления и внесения препарата. С этой целью была выбрана модель, включающая прямое воздействие различных концентраций препарата на микобактерии туберкулеза in vitro и заражение культуры перитонеальных макрофагов мышей микобактериями ex vivo в среде RPMI 1640 c обогащающими добавками. Сочетание экспериментов in vitro и ex vivo позволяет оценить активность препарата не только в отношении возбудителя туберкулеза, но и макрофагов, обеспечивающих элиминацию патогена. 1.2. Влияние суперлимфа на рост M.tuberculosis H37Rv в жидкой питательной среде in vitro Проведенные исследования по изучению прямого антимикобактериального действия в среде RPMI 1640 показали, что на 7 день культивирования количество M.tuberculosis H37Rv в контрольных лунках увеличилось на логарифм с 5,3±0,03 до 6,1±0,1 lgКОЕ. Контрольный препарат рифампицин достоверно (p=0,0005) ингибировал рост чувствительного штамма M.tuberculosis H37Rv и значение логарифма составило 5,3±0,04. При исследовании роста клеток микобактерий было выявлено достоверное (p=0,008) ингибирующее воздействие суперлимфа на M.tuberculosis H37Rv в концентрации 5 мкг/мл (lg КОЕ = 5,7±0,07). Снижение концентраций суперлимфа до 1 мкг/мл и 0,1 мкг/мл приводило к уменьшению эффекта на рост микобактерий. Количество M.tuberculosis H37Rv в лунках за 7 дней культивирования с суперлимфом в концентрации 1мкг/мл составило lgКОЕ МБТ 5,9±0,19 и lgКОЕ МБТ 6,1±0,1 при культивировании с исследуемым препаратом в концентрации 0,1 мкг/мл. Однако выявленное снижение роста было недостоверным по сравнению с величиной lgКОЕ в контрольных лунках с M.tuberculosis H37Rv. Результаты проведенных исследований показали, что препарат суперлимф при воздействии in vitro ингибирует рост M.tuberculosis H37Rv. 15 Степень угнетения роста зависела от дозы препарата. Максимальный эффект оказывал препарат в концентрации 5 мкг/мл (Рис.3). 6,5 lg КОЕ МБТ 6 5,5 5 4,5 I II III I - M.tub H37Rv исх IV V VI II - M.tub H37Rv без преп III - M.tub H37Rv + суперлимф 0,1 мкг/мл IV - M.tub H37Rv + суперлимф 1 мкг/мл V - M.tub H37Rv + суперлимф 5 мкг/мл VI - M.tub H37Rv + рифампицин 5 мкг/мл Рис.3. Рост M.tuberculosis H37Rv при прямом воздействии препарата суперлимф в концентрациях 0,1 мкг/мл, 1 мкг/мл, 5 мкг/мл и контрольного препарата рифампицина в концентрации 5 мкг/мл (lgКОЕ). 1.3. Влияние суперлимфа на рост M.tuberculosis с МЛУ в жидкой питательной среде in vitro. Культивирование в течение 7 дней M.tuberculosis с МЛУ без препаратов приводило к увеличению количества микобактерий с 5,4±0,1 lgКОЕ до 6,2±0,11 lgКОЕ. Добавление суперлимфа ни в одной концентрации не вызывало существенного снижения роста M.tuberculosis с МЛУ по сравнению с культивированием микобактерий без препаратов. Величина lgКОЕ МБТ при различных концентрациях препарата колебалась от 5,90,19 (конц. 5 мкг/мл) до 6,150,20 (конц. 0,01 мкг/мл). Эти результаты достоверно не отличались от роста микобактерий в среде без препаратов, где значение lgКОЕ МБТ составило 6,210,11. Также рост устойчивого к рифампицину штамма M.tuberculosis с МЛУ не угнетался при добавлении в среду контрольного препарата рифампицина в концентрации 5мкг/мл, и количество КОЕ МБТ в среде с 16 препаратом достоверно не отличалось от роста микобактерий без рифампицина (6,120,12 lgКОЕ МБТ)(рис.4). 6,5 lg КОЕ МБТ 6 5,5 5 4,5 I II III IV V VI I- M.tub CN37 исх II - M.tub CN37 без преп III - M.tub CN37 + суперлимф 0,1 мкг/мл IV - M.tub CN37 + суперлимф 1 мкг/мл V - M.tub CN37 + суперлимф 5 мкг/мл VI - M.tub CN37 +рифампицин 5мкг/мл Рис.4. Рост M.tuberculosis CN37 при прямом воздействии препарата суперлимф в концентрациях 0,1 мкг/мл, 1 мкг/мл, 5 мкг/мл и контрольного препарата рифампицина в концентрации 5 мкг/мл (lgКОЕ). Изучение действия комплекса природных цитокинов и птивомикробных пептидов на штамм M.tuberculosis с МЛУ показало, что препарат не влиял на рост микобактериальных клеток. 2. Изучение влияния комплекса природных цитокинов и противомикробных пептидов в модели ex vivo на макрофаги, инфицированные M.tuberculosis H37Rv И M.tuberculosis с МЛУ. Изучение влияния комплекса природных цитокинов и противомикробных пептидов в модели ex vivo на макрофаги, инфицированные M.tuberculosis H37Rv и M.tuberculosis с МЛУ включало следующие эксперименты: – оценка цитотоксического эффекта суперлимфа на интактные макрофаги; – изучение влияние суперлимфа на рост M.tuberculosis H37Rv и M.tuberculosis с МЛУ, фагоцитированных макрофагами; 17 – изучение влияния суперлимфа на макрофаги, инфицированные M.tuberculosis H37Rv и M.tuberculosis с МЛУ; – оценка предварительной инкубации интактных макрофагов с суперлимфом на рост M.tuberculosis H37Rv и M.tuberculosis с МЛУ, фагоцитированных макрофагами; – оценка предварительной инкубации на усиление протективного эффекта суперлимфа на макрофаги, инфицированные M.tuberculosis H37Rv и M.tuberculosis с МЛУ. Изучение антимикобактериального действия препарата суперлимф на рост микобактерий туберкулеза, фагоцитированных макрофагами начали с определения повреждающего действия суперлимфа на интактные макрофаги. Цитотоксический высбождаемой эффект оценивали из поврежденных визуально макрофагов и в по уровню культуральную ЛДГ, среду. Результаты микроскопии в световом инвертированном микроскопе показали, что в культуре макрофагов, обработанной препаратом суперлимф, не наблюдалось видимых изменений морфологии клеток. Макрофаги сохраняли характерную для прикрепленных клеток веретенообразную форму независимо от концентраций препарата, используемого в эксперименте, и не отличались от морфологии клеток в контроле. Специфический лизис макрофагов, оцененный по уровню ЛДГ, достоверно не отличался при воздействии всех концентраций суперлимфа от спонтанного лизиса, который характеризовал естественное разрушение макрофагов в процессе культивирования на протяжении 7 дней. Процент специфического высвобождения ЛДГ при культивировании макрофагов составил 37,3+1,3%, при культивировании макрофагов с препаратом в концентрации 0,1 мкг/мл – 40,4+1,4%, при концентрации 1 мкг/мл – 41,5+4,2% и 41,7+4,1% при концентрации препарата 5мкг/мл (табл.1) 18 Таблица 1. Оценка цитотоксического эффекта суперлимфа на интактные макрофаги. Группы Показатель цитотоксичности I II III IV МФ МФ+суперлимф 0,1 мкг/мг МФ+суперлимф 1 мкг/мл МФ+суперлимф 5 мкг/мл 40,4±1,4 41,5±4,2 41,7±4,1 Р(II-I) > 0,05 Р(III-I) > 0,05 Р(IV-I) > 0,05 без препарата Процент специфического лизиса макрофагов, 37,3±1,3 % Для изучения влияния суперлимфа на макрофаги, зараженные микобактериями, инфицировали макрофаги микобактериями чувствительного штамма M.tuberculosis H37Rv и резистентного штамма M.tuberculosis c МЛУ. Оценку роста M.tuberculosis проводили с помощью ПЦР в режиме реального времени по накоплению продуктов амплификации ДНК микобактерий. Цитопатогенный эффект, оказываемый микобактериями на макрофаги, оценивали по разрушению макрофагов, определяя выход в культуральную среду фермента макрофагов – лактатдегидрогеназы. При исследовании роста M.tuberculosis H37Rv, фагоцитированных МФ, выявлен ингибирующий эффект препарата в концентрации 5 мкг/мл (lgКОЕ составил 5,4+0,12, p=0,02). Культивирование МФ, фагоцитировавших микобактерии, в течение 7 суток в присутствии суперлимфа в концентрациях 1 и 0,1 мкг/мл, не оказывало ингибирующего воздействия на рост микобактерий. Значение lgКОЕ составило 6,0±0,12 при концентрации 0,1 мкг/мл и 5,9±0,14 при концентрации 1 мкг/мл, по сравнению с культивированием фагоцитированных макрофагами микобактерий без препарата (значение lgКОЕ МБТ, 5,9±0,16.). Контрольный препарат рифампицин достоверно ингибировал 19 рост чувствительного к рифампицину штамма M.tuberculosis H37Rv 6,5 6,5 6 6 5,5 5,5 lg КОЕ Lg КОЕ (lgКОЕ=4,9,р=0,001) (рис.5). 5 5 4,5 4,5 4 I II III IV V VI VII I - M.tub H37Rv исх II - M.tub H37Rv без преп III - M.tub H37Rv+МФ IV - M.tub H37Rv+МФ+Суперлимф 0,1мкг/мл V - M.tub H37Rv+МФ+Суперлимф 1мкг/мл VII - M.tub H37Rv+МФ+рифампицин VI- M.tub H37Rv+МФ+Суперлимф 5мкг/мл Рис.5. Рост M.tuberculosis H37Rv в МФ при воздействии суперлимфа без предварительной инкубации. 4 I II III IV V VI VII I- M.tub H37Rv исх III - M.tub H37Rv+МФ II - M.tub H37Rv без преп IV - M.tub H37Rv+МФ+Суперлимф 0,1мкг/мл V - M.tub H37Rv+МФ+Суперлимф 1мкг/мл VII - M.tub H37Rv+МФ+рифампицин 5мкг/мл VI - M.tub H37Rv+МФ+Суперлимф 5 мкг/мл Рис.6. Рост M.tuberculosis H37Rv в МФ после предварительной инкубации МФ с суперлимфом в течение 24 часов. Изучение специфического лизиса МФ, зараженных M.tuberculosis H37Rv, показало, что суперлимф в концентрации 5 мкг/мл снижал цитопатогенный эффект, вызываемый микобактериями. Специфический лизис МФ, зараженных M.tuberculosis H37Rv, в отсутствии препаратов составил 90,3±6,13%. При добавлении суперлимфа в концентрации 5 мкг/мл отмечалось достоверное снижение значения специфического лизиса до 65,7±7,03%. Таким образом, наблюдалось стимулирующее действие суперлимфа на жизнеспособность МФ (табл.2). Предварительное культивирование макрофагов с препаратом привело к снижению выживаемости M.tuberculosis H37Rv в макрофагах. Выявлено ингибирующее действие суперлимфа на рост M.tuberculosis H37Rv не только в концентрации 5 мкг/мл (lgКОЕ 4,9±0,1, р=0,0006), но и при более низких концентрациях 1 мкг/мл (lgКОЕ 4,93±0,07, р=0,00005) и 0,1 мкг/мл (lgКОЕ 5,1±0,09, р=0,001), по сравнению с ростом M.tuberculosis H37Rv в макрофагах без обработки суперлимфом (lgКОЕ 6,07±0,18) (рис.6). 20 Таблица 2. Протективный эффект суперлимфа на макрофаги, инфицированные M.tuberculosis H37R Группы Показатель цитотоксичности I II III IV V VI МФ без препарата МФ + H37Rv МФ + H37Rv + рифапмицин 5мкг/мл МФ + H37Rv + суперлимф 5мкг/мл МФ + H37Rv + суперлимф 1 мкг/мл МФ + H37Rv + суперлимф 0,1мкг/мл 39,3±0,6 65,7±7,03 88,5±2,9 91,1±5,4 Р(III-II) = 0,0001 Р(IV-II) = 0,010 Р(V-II) = 0,67 Р(VI-II) = 0,87 46,2±2,3 37,5±0,8 48,2±7,4 57,9±4,2 Р(III-II) = 0,0008 Р(IV-II) = 0,0004 Р(V-II) = 0,002 Р(VI-II) = 0,002 процент специфического лизиса МФ без предварительной инкубации с суперлимфом, % 37,3±1,3 процент специфического лизиса МФ после предварительной инкубации с cуперлимфом, % 37,1±0,9 90,3±6,1 96,5±9,3 21 Одновременное определение цитопатогенного эффекта микобактерий на макрофаги в этой же модели показало, что предварительная обработка суперлимфом препятствует разрушению макрофагов микобактериями туберкулеза, так как процент специфического лизиса макрофагов составил 37,5±0,84% при обработке препаратом в концентрации 5 мкг/мл, 48,2±7,5% при 1 мкг/мл и 57,9±4,2, % при 0,1 мкг/мл, тогда как специфический лизис макрофагов, зараженных M.tuberculosis H37Rv, без препарата, составлял 96,51±9,32%. Полученные результаты свидетельствуют о достоверном снижении лизиса макрофагов, инфицированных M.tuberculosis H37Rv (табл.2). Культивирование макрофагов, инфицированных M.tuberculosis с МЛУ в течение 7 суток в присутствии суперлимфа не оказывало достоверного ингибирующего воздействия на рост M.tuberculosis (рис.7). 6,5 6,5 6 lg КОЕ lg КОЕ 6 5,5 5 5 4,5 4 5,5 I II III I - M.tub CN37 исх III - M.tub CN37+МФ V - M.tub CN37+МФ+Суперлимф 1мкг/мл VII - M.tub CN37+МФ+рифампицин 5мкг/мл IV V VI VII II - M.tub CN37 без преп IV - M.tub CN37+МФ+Суперлимф 0,1мкг/мл VI - M.tub CN37+МФ+Суперлимф 5мкг/мл Рис.7. Рост M.tuberculosis с МЛУ в МФ при воздействии суперлимфа без предварительной инкубации. 4,5 I II III I -M.tub CN37 исх III - M.tub CN37+МФ V - M.tub CN37+МФ+Суперлимф 1мкг/мл VII - M.tub CN37+МФ+рифампицин 5мкг/мл IV V VI VII II - M.tub CN37 без преп IV - M.tub CN37+МФ+Суперлимф 0,1мкг/мл VI - M.tub CN37+МФ+Суперлимф 5 мкг/мл Рис.8. Рост M.tuberculosis с МЛУ в МФ после предварительной инкубации МФ с суперлимфом в течение 24 часов Однако при оценке цитопатогенного действия выявлен протективный эффект на макрофаги, зараженные устойчивым штаммом M.tuberculosis с МЛУ. Процент специфического лизиса макрофагов, инфицированных M.tuberculosis с МЛУ, составил 98,5±17,47%, в то время как добавление суперлимфа в концентрации 5мкг/мл достоверно снижало процент разрушения макрофагов до 61,8±3,2%., в концентрации 1мкг/мл до 71,3±13,5, а концентрация 0,1мкг/мл не оказывала эффекта и специфический лизис составил 97,3±4,4% (табл.3). 22 Таблица 3 Протективный эффект суперлимфа на макрофаги, инфицированные M.tuberculosis СN37. Группы Показатель цитотоксичности I II III IV V VI МФ без препарата МФ + CN37 МФ + CN37 + рифапмицин 5мкг/мл МФ + CN37 + cуперлимф 5мкг/мл МФ + CN37 + cуперлимф МФ + CN37 + cуперлимф 0,1мкг/мл 90,9 ± 8,04 61,8 ± 3,29 71,3 ± 13,5 97,3 ± 4,4 Р(III-II) = 0,53 Р(IV-II) = 0,02 Р(V-II) = 0,10 Р(VI-II) = 0,91 91,2 ± 2,18 36,7 ± 8,09 41,08 ± 5,8 51,9 ± 9,7 Р(III-II) = 0,11 Р(IV-II) = 0,0003 Р(V-II) = 0,0001 Р(VI-II) = 0,0018 процент специфического лизиса МФ без предварительной инкубации с суперлимфом, % 37,1 ± 1,6 процент специфического лизиса МФ после предварительной инкубации с cуперлимфом, % 39,2 ± 4,8 98,5 ± 17,4 97,02 ± 4,3 1 мкг/мл 23 Предварительная инкубация макрофагов с препаратом суперлимф выявила снижение роста M.tuberculosis с МЛУ, фагоцитированных макрофагами. Угнетение роста было замечено при обработке суперлимфом в концентрации 5мкг/мл, значение lgКОЕ составило 5,7±0,1, р=0,03. Снижение концентрации суперлимфа до 1 мкг/мл также приводило к ингибированию роста (lgКОЕ 5,7±0,13, р=0,07), однако оно было недостоверным, по сравнению со значением роста микобактерий, фагоцитированных макрофагами без обработки препаратом (рис.8). При оценке цитопатогенного действияи выявлено, что M.tuberculosis с МЛУ разрушают суперлимфом в макрофаги. различных Предварительная концентрациях обработка приводила макрофагов к снижению цитотоксического эффекта M.tuberculosis с МЛУ на макрофаги (процент специфического лизиса интактных макрофагов составил 36,7±8,09%, при 5 мкг/мл, 41,08±5,8% при 1 мкг/мл и 51,9±9,7%) по сравнению с процентом специфического лизиса макрофагов, инфицированных M.tuberculosis с МЛУв отсутствии препаратов, который составил 97,02±4,3% (табл.3). Таким образом, действие суперлимфа на микобактерии туберкулеза может реализоваться, по крайней мере, через два механизма. В случае с чувствительным штаммом антимикобактериальное M.tuberculosis действие, опосредуемое проявляется прямое противомикробными пептидами, входящими в состав препарата, которые при взаимодействии с мембраной микроорганизмов вызывают ее деполяризацию и нарушение целостности, приводящее к гибели. Тогда как эффект на резистентный штамм M.tuberculosis связан с регуляцией функций макрофагов, фагоцитировавших M.tuberculosis. В этом случае бактерицидная активность фагоцитов стимулируется цитокинами, что приводит к усилению выработки ими активных форм кислорода и азота, продукции аутологичных цитокинов, что способствует киллингу внутриклеточных патогенов. Полученные данные свидетельствуют о важной роли как цитокинов, так и противомикробных пептидов в противомикробной защите организма. 24 Выводы. 1. Комплекс природных цитокинов и противомикробных пептидов в концентрации 5 мкг/мл подавлял рост лабораторного вирулентного штамма M.tuberculosis H37Rv in vitro. 2. Комплекс природных цитокинов и противомикробных пептидов в концентрациях 0,1 мкг/мл, 1 мкг/мл, 5 мкг/мл не оказывал цитотоксического действия на интактные макрофаги мыши. 3. Культивирование противомикробных пептидов комплекса в природных концентрации 5мкг/мл цитокинов с и макрофагами, инфицированными M.tuberculosis H37Rv, приводило к подавлению роста микобактерий и снижению цитотопатогенного эффекта микобактерий на макрофаги мыши. 4. Культивирование комплекса природных цитокинов и противомикробных пептидов с макрофагами, инфицированными M.tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью, не оказывало влияния на жизнеспособность микобактерий, однако уменьшало цитопатогенный эффект микобактерий на макрофаги. 5. Предварительная обработка интактных макрофагов мыши в течение 24 часов комплексом природных цитокинов и противомикробных пептидов усиливала антимикобактериальный эффект, который проявлялся в отношении фагоцитированных микобактерий (чувствительного штамма M.tuberculosis H37Rv при концентрациях 5 мкг/мл и 1 мкг/мл и M.tuberculosis с МЛУ при концентрации 5 мкг/мл). 6. Предварительная обработка интактных макрофагов мыши комплексом природных цитокинов и противомикробных пептидов в течение 24 часов усиливала протективное действие препарата на макрофаги при их последующем инфицировании M.tuberculosis H37Rv и M.tuberculosis с МЛУ. Практические рекомендации. Использованная модель для изучения влияния комплекса природных цитокинов и противомикробных пептидов in vitro и ex vivo позволила оценить 25 активность препарата, как в отношении возбудителя туберкулеза, так и макрофагов мыши, инфицированных M.tuberculosis. Предложенный методический подход может быть рекомендован в качестве модели для комплексной оценки влияния вновь создаваемых препаратов на макрофаги человека и внутриклеточные патогены. Список научных работ, опубликованных по теме диссертации 1. Смирнова Ковальчук Л.В., Ганковская Л.В., Лаврова Ю.В. (Гвоздева Ю.В.), Т.Г., Ларионова Е.Е., Черноусова Л.Н./Влияние комплекса природных цитокинов (препарат суперлимф) на рост M.tuberculosis H37Rv in vitro.// Материалы VIII Российского съезда фтизиатров. – 2007. –С.121. 2. Ковальчук Л.В., Ганковская Л.В., Лаврова Ю.В (Гвоздева), Смирнова Т.Г., Ларионова Е.Е., Черноусова Л.Н. / Изучение цитотоксического действия препарата суперлимф на макрофаги, инфицированные Mycobacterium tuberculosis H37Rv in vitro. //Материалы VIII конгресса Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии. Российский Аллергологический Журнал – 2007. – №3 Прилож.1. – С.56. 3. Ковальчук Л.В., Гвоздева Ю.В., Ганковская Л.В., Черноусова Л.Н., Смирнова Т.Г., Ларионова Е.Е. /Ингибирующее действие комплекса природных цитокинов и катионных противомикробных пептидов на рост M.tuberculosis H37Rv in vitro. //Журнал микробиологоии, эпидемиологии и иммунобилогии. – 2008. – №6 – С.35-39. 4. Ковальчук Л.В., Гвоздева Ю.В., Черноусова Л.Н., Ганковская Л.В., Смирнова Т.Г., Ларионова Е.Е., Соколова Е.В., Левченко В.А. /Регуляторное действие комплекса природных цитокинов и противомикробных пептидов на мышиные макрофаги, инфицированные клиническим штаммом M.tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью. //Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. – 2010. – №3 – С.52-56. 5. J. Lavrova (Gvozdeva), T. Smirnova, E. Larionova, L. Kovalchuk, L. Chernousova, L. Gankovskaya. /Antimycobacterial effect of Superlimph. //4th 26 Congress of the International Union Against Tuberculosis and Lung Disease, Europe Region – 2007. – Riga, Latvia. – p.80. 6. J. Gvozdeva, L. Kovalchuk, T. Smirnova, L. Gankovskaya, L. Chernousova/ Inhibition of macrophage ingested MDR M.tuberculosis growth by the complex of natural cytokines plus antimicrobial peptides (CNCplusAMP). //20th European Congress of clinical microbiology and infection diseases. – 2010. – Vienna, Austria. СПИСОК СОКРАЩЕНИИЙ. ИЛ – интерлейкин ИНФ – интерферон КОЕ – колониеобразующая единица КПЦ – комплекс природных цитокинов ЛДГ – лактатдегидрогеназа МБТ – микобактерии туберкулеза МФ – макрофаг МЛУ – множественная лекарственная устойчивость ПМП – противомикробные пептиды ПЦР – полимеразная цепная реакция ТФР – трансформирующий фактор роста ФНО – фактор некроза опухоли
