На правах рукописи БАТКАЕВА НАДЕЖДА ВЛАДИМИРОВНА Совершенствование регламентированных методов диагностики,

На правах рукописи
БАТКАЕВА НАДЕЖДА ВЛАДИМИРОВНА
Совершенствование регламентированных методов диагностики,
лечения и профилактики серорезистентности при сифилисе.
14.00.11 – кожные и венерические болезни
14.00.36 – аллергология и иммунология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Москва – 2008
Работа выполнена в ГОУ ДПО «Российская медицинская академия
последипломного образования Росздрава»
Научные руководители:
доктор медицинских наук, профессор Атауллаханов Равшан Иноятович
кандидат медицинских наук, доцент Рюмин Дмитрий Валентинович
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук, профессор Ломоносов Константин Михайлович
Московская медицинская академия им. И.М.Сеченова
доктор медицинских наук, профессор Стенина Марина Александровна
Российский государственный медицинский университет
Ведущая организация:
ГОУ ВПО Российский Университет Дружбы Народов, г. Москва
Защита диссертации состоится 16 февраля 2009 г. в14.00 часов на заседании
диссертационного совета Д 208.072.10 при ГОУ ВПО Российский
государственный медицинский университет по адресу: 117997, г.Москва, ул.
Островитянова, д.1.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке РГМУ.
Автореферат разослан "14" ноября 2008 г.
Ученый секретарь
диссертационного совета
доктор медицинских наук,
профессор
И.В. Хамаганова
2
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы.
Заболеваемость сифилисом в нашей стране на протяжении последних лет
остается стабильно высокой (Н.К. Привалова, Л.И. Тихонова, 2000; Э.А.
Баткаев, 2006). Регламентированные методы специфического лечения сифилиса
не всегда обеспечивают негативацию серологических реакций (КСР, РИБТ и
РИФ), обусловливая развитие феномена серорезистентности (СР). Под
серорезистентностью
при
сифилисе
понимают
сохранение
стойкой
позитивности КСР (РМП с кардиолипиновым антигеном) или отсутствие
снижения титра специфических антител в 4 и более раз в течение года после
проведенного полноценного лечения.
Общепринято выделять три варианта серорезистентности при сифилисе:
истинную, относительную и псевдорезистентность.
Истинная серорезистентность совпадает с проградиентным течением
сифилитической
инфекции.
Такие
больные
подлежат
этиотропной
и
иммунокорригирующей терапии (М.В. Милич, 1987; Е.В. Соколовский, 1995;
Н.В. Фриго, 2001).
Относительная серорезистентность поддерживается наличием в организме
мало- и авирулентных цист (Н.М. Овчинников, 1970; М.В. Милич, 1987; М.А.
Уфимцева, 2003). Такие больные подлежат иммуностимулирующей
и
этиотропной терапии.
Псевдорезистентность – это сохраняющиеся положительные серореакции,
обусловленные нарушениями в иммунной системе, приводящие к постоянной
активации иммунокомпетентных клеток – «клеток-памяти», обеспечивающих
синтез кардиолипиновых антител при отсутствии в организме истинного
возбудителя (В.В. Чеботарев, 2006).
Несмотря на многолетние усилия как отечественных, так и зарубежных
ученых, разработчиков и производителей диагностических систем до сих пор
не удалось создать надежных методик, позволяющих диагностировать наличие
3
либо отсутствие трепонем в организме человека после адекватной и
полноценной этиотропной терапии.
Остается также актуальной проблема повышения эффективности терапии
сифилиса,
поскольку
серорезистентности)
в
частота
последнее
неуспешного
десятилетие
лечения
выросла.
(развитие
Известно,
что
серорезистентность при лечении сифилиса дюрантными формами пенициллина
(ретарпен и экстенциллин), по данным разных авторов, составляет 15-30% (Э.А.
Баткаев, М.В. Шапаренко, 1999, 2000; В.А. Аковбян и соавт., 1998; О.К. Лосева
и соавт., 1998; В.В. Чеботарев и соавт., 1996, 1998).
Таким образом, вопрос создания надежной (высокочувствительной и
специфичной) тест-системы для прямой детекции T. pallidum в организме
больного сифилисом и определения методов лечения, снижающих риск
появления серорезистентности, остается открытым.
Цель исследования: Изучить иммунопатогенез заразных форм сифилиса,
выявить эффективность иммуночипа в диагностике серорезистентности при
сифилисе, определить эффективность применения иммуномодуляторов при
профилактике и лечении серорезистентности.
Задачи исследования:
1) Провести клинико-иммунологическую и серологическую оценку больных
заразными формами сифилиса.
2) Сравнить диагностическую значимость иммуночипа со стандартными
серологическими реакциями: РМП, РИФ-200, РИФ-abs, РИБТ, ИФА при
выявленной серорезистентности при сифилисе и его преимущества.
3) Оценить
терапевтическую
эффективность
иммуномодулятора
иммуномакса в комплексной терапии больных вторичным сифилисом
кожи и слизистых оболочек.
4) Оценить
терапевтическую
эффективность
иммуномодулятора
ронколейкина в комплексной терапии и ее влияние на серорезистентность
при сифилисе.
4
5) Разработать оптимальную схему лечения и профилактики развития
серорезистентности при сифилисе.
Научная новизна. Впервые был
острозаразными
формами
изучен
сифилиса.
иммунопатогенез у больных
Выявлено
снижение
активности
клеточного звена иммунитета, в частности снижение реакции фагоцитоза (у
42%), Т-клеточного и В-клеточного звеньев иммунитета (существенное
снижение количества Т-хелперных (у 45%) и увеличение количества
цитолитических CD8+ Т-киллерных лимфоцитов (у 70%), активированных NKклеток (у 60%), резкое снижение индекса иммунорегуляции (у 60%),
значительное увеличение уровня активированных лимфоидных элементов).
Проведена клинико-иммунологическая и серологическая оценка больных
острозаразными формами сифилиса до и после лечения. Показано, что после
проведенного комплексного лечения дюрантными препаратами пенициллина
(ретарпена,
экстенциллина)
и
иммуномаксом
наступило
клинико-
серологическое выздоровление и нормализация показателей иммунного
статуса: негативация наступила у всех больных, патологически измененные
показатели клеточного и гуморального иммунитета, выявленные до лечения,
после терапии пришли к нормальным значениям у всех пациентов.
Впервые проведена оценка диагностической значимости иммуночипа при
серорезистентности у больных сифилисом.
Впервые на основании клинико-серологических исследований у больных с
серорезистентностью при сифилисе установлено повышение эффективности
антибактериальной
пенициллином)
в
терапии
сочетании
(цефтриаксоном
с
рекомбинантным
и
водорастворимым
интерлейкином-2
–
ронколейкином: полная негативация РМП наступила у 33,3% больных.
Теоретическая и практическая значимость работы.
Проведенные исследования позволили разработать методику диагностики
серорезистентности с использованием иммуночипа, обосновать включение
иммуномакса в комплексную терапию вторичного сифилиса кожи и слизистых
5
оболочек, показать его положительное влияние на сроки регресса сифилидов и
негативацию серологических реакций. Полная негативация РМП наступила у
100% больных через 15 месяцев наблюдения.
Полученные данные о клинической эффективности ронколейкина в
комплексном лечении серорезистентности у больных сифилисом в виде полной
негативация РМП у 33,3% больных и снижения титров с кардиолипиновым
антигеном и значения РМП у всех больных за 15 месяцев клиникосерологического
контроля
позволяют
нам
рекомендовать
данный
иммуномодулятор для включения в схемы лечения серорезистентности в
амбулаторных и стационарных условиях.
Внедрение результатов работы. Методы лечения вторичного сифилиса кожи
и слизистых оболочек с использованием в комплексной терапии иммуномакса и
серорезистентности при сифилисе с использованием ронколейкина внедрены в
работу венерологического отделения ГКБ №14 им. В.Г. Короленко и в работу
Читинского филиала ГУ Научного центра медэкологии ВСНЦ СО РАМН,
используются
на
циклах
ОУ
и
ТУ
последипломной
подготовки
дерматовенерологов на кафедре дерматовенерологии и клинической микологии
ГОУ ДПО РМАПО Росздрава.
Апробация работы. Основные результаты работы доложены и обсуждены на
ХII, XIII междисциплинарных симпозиумах «Новое в дерматовенерологии,
андрологии, акушерстве и гинекологии: наука и практика» (Москва, 2007,
2008); II Всероссийском Конгрессе дерматовенерологов (Санкт-Петербург,
2007); Научно-практической конференции «Актуальные проблемы диагностики
и терапии в дерматовенерологии», посвященной 35-летию КВД №23 (Москва,
2008);
Х
Всероссийском
съезде
дерматовенерологов
(Москва,
2008);
Московском обществе дерматовенерологов (Москва, 2008).
Положения, выносимые на защиту:
1. Иммуночип – эффективный метод в дифференциальной диагностике
серорезистентности при сифилисе.
2. Положительное влияние иммуномакса на изменения в клеточном и
6
гуморальном звеньях иммунитета у больных вторичным сифилисом кожи и
слизистых
оболочек
характеризуется
повышением
эффективности
антибактериальной терапии сифилиса на 36%, позволяет сократить сроки
регресса сифилидов, ускорить негативацию серологических реакций и снизить
риск развития серорезистентности при сифилисе.
3. Комплексное лечение больных с серорезистентностью при сифилисе с
включением ронколейкина позволяет добиться снижения позитивности и
негативации серологических реакций.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 научных работ.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора
литературы, описания материалов и методов, главы собственных исследований,
обсуждения полученных материалов, выводов, списка литературы. Работа
изложена на 146 страницах машинописного текста, включает 12 рисунков и 46
таблиц. Указатель литературы содержит 147 источников, из них 79 –
отечественных и 68 – зарубежных.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.
1. Общая характеристика больных.
За период 2005 – 2008 гг. в венерологическом отделении городской
клинической больницы №14 им. В.Г. Короленко и в КВД №№ 5, 6, 7, 19, 23, 30
города Москвы под нашим наблюдением находилось 232 пациента различными
формами сифилиса. Из них больных вторичным сифилисом кожи и слизистых
оболочек было 80 человек, больных с развившейся серорезистентностью после
полноценного специфического лечения сифилиса было 161 человек. Диагноз
сифилиса выставлялся в соответствии с международной классификацией
болезней Х пересмотра. Состояние «серорезистентности» определялось у
больных при сохранении стойкой позитивности РМП или отсутствии снижения
титра с кардиолипиновым антигеном в 4 и более раза в течение года после
полноценного лечения сифилиса.
7
2. Методы исследования.
2.1. Серологические исследования на сифилис: микрореакция преципитации
(МРП);
комплекс
кардиолипиновым
серологических
антигеном
и
реакций
с
на
сифилис
ультраозвученным
(КСР)
антигеном
с
из
культуральных трепонем проводили всем пациентам с диагнозом вторичный
сифилис кожи и слизистых оболочек; реакция иммобилизации бледных
трепонем (РИБТ); реакция иммунофлюоресценции (РИФ) в вариантах РИФ-200
и РИФ-abs; иммуноферментный анализ (ИФА). Постановка серореакций
выполнялась в соответствии с приказом №87 от 26.03.2001. После проведенного
комбинированного лечения проводился клинико-серологический контроль сразу
после окончания терапии, затем через 3, 6, 9, 12, 15 месяцев. Для постановки
серологических тестов использовались диагностикумы, зарегистрированные на
территории Российской Федерации.
2.2. Иммунологические методы исследования.
Тесты по оценке количественного состава и функционального состояния
иммунокомпетентных клеток выполнялись в отделе активации иммунитета
ГНЦ
«Институт
иммунологии»
ФМБА
России.
Венозную
кровь
для
иммунологических исследований забирали у пациентов из локтевой вены
натощак в 8-10 часов утра, используя систему «Вакутейнер» фирмы «Бэктон
Дикенсон» в 3 пробирки по 5 мл (пробирки с антикоагулянтами ЭДТА и
гепарином и в сухую пробирку). Иммунологические реакции проводились не
позднее чем через 4 часа после забора крови. Иммунный статус исследовали
методами лазерной цитометрии, хемилюминесценции, иммунодиффузии.
Количество клеток и фенотип лимфоцитов, относящихся к различным
популяциям,
а
функциональной
также
молекулярные
специализации
маркеры
клеток
активации,
анализировали
зрелости
и
методом
иммунофлуоресценции с помощью моноклональных антител и проточного
лазерного
цитофлуориметра
FACSCalibur
фирмы
Becton
Dickinson.
Определение зрелых цитолитических CD8+ Т-лимфоцитов и NK-клеток ex vivo
проводили по содержанию внутриклеточного перфорина методом проточной
8
лазерной
цитофлуорометрии.
О
состоянии
фагоцитарной
активности
нейтрофилов периферической крови судили по интенсивности фагоцитоза
меченых флюоресцином бактерий E. coli с последующей оценкой результатов с
помощью проточного лазерного цитофлуориметра. Функциональные ответы
нейтрофилов
на
опсонизированный
зимозан
и
ФМА
измеряли
по
хемилюминесценции клеток. Концентрацию иммуноглобулинов IgG, IgA, IgM
определяли турбодиметрическим методом с помощью наборов фирмы Human,
иммуноглобулина IgE – иммуноферментным методом с помощью наборов «Диа
Плюс», циркулирующие иммунные комплексы – турбодиметрическим методом
по скорости образования агрегатов в 3% и 4% полиэтиленгликоле.
2.3. Иммуночип. Определение рекомбинантных белков T. pallidum Tp47, Tp17,
Tp15, TmpA проводили в ФГУН «ЦНИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора
(Москва)
на
тест-системах
в
формате
иммуночипа
для
выявления
иммуноглобулинов класса М и G к T. pallidum. Интерпретация результатов
производилась путем расчета коэффициентов позитивности (КП) сыворотки
для
каждого
антигена.
КП
рассчитывали
как
отношение
сигнала
флуоресценции (СФ) исследуемого образца к критическому уровню сигнала
флуоресценции (Cut off). Cut off рассчитывали для каждого антигена
индивидуально и принимали равными Cut off = 2К-, где К- — значения
флуоресценции
отрицательного
контрольного
образца. По
алгоритмом интерпретации результатов в тест-системе
аналогии с
«INNO-LIA Siphilis
Score» образец считали положительным, если значения КП было больше или
равно 1,0 для двух и более антигенов. Образец считали неопределенным
(сомнительным) при значении КП больше или равным 1,0 только для одного
антигена. Образец считали отрицательным, если значения КП было меньше 1,0
для всех антигенов.
3. Методики профилактики и лечения серорезистентности при сифилисе.
Методика лечения больных вторичным сифилисом кожи и слизистых
оболочек
заключалась
во
внутримышечном
введении
бензатина
бензилпенициллина (ретарпена фирмы «Biochemie» или экстенциллина фирмы
9
«Rhone-poulenc rorer») в дозировке 2,4 млн. ЕД 1 раз в 7 дней № 3 в комбинации
с иммуномаксом фирмы «Иммафарма» (Россия). Иммуномакс вводили
внутримышечно по 200 ЕД один раз в сутки на 1, 2, 3 дни лечения.
С учетом невысокой эффективности иммуномакса при лечении СР
(исследования, проводимые в отделе активации иммунитета ГНЦ «Институт
иммунологии» ФМБА России), лечение СР при сифилисе осуществлялось
путем введения водорастворимого пенициллина в дозировке 1млн. ЕД каждые
6 часов внутримышечно в течение 28 дней или цефтриаксона по 1,0 г
внутримышечно 1 раз в сутки №20 в сочетании с иммуномодулирующим
препаратом
ронколейкином
фирмы
"Биотех"
(г.
Санкт-Петербург).
Ронколейкин вводили по 0,5 мг подкожно 1 раз в 3 дня, на курс 10 инъекций.
4. Статистический метод исследования.
Обработку полученных данных проводили с помощью программы
статистической
обработки
результатов
с расчетом среднего
значения,
среднеквадратичного отклонения, коэффициента Стьюдента и коэффициента
корреляции. Результаты считались достоверными при р<0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.
1. Оценка эффективности применения иммуномакса при вторичном
сифилисе кожи и слизистых оболочек с целью профилактики развития
серорезистентности при сифилисе.
Данную группу составили 80 больных вторичным сифилисом кожи и
слизистых оболочек, получавших лечение бензатин бензилпенициллином
(ретарпеном и экстенциллином) в сочетании с иммуномаксом. Мужчин было 35
человек (43,75%), женщин — 45 человек (56,25%). Возраст пациентов
составлял от 16 до 66 лет. Распределение больных с диагнозом вторичный
сифилис кожи и слизистых оболочек по возрасту представлено в таблице 1.
Более половины наблюдавшихся больных (75%) были молодыми людьми в
возрасте от 16 до 30 лет.
10
Таблица 1. Распределение больных вторичным сифилисом кожи и
слизистых оболочек по возрасту (1 группа, n=80).
Возраст, лет
Пол
Женщины
Мужчины
Итого:
<20
(n)
17
5
22
21-40
(n)
23
27
50
> 41
(n)
5
3
8
Всего
(n)
45
35
80
Все обследованные были разделены на две группы: опытную и группу
сравнения. Опытную группу составили 30 больных вторичным сифилисом
кожи и слизистых оболочек, которые наряду с базисной терапией (бензатин
бензилпенициллин по 2,4 млн. ЕД 1 раз в 7 дней № 3) получали иммуномакс по
200 ЕД в/м на 1, 2, 3 дни антибиотикотерапии. Группу сравнения составили 50
больных вторичным сифилисом кожи и слизистых оболочек, получавших
только антибиотикотерапию (бензатин бензилпенициллин по 2,4 млн. ЕД 1 раз
в 7 дней № 3).
У всех пациентов имелись клинические проявления вторичного сифилиса.
Из них у 58 (72,5%) – розеолезная сыпь туловища, у 36 (45%) – папулезная
сыпь на туловище, у 35 (43,7%) – папулы ладоней и подошв, у 19 (23,7%) –
гипертрофические папулы и широкие кондиломы перианальной области, у 19
(23,7%) – регионарный склераденит, у 15 (18,7%) – папулезная ангина и
сифилитическое рауседо, у 10 (12,5%) – диффузная алопеция головы, симптом
Пинкуса, у 10 (12,5%) больных имелись остаточные явления твердого шанкра.
Диагноз вторичного сифилиса кожи и слизистых оболочек всем пациентам
был подтвержден серологическими методами исследования, постановкой
микрореакции преципитации, РИБТ, РИФ, ИФА с раздельным определением
специфических IgM и IgG.
Все больные, как в группе исследования, так и в группе контроля хорошо
перенесли лечение, побочных реакций не возникло. Реакция Герксгеймера после
начала антибиотикотерапии отмечалась у всех 80 (100%) человек. Она наступала
11
через 4-5 часов после первой инъекции ретарпена или экстенциллина и
проявлялась недомоганием и повышением температуры тела в пределах 37,538,3ºС, продолжаясь не более 7-8 часов. На введение иммуномакса осложнений
и побочных явлений также выявлено не было. В процессе лечения всеми
пациентами группы исследования было отмечено улучшение общего состояния:
уменьшилось количество жалоб на слабость, плохой сон, утомляемость,
отмечалось повышение жизненной активности, улучшался аппетит, по
сравнению с больными группы контроля, у которых этой положительной
динамики в общем состоянии вообще не отмечалось.
У больных вторичным сифилисом кожи и слизистых оболочек, получавших
комплексную
терапию
дюрантными
препаратами
пенициллина
и
иммуномаксом, отмечался более быстрый регресс сифилидов, по сравнению с
больными из группы контроля (таблица 2).
Таблица 2. Сроки регресса сифилидов у пациентов с диагнозом вторичный
сифилис кожи и слизистых оболочек на фоне лечения иммуномаксом в
сравнении с группой контроля.
Клинические
проявления.
Розеолезная сыпь
Папулы туловища
Папулы ладоней
и подошв
Гипертрофические
папулы и широкие
кондиломы
перианальной
области
Папулезная ангина и
сифилитическое
рауседо
Комплексное
лечение
ретарпеном и
иммуномаксом,
дни
n=30; М±m
5,12±0,35
n=28
10,23±0,53
n=12
15,4±0,25
n=10
Лечение
ретарпеном,
контроль
дни
n=50; М±m
Р
8,5±0,26
n=30
15,3±0,65
n=24
19,8±0,46
n=25
Р<0,001
13,2±0,56
n=6
16,45±0,68
n=13
Р<0,001
6,3±0,76
n=2
9,5±0,54
n=13
Р<0,001
12
Р<0,001
Р<0,001
Как видно из данных таблицы 2, сокращение сроков регресса высыпаний
варьировало от 3 до 7 дней. Так, у больных, пролеченных комбинированным
методом, розеолы туловища исчезали в среднем на 3 дня раньше, папулезные
высыпания на туловище разрешались на 5 дней быстрее, папулы ладоней и
подошв – на 4 дня, гипертрофические папулы и широкие кондиломы
перианальной области – на 3, папулезная ангина и сифилитическое рауседо –
также на 3 дня ранее.
Полученные данные дают основание рассматривать более быстрое
разрешение клинических симптомов как воздействие иммуномакса. Известно,
что при сифилисе нарушаются регенераторные и репаративные процессы,
развиваются воспалительные реакции, поэтому сифилиды заживают дольше.
Возможно,
иммуномакс
опосредованно
через
стимуляцию
моноцитов
увеличивает секрецию ИЛ-8, ИЛ-1β и ФНО-α, которые, в свою очередь, играют
большую роль в регуляции функции фибробластов, эпителиальных клеток, Тклеточного звена иммунитета (Р.И. Атауллаханов, 2005).
Для диагностики иммунологических расстройств у обследованных нами
больных было изучено состояние клеточного и гуморального звеньев
иммунитета у 20 больных группы исследования до и после лечения (в сроки от
1 до 3 месяцев после его окончания).
Исходный иммунный статус больных вторичным сифилисом кожи и
слизистых оболочек характеризовался: повышением моноцитов (у 70%
больных),
палочкоядерных
нейтрофилов
(у
95%),
спонтанной
хемилюминесценции (у 47%), активированных NK-клетки (у 60%), NK-клеток
CD16+56— (у 80%), цитолитических CD8+ Т-лимфоцитов с перфорином (у
70%), СОЭ (у 80%), иммуноглобулинов IgG (у 79%) и IgA (у 71%), ЦИК (у
55%); понижением общего количества лимфоцитов (у 25%), сегментоядерных
нейтрофилов (у 25%), фагоцитирующей способности нейтрофилов (у 42%),
цитолитических NK-клеток, содержащих перфорин (у 45%), CD4+ T-клеток (у
25%), CD4+CD45RA-/RO+ T-клеток «памяти» (у 30%), CD8+ Т -лимфоцитов (у
35%), активированных HLA-DR+CD8+ Т-клеток (у 15%). В целом все эти
13
показатели соответствуют изменениям иммунного статуса при острой
бактериальной инфекции.
С целью коррекции иммунологических нарушений в комплексной терапии
вторичного сифилиса кожи и слизистых оболочек нами был использован
современный
иммуномодулятор
иммуномакс.
Иммунофармакологические
механизмы действия препарата состоят в том, что иммуномакс активирует NКклетки, усиливая их цитолитическую активность; циркулирующие моноциты,
которые
через
2-4
часа
после
активации
иммуномаксом
начинают
секретировать цитокины: ИЛ-8, ИЛ-1β и ФНО-α и активируют популяцию
нейтрофильных гранулоцитов; тканевые макрофаги, что проявляется в
изменении морфологии этих клеток, усилении продукции бактерицидных
субстанций, изменении активности 5'- нуклеотидазы; образование антител
против
чужеродных
антигенов,
растворимых
и
корпускулярных
(Р.И.
Атауллаханов, 2005).
В целом в группе пациентов, получивших комплексное лечение бензатин
бензилпенициллинами и иммуномаксом, отмечались все признаки ослабления
иммунного воспаления после лечения; проявляющиеся снижением количества
палочкоядерных нейтрофилов, иммунорегуляторного индекса, NK-клеток, в
том числе и содержащих перфорин, цитолитических CD8+ Т-клеток,
содержащих перфорин и циркулирующих иммунных комплексов. При
сравнении динамики иммунных показателей между мужчинами и женщинами
происходили практически одинаковые изменения в обеих группах. В то же
время, отсутствие динамики уровня цитолитических NK-клеток, содержащих
перфорин у женщин, характеризует сохранение у них иммунологической
напряженности длительное время (таблица 3).
В процессе лечения происходило достоверное снижение количества NKклеток у больных сифилисом, однако, как было обнаружено ранее до начала
лечения, содержание NK-клеток у мужчин и женщин сильно различалось.
Оказалось, что и динамика NK-клеток, особенно NK-клеток, содержащих
перфорин, у мужчин и женщин была принципиально разной. У больных
14
сифилисом мужчин содержание NK-клеток до начала лечения существенно
превышало норму и после лечения значительно снижалось. У больных
сифилисом женщин наблюдалось исходно низкое содержание NK-клеток (на
нижней границе нормы) и после лечения практически не изменялось.
Таблица 3. Динамика иммунологических показателей больных вторичным
сифилисом кожи и слизистых оболочек после проведенного лечения (n=20).
мг/л
Мужчины (n=13)
До После p
653 469
±298 ±210 0,09
25,3 17,8
±13,8 ±11,1 0,16
12,9 7,2
±8,0 ±2,6 0,17
Женщины (n=7)
До После p
438
387
±193 ±117,79 0,56
30,4 20,3
±15,3 ±14,44 0,23
7,2
6,0 0,58
±2.6
±0
CD3+ T-клетки
кл./мкл
1291 1642
±478 ±646 0,14
1287 1469
±495 ±455,9 0,49
CD8+ T-клетки
кл./мкл
433 628
±277 ±376 0,16
394
480
±167 ±186,01 0,38
Иммунорегуляторный
коэффициент
1,87 1,50 0,13
CD4+/CD8+
±0,64 ±0,52
+
CD3 16/56
498 359
кл./мкл
NK-клетки
±309 ±137 0,17
Активированные
% от
27,0 21,6 0,20
HLA-DR+
NK-клеток
±10,7
±9,2
NK-клетки
2,06 1,78
0,27
±0,56 ±0,29
189
227
±42 ±126,77 0,46
21,2 17,8
±5,8 ±6,63 0,32
Фенотип CD3-16-56+
NK-клеток
Показатель
Палочкоядерные
нейтрофилы
СОЭ
C-реактивный белок
Цитолитические
NK-клетки,
содержащие
перфорин
Активированные
CD4+CD45RA+/RO+
Т-клетки
Активированные
CD8+CD45RA+/RO+
T-клетки
ЦИК (в 4% ПЭГ)
Ед.
измерения
кл./мкл
мм/час
% от
NK-клеток
8,1 17,4
±4,5 ±10,8 0,01
16,2 21,7
±10,1 ±8,89 0,31
кл./мкл
384 269
±246 ±110 0,16
112
170
±45 ±106,34 0,21
% от CD4+
T-клеток
6,2
±2,6
5,3
±2,2
% от CD8+
T-клеток
4,7
4,0
±2,0 ±2,0 0,46
50,9 40,8
±21,6 ±18,2 0,23
y.e.
15
4,4
±1,4 0,05
6,3
±2,14 0,42
5,7
3,5 0,08
±2,3
±2
54,9 43,1
±26,0 ±10,07 0,29
Патологически повышенные или пониженные значения иммунологических
показателей у больных вторичным сифилисом кожи и слизистых оболочек
после проведенного комплексного лечения с включением иммуномакса
достигали
нормальных
значений.
Нормализация
уровней
NK-клеток,
содержащих перфорин, палочкоядерных нейтрофилов, иммунорегуляторного
индекса, цитолитических CD8+ Т-клеток свидетельствует о полной элиминации
бледных трепонем из организма больных (таблица 3).
До начала лечения КСР был положительным у 100% пациентов в обеих
группах. У пациентов в группе исследования уже через 3 месяца наблюдения
отмечалась положительная динамика в негативации РМП (РМП начала
снижаться у всех пациентов и стала отрицательной у 16,7%), в то время как в
группе контроля РМП оставалась без изменений у 14% больных и стала
отрицательной лишь у 6% (рисунок 1). Негативация в группе исследования
происходила у большего процента пациентов в сравнении с группой контроля и
в меньшие сроки.
Через 15 месяцев после проведенного лечения вторичного сифилиса кожи и
слизистых оболочек пациентов в группе исследования полная негативация РМП
с кардиолипиновым антигеном произошла у 30 (100%) человек. Поэтому
диагноз СР при сифилисе не был выставлен ни одному из пациентов,
получавших
лечение
бензатин
бензилпенициллином
(ретарпеном
и
экстенциллином) и иммуномаксом. В то же время, диагноз СР при сифилисе
был выставлен 24% больных в группе контроля. Этим пациентам была
проведена
дополнительная
терапия
в
соответствии
с
Методическими
материалами по диагностике и лечению наиболее распространенных инфекций,
передаваемых половым путем (ИППП), и заболеваний кожи (2003). Еще у 12%
пациентов также было проведено дополнительное лечение в связи с
замедлением негативации серологических реакций.
16
Рисунок 1. Сроки полной негативации РМП после проведенного
комплексного лечения иммуномаксом и бензатинпенициллином у пациентов с
диагнозом вторичный сифилис кожи и слизистых оболочек (n=80).
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
%
100
76,6
64
53,3
56
26,6
16,6
28
22
6
3 мес
6мес
9мес
12 мес
15 мес
▲ – группа исследования
● – группа контроля
Очевидно, что более быстрая негативация серологических реакций в
группе исследования происходила, благодаря включению в комплексную
терапию вторичного сифилиса кожи и слизистых оболочек иммуномодулятора
– иммуномакса.
2. Иммуночип.
Методом иммуночипа был проведен анализ сывороток пациентов с СР
после лечения сифилиса. Группу пациентов с диагнозом сифилис скрытый
серорезистентный составили 91 человек. Возраст – от 19 до 70 лет (40,5±12,8).
Мужчин было 45 (49,5%), женщин – 46 (50,5%). Распределение больных с
диагнозом сифилис скрытый серорезистентный по возрасту представлено в
таблице 4.
Большинство больных 70 (77%) СР были людьми молодого и среднего
возраста (21-50 лет). У всех наблюдавшихся пациентов отмечалось длительное
(до 12 лет) состояние СР после проведенного полноценного лечения различных
форм сифилиса, у 26,9% была выявлена сопутствующая патология.
17
Таблица
4.
Распределение
больных
сифилисом
скрытым
серорезистентным, обследованных по методике иммуночипа, по возрасту
(n=91).
Пол
Возраст, лет
<20 От 21 до 30 От 31 до 40 От 41 до 50 От 51 до 60 >60 Всего
(n)
(n)
(n)
(n)
(n)
(n)
(n)
Женщины 2
18
11
10
3
Мужчины 2
1
11
19
8
Итого:
4
19
22
29
11
Результаты стандартных серореакций представлены в таблице 5.
2
46
4
45
6
91
Методом
ИФА обнаруживались IgG у всех пациентов, IgM не выявлялись.
Таблица 5. Результаты серологического обследования больных с СР при
сифилисе (n=91).
РМП
РИБТ
РИФ200
РИФabs
Результат
n (%)
n (%)
n (%)
n (%)
Резко-положительный
85 (93,4)
9 (9,9)
52 (57,1)
74 (81,3)
Положительный
2 (2,2)
79 (86,8)
26 (28,6)
15 (16,5)
Слабо-положительный
4 (4,4)
3 (3,3)
12 (13,2)
2 (2,2)
Сомнительный
-
-
-
-
Отрицательный
-
-
1 (1,1)
-
Всем пациентам было произведено исследование крови на наличие антител
(IgM и IgG) к рекомбинантным белкам бледной трепонемы Tp15, Tp17, Tp47,
TmpA методом иммуночипа. IgM к отдельным рекомбинантным белкам
обнаруживались у 44% пациентов. С учетом вышеуказанного алгоритма
интерпретации результатов, положительными по IgM оказались 27,5%
проанализированных сывороток пациентов с СР при сифилисе – эти сыворотки
были положительны по двум и более антигенам. Результаты 16,5% сывороток, в
которых определялись антигены к одному рекомбинантному белку T. pallidum
(Tp17), характеризовали как неопределенные (таблица 6). Обнаружение IgM
методом иммуночипа у больных с СР при сифилисе свидетельствует о
сохранении у них маловирулентных высокоиммуногенных форм бледных
18
трепонем и является предпосылкой для проведения дополнительного курса
лечения, включающего антибиотики и иммуномодуляторы.
Таблица 6. Результаты выявления IgM к рекомбинантным белкам T.
pallidum Tp15, Tp17, Tp47, TmpA иммуночипом (n=91).
Результат
Tp15
M±m
3,23±4,3
Tp17
M±m
3,07±2,20
Tp47
M±m
3,16±4,9
TmpA
M±m
3,41±5,8
Положительный (n =19; 20,9%) (n =40; 44,0%) (n =26; 27,5%) (n =13; 14,3%)
0,58±0,20
0,35±0,18
0,55±0,20
0,55±0,17
Отрицательный (n =72; 79,1%) (n =51; 56,0%) (n =66; 72,5%) (n =78; 85,7%)
p
<0,001
<0,001
<0,001
<0,001
При анализе результатов определения IgG в сыворотках крови пациентов с
СР при сифилисе были получены положительные результаты в 98,9% случаев
(усилено
антителообразование
по
отношению
ко
всем
определяемым
антигенам). У 90 пациентов определялись антитела к трем и более антигенам T.
pallidum. У 1 (1,1%) пациента результаты по всем четырем антигенам были
отрицательными при резкой позитивности стандартных серологических
реакций (РМП, РИБТ, РИФ200 и РИФabs). У этого пациента был выявлен факт
неправильного хранения материала перед исследованием, что не исключало
возможности получения ложноотрицательного результата.
Таким образом, при сравнении полученных результатов ИФА и
иммуночипа, можно сделать вывод о более высокой чувствительности и
специфичности иммуночипа. Однако преимуществом иммуночипа является
дифференцированное определение антител к различным специфичным белкам
бледной
трепонемы,
тем
самым,
практически
исключая
появление
ложноположительных результатов (особенно при системных и аутоиммунных
заболеваниях). Кроме того, при использовании иммуночипа появляется
возможность разработки дифференциальных критериев истинной и ложной СР
при сифилисе. Так, обнаружение у больных с СР IgM к рекомбинантным
белкам T. pallidum Tp15, Tp17, Tp47, TmpA свидетельствует о сохранении
19
бледных трепонем в организме после проведенного лечения ранних форм
сифилиса и активности инфекционного процесса, что является показанием для
проведения
комплексного
дополнительного
лечения
с
включением
антибиотиков и иммуномодуляторов и возможностью дифференциации данной
формы СР, как истинной. Обнаружение же у больных IgM только к Tp17 не
является критерием диагностики истинной СР, так как известно, что синтез
антител к данному рекомбинантному белку в течение длительного времени
сохраняется после проведенного лечения заразных форм сифилиса.
Обнаружение только IgG у больных через несколько лет после
проведенного полноценного лечения сифилиса обусловлено постоянной
активацией «клеток-памяти», обеспечивающих синтез антител при отсутствии в
организме возбудителя.
3. Оценка эффективности применения ронколейкина при СР у больных
сифилисом.
В
данную
группу
включен
61
больной
сифилисом
скрытым
серорезистентным, получавшие лечение антибиотиками (водорастворимым
пенициллином или цефтриаксоном), в сочетании с ронколейкином. Мужчин
было 30 (49,2%), женщин – 31 (50,8%). Возраст пациентов варьировал от 20 до
70 лет (39,6±12,6). Распределение больных с диагнозом сифилис скрытый
серорезистентный по возрасту представлено в таблице 7.
Таблица
7.
Распределение
больных
сифилисом
скрытым
серорезистентным по возрасту (n=61).
Возраст, лет
Пол
<20
21-30
31-40
41-50
51-60
Всего
(n)
(n)
(n)
(n)
(n)
(n)
Женщины
2
15
6
6
2
31
Мужчины
0
1
7
12
10
30
Итого:
2
16
13
18
12
61
С целью ускорения негативации серологических реакций у больных с СР
при сифилисе нами был выбран иммуномодулятор ронколейкин, который
восстанавливает синтез эндогенного ИЛ-2 активированными CD4+ и CD8+
20
клетками, компенсирует дефицит эндогенного ИЛ-2, воздействует на клеткимишени: NK-клетки, Т-хелперы, цитотоксические Т-лимфоциты, B-лимфоциты,
моноциты,
являясь
для
них
фактором
активации,
пролиферации
и
дифференцировки, регулирует Th1/Th2 баланс, отменяет иммунологическую
толерантность, предохраняет активированные Т-клетки от преждевременной
гибели.
Все обследованные были разделены на две группы: опытную и группу
сравнения. Опытную группу составили 31 больной сифилисом скрытым
серорезистентным, которые наряду с базисной терапией (водорастворимый
пенициллин или цефтриаксон) получали ронколейкин по 0,5мг п/к 1 раз в 3 дня
№10.
Группу
сравнения
составили
30
больных
сифилисом
скрытым
серорезистентным, получавших только антибиотикотерапию (водорастворимый
пенициллин или цефтриаксон). Диагноз СР при сифилисе пациентам группы
контроля, также как и в группе исследования, был подтвержден анамнезом,
отрицательными серологическими реакциями у половых контактов пациентов,
а также данными клинико-серологического контроля после основного и
дополнительного курсов лечения ранних форм сифилиса. За время наблюдения
ни у одного больного не произошло снижения позитивности РМП с
кардиолипиновым антигеном, титр антител не уменьшился в 4 и более раз.
Выбор
антибиотика
для
дополнительной
терапии
проводился
в
зависимости от ранее проведенной антибактериальной терапии по поводу
ранних форм сифилиса. Во время дополнительного лечения выбирались
антибиотики из другой фармакологической группы, согласно Методическим
материалам по диагностике и лечению наиболее распространенных инфекций,
передаваемых половым путем (ИППП), и заболеваний кожи (2003). Все
больные хорошо перенесли лечение, побочных реакций не возникло.
Динамика негативации серологических реакций отмечалась у 27 (90%)
пациентов группы исследования уже через 3 месяца после лечения (рисунок 2).
21
Рисунок 2.Сравнительная динамика негативации РМП у больных с СР при
сифилисе
после
(водорастворимым
проведения
пенициллином
комплексного
или
лечения
цефтриаксоном)
антибиотиками
в
сочетании
с
ронколейкином (n=31) в сравнении с группой контроля, получавшей лечение
только антибиотиками (n=30).
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
%
33,3
12
12
3,3
0
3 мес
3,3
0
6мес
9мес
3,3
12 мес
♦ - группа исследования
■ – группа контроля
Через год наблюдения у 33,3% пациентов из группы исследования РМП
имела значение 3+, у 25% – 2+, у 8,4% – сохранялись 4+ и у 33,3% – была
отрицательной. Наблюдение за остальными больными продолжается. В группе
контроля через год наблюдения РМП сохранялась отрицательной у 3,3%
пациента, у 13,3% пациентов РМП имело значение 3+, у 6,7% снизилось – до
2+, у 13,3% пациентов 4+ при отсутствии титра и у 36,7% – значения
микрореакции по сравнению с предыдущими не изменились.
На основании вышеизложенного, можно сделать вывод, что включение в
комплексную терапию СР при сифилисе иммуномодулятора ронколейкина
вместе с антибиотиками обусловливает тенденцию к негативации РМП и
снижению титров с КА уже через 3 месяца после лечения. Так, положительная
динамика негативации РМП с кардиолипиновым антигеном отмечалась у 66,7%
пациентов, полная негативация у 33,3% больных группы исследования.
22
Выводы.
1. У больных острозаразными формами сифилиса выявлено снижение
активности реакции фагоцитоза (у 42%), Т-клеточного и В-клеточного звеньев
иммунитета (существенное снижение количества Т-хелперных (у 45%) и
увеличение количества цитолитических CD8+ Т-киллерных лимфоцитов (у
70%), активированных NK-клеток (у 60%), резкое снижение индекса
иммунорегуляции (у 60%), значительное увеличение уровня активированных
лимфоидных элементов).
2. Иммуночип является более информативным методом в диагностике
истинной и ложной серорезистентности по сравнению с положительными
стандартными
серореакциями
(РМП,
РИФ-200,
РИФ-abs,
РИБТ).
При
обследовании больных с серорезистентностью при сифилисе с использованием
в методике иммуночипа имеется возможность установки наличия в организме
бледных трепонем, поддерживающих серорезистентность, и отнесение ее к
категории
истинных.
Выявлена
более
высокая
чувствительность
и
специфичность при определении IgM иммуночипа (по IgM положительными
были 27,5% сывороток) в сравнении с ИФА (IgM не обнаруживались ни у
одного больного).
3.
Включение
в
комплексную
терапию
иммуномакса,
является
высокоэффективным (в сравнении с регламентированной схемой лечения без
включения иммуномодуляторов), так как ускоряется негативация РМП с
кардиолипиновым антигеном, регресс клинических проявлений, нормализация
иммунологических
показателей
и
обеспечивается
полная
негативация
серологических реакций у 100% пациентов через 15 месяцев наблюдения, в
контрольной группе только у 64%.
4. Терапевтическая эффективность схем лечения сифилиса при включении
ронколейкина в комплексную терапию серорезистентности при сифилисе
высокая; она обусловливает тенденцию к негативации серологических реакций
уже через 3 месяца после лечения, существенное снижение титров РМП с
23
кардиолипиновым антигеном отмечена у 66,7% пациентов, полная негативация
– у 33,3% больных.
5. С целью снижения риска развития серорезистентности при сифилисе у
больных вторичным сифилисом кожи и слизистых оболочек нами предлагается
схема лечения таких больных с включением в комплексную терапию бензатин
бензилпенициллина (по 2,4 млн. ЕД 1 раз в 7 дней №3) в сочетании с
иммуномаксом (по 200 ЕД 1 раз в сутки на 1,2 и 3 дни антибиотикотерапии). С
целью
решения
проблемы
сформировавшейся
серорезистентности
при
сифилисе нами предлагается схема лечения таких больных с включением в
комплексную терапию антибиотиков (водорастворимого пенициллина по 1 млн.
ЕД, каждые 6 часов 28 дней или цефтриаксона по 1,0 г ежедневно №20) и
иммуномодулятора ронколейкина (по 0,5 мг подкожно 1 раз в 3 дня №10).
Практические рекомендации.
Иммуномакс рекомендуется применять при лечении больных с вторичным
сифилисом кожи и слизистых оболочек с целью профилактики развития
серорезистентности
при
сифилисе.
Введение
препарата
рекомендовано
проводить внутримышечно по 200 ЕД на 1, 2, 3 дни антибиотикотерапии.
Ронколейкин рекомендуется применять для лечения сформировавшейся
серорезистентности
при
сифилисе.
Введение
препарата
рекомендовано
проводить подкожно в область передней брюшной стенки или в верхнюю треть
плеча по 0,5 мг 1 раз в 3 дня №10.
Иммуночип с определением антител (IgM и IgG) к рекомбинантным белкам
T. pallidum (Tp47, Tp17, Tp15, TmpA) рекомендуется проводить для
дифференциальной диагностики истинной и ложной серорезистентности при
сифилисе.
Список, опубликованных научных работ по теме диссертации.
1. Баткаева Н.В. Эффективность Ронколейкина в комплексной терапии
серорезистентности при сифилисе.//Вестник последипломного образования. –
2007. – №1. – С.35-37.
24
2. Баткаева Н.В. Иммунокоррекция, как возможный метод профилактики
серорезистентности при сифилисе./Баткаева Н.В., Баткаев Э.А., Атауллаханов
Р.И.
и
др.//
Тезисы
научных
работ
II
Всероссийского
Конгресса
дерматовенерологов. – С.-Пб., – 25-27сентября, 2007. – С.123.
3. Баткаева Н.В. Сравнение эффективности стандартных методов лечения при
сифилисе./Баткаева Н.В., Баткаев Э.А., Рюмин Д.В. и др.// Тезисы научных
работ II Всероссийского Конгресса дерматовенерологов. – С.-Пб., – 2527сентября, 2007. – С.123-124.
4. Баткаев Э.А. К вопросу о ложной позитивности результатов серологических
реакций на сифилис./Баткаев Э.А., Рюмин Д.В., Топоровский Л.М., Баткаева
Н.В. и др.//Вестник последипломного образования. – 2006. – №2. – С.14-16.
5. Баткаев Э.А. Опыт применения иммуномакса с целью профилактики
серорезистентности при сифилисе./Баткаев Э.А., Топоровский Л.М., Рюмин
Д.В., Баткаева Н.В.//Вестник последипломного образования. – 2006. – №2. –
С.16-18.
6. Баткаева Н.В. Эффективная профилактика серорезистентности у больных
ранними формами сифилиса.//Альманах клинической медицины. Актуальные
вопросы дерматовенерологии и дерматоонкологии. МОНИКИ. – 2006. – том
15. – С.23-27.
7. Баткаева Н.В. Коррекция иммунологических нарушений в комплексной
терапии больных ранними формами сифилиса.//Тезисы к конференции
Актуальные вопросы дерматовенерологии и дерматоонкологии. – Москва. – 2829 мая, 2008. – С.65-66.
8.
Баткаев
Э.А.
Иммуночип
в
диагностике
серорезистентности
при
сифилисе./Э.А. Баткаев, А.Е. Гущин, Н.В. Баткаева, и др.//Актуальные
проблемы диагностики и терапии дерматовенерологии. – 2008. – С.141-142.
9. Баткаев Э.А. Отдаленные результаты лечения больных ранними формами
сифилиса стандартными методами./Э.А. Баткаев, Д.В. Рюмин, Н.В. Баткаева и
др.//Актуальные проблемы диагностики и терапии дерматовенерологии. – 2008.
– С.140-141.
25
10. Баткаев Э.А. Профилактика и лечение серорезистентности при сифилисе.
/Атауллаханов Р.И., Рюмин Д.В., Топоровский Л.М., Баткаева Н.В. и др. //
Вестник последипломного образования. – 2008. – №2. – С.68-70.
Список использованных сокращений
ИЛ – интерлейкин
ИФА – иммуноферментный анализ
КСР – комплекс серологических реакций
РИБТ – реакция иммобилизации бледных трепонем
РИФ – реакция иммунофлуоресценции
РМП – реакция микропреципитации
СР – серорезистентность
ФНО-α – фактор некроза опухолей - α
ЦИК – циркулирующие иммунные комплексы
CD - кластеры дифференцировки лейкоцитов
HLA-DR – человеческий лейкоцитарный антиген DR.
26