Кардиолипин – один из фармакологически активных липидов
реклама
Кардиолипин – один из фармакологически активных липидов. Бактерицидное действие кардиолипина на микобактерии туберкулеза Селищева А.А., Микулович Ю.Л., Сорокоумова Г.М. Тема этой статьи – туберкулез и кардиолипин. Что связывает такие разные понятия, как инфекционное заболевание с высоким уровнем смертности и фосфолипид, который входит в состав любых видов клеток (и эукариот, и прокариот). В статье «Современные подходы к созданию новых противотуберкулезных препаратов» (авторы Андреевская С.Н., Смирнова Т.Г., Ларионова Е.Е., Черноусова Л.Н.), размещенной на сайте МИТХТ, приводятся данные о разработке новых противотуберкулезных препаратов в связи с появлением штаммов с множественной и широкой лекарственной устойчивостью (МЛУ и ШЛУ соответственно). Одна из причин появления резистентности обусловлена способностью клеток бактерий при появлении препаратов, отрицательно влияющих на их метаболизм, включать защитные механизмы, а именно: экспрессировать гены, активирующие синтез определенных белков. Функция этих белков заключается в том, чтобы тем или иным способом удалить эти препараты из клетки. Для этого существуют разные механизмы. Например, синтезируются белки–транспортеры, которые переносят вещество во внешнюю среду, или ферменты, модифицирующие вещество таким образом, что оно становится неактивным. Итак, можно констатировать, что любое «чужеродное» вещество в конце концов вызовет выше описанную реакцию клетки микобактерии. Что же тогда можно предложить? Может быть, попробовать бороться с микобактерией ее собственным оружием? Жизнь бактерии развивается в двух фазах: первая (логарифмическая), когда клетки делятся значительно быстрее, чем умирают. В этом периоде быстро (в десятки и сотни раз) увеличивается число клеток. Затем наступает так называемая стационарная фаза. Уже из ее названия понятно, что число вновь появившихся клеток равняется числу умерших и общее количество живых клеток остается на одном и том же уровне. Как регулируется этот процесс, до сих пор не очень ясно. Конечно, есть много предположений. Более или менее известно, что и белковый, и липидный состав клеток микобактерий изменяется при переходе из логарифмической фазы в стационарную. Поэтому возникло следующее предположение: что, если изменить липидный состав клетки микобактерии таким образом, чтобы подавить ее размножение. Для этого мы выбрали компонент бактериальной мембраны – кардиолипин. И, действительно, как это будет описано ниже, оказалось, что КЛ может подавлять размножение и жизнеспособность бактерий. Однако прежде, чем перейти к результатам проведенных исследований, следует обсудить структуру и свойства этого не совсем обычного фосфолипида, а также его функции в клетках прокариот и эукариот. Структура и свойства КЛ В 1941 году Мэри Пэнгборн выделила фосфолипид из сердечной мышцы быка и назвала его кардиолипином. Он отличается от классических фосфолипидов тем, что содержит четыре остатка жирных кислот. Как следует из структурной формулы, приведенной на рис.1, в его молекуле присутствуют две замещенные фосфатные группы, что означает, что при рН > 7.5 среды молекула кардиолипина имеет два отрицательных заряда. В дальнейшем при обсуждении функций КЛ в клетке это свойство окажется весьма важным, т.к. оно в какой-то мере определяет взаимодействие КЛ с белками, связывающимися с отрицательно заряженной ДНК. 1 3 2 4 Рис. 1. Структурные формулы: 1 – КЛ, 2 – лизо-КЛ, 3 – бислизо-КЛ, 4 – линолевой кислоты. Диспергирование КЛ в водной фазе. Кардиолипин (КЛ) в виде липидной пленки легко диспергируется в воде с образованием мультиламмелярных везикул, которые могут быть превращены в большие однослойные везикулы (липосомы) методом экструзии, т.е. продавливанием через пористый фильтр под давлением. Иными словами, КЛ является фосфолипидом, образующим бислой. При инкубации с ионами Са происходит нейтрализация отрицательного заряда, объем полярной части молекулы КЛ уменьшается, что индуцирует образование гексагональной фазы КЛ. В пространстве молекулы КЛ имеют структуру, в которой можно выделить две области, различающиеся по своим свойствам. Это полярная область, где находятся замещенные фосфатные группы и которая легко контактирует с молекулами воды. Другая область сформирована четырьмя остатками жирных кислот и ей термодинамически выгодно контактировать с жирнокислотными остатками соседней молекулы или с остатками жирных кислот молекулы из соседнего ряда. Это станет более понятным, если рассматривать поведение молекулы КЛ в системе масло/вода, где молекула КЛ будет располагаться таким образом, что его полярная часть будет экспонирована в водную фазу, а аполярная (остатки жирных кислот) – в масло. Собственно, по этому же принципу формируется клеточная мембрана, состоящая из фосфолипидов и белков. Молекулы фосфолипидов образуют два слоя – так называемый бислой, в котором молекулы одного слоя контактируют аполярной частью с молекулами другого слоя, а полярная часть экспонирована в водное пространство. Далее структурная организация молекул фосфолипидов в мембране будет зависеть от соотношения объемов полярной и аполярной (гидрофобной) частей самой молекулы. В молекуле КЛ площадь, на которую проецируется полярная часть, практически равна площади, на которую проецируются остатки жирных кислот. Поэтому при вращении молекулы вдоль оси она образует объем, который близок цилиндру. Это позволяет молекулам образовывать плотную упаковку в мембране, которая так и называется бислойной. Важно отметить, что такая структура не проницаема для ионов и низкомолекулярных веществ типа глюкозы. Именно эта особенность структуры КЛ по сравнению с другими фосфолипидами (более плотная упаковка остатков жирнокислотных цепей) позволила исследователям предположить, что КЛ должен окисляться с большей скоростью по сравнению, например, с фосфатидилхолином, содержащим те же жирнокислотные остатки, потому что в молекуле КЛ липоперекиси могут образовываться не только в одной цепи, но и между цепями. Однако при сравнении скорости спонтанного неиндуцируемого окисления КЛ и фосфатидилхолина, в молекуле которого только два остатка жирных кислот, оказалось, что КЛ окисляется действительно быстрее, но разница в скорости окисления небольшая. Деструкция КЛ. Было высказано предположение о том, что при инкубации КЛ в среде культивирования микобактерий, содержащей ионы железа (среда Дюбо), может происходить его деструкция с образованием различных продуктов. Нами были выполнены специальные исследования, необходимость проведения которых обусловлена тем, что микобактерия туберкулеза является медленно растущей бактерией и логарифмическая фаза ее роста равна 20 дней. Поэтому важно быть уверенными, что действующее вещество в основном сохраняется. При инкубации КЛ в фосфатном буфере в течение четырех часов мы не обнаружили продуктов деструкции методом тонкослойной хроматографии (ТСХ), а после инкубации в течение 4 и 6 дней в среде Дюбо продукты деструкции образовывались, но исходного КЛ оставалось 80% (рис 2). В качестве продуктов деструкции, помимо лизопродуктов, нами была обнаружена еще фосфатидная кислота (ФК). Рис. 2. ТСХ продуктов деструкции КЛ, инкубированного в среде Дюбо в течение 4 и 6 дней. № дорожек: 1 – КЛ стандарт; 2 – КЛ, инкубированный в среде Дюбо 4 дня; 3 – КЛ, инкубированный в среде Дюбо 6 дней; 4 – смесь, состоящая из КЛ, лКЛ, ллКЛ, ЛК (получена под действием фосфолипазы А2 на КЛ); 5 – очищенный лКЛ, полученный под действием фосфолипазы А2 на КЛ; 6 – очищенный ллКЛ, полученный под действием фосфолипазы А2 на КЛ; 7 – очищенная ФК, полученная под действием фосфолипазы D на фосфатидилхолин; 8 – Линолевая кислота (ЛК), стандарт 1 2 3 4 5 6 7 8 Из всего сказанного выше можно сделать вывод о том, что КЛ является бислойным фосфолипидом, в молекуле которого присутствуют два отрицательных заряда и который способен при эмульгировании в водной фазе образовывать структуры, состоящие из бислоя. При этом он медленно аутоокисляется, а при достаточно длительной инкубации распадается с образованием лизо-, бислизо- КЛ и фосфатидной кислоты. Чем же интересен КЛ, почему еще в самом начале развития липидологии ему было посвящено немало научных публикаций? Прежде, чем отвечать на этот вопрос, разделим его на две части, а именно: каковы функции КЛ в клетках эукариот, которые имеют ядро и различные органеллы, в том числе митохондрии, и в клетках прокариот, не имеющих ядерной мембраны и органелл. КЛ в клетках эукариот, в митохондриальной мембране Митохондрии в клетках эукариот имеют две мембраны: внутреннюю и внешнюю, – и именно во внутренней мембране располагается КЛ. Достаточно давно установили, что при выделении белков из митохондрий происходит выделение вместе с ними «тесно связанных» фосфолипидов. Одним из них оказался КЛ, который выделялся вместе с белками, участвующими в процессе окислительного фосфорилирования: цитохромоксидазой, в комплексе с которой он создает условия для оптимального функционирования белка; белком, обменивающим АТФ на АДФ, отсутствие которого уменьшает мембранный потенциал; F0F1-субъединицы АТФ-синтазы, где он также создает оптимальные условия для белка; транспортером ортофосфата и комплексом цитохромов bc1. В последние годы была исследована роль КЛ в процессе апоптоза (запрограммированной смерти клетки). Это очень сложный многостадийный и до конца неисследованный процесс, к которому сейчас приковано внимание большого числа ученых. В серии работ В.Каган [1] и соавторы показали, что в митохондриях печени крыс появление проапоптического компонента tBid (коричневый полукруг на рис.3) индуцирует переход КЛ на внутреннюю сторону мембраны и активацию фосфолипазы А2 (желтый круг), которая специфично гидролизует КЛ до лизо-КЛ. На рис.3. КЛ изображен синим цветом, лизокомпонент – голубым. Далее они предположили, что образование лизокомпонентов КЛ и, как следствие, жирных кислот приводит к таким изменениям в структуре мембраны, которые позволяют лизоКЛ и КЛ выйти во межмембранное пространство, образованное внутренней и внешней мембранами митохондрий, где располагается цитохром с, изображенный небольшим кружком красного цвета. При взаимодействии белка с превращается в КЛ образуется комплекс, в составе которого цитохром с высокоэффективную пероксидазу, способную окислять КЛ с образованием липоперекисей. На рис.3 КЛ, содержащий липоперекись, изображен синим кругом с небольшим голубым кружком на остатке жирной кислоты Этот процесс инициирует выход цитохром с из митохондрий в цитозоль, где происходит активация каспаз и начинается апоптоз. Рис. 3. Схема выхода цитохрома с в цитозоль. Пояснения см. в тексте. Сравнительно давно было установлено, что КЛ может двояким образом влиять на активность различных ферментов в клетке: и активировать их, и ингибировать. Он активирует сукцинатоксидазу (фермент цикла трикарбоновых кислот), АТФазу (фермент митохондрий), причем происходит это за счет того, что КЛ благодаря отрицательным зарядам своей молекулы сначала принимает два протона, а затем отдает их АТФазе. Иными словами, он работает как протонная ловушка. КЛ в клетках бактерий. Значительно более полно изучены функции КЛ в клетках различных бактерий, в первую очередь, конечно, E.coli. Известно, что КЛ связан в этих клетках с белком DnaA, который является инициатором репликации ДНК и связывается со специфической нуклеотидной последовательностью с хромосомальным участком репликации oriC. Изучение свойств белка DnaA в E. coli показало, что он может связывать и АТФ, и АДФ с равной эффективностью и гидролизовать АТФ. Продукт гидролиза АДФ, ассоциированный с DnaA, образует неактивную форму, которая не активирует репликацию oriC; кислые фосфолипиды (в первую очередь КЛ) промотируют диссоциацию нуклеотида и активацию белка DnaA. Дальнейшее связывание DnaA в комплексе с АТФ и дальнейшее взаимодействие с oriC дает открытие спирали и синтез ДНК. Для визуализации распределения КЛ в клетках E. сoli применили окрашивание живых клеток красителем 10-N-нонил акридиновым оранжевым (10-N-нонил-3,6бис(диметиламино)акридин, NAO) [2]. С КЛ, который содержит две фосфатные группы на одну молекулу, краситель образует димер, а с фосфолипидами (ФЛ), содержащими одну фосфатную группу, соотношение ФЛ/краситель равно 1:1. Вследствие образования димера сродство КЛ к NAO (Ka=2·106 М-1) гораздо выше, чем ФЛ с одной фосфатной группой (Ka=7·104 М-1). Особенностью взаимодействия NAO с КЛ является сдвиг максимума испускания флуоресценции из зеленой в красную область, которая объясняется наложениеи π–π-связей двух положительно заряженных молекул NAO, связанных с двумя ионизованными фосфатными группами КЛ, что отличает КЛ от других ФЛ, содержащих только одну фосфатную группу. В клетках E. сoli обнаружили испускание красной флуоресценции связанным NAO, что подтвердило наличие КЛсодержащих доменов, причем они были расположены в септальной области и у полюсов клетки. Белок DnaA присутствует и в микобактериях туберкулеза (МБТ). Как было установлено, он также связывает, а затем гидролизует АТФ, также ассоциирован с мембранными липидами и, как в E. coli, также расплетает спираль ДНК. механизм, регулирующий начальную стадию репликации в МБТ, Однако в основном был неизвестен. Для этого использовали флуоресцентную метку NAO, которая связывается с КЛ, и показали, что при делении клетки КЛ локализован в области септы и, таким образом, участвует в активном росте МБТ Наряду с этим есть многочисленные литературные данные о том, что этот липид имеет важное значение для многих других белков. В таблице 1 представлены белки, активность которых напрямую зависит от взаимодействий с КЛ. Таблица 1. Взаимодействие КЛ с белками в прокариотических клетках Белок MinD FtsA DnaA ДНК-полимераза III ДНК-топоизомераза I EmrE, TBsmr KcsA Сукцинат дегидрогеназа Формиат дегидрогеназа N (FdnGHI) Нитрат редуктазный комплекс (NarGHI) SecYEG Lon Кроме того известно, что Функция часть комплекса MinCDE, отвечающего за правильное размещение центра деления клетки локализация Z-кольца в центре клетки инициация репликации ДНК в oriC репликация ДНК репликация ДНК мультилекарственные белки-переносчики К+-канал комплекс дыхательной цепи комплекс дыхательной цепи комплекс дыхательной цепи комплекс белкового канала АТФ-зависимая протеза Микроорганизм E.coli E.coli E.coli , M. tuberculosis E.coli E.coli E.coli, M. tuberculosis S. lividans E.coli E.coli E.coli E.coli E.coli КЛ обладает способностью связываться с такими важными ферментами, участвующими в репликации ДНК, как полимераза III и топоизомераза I. Все эти факты позволили сделать предположение о том, что содержание КЛ в бактериальной мембране влияет на формирование доменов, связывание с белками и процесс репликации ДНК. Эти соображения инициировали исследования, проведенные нами по влиянию КЛ на скорость роста и жизнеспособность клеток МБТ [3]. ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ На первых этапах работы изучали рост культуры M. tuberculosis H37Rv в присутствии различных концентраций КЛ (33, 500 µМ), который регистрировали в автоматизированной системе BACTEC MGIT 960 (рис. 4). 45000 40000 2 1 35000 30000 Рис. 4. Регистрация роста M. tuberculosis H37Rv в автоматизированной системе BACTEC MGIT960 при культивировании с КЛ. 1 – H37Rv; 2 – H37Rv + КЛ 33 µМ; 3 – H37Rv + КЛ 500 µМ. ОЕФ 25000 20000 15000 10000 3 5000 0 0 5 10 15 20 25 -5000 дни В такой системе регистрация роста микроорганизмов осуществляется оптически и основана на флуоресценции, возникающей при потреблении кислорода в процессе роста микобактерий. На дне специальной пробирки, в которой культивируют МБТ, содержится кислород-зависимый флуорохромный краситель, покрытый слоем силикона. Изначально концентрация кислорода в среде достаточно велика, что вызывает гашение флуоресценции. Размножение микобактерий приводит к потреблению кислорода в пробирке и снижению его концентрации, что вызывает усиление флуоресценции, которая становится видимой при облучении пробирки ультрафиолетовым светом и автоматически регистрируется фотодатчиками, встроенными в прибор ВАСТЕС MGIT 960. Рост клеток M. tuberculosis H37Rv без липосом (контроль) наблюдали на 8 сутки культивирования, наличие 33 µМ КЛ приводило к задержке роста на 2 дня по сравнению с контролем, в присутствии 500 µМ КЛ клетки вообще не росли (рис. 4). Этот метод не позволяет определить, клетки остановились в росте или погибли. Поэтому далее нами была исследована жизнеспособность МБТ микроскопией после окрашивания клеток по методу Мурохаши (рис. 5), при котором живые клетки окрашиваются в зеленый цвет, а мертвые – в красный. 1 2 3 Рис. 5. Фотографии МБТ под микроскопом после окрашивания клеток по методу Мурохаши (на 14 день роста). 1 – H37Rv; 2 – H37Rv + КЛ (33 µМ); 3 – H37Rv + КЛ (500 µМ). Из рис. 5 видно, что в контроле МБТ (без липосом) преобладали живые клетки, при добавлении 33 µМ КЛ выявлялось около 40% погибших клеток, а в случае с 500 µМ КЛ вообще не обнаружено ни одной микобактериальной клетки. В качестве другого метода оценки жизнеспособности клеток M. tuberculosis H37Rv при культивировании с КЛ (84 и 500 µМ) на 0, 2, 6, 8 и 14 сутки использовали метод ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) для выявления РНК. РНК погибших клеток выходит в культуральную среду и, в отличие от ДНК, быстро разрушается, поэтому отсутствие РНК в образцах МБТ является подтверждением гибели клеток. Результаты определения относительного содержания мРНК в образцах по сравнению с исходным приведены в табл.2. Таблица 2. Относительное число копий мРНК гена rrs16S, кодирующего 16S рРНК, в процессе роста M. tuberculosis H37Rv в присутствии различных концентрациий КЛ 0 день 2 день 6 день 8 день 14 день H37Rv 1 1,86 14,91 32,33 170373 + КЛ 84 µМ 1 1,11 1,05 5,48 4,76 + КЛ 500 µМ 1 мРНК rrs16S отсутствует Как видно из таблицы 2, в контрольных образцах (без КЛ) происходило существенное увеличение содержания мРНК rrs16S на 14 сутки по сравнению с началом эксперимента - в 170373 раза. Под действием 84 µМ КЛ на МБТ в точке окончания эксперимента наблюдали уровень мРНК, превышающий исходный не более чем в 6 раз. То есть 84 µМ КЛ ингибировал увеличение содержания мРНК к концу эксперимента по сравнению с контролем МБТ. А при экспозиции с КЛ в концентрации 500 µМ, начиная уже со второго дня эксперимента, мРНК в пробах не обнаружено. Следующим этапом работы было изучение влияния экзогенного КЛ на рост резистентных штаммов МБТ. В качестве резистентных штаммов M. tuberculosis были использованы клинические штаммы из коллекции ЦНИИТ РАМН: MS-115 , устойчивый одновременно к пяти ПТП 1 ряда (рифампицину, изониазиду, стрептомицину, этамбутолу, пиразинамиду) (штамм с МЛУ) и CN-37 , резистентный, кроме перечисленных выше ПТП 1 ряда, еще к амикацину, капреомицину, офлоксацину (штамм с ШЛУ). Действие липосом КЛ на МБТ указанные штаммы оценивали с использованием тех же методов, что и для чувствительного штамма H37Rv. Регистрацию роста МБТ с МЛУ и ШЛУ в автоматизированной системе BACTEC MGIT 960 проводили в присутствии КЛ (84, 335 и 500 µМ), а также рифампицина (RIF, 1 мкг/мл) и офлоксацина (OFХ, 2 мкг/мл) в их критических для роста чувствительного штамма H37Rv концентрациях (контроли) (рис. 6). 35000 18000 МЛУ ШЛУ 1,2 14000 5 25000 2 16000 30000 1 12000 5,6 10000 MTB-12 без преп MTB-12+КЛ 125 мкг/мл 8000 MTB-12+КЛ 500 мкг/мл MTB-20 без преп MTB-20 + КЛ 125 мкг/мл О ЕФ ОЕФ 20000 15000 MTB-20 + КЛ 500 мкг/мл MTB-20 + КЛ 750 мкг/мл MTB-20 + RIF 1 мкг/мл MTB-20 + OFL 2 мкг/мл MTB-12 + 750 мкг/мл MTB-12 + RIF 1 мкг/мл 6000 10000 4000 5000 3,4 0 2000 3,4 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 -2000 -5000 дни дни Рис. 6. Кривые роста M.tuberculosis штамма MS-115 с МЛУ (слева) и штамма CN-37 с ШЛУ (справа) в автоматизированной системе BACTEC MGIT 960 при культивировании с контрольными (RIF и OFХ) и тестируемым (КЛ) препаратами. МЛУ: 1 – МЛУ, 2 – МЛУ + КЛ (84 µМ), 3 - МЛУ + КЛ (335 µМ), 4 - МЛУ + КЛ (500 µМ), 5 - МЛУ + RIF (1 мг/мл). ШЛУ: 1 –ШЛУ, 2 –ШЛУ + КЛ (84 µМ), 3 - ШЛУ + КЛ (335 µМ), 4 - ШЛУ + КЛ (500 µМ), 5 - ШЛУ + RIF (1 мг/мл), 6 - ШЛУ + OFХ (2 мг/мл). Исходное количество клеток 106 КОЕ/мл. Показано, что контрольный препарат RIF не влиял на рост штамма M.tuberculosis MS-115, тогда как OFX полностью подавлял его рост. Для МБТ CN-37 продемонстрирован рост культуры в присутствии летальных для чувствительного штамма концентраций как RIF, так и OFX (рис.6). При культивировании МБТ обоих штаммов с КЛ получены похожие результаты: липосомы КЛ 84 µМ вызывали задержку начала роста клеток на 4 и 5 дней штаммов с МЛУ и ШЛУ соответственно по сравнению с контрольной культурой (без КЛ). 335 и 500 µМ КЛ полностью подавляли рост клеток обоих штаммов. Эти результаты были подтверждены данными, полученными при определении роста резистентных штаммов МБТ при культивировании с КЛ методом количественной ПЦР на 2, 4, 6, 8 и 14 сутки для МЛУ и на 5, 8, 11, 14 и 18 сутки для ШЛУ. Определение жизнеспособности клеток методом окрашивания по Мурохаши выявило, что в контрольных образцах МБТ с МЛУ и ШЛУ (без добавления препаратов) преобладали живые клетки, при 14-ти дневном инкубировании МЛУ и 18-ти дневном инкубировании ШЛУ с 84 µМ КЛ в мазках выявлено более 30 и 40% погибших клеток соответственно. В образцах M. tuberculosis c МЛУ и ШЛУ, культивируемых с 500 µМ КЛ, клетки в мазках не были обнаружены. Таким образом, различными методами нами был достоверно обнаружен бактерицидный эффект КЛ в концентрациях выше 335 µМ в отношении как чувствительного штамма M. tuberculosis H37Rv, так и клинических резистентных штаммов M. tuberculosis с МЛУ и ШЛУ. Полученные результаты открывают реальные возможности создания новых эффективных липосомальных форм ПТП на основе КЛ для лечения резистентных форм туберкулеза, поскольку предполагается и подтверждается предварительными исследованиями, что включение в липосомы из КЛ известных на сегодняшний день ПТП может снизить концентрацию используемой активной субстанции и повысить эффективность бактерицидного действия липосомальной формы препарата на патогенные штаммы, не чувствительные к антибиотикам. СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ: 1. Tyurin V.A., Tyurina Y.Y., Osipov A.N., Belikova N.A., Basova L.V., Kapralov A.A., Bayir H., Kagan V.E. Interactions of cardiolipin and lyso-cardiolipins with cytochrome c and tBid: conflict or assistance in apoptosis // Cell Death and Differentiation. – 2007. – V. 14. – P. 872– 875. 2. Mileykovskaya E., Dowhan W. Cardiolipin membrane domains in prokaryotes and eukaryotes // Biochim Biophys Acta. – 2009. – V. 1788. – P. 2084–2091. 3.Сорокоумова Г.М., Андреевская С.М., Смирнова Т.Г., Петрова Е.Е., Жогина Ю.А., Калашникова Т.Ю., Черноусова Л.Н., Селищева А.А., Швец В.И. Влияние экзогенного кардиолипина на рост и жизнеспособность культуры M. tuberculosis H37Rv in vitro // Доклады академии наук. – 2010. – Т. 434, №5. – С. 705–708.
