ТезисыМиН2015_Усковаx

УДК 535.37:577.325.3
ФЛУОРЕСЦЕНТНОЕ ЗОНДИРОВАНИЕ АФФИННЫХ ХАРАКТЕРИСТИК
БАКТЕРИАЛЬНОЙ ЛЮЦИФЕРАЗЫ В ВЯЗКИХ СРЕДАХ
Ускова Т.А.
Научный руководитель: канд. физ.-мат. наук Немцева Е.В.
Сибирский федеральный университет
Вязкие среды могут рассматриваться как модель микроокружения белков (в том
числе ферментов) внутри клетки. Влияние вязких сред на активность ферментов может
проявляться в изменении их аффинности по отношению к субстратам и лигандам.
Данный процесс может быть исследован флуоресцентным методом с помощью зонда 1анилино-8-нафталинсульфоновая кислота (1,8-ANS). При связывании с ферментом
квантовый выход флуоресценции 1,8-ANS значительно увеличивается по сравнению с
выходом в свободном состоянии. Также наблюдается гипсохромный сдвиг максимума
флуоресценции 1,8-ANS от 505-540 нм в воде до 470-480 нм в связанном с белком
состоянии. Данные свойства делают зонд 1,8-ANS удобным инструментом для изучения
способности фермента связываться с субстратами и конформационных перестроек
белковой молекулы [1].
Ранее для исследования влияния вязких сред на ферментативные реакции была
изучена биолюминесценция биферментной системы бактерий в растворах с глицерином
и сахарозой [2]. Было получено, что при нормальных условиях вязкие среды снижают
активность ферментов. Механизмы, за счет которых реализуется это влияние, включают
затруднение диффузии компонентов реакции, изменение их конформации, ослабление
фермент-субстратных и белок-белковых взаимодействий и др.
Целью данной работы являлся анализ влияния вязких сред на ферментсубстратные взаимодействия люциферазы с помощью флуоресцентного зонда 1,8-ANS.
Материалы и методы
В работе были использованы следующие реактивы: бактериальная люцифераза
Photobacterium lieognathi производства лаборатории нанобиотехнологий и
биолюминесценции Института биофизики СО РАН, 1-анилино-8-нафталинсульфоновая
кислота (1,8-ANS) производства Sigma-Aldrich, глицерин производства Panreac.
Параметры связывания зонда с белком определяли методом флуоресцентного
титрования. Процедуру флуоресцентного титрования проводили последовательным
добавлением малой дозы (0,5-3 мкл) раствора зонда с концентрацией 410-3 М к 400 мкл
раствора люциферазы с концентрацией 510-6 М. Параллельно проводили контрольный
эксперимент с титрованием буферного раствора идентичными дозами 1,8-ANS. В
процессе титрования регистрировали спектры поглощения и флуоресценции при длине
волны возбуждения 360 нм, а также время жизни флуоресценции при длине волны 470
нм. Получаемые концентрации зонда рассчитывали по поглощению при 350 нм с
использованием коэффициента молярной экстинкции 5000 М-1см-1. Титрование
проводили в фосфатном буфере (вязкость η =1 сП) и буфере с 46% глицерина (η = 5 сП)
при 20 С.
Регистрацию спектров поглощения проводили на спектрофотометре Cary 5000
(Agilent Technologies), спектры флуоресценции и времена жизни флуоресценции
определяли с помощью спектрофлуориметра Fluorolog 3 (Horiba Jobin Yvon).
Зарегистрированные спектры испускания были откорректированы с учетом
чувствительности прибора, эффекта внутреннего фильтра и фона от растворителя.
По интенсивности флуоресценции на длине волны 470 нм для разных
концентраций зонда строили кривую титрования. По временам жизни флуоресценции
зонда проводили разделение кривой титрования на три компоненты: свободный зонд,
1
зонд, связанный с внутренними сайтами белка, и зонд, присоединившийся на внешних
сайтах. Каждую кривую для связанного зонда описывали нелинейным уравнением [3]:
𝐾𝑑
𝐿𝑡
𝐾𝑑
𝐿𝑡
2
𝑦 = 𝐹 ∗ [(1 + 𝑛∗𝑃 + 𝑛∗𝑃) − √(1 + 𝑛∗𝑃 + 𝑛∗𝑃) −
4𝐿𝑡
𝑛∗𝑃
],
(1)
где F – размерный коэффициент, Kd – константа диссоциации, n – число центров
связывания, Lt – концентрация лиганда (зонда), P – концентрация белка (люциферазы).
Результаты и обсуждение
Были зарегистрированы стационарные спектры флуоресценции 1,8-ANS в
присутствии бактериальной люциферазы в двух средах: в фосфатном буфере и вязкой
среде, содержащей 46 % глицерина (рис. 1).
5
Б
1.0
2б
4
Нормированная
интенсивность
Интенсивность, 105 cps
А
2г
3
2
1г
1
1б
0
360
460
560
Длина волны, нм
0.8
0.6
2б
2г
0.4
1б
1г
0.2
0.0
660
360
460
560
660
Длина волны, нм
Рисунок 1 – Спектры флуоресценции зонда 1,8-ANS (910-5 М) в свободном (1б и
1г) и связанном (2б и 2г) состояниях в буфере (1б и 2б) и 46%-ом растворе глицерина (1г
и 2г).
По рисунку 1 видно, что спектральные характеристики зонда в присутствии
глицерина изменяются, как в свободном, так и в связанном состоянии. Наблюдается
гипсохромный сдвиг максимума люминесценции свободного зонда (на 4 нм) и
батохромный сдвиг спектра связанного зонда (на 6 нм) (рис. 1Б). Квантовый выход
флуоресценции также изменяется, что видно по значениям интенсивности (рис. 1А).
Анализ времен жизни флуоресценции зонда () во всех средах показал наличие
трех компонент: с 1=0,41-0,47 нс (соответствующая свободному зонду), с 2=16-18 нс,
(соответствующая зонду, связанный с внутренними областями белка) и с 3=5-7 нс
(соответствующая зонду, связанный с внешними сайтами). Эти времена не меняются при
переходе в вязкую среду.
С учетом вкладов каждой компоненты в интенсивность флуоресценции зонда при
длине волны 470 нм были получены кривые титрования внутренних и внешних сайтов
связывания люциферазы (рис. 2). Анализ отдельных кривых титрования показал, что
связывание зонда с внутренними центрами люциферазы в вязком растворе
характеризуется более высокой константой диссоциации, чем в буфере (796 M и 564
M соответственно), что может быть признаком ослабления взаимодействия фермента с
субстратом в присутствии глицерина.
2
А
Б
60
80
исходная
70
60
50
18 нс
40
30
6 нс
20
10
Интенсивность, 104 cps
Интенсивность, 104 cps
90
50
исходная
40
30
18 нс
20
10
6 нс
0
0
0
10
20
30
0
40
10
20
[ANS],
[ANS], M10-5
30
40
M10-5
Рисунок 2 – Разложение кривой флуоресцентного титрования бактериальной
люциферазы на компоненты с учетом вкладов разных времен жизни (при 470 нм): А – в
буферном растворе, Б – в растворе с глицерином.
По рисунку видно, что вклад флуоресценции зондов, связанных с внешними
сайтами белка, в общую интенсивность испускания значительно уменьшается при
переходе в вязкую среду. Это говорит об уменьшении количества наружных центров
связывания люциферазы с зондом, что может объясняться явлением «преимущественной
гидратации», свойственным для белков в средах с осмолитами, к которым относится
глицерин. Константа диссоциации в буфере для внешних сайтов составила 19844 M, а
в вязкой среде 14023 M. Установлено также, что уменьшение вклада зондов, связанных
с внешними сайтами белка, происходит за счет увеличения вклада свободного зонда.
Микроокружение флуоресцентного зонда во внутренних сайтах связывания
люциферазы не меняется в вязкой среде с 46% глицерина, что говорит об отсутствии
конформационных перестроек люциферазы под действием глицерина.
Таким образом, получено, что вязкая среда оказывает влияние на аффинные
характеристики, главным образом, поверхностных областей бактериальной
люциферазы.
Благодарности
Авторы благодарят Герасимову Марину Анатольевну за измерение времяразрешенных характеристик флуоресценции. Работа выполнена при частичной
поддержке проекта 1762 в рамках государственного задания Минобрнауки России
Сибирскому федеральному университету.
Список использованной литературы
1. Артюхов В.Г. Оптические методы анализа интактных и модифицированных
биологических систем: Учеб. пособие / Артюхов В.Г., Путинцева О.В. - Воронеж:
Издательство Воронежского государственного университета, 1996.- 240 с.
2. Sukovataya I. E. Thermal stability of coupled enzyme system NADH:FMNoxidoreductase–
luciferase in solvents of different viscosity / Sukovataya I. E., Sutormin O.S., Kratasyuk V.A.
// Luminescence 2012; 27: 95–178, p. 161
3
3. Gasymov O. K., Evidence for internal and external binding sites on human tear lipocalin /
O. K. Gasymov, A. R. Abduragimov, B. J. Glasgow // Archives of Biochemistry and Biophysics
– 2007. - № - 468. – p. 15–21.
4