ISBN 978-5-7262-1375-0. НЕЙРОИНФОРМАТИКА – 2011. Часть 1
advertisement
ISBN 978-5-7262-1375-0. НЕЙРОИНФОРМАТИКА – 2011. Часть 1 Н.А. КОКАНОВА, Н.Ю. ЦАПЛИНА, Г.З. МИХАЙЛОВА, Р.Ш. ШТАНЧАЕВ Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, Пущино kokanchik@rambler.ru ВЛИЯНИЕ ТРЕНИРОВОЧНЫХ СТИМУЛЯЦИЙ И АППЛИКАЦИИ ЭКЗОГЕННОГО ДОФАМИНА НА СТРУКТУРУ И ФУНКЦИЮ МАУТНЕРОВСКИХ НЕЙРОНОВ С ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНО ИНДУЦИРОВАННЫМ В НИХ АМИЛОИДОЗОМ Показано, что тренировочные сенсорные стимуляции МН золотых рыбок или аппликация на эти нейроны экзогенного дофамина индуцируют устойчивость МН к утомительной сенсорной стимуляции, даже на фоне развивающегося амилоидоза. Мы предполагаем, что основную роль в защите МН от разрушения амилоидными агрегатами играет внутриклеточный дофамин, полимеризующий цитоскелетный актин во время адаптации к стимуляциям. Кроме того, дофамин оказывает прямое разрушающее действие на амилоидные полимеры in vitro. Ключевые слова: маутнеровские нейроны, бета-амилоидоз, адаптация, дофамин, стабилизация структуры нейронов Введение Причиной болезни Альцгеймера считают отложение бета-амилоидного белка (Аβ) с образованием бляшек снаружи нейронов и формирование внутри нейронов агрегатов тау-белка, соединяющего тубулиновый и актиновый цитоскелет в единый комплекс. Показано, что такие изменения имеют патологические последствия для нейрона: они погибают или значительно изменяют свою основную структуру и функцию [1]. В то же время из-за отсутствия адекватных клеточных моделей амилоидоза невозможно установить, какие морфологические изменения происходят в процессе развития болезни в индивидуальных нейронах мозга, что мешает Данная работа поддержана грантом РФФИ № 07-01-00651-а и Федеральной целевой программой «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России», Госконтракт № 02.740.11.0301. УДК 004.032.26(06) Нейронные сети 230 ISBN 978-5-7262-1375-0. НЕЙРОИНФОРМАТИКА – 2011. Часть 1 расшифровать механизмы амилоидоза и определить возможные мишени для выбора терапии. Маутнеровские нейроны (МН) благодаря своим размерам, топографическому разделению сенсорных входов и структурной асимметрии являются адекватной клеточной моделью для изучения амилоидоза, как нами было показано ранее [2]. Кроме того, взаимосвязь между структурной асимметрией правого и левого МН и их функцией, проявляющейся в виде моторной асимметрии рыбки, хорошо изучена в нормальных условиях функционирования, а также после длительной зрительной или вестибулярной стимуляции. В данных условиях моторная асимметрия коррелирует со структурными характеристиками этих нейронов и их дендритов [3]. Было показано также, что выработка адаптированного состояния МН к повторяющейся сенсорной стимуляции является длительной (многонедельной) модификацией функции и приводит к морфофункциональной устойчивости МН [4]. Показано, что такое состояние обусловлено полимеризацией актина в результате выброса эндогенного дофамина [5]. Мы предположили, что полимеризация актина эндогенным дофамином в процессе адаптации к длительным сенсорным воздействиям может укрепить актиновый цитоскелет МН настолько, что он будет оказывать сопротивление бета-амилоидным образованиям. Кроме того, для проверки предположения о механизме действия дофамина, необходимо было смоделировать состояние адаптации МН посредством аппликации экзогенного дофамина на МН до индуцирования в них амилоидоза. Решению этих вопросов была посвящена данная работа. Постановка задачи, материал и методы исследования Первой задачей исследования было изучить влияние тренировочных стимуляций афферентных входов МН на последующее развитие в них бета-амилоидоза. Для этого у золотых рыбок вырабатывали адаптированное состояние к вестибулярной или зрительной стимуляции. У части рыбок, адаптированных к вестибулярной стимуляции (ВС), после стадии отдыха проводили проверочную зрительную стимуляцию. После выработки адаптированного состояния животным экспериментальной группы вводили в область расположения маутнеровских нейронов фрагмент 25-35 бета-амилоида (Aβ25-35) объемом 4мкл в дозе 1мкг/г массы тела. Животным контрольной группы апплицировали среду разведения – дистиллированную воду (ДВ). После введения препаратов у рыбок, адаптированных к оптокинетической стимуляции и у части рыбок, адаптированных к ВС, проводили проверочную зрительную стимуляцию. У другой части адапУДК 004.032.26(06) Нейронные сети 231 ISBN 978-5-7262-1375-0. НЕЙРОИНФОРМАТИКА – 2011. Часть 1 тированных к ВС рыбок проводили проверочную ВС. В качестве контроля использовали интактных рыбок, которых после введения Aβ25-35 (или ДВ) подвергали тем же сенсорным стимуляциям. Второй задачей исследования была проверка нашего предположения, что основным действующим агентом в процессе тренировочных сенсорных стимуляций является дофамин (ДА). Для этого животным экспериментальной группы вводили в область расположения маутнеровских нейронов ДА и Aβ25-35. Животным контрольной группы апплицировали среду разведения дофамина. В работе было использовано около 60 рыбок, каждую группу рыбок до и после воздействия тестировали в прямолинейном канале [4]. Функциональную активность МН оценивали по коэффициенту моторной асимметрии (КМА), который определяли как отношение числа поворотов в предпочитаемую сторону к сумме поворотов в обе стороны. Двигательную активность и моторную асимметрию рыбок определяли до и после аппликации каждого препарата, а также после сенсорной стимуляции и во время выработки адаптированного к стимуляции состояния. Через несколько часов после аппликации препаратов (время действия выбирали по проявлению наибольшего эффекта из предварительных экспериментов) рыбок подвергали 2-х часовой естественной ВС или 10часовой зрительной стимуляции по разработанной в лаборатории методике [6]. Для изучения структурных изменений и определения объемов МН применяли метод трехмерной реконструкции по серийным гистологическим срезам продолговатого мозга. По данным морфометрического анализа подсчитывали интегральный коэффициент структурной асимметрии (КСА) МН как отношение объема контралатерального нейрона к сумме объемов обоих нейронов, а также КСА отдельных частей МН, подсчитываемые по тому же принципу. Кроме того, методом негативного контрастирования исследовали, как взаимодействуют агрегированный Аβ и дофамин in vitro. Влияние бета-амилоида на структуру и функцию МН адаптированных рыбок После аппликации Aβ25-35 на контрольные (неадаптированные) МН через 17 часов у большей части рыбок наблюдается достоверное усиление моторной асимметрии (КМА увеличился с 0,56±0,04 до 0,74±0,11; n=10). При этом у рыбок наблюдается достоверное по сравнению с рыбками контрольной группы (которым вводили ДВ) уменьшение скорости повоУДК 004.032.26(06) Нейронные сети 232 ISBN 978-5-7262-1375-0. НЕЙРОИНФОРМАТИКА – 2011. Часть 1 ротов до и после введения в 3,1 раза (n=10). После введения Aβ25-35 адаптированным к ВС рыбкам степень их моторного предпочтения достоверно увеличивается до 0,67±0,08 (р=0,02; n=8). Важно отметить, что при этом не происходит снижения скорости поворотов рыбок, она остается такой же, как и до введения. Показано также, что у адаптированных рыбок контрольной группы, которым апплицировали ДВ, не наблюдалось достоверных физиологических изменений по сравнению с интактными рыбками. Самым заметным структурным отличием интактного нейрона, на который апплицировали Aβ25-35, является уменьшение размеров вентральных дендритов (ВД) обоих МН. Объем ВД контралатерального (левого) МН уменьшается в 7 раз и становится равным 9х10 3 мкм3, а объем ВД ипсилатерального (правого) МН – в 3 раза (рис. 1Б). Таким образом, аппликация Aβ25-35 на МН сама по себе вызывает непропорциональную дистрофию дендритов и сомы нейронов, которая никак не коррелирует с функциональными сдвигами в нейронах. ЛД Левый МН АЧ С Аксон Правый МН ВД ВД А Б ЛД В С ВД Г Рис. 1. Влияние аппликации бета-амилоида на структуру МН А – МН интактной рыбки–правши после аппликации ДВ, Б – МН интактной рыбки–правши после аппликации Aβ25–35, В – МН адаптированной к ВС рыбки–правши, Г – МН адаптированной к ВС рыбки-правши после аппликации Aβ25-35. Сокращения: ЛД и ВД – латеральный и вентральный дендриты, соответственно, С – сома нейрона, АЧ – аксонная чаша. Масштаб 100 мкм УДК 004.032.26(06) Нейронные сети 233 ISBN 978-5-7262-1375-0. НЕЙРОИНФОРМАТИКА – 2011. Часть 1 Адаптированные к ВС нейроны характеризуются увеличением размеров сомы и ЛД, а также увеличением числа ветвлений и толщины веток 2 и 3 порядка (рис. 1В). После введения Aβ25-35 на адаптированные к ВС нейроны не наблюдается достоверных отличий по сравнению с адаптированными МН без индуцированного в них амилоидоза (рис. 1Г). Влияние бета-амилоида на структуру и функцию МН интактных и адаптированных рыбок, которых после аппликации амилоида подвергали однократной утомительной стимуляции Сочетание аппликации Aβ25-35 с утомительной ВС приводит к снижению КМА контрольных рыбок с 0,74±0,11 до 0,32±0,19 (n=5). При этом у рыбок в 11 раз уменьшается скорость поворотов. У контрольных рыбок после ВС наблюдалось сглаживание функциональной асимметрии МН и их структурных различий за счет уменьшения объема ЛД контралатерального МН до ипсилатерального (рис. 2А). Для рыбок, которым вводили Aβ25-35, инверсия моторной асимметрии рыбки после ВС сопровождается уменьшением размеров ЛД нейрона и увеличением размера ВД в 2 раза (рис. 2Б). Аксон АЧ ЛД Левый С МН ВД ЛД Правый МН ВД А ЛД Б ЛД С ВД В ВД Г Рис. 2. Влияние аппликации Aβ25–35 и последующей ВС на структуру МН А – МН контрольной рыбки–правши после ВС, Б – МН рыбки–правши после аппликации Aβ25-35 и ВС, В - МН адаптированной к ВС рыбки– правши после аппликации на них ДВ и однократной проверочной ВС, Г – МН адаптированной к ВС рыбки-левши после индуцирования в них бетаУДК 004.032.26(06) Нейронные сети 234 ISBN 978-5-7262-1375-0. НЕЙРОИНФОРМАТИКА – 2011. Часть 1 амилоидоза и однократной проверочной. Сокращения: ЛД и ВД – латеральный и вентральный дендриты, соответственно, С – сома нейрона, АЧ – аксонная чаша. Масштаб 100 мкм Адаптированные к ВС нейроны контрольной рыбки-правши после аппликации на них ДВ и воздействия однократной ВС сохраняют размеры ЛД нейронов на уровне 50х103 мкм3 (рис. 2В). Структурная асимметрия МН остается такой же, как у интактных, поскольку соматическая часть левого МН в 1,6 раза больше сомы правого МН. После введения Aβ 25-35 на адаптированные к ВС нейроны и проверочной ВС у контралатерального (левого) МН наблюдается инверсия структурной асимметрии МН за счет того, что сома контралатерального МН по размеру становится почти равной соме ипсилатерального МН (81х103 мкм3). Однако контралатеральный МН по-прежнему доминирует даже после ВС, что выражается в увеличении КМА рыбки до 0,75. По-видимому, это усиление происходит вследствие укорочения и уменьшения объема ВД контралатерального МН до 30х103 мкм3 (рис. 2Г). При этом размер ВД ипсилатерального МН остается на уровне, характерном для контроля (50х10 3 мкм3). Очевидно, что у адаптированных рыбок после введения Aβ25–35 и утомительной стимуляции не происходит «разбухания» ВД или их сдавливания. Сочетание аппликации Aβ25–35 с утомительной контралатеральной стимуляцией (КОС) приводит к достоверному снижению степени моторной латерализации, так же как и у контрольных рыбок, до уровня 0,35±0,13 (n = 7, р < 0,001). Трехмерная морфология контрольных МН после введения ДВ и КОС не отличается от структуры МН интактных рыбок после КОС (рис. 3А). Ранее нами было показано, что у интактных рыбок после КОС на фоне инвертирования моторной асимметрии обнаруживается значительное уменьшение объема ВД ипсилатерального МН, за счет которого ипсилатеральный МН и становится, по-видимому, функционально доминантным [3]. В данном случае у рыбок после введения ДВ и КОС также наблюдается уменьшение объема ВД ипсилатерального МН до 17х103 мкм3. Анализ структуры реконструированных МН показал, что КОС на фоне действия Aβ25-35 усиливает деградацию разных частей МН, вызывая разрывы отростков и их атрофию (рис. 3Б). Более того, кроме уменьшения размеров ВД обоих МН до 7 и 14х10 3 мкм3, также наблюдаются передавливание аксона и аномальные изменения медиальных дендритов МН, которые у интактных МН по размеру меньше в 8–10 раз (рис. 3Б). У адаптированных к КОС нейронов после аппликации на них ДВ и воздействия однократной утомительной КОС размеры ЛД и ВД обоих УДК 004.032.26(06) Нейронные сети 235 ISBN 978-5-7262-1375-0. НЕЙРОИНФОРМАТИКА – 2011. Часть 1 нейронов не изменяются по сравнению с интактными нейронами (рис. 4А). Структурная асимметрия соматических частей после КОС также сохраняется (КСА для сомы равен 0,53), согласуясь с моторной асимметрией рыбки (КМА равен 0,54). После введения Aβ25–35 на адаптированные к КОС нейроны и проверочной КОС не обнаружено никаких структурных отличий от контрольных адаптированных МН (рис. 4Б). АЧ Л Д Аксон С МД ВД ВД А ВД МД Б Рис. 3. Влияние аппликации Aβ25–35 и последующей КОС на структуру МН А – МН контрольной рыбки–левши после КОС, Б – МН рыбки–левши после аппликации Aβ25–35 и КОС. Сокращения: ЛД, МД и ВД – латеральный, медиальный и вентральный дендриты, соответственно, С – сома нейрона, АЧ – аксонная чаша. Масштаб 100 мкм ЛД С ВД А Аксон АЧ Б ЛД ЛД ВД ВД В Г Рис. 4. Влияние аппликации Aβ25–35 и последующей КОС на структуру адаптированных МН УДК 004.032.26(06) Нейронные сети 236 ISBN 978-5-7262-1375-0. НЕЙРОИНФОРМАТИКА – 2011. Часть 1 А – МН адаптированной рыбки–правши после аппликации ДВ и КОС, Б – МН рыбки–правши после аппликации Aβ25–35 и КОС, В – МН адаптированной к ВС рыбки–правши после аппликации ДВ и КОС, Г – МН адаптированной к ВС рыбки–правши после аппликации Aβ25-35 и КОС. Сокращения: ЛД и ВД – латеральный и вентральный дендриты, соответственно, С – сома нейрона, АЧ – аксонная чаша. Масштаб 100 мкм Кроме того, была проведена перекрестная проверка резистентности адаптированных к ВС рыбок с помощью зрительной тест-стимуляции (т.е. КОС). Показано, что КОС приводит к незначительному (по сравнению с неадаптированными рыбками) снижению КМА адаптированных к ВС рыбок до 0,45. Однако выработка адаптированного состояния МН, хотя и к стимуляции другой модальности, привела к возникновению устойчивости ВД ипсилатерального МН. На рис. 4В представлена реконструкция адаптированных к ВС нейронов после аппликации ДВ и последующей КОС. ВД, который уменьшается у интактных рыбок после КОС до 15х10 3 мкм3, остается таким же по размеру, как и у любого интактного МН (40х103 мкм3). Кроме того, показано, что сома контралатерального МН меньше по размеру, чем сома ипсилатерального МН. При этом ВД контралатерального МН укорачивается почти в 2 раза (до 107 мкм), что, вероятно, является одним из механизмов регуляции МН при усилении притока сенсорных стимулов извне (рис. 4В). Данный структурный эффект наблюдается у всех МН рыбок, подвергавшихся перекрестной проверке, независимо от того, вводили им ДВ или Aβ25–35. У рыбок, адаптированных к ВС, после аппликации Aβ25–35 и проверочной КОС также наблюдается снижение КМА до 0,47. При этом на клеточном уровне не происходит симметризации асимметрии: сома и ЛД контралатерального МН по размеру доминирует над сомой ипсилатерального МН, а ВД левого МН укорачивается (рис. 4Г). Влияние дофамина на функциональное состояние МН интактных рыбок и МН рыбок с индуцированным в них амилоидозом Ранее было показано [7], что аппликация на МН дофамина предохраняет МН от утомительного действия ВС. В данной части работы было выявлено, что ДА изменяет функциональное состояние рыбок с развивающимся в них амилоидозом. После аппликации ДА сначала происходит усиление активности контралатерального МН, что приводит к увеличению КМА, двигательной активности рыбок и скорости их поворотов в УДК 004.032.26(06) Нейронные сети 237 ISBN 978-5-7262-1375-0. НЕЙРОИНФОРМАТИКА – 2011. Часть 1 Кол-во поворотов в минуту канале. Через 5 часов после аппликации ДА у рыбок на фоне развития у них амилоидоза происходит постепенное возвращение исходных физиологических параметров. У контрольных рыбок, которым вводили физиологический раствор (ФР), не наблюдалось одинаковых изменений физиологических параметров. В дальнейшем после ВС у рыбок, которым апплицировали ДА, не происходило уменьшения скорости поворотов, как это происходило у контрольной группы рыбок, которым вводили ФР (рис. 5). 40 35 30 25 20 * 15 10 5 0 1 2 Рис. 5. Влияние утомляющей ВС на скорость поворотов рыбок, которым апплицировали ДА или ФР на фоне развивающегося в них амилоидоза 1 – после введения ДА, 2 – после введения ФР. Сплошные столбики показывают значения скорости поворотов до ВС (n = 4), заштрихованные – значения скорости поворотов после ВС (n = 3). Звездочкой отмечено достоверное снижение КМА у неадаптированных рыбок после КОС, p < 0,05 Взаимодействие дофамина и Aβ25–35 in vitro Было изучено действие дофамина на агрегаты бета-амилоида in vitro методом негативного контрастирования уранилацетатом. По данным ультраструктурного анализа самого белка было выявлено, что фибриллы Aβ25-35 представляют собой закрученные по спирали протяженные ленты (рис. 6А; масштаб 0,5мкм). При совместном инкубировании ДА и агрегированного белка было обнаружено, что экзогенный ДА способен разрушать бета-амилоидные полимерные образования, основу бляшек, диссоциируя их на более короткие фрагменты (рис. 6Б). А Б УДК 004.032.26(06) Нейронные сети 238 ISBN 978-5-7262-1375-0. НЕЙРОИНФОРМАТИКА – 2011. Часть 1 Рис. 6. Влияние дофамина на агрегаты бета-амилоида Выводы В более ранних исследованиях двигательной активности контрольных и подопытных рыбок было установлено, что адаптированные рыбки приобретают резистентность к последующей утомительной стимуляции, то есть практически не изменяется асимметричность поведения рыбок, даже на фоне действия амилоидоза [2]. В данной работе было показано, что на фоне развивающегося амилоидоза адаптированные к различным сенсорным стимуляциям МН характеризуются трехмерной морфологией, близкой к той, которая наблюдается у контрольных особей. Очевидно, что свойство цитоскелетного актина к полимеризации по всей протяженности нейрона во время адаптации к сенсорным нагрузкам любой модальности защищает МН золотых рыбок от катастрофических структурных изменений, даже гибели. Мы предполагаем, что основным действующим агентом при этом является внутриклеточный дофамин, вырабатывающийся в избытке при адаптации к сенсорным нагрузкам. В данной работе показано, что введение дофамина перед индуцированием в нейронах амилоидоза также вызывает в маутнеровских нейронах состояние резистенции к последующему утомлению вестибулярного входа. Кроме того, дофамин способен прямо действовать на агрегаты бета-амилоида, разрушая его in vitro. Все вместе взятое открывает перспективы для разработки новых приемов в терапии и профилактике амилоидозов. Список литературы 1. Mattson M. Pathways toward and away from Alzheimer ,s disease // Nature. 2004. V. 430. P.631–638. 2. Коканова Н.А, Михайлова Г.З., Штанчаев Р.Ш., Тирас Н.Р., Безгина Е.Н., Мошков Д.А. Морфофункциональные изменения маутнеровских нейронов золотой рыбки после аппликации β-амилоида//Морфология. 2009. Т. 136. №6. С.43–47. 3. Moshkov D.A., Mikhailova G.Z., Grigorieva E.E., Shtanchaev R.Sh. Role of different dendrites in the functional activity of the central neuron controlling goldfish behavior // J. Integr. Neurosci. 2009. V. 8. № 4. P. 441–451. УДК 004.032.26(06) Нейронные сети 239 ISBN 978-5-7262-1375-0. НЕЙРОИНФОРМАТИКА – 2011. Часть 1 4. Михайлова Г.З., Тирас Н.Р., Павлик В.Д., Санталова И.М., Григорьева Е.Е., Мошков Д.А. Морфологические характеристики маутнеровских нейронов золотых рыбок с измененной асимметрией моторного поведения // Нейрофизиология / Neurophysiology. 2006. Т. 38. № 1. С. 18–31. 5. Мошков Д.А., Павлик Л.Л., Тирас Н.Р., Дзебан Д.А., Михеева И.Б. Признаки долговременной потенциации в ультраструктуре афферентных смешанных синапсов маутнеровских нейронов при естественной модификации функции // Нейрофизиология / Neurophysiology. 2003. Т. 35. № 3. С. 186–196. 6. Штанчаев Р.Ш, Михайлова Г.З., Дектярева Н.Ю., Коканова Н.А., Тирас Н.Р., Мошков Д.А. Влияние оптокинетической стимуляции на моторную асимметрию у золотой рыбки // Нейрофизиология / Neurophysiology. 2007. Т. 39. № 2. С. 133–145. 7. Безгина Е.Н., Павлик Л.Л., Михайлова Г.З. и др. Морфофункциональные исследования взаимодействия глутамата и дофамина с маутнеровскими нейронами // Нейрофизиология / Neurophysiology. 2006. Т. 38. № 6. С. 411–421. УДК 004.032.26(06) Нейронные сети 240
