Уважаемые Сергей Борисович и Леонид Викторович

ЛЮМИНЕСЦЕНЦИЯ БИОПОЛИМЕРНЫХ ПЛЕНОК ДНКАКРИДИНОВЫЙ ОРАНЖЕВЫЙ
Лантух Ю.Д, Пашкевич С.Н., Кульсарин А.А.
Оренбургский государственный университет, г. Оренбург
Молекула ДНК, являющаяся носителем генетической информации, рассматривается в последнее время в качестве одного из кандидатов на роль основного конструктивного элемента при создании новых материалов в нанотехнологиях [1].
Нуклеиновые кислоты не обладают светочувствительностью в видимой
области спектра (максимум поглощения оснований ДНК находится в районе
260 нм), поэтому создание материалов для оптоэлектронных приложений требует введения в их состав спектральных сенсибилизаторов. В качестве таковых
могут быть использованы органические красители, взаимодействие которых с
молекулами нуклеиновых кислот наряду с другими биологически активными
соединениями широко исследуется в последнее время.
Многие органические красители (акридиновые, тиазиновые и др.) являются биологически активными соединениями, демонстрирующими мутагенную
активность и фотодинамическое действие. Такие эффекты возможны благодаря
связыванию молекул красителей с ДНК. Обладая высоким квантовым выходом
флуоресценции, некоторые красители широко используются в биологии в качестве молекулярных люминесцентных зондов.
Нами получены образцы пленок ДНК-краситель оптического качества,
что дает возможность применять оптические методы для исследования их
структуры и использовать такие пленки в качестве среды для оптической (голографической) записи. Для введения в ДНК использовались известные в молекулярной биофизике люминофоры: акридиновый оранжевый (АО), родамин 6Ж,
бромистый этидий и другие катионные красители. Молекулы красителей в таких пленках могут быть интеркалированы в двойную спираль ДНК или фиксироваться на ее внешней части.
Ранее нами было показано [2,3], что в пленках на основе высокомолекулярной ДНК, активированной органическими красителями, возможна запись
высокоэффективных рельефно-фазовых голографических решеток, которые самопроизвольно стираются с течением времени при комнатной температуре.
Кроме этого, в пленочных образцах ДНК-краситель можно записывать динамические голограммы на триплетных состояниях красителей, фотохимические голограммы и ряд других.
Было отмечено также, что люминесцентный канал размена энергии электронного возбуждения красителей в пленочных системах ДНК-краситель обладает крайне малой эффективностью. В то же время получение пленочных образцов ДНК-краситель с высоким выходом люминесценции открывает перспективы создания ДНК – специфичных датчиков, люминесцентных сенсоров для
биомедицины и экологии.
Учитывая чрезвычайно плотную упаковку красителя в такой матрице и
используя красители с высоким выходом люминесценции, можно возбуждать
суперлюминесценцию красителя при относительно низких (миллиджоули)
энергиях накачки и создавать миниатюрные источники когерентного излучения
(лазеры). Такие системы предлагается использовать также в качестве регистрирующей среды для записи усиливающих динамических голограмм [4].
В предлагаемом сообщении ставится задача модифицировать структуру
пленок ДНК-краситель и исследовать условия, при которых флуоресцентный
канал дезактивации электронного возбуждения для красителей становится преобладающим.
На примере системы АО-ДНК нами предложен способ получения оптически однородных пленочных структур на основе двуспиральной ДНК, сформированных по принципу «гость-хозяин», в которых роль «гостя» отводится
катионному красителю АО, а «хозяина» – сайтам связывания красителя на ДНК
интеркаляционного типа. Молекулы АО в такой системе обладают высокой
флуоресцентной способностью, являются однородными оптическими центрами,
спектр флуоресценции которых не зависит от длины волны возбуждения.
Спектры поглощения и люминесценции регистрировали на спектрофлуориметрах Флюорат-02-Панорама (Люмэкс), СМ2203 (Солар) и оптоволоконном
спектрометре AvaSpec (Avantes). В последнем случае для возбуждения флуоресценции использовали перестраиваемый аргоновый лазер Lexel-88 (LEXEL) и
DPSS YAG-Nd CW лазер КLM-532/SLN (ФТИ-Оптроник).
Молекулы красителя, связанные с биополимером в виде комплексов различного типа, представляют собой разнородные оптические центры. Присутствие в системе таких центров приводит к различию частот электронных переходов, что обуславливает проявление неоднородного уширения оптических
спектров. Непосредственным отражением данного эффекта может служить зависимость спектров флуоресценции от длины волны возбуждающего излучения.
Эффект неоднородного уширения можно наблюдать, в частности, в полимерных пленках поливинилового спирта, активированных АО, где молекулы
красителя представляют собой разнородные неупорядоченные оптические центры. Полученные нами спектры флуоресценции пленок ПВС-АО при возбуждении в области максимума поглощения не совпадают со спектрами флуоресценции, возбуждаемыми на длинноволновом краю спектра поглощения пленки
в широком диапазоне концентраций красителя. На рисунке 1а приведен спектр
флуоресценции пленки ПВС-АО (С = 10–5), где наблюдается смещение максимума полосы свечения в длинноволновую область спектра на несколько нанометров.
532 нм
0.8
б
DI
1.0
0.8
1
488 нм
0.6
a
2
0.4
514 нм
DI
1.0
0.6
1
0.4
2
0.2
0.2
0.0
0.0
470
510
550
590
630
, нм
470
510
550
590
630
, нм
Рис. 1. Нормированные спектры флуоресценции: a – пленки ПВС-АО,
С = 1×10–5 М, при возбуждении аргоновым лазером, λвозб. = 488 нм (1) и
Nd:YAG-лазером, λвозб. = 532 нм (2); б – пленки ДНК-АО-глицерин при возбуждении аргоновым лазером, λвозб. = 488 нм (1) и λвозб. = 514 нм (2).
Неоднородное уширение отсутствует, если в системе имеются оптические
центры преимущественно одного типа. Одним из способов получения таких систем является организация супрамолекулярных ансамблей, построенных по
принципу «гость-хозяин» [5].
Согласно нашим представлениям, самосборка одинаковых молекулярных
образований типа «гость-хозяин» реализуется в полимерных пленках ДНКорганический краситель в случае, если биополимер находится в состоянии
двойной спирали. В подобных пленках в качестве «гостя» выступают молекулы
красителя, а «хозяина» – сайты связывания интеркаляционного типа молекул
нативной ДНК.
Нами установлено, что эффект стабилизации В-формы ДНК даже при пониженных значениях относительной влажности (о.в.) среды может быть достигнут путем внесения в полимерные пленки добавок глицерина: в исследуемых образцах наблюдается сохранение двуспиральной структуры ДНК, о чем
свидетельствуют данные электронной и колебательной спектроскопии. По
нашему мнению, стабилизирующее влияние добавки может быть обусловлено
как высокой способностью глицерина удерживать сорбционную воду, так и
непосредственным взаимодействием молекул глицерина с ДНК, сопоставимым
с влиянием молекул воды на состояние двойной спирали.
На рисунке 2 приведены нормированные спектры поглощения (1) и флуоресценции (2) полимерной пленки ДНК-АО с добавкой глицерина при соотношении отношение концентрации нуклеотидов к концентрации лиганда P/D =
40 и о.в. воздуха ~ 30 %.
D,
1.0I
0.8
1
2
0.6
0.4
0.2
0.0
420
460
500
540
580
, нм
620
Рис. 2. Нормированные спектры поглощения (1) и флуоресценции (2)
пленки ДНК-АО с добавкой глицерина (P/D = 40).
Спектр поглощения, приведенный на рисунке, совпадает со спектром поглощения водного раствора ДНК-АО, где краситель присутствует в виде мономерных молекул, интеркалированых в двойную спираль ДНК.
Спектр флуоресценции на рисунке 2 получен при возбуждении в области
максимума поглощения пленки. По форме и положению этот спектр соответствует свечению мономерных молекул красителя, находящихся между парами
оснований в водном растворе ДНК-АО [6]. Следовательно, в пленке ДНК-АО с
добавкой глицерина молекулы биополимера имеют нативную двуспиральную
структуру, вследствие чего краситель находится в мономерной форме в виде
комплексов интеркаляционного типа.
Отметим, что в спектрах флуоресценции пленок ДНК-АО без добавки
глицерина при аналогичных условиях возбуждения полоса свечения мономерных молекул красителя не наблюдается.
При возбуждении флуоресценции пленки ДНК-АО с добавкой глицерина
аргоновым лазером на длинноволновом краю спектра поглощения при λвозб. =
514 нм (рис. 1б), спектр флуоресценции совпадает со спектром, полученным
при возбуждении в области максимума поглощения пленки, λвозб. = 488 нм. На
основании этого можно заключить, что неоднородное уширение в полимерных
пленках ДНК-АО с добавкой глицерина отсутствует.
Полученные данные свидетельствуют о том, что в полимерных пленках
ДНК-АО с добавкой глицерина краситель присутствует в виде наноразмерных
оптически активных центров одного типа.
Таким образом, в настоящей работе показано, что в пленочных образцах
ДНК-АО-глицерин реализуется принцип «гость-хозяин» путем самосборки однородных супрамолекулярных структур по методике «снизу-вверх» и указанные пленочные структуры можно отнести к наноструктурированным материалам с заранее заданными свойствами.
Работа выполнялась при поддержке РФФИ, грант № 11-02-97021р_поволжье_а
Список литературы
1. Seeman N.S. // Annu. Rev. Biochem. - 2010. - V. 79.- P. 65–87.
2. Lantukh Yu. D. Holographic investigation of DNA activated by organic dyes
[Текст] / Yu. D. Lantukh, S. N. Paschkevich, S. N. Letuta, G. A. Ketsle, E. K.
Alidjanov, I. V. Ipatov // Proc. SPIE. – 2004. – Vol. 5447. – P. 375 – 380.
3. Lantukh Yu. D. Investigation of DNA - acridine orange biopolimer films by holographic and spectroscopic techniques [Текст] / Yu. D. Lantukh, S. N. Paschkevich,
S. N. Letuta, G. A. Ketsle, E. K. Alidjanov, A. A. Kulsarin // Proc. SPIE. – 2007. –
Vol. 7006. – P. 700614.
4. Ивакин Е.В., Лазарук А.М., Петрович И.П., Рубанов А.С. // ЖПС, -1978. Т28. - С. 992-996.
5. Алфимов М. В. Фотоника супрамолекулярных наноразмерных структур
[Текст] / М. В. Алфимов // Известия АН. Серия Химическая. – 2004. – № 7. – С.
1303.
6. Tomita G. Fluorescence-excitation spectra of acridine orange – DNA and – RNA
system [Текст] / G. Tomita // Biophysik. – 1967. – N 4. – P. 23 – 29.