1 На правах рукописи СТОЛЯРОВ ЕВГЕНИЙ ЕВГЕНЬЕВИЧ
реклама
На правах рукописи СТОЛЯРОВ ЕВГЕНИЙ ЕВГЕНЬЕВИЧ Разработка хроматографических методик и методического подхода к метрологическому обеспечению химико токсикологического анализа местных анестетиков 14.04.02 – фармацевтическая химия, фармакогнозия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук Пермь - 2011 2 Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Пермская государственная фармацевтическая академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию». Научный руководитель: кандидат фармацевтических наук, доцент Малкова Тамара Леонидовна Официальные оппоненты: доктор фармацевтических наук, профессор Ярыгина Татьяна Ивановна ГОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия Росздрава» кандидат фармацевтических наук, доцент Захарова Людмила Андреевна, Управляющая компания «Медисорб Групп», г. Пермь Ведущая организация: ГОУ ВПО «Пятигорская государственная фармацевтическая академия Росздрава» Защита состоится «31» мая 2011 г. в 13 часов на заседании диссертационного совета Д 208. 068. 01 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Пермская государственная фармацевтическая академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» по адресу: 614990, г. Пермь, ул. Полевая, д.2. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Пермской государственной фармацевтической академии по адресу: г. Пермь, ул. Крупской, д.46. Дата размещения объявления о защите диссертации на сайте ПГФА http://www.pfa.ru «28» апреля 2011 г. Автореферат разослан «29» апреля 2011 г. Ученый секретарь диссертационного совета Д 208. 068. 01, кандидат фармацевтических наук, доцент И.А. Липатникова 3 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность лекарственных темы. средств, Химико-токсикологический представляющих интерес с анализ (ХТА) точки зрения потенциальной опасности для человека при острых отравлениях и преступных деяниях, достаточно трудоемкий процесс, где в качестве объектов исследования фигурируют биологические объекты (биожидкости, секреты, органы и т.п.). Основным в аналитической токсикологии является подготовка проб, включающая выделение (изолирование), очистку и концентрирование токсических соединений, правильное использование возможностей различных методов анализа, их рациональное сочетание и умение интерпретировать результаты. В этой области анализа очень большое значение имеет качество измерений, т.е. совокупность свойств, обуславливающих получение результатов с требуемыми точностными характеристиками, в необходимом виде и в установленные сроки. Метрологическое обеспечение – это цикл мероприятий, правил, действий, направленных на получение достоверных, правильных, точных и воспроизводимых результатов измерений (анализа, контроля и т.п.). Обязательные требования Федерального закона «Об обеспечении единства измерений» предъявляются, в том числе к измерениям, которые выполняются по поручению суда, органов прокуратуры, государственных органов исполнительной власти. В настоящее время подготовка и обоснование метрологического обеспечения проведения химико-токсикологического анализа, как в отношении живых лиц, так и в отношении экспертных исследований, имеющих судебно-химическую направленность, имеет первостепенное значение. Аналитическая служба Бюро судебно-медицинской экспертизы (Бюро СМЭ) и химико-токсикологических лабораторий (ХТЛ) крайне заинтересована в установлении и применении научных и организационных основ, технических средств, правил и норм, необходимых для достижения единства и требуемой точности измерений. 4 Обеспечение необходимой точности анализа при реализации аттестованных методик в испытательной лаборатории требует внедрения внутреннего контроля показателей качества результатов анализа. Жизненный цикл методики выполнения измерений позволяет сформулировать требования к современной лабораторно-информационной системе с целью автоматизации метрологических нужд аналитической лаборатории. Местные анестетики по частоте развития лекарственных осложнений стабильно занимают одно из первых мест в связи с широким применением в медицинской практике и способностью вызывать отравления, в том числе и смертельные, сопровождающиеся негативными реакциями организма от простых форм аллергии до анафилактического шока. Неблагоприятные побочные эффекты токсического характера развиваются, как правило, на фоне повышенных концентраций препарата в крови при использовании их в дозах, превышающих рекомендуемые, при случайном попадании в сосудистое русло, при быстром введении препарата, а также при введении пациентам с медленным типом метаболизма. В Пермской фармакадемии ранее проведены исследования по разработке хроматографических методов определения лидокаина, тримекаина, артикаина и анилокаина в биообъектах . Необходимым этапом использования высокочувствительных методик анализа является их аттестация, оценка пригодности (валидация) и определение форм и методов контроля стабильности получаемых результатов при их реализации в экспертной практике. Цель и задачи. Целью работы является разработка и оптимизация методик обнаружения и количественного определения ряда местных анестетиков, выработка методического подхода к метрологическому обеспечению проведения испытаний для целей химико-токсикологического анализа. Для достижения поставленной цели предстояло решить следующие задачи: 5 Оптимизировать методику изолирования местноанестезирующих средств из биожидкостей на основании изучения степени извлечения в диапазоне терапевтических и токсических концентраций. Разработать скрининговую методику определения группы местных анестетиков на основе капиллярной газо-жидкостной хроматографии для включения в схему химико- токсикологического анализа биожидкостей. Аттестовать методику обнаружению и выполнения количественному измерений (МВИ) определению по местных анестетиков в биожидкостях, провести эксперимент по оценке пригодности методики и рассчитать характеристики погрешности результатов анализа при реализации, аттестованной МВИ. Провести сравнительную оценку требований государственных стандартов к методам проведения приемлемости методов при испытаний и оценке проведении химико- реализации процедуры токсикологических исследований. Определить основные внутрилабораторного направления контроля при проведении химико- токсикологического анализа для выработки рекомендаций по его метрологическому обеспечению. Апробировать проведение внутрилабораторного контроля при проведении химико-токсикологического анализа местных анестетиков с использованием компьютерной программы «QControl 5.0». Научная новизна. Разработаны условия скринингового определения 12 местноанестезирующих веществ в крови и моче на основе капиллярной газожидкостной хроматографии, установлены оптимальные температурные градиенты для разделения всех анализируемых веществ. 6 На основании изучения степени извлечения в диапазоне терапевтических и токсических концентраций оптимизирована методика изолирования местноанестезирующих средств из биожидкостей. Разработан методический подход на основании идеологии стандарта ГОСТ Р ИСО 5725-2002 к деятельности аналитической систематизации обязательных этапов службы экспертных учреждений по обеспечению достоверности и качества проведения испытаний, к которым относится аттестация аналитических методик, оценка их пригодности в конкретной лаборатории и проведение внутрилабораторного контроля качества. Определена последовательность процедур по оценке показателей точности методики при её разработке и аттестации, оценке показателей точности результатов анализа при реализации экспертной методики в конкретной лаборатории на примере МВИ по обнаружению и количественному определению местных анестетиков в крови и моче. Дана оценка функции внутрилабораторного контроля качества контролю стабильности токсикологического результатов судебно-химического анализа как стабильности и по химико- метрологических характеристик измерений для обеспечения точности и сопоставимости результатов. Обоснована необходимость автоматизации рутинной деятельности химико-токсикологических и судебно-экспертных лабораторий с помощью информационных технологий, определены технические возможности использования отдельных видов контрольных карт на основе программного обеспечения «Q-контроль 5.0» в практике химико-токсикологического анализа. Практическая значимость. Выполненная работа позволяет принимать научно-обоснованные решения при определении форм и методов реализации требований по метрологическому обеспечению проведения судебно- 7 химических и химико-токсикологических исследований, способствующих повышению качества и обеспечению достоверности результатов испытаний. Разработанные методики определения местных анестетиков в биожидкостях на основе хроматографических методов внедрены в практику судебно-химического отделения Пермского бюро судебно-медицинской экспертизы (акт внедрения от 27 апреля 2009 г.), судебно-химического отделения Тюменского бюро судебно-медицинской экспертизы (акт внедрения от 14 мая 2009 г.), химико-токсикологической лаборатории областного центра острых отравлений Свердловской областной клинической психиатрической больницы (акт внедрения от 05 октября 2009 года). Усовершенствованная процедура химико-токсикологического исследования местных анестетиков в биологических жидкостях (кровь, моча) легла в основу Новой медицинской местноанестезирующих технологии препаратов в «Определение биожидкостях при судебно- химическом и химико-токсикологическом исследовании», принятой к рассмотрению Российским центром судебно-медицинской экспертизы. Методические подходы к проведению аттестации методик обнаружения и количественного определения местных анестетиков в биообъектах внедрены в практику судебно-химического отделения Курганского бюро судебно-медицинской экспертизы (акт внедрения от 07 апреля 2009 года). Методические подходы к проведению внутрилабораторного контроля при проведении судебно-химических и химико-токсикологических исследований внедрены в работе химикотоксикологической лаборатории МУ ГКБ № 14 при построении системы менеджмента качества (акт внедрения от 16 мая 2009 г.), судебнохимического отделения Кировского областного бюро судебно-медицинской экспертизы (акт внедрения от 25 мая 2009 г.), химико-токсикологической лаборатории областного центра острых отравлений Свердловской областной клинической психиатрической больницы (акт внедрения от 05 октября 2009 года). 8 Апробация работы. Основные материалы работы доложены на межвузовской научно-практической конференции «Актуальные проблемы фармацевтической науки и образования: Итоги и перспективы. Вузы и регион» (Пермь, 2003), международной научно-практической конференции «Традиции и инновации в понимании и решении проблем инвалидности» (Пермь, 2005), научной конференции «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической Всероссийской продукции» студенческой научной (Пятигорск, конференции 2006), 80-ой (Казань, 2006), Всероссийской научной конференции студентов, аспирантов и мол. ученых «Молодежь и наука – третье тысячелетие» (Красноярск, 2006), российской научно-практической конференции, посвященной 70-летию ПГФА «Достижения и перспективы в области создания новых лекарственных средств» (Пермь, конференции, 2007), посвященной Всероссийской памяти научно – профессора практической Ю.М.Кубицкого «Современные проблемы медико-криминалистических, судебно-химических и химико-токсикологических экспертных исследований» (Москва, 2007), Российской научно-практической конференции «Современное состояние и пути оптимизации лекарственного обеспечения населения» (Пермь, 2008), Всероссийской участием научно-практической «Актуальные конференции вопросы с международным судебно-химических, химико- токсикологических исследований и фармацевтического анализа» (Пермь, 2009). Объем и структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части (3 главы), общих выводов, списка литературы, включающего 172 наименования (53 источника зарубежной литературы), приложения. Работа изложена на 153 страницах машинописного текста, включает 33 таблицы, 22 рисунка и 59 страниц приложения, включающего акты внедрения, документы по аттестации методик выполнения измерений, Новую медицинскую технологию, 9 результаты эксперимента по внутрилабораторному контролю качества с использованием программного обеспечения «Q-Control 5.0». Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 работ, из них 2 – в журналах, рекомендованных ВАК, 1 монография. Связь задач фармацевтических соответствии с исследования наук. планом с проблемным Диссертационная исследований работа планом выполнена Пермской в государственной фармацевтической академии (номер государственной регистрации 01.9.50 007417). На защиту диссертации выносятся следующие положения: Теоретическое обоснование методического подхода к систематизации обязательных этапов деятельности аналитической службы экспертных учреждений по обеспечению достоверности и качества проведения химико-токсикологических исследований. Результаты изучения степени извлечения анилокаина, лидокаина, тримекаина и артикаина из мочи и крови в диапазоне терапевтических и токсических концентраций. Результаты экспериментальных исследований по разработке скрининговой газохроматографической методики обнаружения ряда местноанестезирующих веществ при их совместном присутствии на основе изучения факторов, влияющих на хроматографическое разделение Результаты эксперимента по аттестации и оценке пригодности методики выполнения измерений (МВИ) по обнаружению и количественному определению местных анестетиков в биожидкостях с использованием хроматографии. метода высокоэффективной жидкостной 10 Результаты апробации проведения внутрилабораторного контроля при проведении химико-токсикологического анализа местных анестетиков в крови с использованием компьютерной программы «Q-Control 5.0». СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Состояние методического и метрологического обеспечения проведения химико-токсикологических и судебно-химических экспертных исследований местных анестетиков Существующие на сегодняшний день основные теории механизма действия местных анестетиков характеризуют эти вещества как специфически воздействующие на нервные эфферентные образования, прекращающие проведение нервных импульсов. Использование в качестве объектов исследования группы местноанестезирующих средств обусловлено проявлением системных токсических процессов и аллергических реакций, в том числе со смертельным исходом. Фармакокинетика амидных анестетиков во многом определяется быстротой всасывания, малым периодом полувыведения. На основании анализа литературных источников сделаны выводы о необходимости оптимизации изолирования местных анестетиков из крови и мочи в диапазоне терапевтических и токсических концентраций, разработки современных скрининговых методик анализа. Предлагаемые отечественными и зарубежными высокоэффективной авторами методики газожидкостной их обнаружения хроматографии в на основе подавляющем большинстве случаев базируются не на капиллярных, а на устаревших набивных колонках, не обеспечивающих должную чувствительность и эффективность при разделении внутри группы большого числа сходных по структуре веществ. Разработанные методики требуют проведения процедур аттестации для определения соответствующих метрологических параметров, валидации (оценки пригодности) методик и установления процедур контроля 11 стабильности результатов химико-токсикологического анализа. Для метрологического обеспечения получения достоверных, правильных, точных и воспроизводимых результатов экспертных исследований необходимо использование современной нормативно – правовой документации: ГОСТ Р ИСО 5725-2002 рекомендует достаточно большой набор способов контроля качества результатов исследований, приемлемых в том числе при проведении судебно-химических и химико-токсикологических исследований. Требует обоснования и возможность применения контрольных карт для контроля стабильности результатов химико-токсикологического анализа на основе компьютерных программ, позволяющих полностью или частично автоматизировать внутрилабораторный контроль. Важнейшим информационным инструментом являются методики выполнения измерений (МВИ), основные этапы «жизни» представлены на рисунке 1. Разработка методики Пропись методики Аттестация Оценка показателей качества методики Внедрение в лабораториях Оценка показателей качества результатов измерений Эксплуатация в лабораториях Отказ от методики Рис. 1 – Жизненный цикл методики анализа Внутрилабораторный контроль, межлабораторные сравнительные испытания которых 12 Таким образом, построение плана эксперимента основывалось на основных этапах жизненного цикла МВИ, а методический подход к реализации метрологических требований включал оценку показателей качества разработанных методик анализа местных анестетиков, оценку показателей качества внутрилабораторного при внедрении контроля с методик и использованием процедуры современных информационных технологий. 2. Объекты и методы исследования В эксперименте были использованы фармацевтические субстанции или инъекционные растворы соответствующие требованиям местноанестезирующих нормативной препаратов, документации. Для приготовления модельных смесей использовали образцы мочи и цельной крови, полученные от здоровых добровольцев, не принимавших лекарственные препараты в течение месяца до отбора проб. Модельные смеси мочи и крови готовили путем добавления 0,1 % водных растворов субстанций исследуемых веществ или растворов, представляющих собой готовые лекарственные средства, до получения концентраций 2, 5, 10 мкг/мл (что охватывает диапазон терапевтических и токсических концентраций). При проведении исследований методом ВЭЖХ использовался жидкостный микроколоночный хроматограф «Милихром А-02», методом ГЖХ - хроматографы «Кристалл 2000М» и «Agilent 7890A». 3. Разработка и оптимизация методик химико-токсикологического анализа местных анестетиков, аттестация и оценка пригодности МВИ Нами был проведен эксперимент по изучению степени извлечения лидокаина, тримекаина, артикаина и анилокаина из биожидкостей (кровь, моча) в зависимости от их концентрации (2, 5 и 10 мкг/мл). Для контроля выхода анестетиков использовалась разработанная ранее методика ВЭЖХ. 13 Предел обнаружения исследуемых веществ методом ВЭЖХ в крови составил для лидокаина – 0,8 мкг/мл, для тримекаина и артикаина – 1,5 мкг/мл, для анилокаина – 1 мкг/мл, в моче – для лидокаина и анилокаина – 0,5 мкг/мл, для артикаина и тримекаина – 0,7 мкг/мл. Таким образом, предлагаемые методики позволяют определять уровень терапевтических и токсических концентраций анестетиков в биожидкостях. Нами был проведён эксперимент и разработана скрининговая методика определения ряда 12 местных анестетиков (анестезина, лидокаина, тримекаина, мепивакаина, артикаина, анилокаина, ропивакаина, кокаина, дикаина, бупивакаина, пиромекаина, оксибупрокаина), методом капиллярной газожидкостной хроматографии на модельных смесях, представляющих собой растворы с концентрацией 10 мкг/мл в метаноле. Известно, что наиболее существенными факторами, способствующими сокращению времени анализа местных анестетиков, при достаточно полном их разделении, является градиентное поднятие температуры в колонке хроматографа, скорость газа носителя, деление потока газа, температуры детектора и испарителя. Было установлено, что при стартовой температуре колонки 130°С, 140°С, 155°С, 180°С, при любом градиентном изменении температурного режима, вещества делятся не полностью и зачастую образуют продукты разложения. При стартовой температуре колонки 160°С также возможно неполное деление и возникновение продуктов разложения анализируемых веществ, но при гибком варьировании температурного градиента удается почти или полностью избежать этих недостатков. Таким образом, наибольшая эффективность колонки при оптимальной чувствительности определения была получена при работе на хроматографе «Кристалл 2000М» при следующих условиях: температурные параметры: детектор пламенно-ионизационный (ПИД) 300С; испаритель 250С; 14 расходы газов (мл/мин): азот 39, водород 20, воздух 200. Коэффициент деления потока газа-носителя 1:17, линейная скорость азота 53 см/сек. С учетом коэффициента деления объемная скорость потока азота, проходящего через колонку, составила 2,3 мл/мин. начальная температура колонки 160С – 1 мин., подъем до 200С со скоростью 8С/мин, выдержка при 200С - 1 мин., подъем до 211С со скоростью 1С/мин, выдержка при 211С - 2 мин., далее подъем до 290С со скоростью 25С/мин. Общее время хроматографирования 24 минуты (рис. 2). Рис. 2 – Хроматограмма разделения группы местных анестетиков при скрининге ГЖХ на хроматографе «Кристалл 2000М» При работе на хроматографе «Agilent 7890A» (рис.3) наибольшая эффективность колонки при оптимальной чувствительности определения была получена при следующих условиях: температурные параметры: детектор ПИД 300С; испаритель 250С; расходы газа (мл/мин): гелий 34, Коэффициент деления потока газаносителя 1:30. С учетом коэффициента деления объемная скорость потока гелия, проходящего через колонку, составила 3 мл/мин. 15 температура колонки 160С – 1 мин., подъем до 180С со скоростью 8С/мин, выдержка при 180С - 2 мин., подъем до 190С со скоростью 1С/мин, выдержка при 190С - 1 мин., далее подъем до 290С со скоростью 25С/мин. Общее время хроматографирования 23 минуты. Рис. 3 – Хроматограмма разделения группы местных анестетиков при скрининге ГЖХ на хроматографе «Agilent 7890A» Как видно из рисунков 2,3 имеет место достаточно четкое разделение всех компонентов смеси, пики узкие и симметричные. Таким образом, данные температурные режимы были выбраны как рабочие, для всех 12 местных анестетиков. Нами предложена схема химико-токсикологического исследуемых веществ в биологических анализа жидкостях хроматографическими методами на основе ранее разработанных условий (рис. 4), которая легла в основу Новой местноанестезирующих медицинской препаратов технологии в биожидкостях химическом и химико-токсикологическом исследовании». «Определение при судебно- 16 Кровь (10мл) Моча (10мл) Изолирование Хлороформное извлечение 10 (мл) 5 мл извлечения (концентрирование) 5 мл извлечения (получение сухого остатка с последующим растворением в 1 мл метанола Предварительное исследование методом ТСХ Предварительное исследование методом ГЖХ Подтверждающее исследование и количественное определение методом ВЭЖХ Рис. химико-токсикологического исследования биожидкостей на наличие ряда местных анестетиков (лидокаина, 4 – Схема тримекаина, артикаина и анилокаина) Разработанные методики биожидкостях при исследовании внедрены определения судебно-химическом в практику и местных анестетиков в химико-токсикологическом судебно-химического отделения Пермского бюро судебно-медицинской экспертизы (акт внедрения от 27 апреля 2009 г.), судебно-химического отделения Тюменского бюро судебномедицинской экспертизы (акт внедрения от 2.05.2009), химико- токсикологической лаборатории областного центра острых отравлений Свердловской областной клинической психиатрической больницы (акт внедрения от 05.10.2009 г.). Нами были представлены подходы к оценке показателей точности при аттестации методики химико-токсикологического анализа с использованием 17 высокоэффективной жидкостной местноанестезирующих средств артикаина) Для в крови. хроматографии (лидокаина, проведения на анилокаина, эксперимента примере тримекаина, использовались модельные смеси, содержащие определяемые вещества в диапазоне терапевтических и токсических концентраций. Общий объем пробы (крови) в каждом случае составлял 400 мл, для проведения эксперимента использовали метод добавок. В ходе аттестации МВИ был определен порядок проведения процедуры оперативного контроля повторяемости (сходимости), который должен проводиться при каждом испытании рабочих проб. По итогам свидетельство об аттестации Уральским аттестации № НИИ метрологии 223.1.11.11.83/2007 от выдано 31.08.2007. Методические подходы к проведению аттестации методик обнаружения и количественного определения местных анестетиков в биообъектах внедрены в практику судебно-химического отделения Курганского бюро судебномедицинской экспертизы (акт внедрения от 07 апреля 2009 года). В качества образцов для оценивания характеристик погрешности результатов анализа в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725 были приготовлены модельные смеси (на основе крови) с содержанием лидокаина, анилокаина, артикаина, тримекаина 5 мкг/мл. Показатели качества результатов анализа определяемых веществ в лаборатории в целом соответствует указанным в приложении к свидетельству об аттестации МВИ (таблица 1). В связи с введением в действие с 1 мая 2009 года ГОСТ Р 52960-2008 «Аккредитация судебно-экспертных лабораторий. Руководство по применению ГОСТ Р ИСО/МЭК 17025» проведена сравнительная оценка государственных стандартов для целей использования в экспертной практике, сформулированы основные положения, устанавливающие требования к методам проведения испытаний и оценке приемлемости, к прослеживаемости измерений. 18 Таблица 1 – Сравнительная оценка показателей точности при аттестации методики с показателями качества результатов анализа местных анестетиков Диапазон измерений, значения показателей точности, повторяемости, внутрилабораторной прецизионности и воспроизводимости согласно свидетельству № 223.1.11.11.83 ФГУП УНИИМ Показатель внутрилабораторной Показатель Показатель Наименование прецизионности точности повторяемости (относительное (границы соединения, (относительное значение относительной диапазон значение среднеквадратического погрешности среднеквадратического измерений, при отклонения отклонения 3 вероятности внутрилабораторной мкг/см повторяемости), σr,% (Р=0,95), δ, % прецизионности), σRл % Анилокаин 12 15 40 От 5 до 105 вкл Лидокаин 11 13 32 От 5 до 105 вкл Тримекаин 11 13 32 От 5 до 85 вкл Артикаин 10 12 30 От 5 до 105 вкл Диапазон измерений, значения показателей точности, повторяемости, внутрилабораторной прецизионности и воспроизводимости, полученные в РИЦ «Фарматест» Пермской государственной фармацевтической академии Анилокаин От 5 до 105 вкл Лидокаин От 5 до 105 вкл Тримекаин От 5 до 85 вкл Артикаин От 5 до 105 вкл 9,34 9,36 34 9,28 8,50 32 7,87 8,48 32 10 8,26 30 4. Внутренний контроль качества экспертных исследований В связи с современными требованиями предупреждения попадания в протокол или заключение эксперта разработаны рекомендации по ошибочных результатов, нами организации и проведению внутрилабораторного контроля качества как одного из этапов обеспечения качества химико-токсикологического анализа. Проведенные исследования направлениях внедрения позволили сделать вывод об основных внутрилабораторного контроля: создание нормативного документа, регламентирующего порядок и формы проведения 19 ВЛК; разработка контрольных материалов для разных биоматриц методов определения, их контрольных аттестация карт; создание и включение в компьютерных реестр; использование программ, позволяющих полностью или частично автоматизировать ВЛК В качестве одной из форм контроля стабильности результатов анализа нами рекомендовано и с положительным результатом апробировано на примере химико-токсикологического анализа местных анестетиков использование контрольных карт с применением компьютерной программы «Q-Control 5.0». В ходе исследования модельных смесей крови, содержащей лидокаин, артикаин, анилокаин, тримекаин, нами были изучены различные виды контрольных карт и оценена возможность их использования при проведении судебно-химического и химико-токсикологического анализа. Периодичность оценки рабочих проб составляла 3 дня в неделю, контрольные карты велись в течение 2 месяцев. Нами показана целесообразность ведения контрольных карт размахов, текущих расхождений, Шухарта (средних значений), CUSUM с использованием стандартных образцов, сформулированы рекомендации по их использованию в экспертной практике на базе программы «Q-Control 5.0». Сделан вывод о том, что контрольные карты на основе рабочих проб не могут быть применены вследствие особенностей проведения экспертных исследований. Разработан методический подход к обеспечению качества химикотоксикологических и судебно-химических исследований, включающий поэтапную систематизацию деятельности аналитической службы экспертных учреждений по обеспечению достоверности и качества проведения испытаний и план каждого этапа. Методические подходы к проведению внутрилабораторного контроля при проведении судебно-химических и химико-токсикологических исследований внедрены в работе химико-токсикологической лаборатории 20 МУ ГКБ № 14 г. Екатеринбург, при построении системы менеджмента качества, судебно-химического отделения Кировского областного бюро судебно-медицинской экспертизы. ВЫВОДЫ 1. Оптимизирована методика изолирования местных анестетиков из биожидкостей на основе изучения степени извлечения в диапазоне терапевтических и токсических концентраций. Предложенные методики в среднем позволяют извлекать из крови 74 % лидокаина, 66 % тримекаина, 65 % артикаина и 69 % анилокаина, из мочи 90 % лидокаина, 84 % тримекаина, 76 % артикаина и 91 % анилокаина (процент извлечения указан для концентрации местных анестетиков 10 мкг/см3 биожидкости). 2. Разработана анестетиков скрининговая методом методика обнаружения высокоэффективной 12 местных газожидкостной хроматографии для аппаратно-программных комплексов «Кристалл 2000» (газ-носитель азот) и «Agilent 7890A» (газ-носитель гелий), общее время хроматографирования составило соответственно 24 и 23 минуты. Установлены оптимальные температурные градиенты для разделения всех анализируемых веществ. Предложена схема химикотоксикологического анализа исследуемых веществ в биологических жидкостях хроматографическими методами, которая легла в основу Новой медицинской технологии «Определение местноанестезирующих препаратов в биожидкостях при судебно-химическом и химикотоксикологическом исследовании», принятой к рассмотрению Российским центром судебно-медицинской экспертизы. 3. Проведен эксперимент по аттестации методики выполнения измерений (МВИ) по обнаружению и количественному определению местных анестетиков в биожидкостях с использованием метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (свидетельство об аттестации № 223.1.11.11.83/2007 от 31.08.2007). В ходе аттестации 21 МВИ определен порядок проведения процедуры оперативного контроля повторяемости (сходимости), который должен проводиться при каждом испытании. Проведена оценка пригодности методики и расчет характеристик погрешности результатов анализа при реализации аттестованной МВИ в РИЦ «Фарматест» ГОУ ВПО ПГФА Росздрава. Показатели качества результатов анализа определяемых веществ в лаборатории в целом оказались не хуже, чем указанные в приложении к свидетельству об аттестации МВИ. 4. Проведена сравнительная оценка требований государственных стандартов ГОСТ Р 52960-2008 «Аккредитация судебно-экспертных лабораторий. Руководство по применению ГОСТ Р ИСО/МЭК 17025» и ГОСТ Р ИСО/МЭК 17025 «Общие требования к компетентности испытательных и калибровочных лабораторий» к методам проведения испытаний и оценке приемлемости методов при проведении судебноэкспертных исследований. Широкая область применения стандарта ГОСТ Р ИСО/МЭК 17025-2006 интерпретирована с учетом такой специфики сферы деятельности аналитических лабораторий как участие в судопроизводстве. 5. Разработаны рекомендации по использованию ряда положений приказа Минздрава России № 220, утвердившего ОСТ "Правила проведения внутрилабораторного контроля качества количественных методов клинических лабораторных исследований с использованием контрольных материалов» в практике экспертной деятельности. Результаты проведенного исследования позволили определить основные направления реализации процедуры внутрилабораторного контроля разработка при проведении и химико-токсикологического утверждение нормативного анализа: документа, регламентирующего порядок и формы проведения ВЛК; создание контрольных материалов для разных биоматриц и разных методов определения, их аттестация и включение в реестр МЗиСР РФ; 22 применение идеологии проведения оперативного контроля качества аналитических исследований с использованием контрольных карт; разработка и использование компьютерных программ, позволяющих полностью или частично автоматизировать ВЛК. 6. С положительным результатом апробировано проведение ВЛК при проведении химико-токсикологического анализа местных анестетиков с использованием компьютерной программы «QControl 5.0». При проведении судебно-химического анализа целесообразно ведение контрольных карт размахов, текущих расхождений, Шухарта (средних значений), CUSUM с использованием стандартных образцов. Контрольные карты на основе рабочих проб не могут быть применены вследствие особенностей проведения экспертных исследований. Разработаны рекомендации по организации контроля стабильности результатов с использованием контрольных карт для химикотоксикологических лабораторий и судебно-химических отделений бюро СМЭ. По теме диссертации опубликованы следующие работы: 1. Гайсинович, М. С. Скрининг местных анестетиков методом капиллярной газовой хроматографии / М. С. Гайсинович, Т. Л. Малкова, Е. Е. Столяров // Актуальные проблемы фарм. науки и образования: итоги и перспективы: материалы. МНПК проф.- препод. состава «Вузы и регион». – Пермь, 2003. – С. 92. 2. Определение местных анестетиков методом капиллярной хроматографии с использованием аппаратно-программного комплекса «Кристалл 2000М» / Е.Е Столяров, Т.Л. Малкова, М.С. Гайсинович, Ю.Н. Карпенко // Проблемы экспертизы в медицине. – 2004. – № 3. – С. 25-27. 3. Капиллярная газовая хроматография в экспертизе острых отравлений лекарственными препаратами, применяемыми в анестезиологии / Т.Л. Малкова, М.С. Гайсинович, Ю.Н. Карпенко, Е.Е. Столяров // Традиции и 23 инновации в понимании и решении проблем инвалидности: материалы науч. - практ. конф. – Пермь, 2005. – С. 181-183. 4. Булатов, Р.М. Применение капиллярной газо – жидкостной хроматографии при химико-токсикологических исследованиях / Р.М. Булатов, Т.Л. Малкова, Е.Е. Столяров // Вестн. Перм. гос. фарм. акад.: науч.-практ. журн. студ. науч. общества. – 2006. – № 1. – С.56. 5. Химико-токсикологический анализ местноанестезирующих препаратов и лекарственных средств, потенцирующих их действие / Е.Е. Столяров, Т.Л. Малкова, М.С. Гайсинович, Р.М. Булатов // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сборник науч. трудов.- Вып. 61. – Пятигорск: изд. ПятГФА, 2006. – С. 298. 6. Булатов, Р.М. Токсикологическое значение лекарственных препаратов, применяемых в анестезиологической практике / Р.М. Булатов, Е.Е. Столяров, Т.Л. Малкова // Сборник тезисов 80-ой Всероссийской студенческой научной конференции (18-20 апреля 2006 г.). – Казань, 2006. – С. 201-202. 7. Карпенко, Ю.Н. Хроматографические методы в химико- токсикологическом анализе ряда местных анестетиков / Ю.Н. Карпенко, Т.Л. Малкова, Е.Е. Столяров // Современные проблемы медико- криминалистических, судебно-химических и химико-токсикологических экспертных исследований: сборник материалов Всерос. науч.-практ. конф., посвящ. памяти проф. Ю.М. Кубицкого. – Москва, 2007. – С. 218-221. 8. Столяров, Е.Е. Высокоэффективная жидкостная хроматография в химикотоксикологическом анализе местноанестезирующих средств / Е.Е. Столяров, Р.М. Булатов, Т.Л. Малкова // Достижения и перспективы в области создания новых лекарственных средств: материалы рос. науч. - практ. конф., посвящ. 70 - летию ПГФА (27-28 ноября 2007 г.). – Пермь, 2007. – С. 217-219. 9. Столяров, Е.Е. К вопросу аттестации МВИ массовых концентраций местных анестетиков в биологических жидкостях / Е.Е. Столяров, Т.Л. Малкова // Современное состояние и пути оптимизации лекарственного обеспечения населения: материалы рос. науч.-практ. конф. ПГФА (14-ая 24 международная выставка «Медицина и здоровье», 13-15 ноября 2008 г.). – Пермь, 2008. – С.155-157. 10. Столяров, Е.Е. Определение ряда местных анестетиков в биологических жидкостях при химико-токсикологических исследованиях / Е.Е. Столяров, Ю.Н. Карпенко, Т.Л. Малкова // Суд. – мед. экспертиза. – 2009. – №3. – С. 24 – 27. 11. Контрольные карты в системе внутрилабораторного контроля качества, программные и технические средства их применения / Е.Е. Столяров, И.П. Крохин, Р.М. Булатов, Т.Л. Малкова // Вестн. Перм. гос. фарм. акад.: науч.практ. журн. – 2009. – № 5. – С.156 -157. 12. Столяров, Е.Е. Методическое и метрологическое обеспечение проведения химико-токсикологических и судебно-химических экспертных исследований на примере местных анестетиков / Е.Е. Столяров // Сборник материалов Всероссийской научно-практической конференции с международным участием (ГОУ ВПО ПГФА Росздрава, 28.09 – 3.10.2009 г.). – Пермь, 2009. – С. 11-14. 13. Столяров, Е.Е. Использование программы Qcontrol 5.0 при проведении внутрилабораторного контроля качества химико-токсикологического анализа местных анестетиков в биожидкостях / Е.Е. Столяров, Т.Л. Малкова // Сборник материалов Всероссийской научно-практической конференции с международным участием (ГОУ ВПО ПГФА Росздрава, 28.09 – 3.10.2009 г.). – Пермь, 2009. – С. 25-27. 14. Малкова, Т.Л. Внутренний и внешний контроль качества судебнохимических экспертных исследований / Т.Л. Малкова, Е.Е. Столяров. Монография. – Пермь (ГОУ ВПО ПГФА Росздрава), 2009. – 73 с.
