изучение генетической предрасположенности к атопической
advertisement
На правах рукописи ДМИТРИЕВА-ЗДОРОВА ЕЛЕНА ВИКТОРОВНА ИЗУЧЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ПРЕДРАСПОЛОЖЕННОСТИ К АТОПИЧЕСКОЙ БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМЕ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ПОЛИМОРФНЫХ МАРКЕРОВ ГЕНОВ-КАНДИДАТОВ 03.01.03 – молекулярная биология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2010 Работа выполнена в лаборатории химической геномики Учреждения Российской академии медицинских наук Научно-исследовательском институте биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича РАМН (ИБМХ РАМН). Научный руководитель: кандидат биологических наук, ст.н.с. ИБМХ РАМН Воронько Ольга Евгеньевна Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор ГУ НИИ ЭЧ и ГОС им. А.Н. СЫСИНА РАМН Журков Вячеслав Серафимович кандидат биологических наук, вед.н.с. ФГУП «ГосНИИ генетика» Серегин Юрий Александрович ГУ Медико-генетический научный центр РАМН, г. Москва Ведущая организация: Защита диссертации состоится «___» марта 2010 г. в 14 часов на заседании Диссертационного совета Д.217.013.01 при Государственном научно- исследовательском институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов по адресу: 117545, Москва, 1-й Дорожный проезд, 1. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУП «ГосНИИ генетика». Реферат разослан «___» февраля 2010 г. Учёный секретарь Диссертационного совета, кандидат химических наук Т.Л. Воюшина 2 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Одной из наиболее сложных задач современной генетики является изучение молекулярно-генетических основ многофакторных заболеваний. Важное место среди многофакторных заболеваний бронхолегочной системы человека занимает бронхиальная астма (БА). В некоторых странах БА является главной причиной инвалидности и смертности населения, опережая даже сердечно-сосудистые и онкологические патологии, что характеризует БА как глобальную медико-социальную проблему (Jarvis et al, 1997). Эпидемиологические исследования последних лет говорят о том, что 4-8% населения страдают БА, в том числе 5-10% детской популяции и 5% взрослой (Чучалин, Баранов, 2006). В России данным заболеванием страдает примерно 10% взрослого и 15% детского населения. В последние десятилетия прогрессивно увеличивается заболеваемость и смертность от БА. В основе развития БА лежит взаимодействие различных генетических факторов с факторами внешней среды (Cookson WO, 2002; Vercelli D, 2003). Один из эффективных подходов к изучению роли генетических механизмов развития БА связан с выделением группы генов, продукты которых прямо или косвенно могут быть вовлечены в развитие данной патологии, так называемых генов-кандидатов (Федосеев, 1998). В настоящее время известно более 100 генов-кандидатов БА (Scirica, 2007; Фрейдин, 2002). Гены предрасположенности к БА условно можно разделить на 5 групп: 1) гены врожденного иммунитета и гены иммунорегуляции; 2) гены, связанные с дифференцировкой клеток Th2 и эффекторными функциями иммунной системы; 3) гены, экспрессирующиеся в клетках эпителия бронхов; 4) гены, ассоциированные с перестройкой (ремоделингом) дыхательных путей и тяжестью заболевания; 5) гены предрасположенности к БА, открытые позиционным клонированием (Vercelli D, 2008). Изучение ассоциации генов-кандидатов с заболеванием проводят с помощью полиморфных маркеров, которые могут располагаться внутри гена или рядом с ним. Исследование ассоциации полиморфных маркеров генов-кандидатов основано на выявлении и сравнении частот встречаемости генотипов и аллелей в группах с наличием и отсутствием заболевания. Если различия в частотах аллелей и генотипов являются статистически достоверными, считают, что данный маркер ассоциирован с развитием заболевания. Установленные предрасполагающие или предохраняющие генетические маркеры в дальнейшем могут быть использованы для прогнозирования заболевания у человека на основе исследования индивидуальных особенностей его генома. Поэтому анализ ассоциации полиморфных маркеров с атопической БА является актуальной задачей современной молекулярной генетики. Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы – оценить уровень ассоциации двенадцати полиморфных маркеров восьми генов-кандидатов БА: 3 интерлейкина-13 (IL13), интерлейкина-5 (IL5), альфа-цепи рецептора интерлейкина-8 (IL8RA), toll-подобного рецептора 4 (TLR4), антигена 4, ассоциированного с цитотоксическими Т-лимфоцитами (CTLA4), G-белка, ассоциированного с астмой (GPRA), эотаксина-3 (CCL26) и регулятора активности нормальной экспрессии и секреции Т-клеток (CCL5) с атопической БА. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи: 1. Сформировать группы больных БА различной степени тяжести, а также группу здорового контроля русского происхождения. 2. Определить частоты аллелей и генотипов полиморфных маркеров C(–1055)T и R130Q гена IL13, С(–703)Т гена IL5, M31R и R335C гена IL8RA, Asp299Gly гена TLR4, C(–318)T и A(+49)G гена CTLA4, rs324396 (С/Т) и rs740347 (G/C) гена GPRA, T(+2497)G гена CCL26, A(–403)G гена CCL5 в группе больных атопической бронхиальной астмой и в группе здоровых индивидов. 3. Провести сравнительный анализ распределения аллелей и генотипов выбранных полиморфных маркеров в группах больных и здоровых индивидов для выявления их ассоциации с развитием БА и тяжестью течения БА. 4. Провести анализ ассоциации гаплотипов генов IL13, IL8RA, CTLA4, GPRA с БА и тяжестью течения БА. Научная новизна работы. В данной работе впервые изучена ассоциация полиморфных маркеров генов IL13, IL5, IL8RA, TLR4, CTLA4, GPRA, CCL26, CCL5 с атопической БА и тяжестью ее течения среди русского населения г. Москвы. Вышеизложенные результаты были получены впервые. Практическая ценность работы. Результаты молекулярно-генетического анализа полиморфных участков генов-кандидатов атопической БА могут использоваться для медико-генетического консультирования с целью раннего выявления пациентов с повышенным риском развития заболевания, проведения донозологической профилактики и прогнозирования течения болезни. Апробация работы. Результаты настоящей работы докладывались на IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008 г.), на II Всемирном форуме по астме и респираторной аллергии (Санкт-Петербург, 2009 г.), на конференции «The 6th Annual Cytokines & Inflammation Conference» (Орландо, 2008 г.), на 4-й интернациональной конференции «Genomics, Proteomics, Bioinformatics and Nanobiotechnologies for Medicine» (Москва, 2008 г.), на конгрессе «The World Asthma Meeting (WAM’2007)» (Стамбул, 2007 г.) и на ежегодном конгрессе Европейского респираторного общества (Стокгольм, 2007 г.; Берлин, 2008 г.; Вена, 2009 г.). Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на заседании межлабораторного семинара ИБМХ РАМН от 17 ноября 2009 г. и секции «Молекулярная биология» Ученого Совета ФГУП «ГосНИИ генетика» от 9 декабря 2009 г. 4 Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ, включая 2 статьи и материалы международных конференций. Структура диссертации. Диссертация состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, описание использованных материалов и методов, результаты и обсуждение, выводы и список литературы. Материалы диссертации изложены на ___ страницах машинописного текста и содержат __ таблиц и __ рисунков. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Материалы и методы. В исследовании были использованы образцы ДНК 283 больных атопической БА и 227 здоровых индивидов русского происхождения. Общая характеристика групп представлена в таблице 1. Образцы ДНК и клинические данные больных атопической БА были предоставлены лабораторией аллергодиагностики НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН. В контрольную группу были включены здоровые индивиды без клинически диагностированной БА, аллергических и бронхолегочных заболеваний. Образцы ДНК здоровых людей были предоставлены лабораторией молекулярно-генетической диагностики НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им. А.Н. Сысина РАМН. Выборки были этнически однородны и составлены из русских (на основании паспортных данных), проживающих в г. Москве. Для выявления ассоциации генетических маркеров с тяжестью течения заболевания больные атопической БА были разделены на две подгруппы согласно критериям GINA: больные с астмой легкой степени тяжести (n=139) и больные со средним и тяжелым течением заболевания (n=152) (Табл. 1). Анализ нуклеотидных последовательностей интересующих нас хромосомных областей осуществляли с помощью системы NCBI в сети Интернет (www.ncbi.nlm.nih.gov), с использованием следующих разделов: MapView (расположение полиморфных маркеров на хромосоме), dbSNP (информация об однонуклеотидных полиморфных маркерах). Для подбора праймеров и специфических зондов использовали программу Primer Premier 5.0. Идентификация генотипов полиморфных маркеров проводилась c использованием времяпролетной масс-спектрометрии с лазерно-десорбционной ионизацией образца в матрице (MALDI-TOF). Метод состоит из следующих стадий: 1) пробоподготовка, включающая в себя амплификацию участка ДНК, содержащего исследуемую нуклеотидную замену, и последующую реакцию удлинения праймера (минисиквенс); 2) разделение фрагментов ДНК (праймеров с присоединенным на 3’конце нуклеотидом, соответствующим аллелю искомого полиморфного маркера) по массе с помощью масс-спектрометрии MALDI-TOF. 5 Таблица 1. Общая характеристика обследованных групп с наличием (БА+) и отсутствием (БА–) атопической БА. «БА+» (n=283) БА средней и тяжелой степени тяжести (n=152) 65/87 «БА–» (n=227) Пол, м/ж БА легкой степени тяжести (n=131) 71/60 Возраст, лет 34,4 ± 13,4 41,8 ± 16,2 38,5 ± 10,4 11,9 ± 8,6 13,1 ± 8,4 - Длительность заболевания, лет Возраст начала заболевания, лет Общий IgE, кЕ/л 103/124 15,4 7,6 - 230 (65; 620) 45 (23; 89) Данные по возрасту и длительности БА представлены в формате M ± SD, где M – среднее, SD – стандартное отклонение. Данные по концентрации IgE – в формате Me (25%; 75%), где Me – медиана, 2575% – интерквартильный интервал. Для сравнения частот аллелей и генотипов исследуемых полиморфных маркеров в группах с наличием и отсутствием БА, а также в группах больных различной степени тяжести БА, нами использовался точный двусторонний критерий Фишера. Достоверными считали различия при p<0,05. Распределения аллелей и генотипов всех маркеров проверяли на соответствие закону Харди-Вайнберга. Относительный риск развития заболевания оценивали с помощью показателя соотношения шансов (odds ratio, OR). Значение ОR и 95% доверительный интервал (confidence interval, CI) вычисляли с помощью программы Calculator for confidence intervals of odds ratio (http://www.hutchon.net/ConfidOR.htm). OR=1 рассматривали как отсутствие ассоциации; OR>1 – как положительную ассоциацию ("предрасположенность"), OR<1 – как отрицательную ассоциацию аллеля или генотипа с заболеванием. Анализ гаплотипов проводился с использованием программы Hapstat 3.0 (University of North Carolina, USA). 2. 2.1. Результаты и обсуждение. Исследование ассоциации полиморфных маркеров C(–1055)T и R130Q гена IL13 с атопической БА. Интерлейкин-13 (ИЛ-13) является одним из основных по значимости цитокинов в патогенезе атопической БА. ИЛ-13 – мощный индуктор эозинофильного, макрофагального и лимфоцитарного ответа, связанного с развитием фиброза дыхательных путей, активацией слизепродуцирующих клеток и повышенной бронхореактивностью (Zhu et al, 1999). Воспалительный ответ реализуется через способность ИЛ-13 стимулировать выработку хемокинов и протеолитических ферментов, таких как металлопротеиназы матрикса. Установлено также, что развитие 6 фиброзных изменений в ткани бронхов – результат активации интерлейкином-13 фиброгенного цитокина TGF-β1 через MMP-9 и плазмин-зависимый путь (Lee et al, 2001). Таким образом, ИЛ-13 является конечной точкой приложения Тh2опосредованных воспалительных эффектов. Ген IL13 локализован на хромосоме 5q31.1. Последовательность гена содержит ряд однонуклеотидных замен (Рис. 1), часть из которых ассоциирована с развитием БА и атопией. Наибольшее внимание исследователей в настоящее время привлекают два маркера в данном гене: C(–1055)T в промоторной области гена и R130Q в кодирующей области. Полиморфный маркер C(–1055)T гена IL13 представляет собой однонуклеотидную замену C → T в положении –1055 промоторной области гена (Рис. 1). Функциональное действие данного маркера может быть объяснено тем, что замена расположена непосредственно перед сайтом связывания Т-клеточного транскрипционного фактора NFAT, который регулирует экспрессию генов IL13 и IL4. Ранее было показано, что наличие тимина в положении –1055 приводит к более активному связыванию NFAT с промотором и, таким образом, данный маркер может влиять на экспрессию гена IL13 (van der Pouw Kraan et al, 1999). Полиморфный маркер R130Q гена IL13 представляет собой однонуклеотидную замену G → A в положении +2043 в экзоне 4, приводящую к аминокислотной замене положительно заряженного аргинина на нейтральный глутамин в положении 130 αспирали D-домена интерлейкина-13. Это участок, посредством которого происходит взаимодействие ИЛ-13 с рецептором. В последних исследованиях было показано, что замена аргинина на глутамин в положении +2043 не изменяет константу связывания ИЛ-13 с рецептором и не влияет на стабильность этого комплекса. В то же время, данная замена сопровождается повышенным уровнем экспрессии ИЛ-13 (Arima et al, 2002). Рис. 1. Полиморфные маркеры гена IL13. При исследовании распределения частот аллелей и генотипов полиморфного маркера C(–1055)T в группе больных атопической БА и группе здорового контроля отмечено преобладание аллеля С и генотипа СС (Табл. 2). Минорный аллель Т встречался в обеих группах примерно с одинаковой частотой – 2728%, что согласуется с частотами данного аллеля в европейских популяциях – 20-33% (Дания, Нидерланды, Германия) (Graves et al, 2000). В группе больных БА наблюдалось увеличение частоты аллеля С и генотипа СС с одновременным снижением доли аллеля 7 Т и генотипов СT и TT по сравнению с контрольной группой. Такие различия не являются статистически достоверными, что свидетельствует об отсутствии ассоциации данного маркера с развитием атопической БА. Таблица 2. Распределение частот аллелей и генотипов полиморфных маркеров C(–1055)T и R130Q гена IL13 в группах с наличием (БА+) и отсутствием (БА–) атопической БА. В распределении частот аллелей и p генотипов полиморфного маркера R130Q в «БА+» «БА–» обеих группах наблюдалось преобладание C(–1055)T содержания аллеля Arg и генотипа Arg/Arg Аллель С 0,731 0,722 > 0,05 (Табл. 2). Гомозиготный генотип Gln/Gln Аллель Т 0,269 0,278 Генотип СС 0,526 0,515 > 0,05 встречался в обеих группах примерно с Генотип СT 0,410 0,414 > 0,05 одинаковой частотой (7-8%). Также было Генотип TT 0,064 0,071 > 0,05 отмечено увеличение доли аллеля Gln и R130Q Аллель Arg 0,714 0,738 > 0,05 генотипа Arg/Gln и снижение частоты Аллель Gln 0,286 0,262 аллеля Arg и генотипа Arg/Arg в группе Генотип Arg/Arg 0,509 0,551 > 0,05 Генотип Arg/Gln 0,410 0,374 > 0,05 больных БА. Однако статистически Генотип Gln/Gln 0,081 0,075 > 0,05 достоверных различий не обнаружено, что говорит об отсутствии ассоциации данного маркера с развитием атопической БА. Аллели и генотипы Частота аллелей и генотипов Таблица 3. Распределение аллелей и генотипов полиморфного маркера C(–1055)T гена IL13 у больных с атопической БА разной степени тяжести. В результате сравнения частот аллелей и Аллели и генотипов маркера C(– p OR и 95% CI генотипы 1055)T в группах, разделенных по степени тяжести БА, была Аллель С > 0,05 выявлена выраженная Аллель Т Генотип СС 0,025 0,54 [0,34–0,87] ассоциация маркера C(– Генотип СT 0,001 2,16 [1,44–3,98] 1055)T с тяжестью БА, Генотип TT > 0,05 что отразилось в снижении частоты встречаемости генотипа СС в группе больных со средней и тяжелой степенью астмы, с одновременным увеличением встречаемости генотипа СT в этой группе. Данные различия являются статистически достоверными, при этом носительство генотипа СТ связано с более тяжелым течением атопической БА Частота аллелей и генотипов БА БА легкой средней и степени тяжелой тяжести степени тяжести 0,763 0,704 0,237 0,296 0,611 0,461 0,305 0,487 0,084 0,052 8 (OR=2,16, 95% CI [1,44–3,98]), а генотип СС, напротив, связан с легким течением астмы (OR=0,54, 95% CI [0,34–0,87]) у русских пациентов г. Москвы (Табл. 3). Для полиморфного маркера R130Q гена IL13 ассоциации с тяжестью течения заболевания установлено не было. Для того чтобы оценить комбинированный вклад маркеров C(–1055)T и R130Q гена IL13 в патогенез БА, мы провели сравнительный анализ частот встречаемости гаплотипов в группе больных атопической БА и группе здорового контроля. Данный анализ не выявил достоверных различий в частотах встречаемости гаплотипов между группами. Также не было обнаружено ассоциации гаплотипов с тяжестью течения БА. Наши результаты для маркера C(–1055)T гена IL13 отличаются от большинства исследований, проведенных на европейских популяциях, в которых была обнаружена достоверная ассоциация полиморфного маркера C(–1055)T с развитием БА (van der Pouw Kraan et al, 1999; Howard, 2001). Ассоциация генотипа ТТ с заболеванием также была подтверждена в США на выборке афроамериканцев (Moissidis et al, 2005). Однако нами была установлена ассоциация маркера C(–1055)T с тяжестью течения БА, что согласуется с важной ролью интерлейкина-13 в прогрессии аллергического воспаления и развитии фиброза бронхов. Литературные данные по ассоциации маркера R130Q с развитием БА противоречивы. Так, в нескольких работах демонстрируется связь данного маркера с БА и уровнем общего IgE (Heinzmann et al, 2000 и 2003). Однако другие исследователи не выявили никакой ассоциации данного маркера с развитием БА (Leung et al, 2001, Hummelshoj et al, 2003). Полученные нами данные также не демонстрируют ассоциации между маркером R130Q и развитием атопической БА. Подобная противоречивость результатов может быть объяснена влиянием различных популяционных факторов на частоты аллелей и генотипов данного маркера, а также разными критериями включения/исключения индивидов в выборки. Отсутствие ассоциации маркера R130Q с развитием заболевания и его прогрессией объясняется, по-видимому, тем, что ИЛ-13 реализует свои эффекторные функции через взаимодействие со специфическим рецептором, а данная замена никак не влияет на кинетику связывания белка с рецептором и стабильность комплекса лиганд-рецептор. 2.2. Исследование ассоциации полиморфного маркера С(–703)Т гена IL5 с атопической БА. Интерлейкин-5 (ИЛ-5) является мощным активатором эозинофилов, которые в свою очередь, провоцируют развитие воспаления, приводящего к обструкции и гиперреактивности дыхательных путей. ИЛ-5 – один из основных факторов, контролирующих созревание и функциональную активность эозинофилов (Campbell et al, 1987; Lopez et al, 1988). Также ИЛ-5 играет важную роль в дифференцировке В9 лимфоцитов, активированных специфическим антигеном или митогеном (Takatsu et al, 1988) и усиливает продукцию иммуноглобулинов этими клетками (Takatsu et al, 1988; Feghali, Wright, 1997). Ген IL5 локализован на хромосоме 5q31.1 (Sutherland et al, 1988) в кластере 5q31-33 с другими генами интерлейкинов (Boulay et al, 1992). Обнаружено сцепление локуса 5q31.1 с атопической БА (Marsh et al, 1994), уровнем циркулирующих эозинофилов (Martinez et al, 1998) и аутосомно-доминантной семейной эозинофилией (Rioux et al, 1998). Исследованный в данной работе полиморфный участок С(–703)Т представляет собой однонуклеотидную замену C → T в положении –703 в промоторной области гена IL5. Рис. 2. Пример спектра MALDITOF, по которому проводилась идентификация аллелей и генотипов маркера С(–703)Т гена IL5 (на спектре представлен гетерозиготный генотип СT). Первый пик соответствует интактному праймеру с массой 2482 Да, второй пик и третий пик – праймерам, удлиненным с 3’конца на ddA и ddG, соответственно. Таблица 5. Распределение аллелей и генотипов полиморфного маркера С(–703)Т гена IL5 в группах с наличием (БА+) и отсутствием (БА–) атопической БА. Аллели и генотипы Частота аллелей и генотипов «БА+» «БА–» p Аллель С 0,731 0,694 Аллель Т 0,269 0,306 Генотип СС 0,528 0,485 > 0,05 Генотип СT 0,406 0,418 > 0,05 Генотип TT 0,066 0,097 > 0,05 > 0,05 В распределении генотипов в группе больных БА наблюдалось возрастание доли генотипа CC (0,528 против 0,485 в контрольной группе) и уменьшение содержания генотипа CT (0,406 против 0,418 в контрольной группе) (Табл. 5). Генотип TT встречался очень редко как в группе больных, так и в группе здоровых индивидов. Частота аллеля Т в обеих группах составляет 27-30%, что согласуется с частотой данного аллеля в немецкой популяции – 29% (Kabesch et al, 2007). В распределении аллелей в группе больных БА наблюдалось возрастание доли аллеля C (0,731 против 0,694 в контрольной группе), при уменьшении содержания аллеля T (0,269 против 0,306 в контрольной группе). В обеих группах наиболее часто встречался аллель C (0,731 и 0,694 в группах «БА+» и «БА–», соответственно). Различия в частотах генотипов и аллелей между группами являются 10 статистически недостоверными. Полученные данные свидетельствуют об отсутствии ассоциации полиморфного маркера С(–703)Т гена IL5 с развитием атопической БА. Также не было выявлено никакой ассоциации данного маркера с тяжестью течения БА. Известно очень небольшое количество работ, связанных с поиском ассоциации полиморфного маркера С(–703)Т гена IL5 с БА. С помощью анализа сцепления на русских семьях из г. Томск была выявлена ассоциация аллеля C с БА, повышенной бронхореактивностью и атопией по данным кожных аллергопроб (Фрейдин и др., 2000 и 2002). В данной работе исследовалось наследование аллелей у больных БА, но не было проведено сравнительного анализа со здоровым контролем. Также известны две публикации, сфокусированные на роли маркера С(–703)Т гена IL5 в развитии и течении БА у детей. В одной работе показана ассоциация маркера С(–703)Т со снижением спирометрических показателей тяжести БА у корейских детей, однако ассоциации с БА получено не было (Hong et al, 2005). В другой работе был установлен пониженный риск развития атопической БА у носителей аллеля T, а также данный аллель проявляет защитный эффект по отношению к атопии (Kabesch et al, 2007). В нашей работе распределение аллелей тоже показало возрастание доли аллеля C и уменьшение доли минорного аллеля T у больных БА по сравнению со здоровым контролем, однако статистически достоверных различий получено не было. Функциональная роль полиморфного маркера С(–703)Т на данный момент не известна, однако предполагают, что данная замена в промоторе гена может приводить к изменению экспрессии IL5 и опосредованно влиять на специфические процессы, имеющие место при БА, например, на рекрутинг эозинофилов. При этом сама по себе замена может не оказывать влияние на предрасположенность к развитию БА, что и нашло отражение в полученных нами результатах. 2.3. Исследование ассоциации полиморфных маркеров M31R и R335C гена IL8RA с атопической БА. Интерлейкин-8 (ИЛ-8) вовлечен в процесс стимуляции, развития и поддержания острого воспалительного процесса (Harada et al, 1994). Важная роль ИЛ-8 в патофизиологии бронхиальной астмы человека была подтверждена во многих исследованиях (Remick et al, 2005; Heinzmann et al, 2004; Nocker et al, 1996). Взаимодействуя со своим рецептором IL8RA (CXCR1), ИЛ-8 приводит к активации и направленной миграции в очаг воспаления лейкоцитов и нейтрофильных гранулоцитов, представляющих первую линию неспецифической защиты организма (Kunkel et al, 1991; Sarmiento et al, 2009). Рецептор IL8RA играет критическую роль в трансдукции сигнала ИЛ-8 в нейтрофилах (Рис. 3), поэтому интересной задачей является изучение вклада гена IL8RA в развитие БА. 11 Рис. 3. Взаимодействие ИЛ-8 со своими рецепторами на нейтрофилах. Ген IL8RA локализован на хромосоме 2q35. Установлено, что данный хромосомный регион связан с повышенным уровнем общего IgE у больных БА (Xu et al, 2000). В этом гене обнаружен ряд полиморфных участков, в том числе маркер M31R гена IL8RA, представляющий собой однонуклеотидную замену G → T в положении +92 в экзоне 2, приводящую к аминокислотной замене аргинина на метионин в положении 31 полипептидной цепи внеклеточного N-домена рецептора. Другой полиморфный маркер гена IL8RA – R335C, представляет собой однонуклеотидную замену C → T в положении +1003 в экзоне 2, приводящую к аминокислотной замене аргинина на цистеин в положении 335 полипептидной цепи внутриклеточного C-домена рецептора. Таблица 6. Распределение аллелей и генотипов полиморфных маркеров M31R и R335C гена IL8RA в группах с наличием (БА+) и отсутствием (БА–) атопической БА. Аллели и генотипы M31R Аллель Met Аллель Arg Генотип Met/Met Генотип Met/Arg R335C Аллель Arg Аллель Cys Генотип Arg/Arg Генотип Arg/Cys Частота аллелей и генотипов «БА+» «БА–» p OR и 95% CI 0,968 0,032 0,992 0,008 0,043 0,23 [0,08–0,67] 4,39 [1,48–13] 0,936 0,985 0,004 0,22 [0,07–0,66] 0,064 0,015 0,004 4,51 [1,51–13,43] 0,970 0,030 0,978 0,022 > 0,05 - 0,940 0,955 > 0,05 - 0,060 0,045 > 0,05 - Для полиморфного маркера M31R в обеих группах отмечено преобладание содержания аллеля Met и генотипа Met/Met (Табл.6). Гомозиготный генотип Arg/Arg не был обнаружен ни в контрольной группе, ни в группе больных. При исследовании распределения частот аллелей и генотипов данного маркера в группах отмечено увеличение частоты встречаемости минорного аллеля Arg и гетерозиготного генотипа Met/Arg в группе больных. Полученные различия носят статистически достоверный характер и свидетельствуют об ассоциации маркера M31R с развитием атопической БА у русских жителей г. Москвы. При этом носительство аллеля Arg и гетерозиготного генотипа Met/Arg связано с увеличением риска развития патологии более чем в 4 раза (OR=4,39, 95% CI [1,48–13] и OR=4,51, 95% CI [1,51–13,43], соответственно). Наличие аллеля Met и генотипа Met/Met в геноме, напротив, связано с пониженным риском развития 12 заболевания (OR=0,23, 95% CI [0,08–0,67] и OR=0,22, 95% CI [0,07–0,66], соответственно). В распределении частот аллелей и генотипов маркера R335C в обеих группах отмечено преобладание содержания аллеля Arg и генотипа Arg/Arg (Табл. 6). Гомозиготный генотип Cys/Cys не был обнаружен ни в группе больных, ни в контрольной группе. Минорный аллель Cys встречался в обеих группах примерно с одинаковой частотой 2-3%. Сравнительный анализ частот аллелей и генотипов маркера R335C не выявил статистически достоверных различий между группами, что свидетельствует об отсутствии ассоциации данного маркера с развитием БА. В результате сравнения частот генотипов и аллелей полиморфных маркеров M31R и R335C гена IL8RA в группах больных БА различной степени тяжести обнаружено, что данные маркеры не ассоциированы с тяжестью течения БА. Анализ встречаемости гаплотипов по маркерам M31R и R335C не показал достоверных различий в их частотах между группами с наличием и отсутствием БА. Также не было получено ассоциации гаплотипов с тяжестью течения атопической БА. На данный момент известно всего две работы, в которых проводилось изучение ассоциации полиморфных маркеров M31R и R335C гена IL8RA с развитием БА. В одной публикации немецкими учеными было показано, что носительство аллеля Arg маркера M31R и аллеля Cys маркера R335C является фактором риска развития БА (Stemmler et al, 2005). В другом же исследовании не было установлено ассоциации данных маркеров с БА (Puthothu et al, 2006). Показанная в нашей работе ассоциация маркера M31R гена IL8RA с атопической БА согласуется с результатом немецкой группы исследователей (Stemmler et al, 2005). Данный полиморфный маркер приводит к замене метионина на аргинин во внеклеточном домене рецептора, поэтому такая замена может влиять на связывание белка с IL8RA и стабильность комплекса лиганд-рецептор. Поскольку при взаимодействии ИЛ-8 с нейтрофилами посредством IL8RA происходит активация нейтрофилов и их направленная миграция в очаг воспаления, а также дополнительная выработка нейтрофилами ИЛ-8, возможно, данная замена в IL8RA увеличивает сродство рецептора к ИЛ-8 и приводит к последующей сверхэкспрессии ИЛ-8 нейтрофилами. В результате развивается воспалительный процесс, а в дальнейшем – хроническое воспаление дыхательных путей. Отсутствие ассоциации маркера R335C гена IL8RA с развитием БА было также ранее показано немецкими учеными (Puthothu et al, 2006). Поэтому можно предположить, что замена аргинина на цистеин во внутриклеточном домене IL8RA не влияет на передачу сигнала внутри клетки. 13 2.4. Исследование ассоциации полиморфного маркера Asp299Gly гена TLR4 с атопической БА. В последнее время большой интерес вызывает гипотеза, согласно которой, длительный контакт с микробным антигеном или перенесенные в раннем возрасте инфекции играют защитную роль в предрасположенности к Th2-опосредованным атопическим заболеваниям. Данные факты можно объяснить дисбалансом в образовании клеток Th1 и Th2 из наивных T-хелперов с последующим смещением равновесия в сторону Th2-опосредованного иммунного ответа и развитием аллергических заболеваний. Следовательно, мутации в генах, продукты которых вовлечены в распознавание микробных антигенов, могут вносить серьезный вклад в предрасположенность к развитию аллергических заболеваний и БА (Yamada et al, 2005). Toll-подобный рецептор 4 (TLR-4) представляет собой рецептор, который связан с внеклеточным распознаванием липополисахарида (ЛПС) бактерий (Рис. 4). Рис. 4. Клеточный рецепторный комплекс для ЛПС бактерий, основным компонентом которого является Toll-подобный рецептор 4. Ген TLR4 расположен на хромосоме 9q32-33. Полиморфный маркер Asp299Gly гена TLR4 представляет собой однонуклеотидную замену А → G в положении +896 в экзоне 3, приводящую к аминокислотной замене аспарагиновой кислоты на глицин в положении 299 полипептидной цепи во внеклеточном домене рецептора (Liang et al, 2005). Посредством данного домена происходит прямое взаимодействие рецептора с лигандами микроорганизмов. Было обнаружено, что маркер Asp299Gly гена TLR4 ассоциирован со снижением иммунного ответа на ЛПС бактерий, в результате уменьшения клеточной экспрессии TLR4 с последующим прекращением взаимодействия TLR-4 с ЛПС (Arbour et al, 2000). В другом исследовании было показано, что данный полиморфный маркер является ответственным за подавление передачи сигнала рецептором и уменьшение воспалительной реакции на грамм-отрицательные бактерии (Kiechl S et al, 2002). В нашей работе было отмечено преобладание в обеих группах содержания аллеля Asp и генотипа Asp/Asp полиморфного маркера Asp299Gly (Табл. 8). Частоты минорного аллеля Gly и гомозиготного генотипа Gly/Gly в контрольной группе практически не отличались от таковых в группе больных. При исследовании распределения частот аллелей и генотипов данного маркера между группами не было выявлено статистически достоверных различий, что свидетельствует об отсутствии прямой ассоциации данного маркера с развитием атопической БА. 14 Таблица 8. Распределение аллелей и генотипов полиморфного маркера Asp299Gly гена TLR4 в группах с наличием (БА+) и отсутствием (БА–) атопической БА. Аллели и генотипы Частота аллелей и генотипов p «БА+» «БА–» Аллель Asp 0,919 0,940 Аллель Gly 0,081 0,060 Генотип Asp/Asp 0,865 0,881 > 0,05 Генотип Asp/Gly 0,109 0,119 > 0,05 Генотип Gly/Gly 0,026 0 > 0,05 > 0,05 После сравнения частот аллелей и генотипов маркера Asp299Gly гена TLR4 в группах, разделенных по степени тяжести БА, была обнаружена выраженная ассоциация данного маркера с тяжестью течения БА у русских индивидов г. Москвы. Снижение частоты встречаемости аллеля Asp и генотипа Asp/Asp было отмечено в группе больных со средней и тяжелой степенью астмы, а аллеля Gly и генотипов Asp/Gly и Gly/Gly – в группе больных с легким течением БА. Различия в частотах аллелей являлись статистически достоверными, носительство минорного аллеля Gly связано с более тяжелым течением атопической БА (OR=2,12, 95% CI [1,08–4,18]), а аллеля Asp – с легким течением астмы (OR=0,47, 95% CI [0,24–0,93]) (Табл. 9). Таблица 9. Распределение аллелей и генотипов полиморфного маркера Asp299Gly гена TLR4 у больных с атопической БА разной степени тяжести. Частота аллелей и генотипов Аллели и генотипы Аллель Asp Аллель Gly Генотип Asp/Asp Генотип Asp/Gly Генотип Gly/Gly БА легкой степени тяжести БА средней и тяжелой степени тяжести 0,948 0,052 0,903 0,089 0,008 0,895 0,105 0,833 0,123 0,044 p 0,035 > 0,05 > 0,05 > 0,05 OR и 95% CI 0,47 [0,24–0,93] 2,12 [1,08–4,18] - Несмотря на то, что в некоторых работах была установлена ассоциация маркера Asp299Gly с БА (Fageras et al, 2004), в большом количестве исследований было показано отсутствие ассоциации (Raby et al, 2002; Noguchi at Al, 2004; Eder et al, 2005). Таким образом, наши результаты согласуются с данными большинства других исследователей. Только в одной работе исследовалась ассоциация маркера с тяжестью 15 БА, однако ассоциации обнаружено не было, но была показана ассоциация генотипов Asp/Gly и Gly/Gly с тяжестью атопии (Yang et al, 2004). Выявленная ассоциация полиморфного маркера Asp299Gly гена TLR4 с тяжестью течения БА подтверждает теорию о том, что при нарушении взаимодействия человека с микробным антигеном усиливается развитие аллергии и БА. Известно, что данный маркер ассоциирован c уменьшением клеточной экспрессии TLR-4 с последующим прекращением взаимодействия TLR-4 с ЛПС. Вероятно, ухудшение взаимодействия TLR-4 с ЛПС в большей степени влияет на прогрессию атопической БА, а не на возникновение данного заболевания. 2.5. Исследование ассоциации полиморфных маркеров C(–318)T и A(+49)G гена CTLA4 с атопической БА. Ген CTLA4 расположен на хромосоме 2q33 и кодирует антиген 4, ассоциированный с цитотоксическими Т-лимфоцитами. Это Т-клеточный рецептор, трансмембранный гликопротеин, экспрессирующийся в течение 2-3 дней после активации Т-лимфоцитов. Через CTLA-4 подается сигнал к подавлению активации Тh2 клеток, что приводит к смещению баланса в сторону развития ответа по Th1зависимому типу (Oosterwegel et al, 1999). Рис. 5. Полиморфные маркеры гена CTLA4. В данной работе мы исследовали ассоциацию с БА двух полиморфных маркеров гена CTLA4. Полиморфный маркер C(–318)T представляет собой однонуклеотидную замену C → T в положении –318 промоторной области гена, другой маркер A(+49)G – однонуклеотидную замену A → G в положении +49 в экзоне 1, приводящую к аминокислотной замене треонина на аланин в положении 17 полипептидной цепи (Рис. 5). В нескольких исследованиях было установлено, что аллель T маркера C(–318)T ассоциирован с повышенной промоторной активностью гена (Wang et al 2002). Показано, что носительство аллеля Т приводит к повышению экспрессии CTLA-4 на поверхности активированных клеток и повышению уровня мРНК CTLA-4 в нестимулированных клетках, что подтверждает потенциальную роль данной замены в регуляции экспрессии гена (Ligers et al, 2001). В других исследованиях было установлено, что CTLA-4 ингибирует образование Th2-клеток из наивных хелперов 16 (Th0), поэтому аллель Т можно рассматривать как защитный фактор против заболеваний с аллергической компонентой. У носителей аллеля Thr полиморфного маркера A(+49)G была обнаружена повышенная экспрессия CTLA-4 на поверхности активированной Т-клетки (Ligers et al, 2001). Также известно, что генотип Ala/Ala ассоциирован с уменьшением экспрессии CTLA-4 на поверхности Т-клеток с последующим ослаблением функции CTLA-4 (Kouki et al, 2000). При изучении распределения аллелей и генотипов отмечено преобладание содержания аллеля С и генотипа СС полиморфного маркера C(–318)T в обеих группах (Табл. 10). Наблюдалось увеличение частоты встречаемости аллеля С и гомозиготного генотипа СС в группе больных БА по сравнению с контрольной группой и одновременное снижение частоты встречаемости аллеля Т и генотипов СТ и ТТ в этой же группе. При этом статистически достоверных различий в частотах выявлено не было, что говорит об отсутствии ассоциации данного маркера с развитием атопической БА. Таблица 10. Распределение аллелей и генотипов полиморфных маркеров C(–318)T и A(+49)G гена CTLA4 в группах с наличием (БА+) и отсутствием (БА–) атопической БА. Частота аллелей и генотипов «БА+» «БА–» C(–318)T Аллель С Аллель T Генотип СС Генотип СT Генотип TT A(+49)G Аллель Thr Аллель Ala Генотип Thr/Thr Генотип Ala/Thr Генотип Ala/Ala 0,890 0,110 0,788 0,205 0,007 0,853 0,147 0,716 0,275 0,009 p >0,05 В обеих группах отмечено преобладание содержания аллеля Thr и генотипа Ala/Thr маркера A(+49)G (Табл. 10). При исследовании распределения аллелей и генотипов данного полиморфного маркера между группами отмечено увеличение частоты встречаемости аллеля Ala и гетерозиготного генотипа Ala/Thr в группе 0,644 0,649 >0,05 больных с одновременным снижением 0,356 0,351 0,385 0,410 >0,05 частоты встречаемости аллеля Thr и 0,517 0,478 >0,05 гомозиготных генотипов Thr/Thr и Ala/Ala 0,098 0,112 >0,05 в этой же группе. Данные различия не являются статистически достоверными, что свидетельствует об отсутствии ассоциации полиморфного маркера A(+49)G гена CTLA4 с развитием атопической БА. >0,05 >0,05 >0,05 Также не было выявлено ассоциации маркеров гена CTLA4 с тяжестью течения БА. Для оценки комбинированного вклада рассматриваемых маркеров гена CTLA4 в патогенез астмы нами был проведен анализ частот гаплотипов в группе больных атопической БА и группе здорового контроля. Наиболее частым гаплотипом в обеих группах был гаплотип дикого типа – С–Thr (Табл. 12). Можно отметить повышение частоты гаплотипов C–Ala и T–Thr у больных БА по сравнению со здоровым контролем, а также уменьшение частоты встречаемости гаплотипов C–Thr и T–Ala в 17 группе больных БА. Только для гаплотипа T–Ala была обнаружена ассоциация с БА. Данный гаплотип связан с пониженным риском развития БА (ОR=0,081, 95% CI [0,01– 0,647]). Таблица 12. Распределение частот встречаемости гаплотипов гена CTLA4 в группах с наличием (БА+) и отсутствием (БА–) атопической БА. Ассоциации гаплотипов гена Частота гаплотипов CTLA4 с тяжестью течения БА Гаплотипы p OR и 95% CI обнаружено не было. «БА+» «БА–» Полученные результаты C–Thr 0,536 0,548 >0,05 C–Ala 0,349 0,308 >0,05 согласуются с данными других T–Thr 0,111 0,101 >0,05 исследователей. В трех T–Ala 0,004 0,043 0,01 0,08 [0,01–0,65] работах, в которых изучались польская, японская и корейская популяции, также не было найдено ассоциации данных маркеров (по отдельности) с атопической БА (Nakao et al, 2000; Yasek et al, 2006; Lee et al, 2002). Однако корейскими учеными установлена ассоциация аллеля T маркера C(– 318)T с тяжестью течения БА (Lee et al, 2002). В этой же работе была найдена ассоциация гаплотипа C–Ala по маркерам C(–318)T и A(+49)G с атопической БА (OR=0,702) (Sohn MH et al, 2007). Нами же получена ассоциация гаплотипа T–Ala c развитием БА (OR=0,081). Это можно объяснить тем, что частоты встречаемости аллелей и генотипов маркера A(+49)G широко варьируют в различных популяциях. Так, для корейцев было получено следующее распределение частот генотипов – Ala/Ala – 55-57%, Ala/Thr – 27-34%, Thr/Thr – 9-17% (Lee et al, 2002), которое сильно отличается от распределения частот генотипов у людей русского происхождения. Такая разница в частотах может влиять на различный вклад полиморфного маркера в генетическую предрасположенность к БА в зависимости от популяции. 2.6. Исследование ассоциации полиморфных маркеров rs324396 (С/Т) и rs740347 (G/C) гена GPRA с атопической БА. GPRA (G protein-coupled receptor for asthma susceptibility) – ген рецептора Gбелка, открытый позиционным клонированием. Данный ген ассоциирован с развитием БА и повышенным уровнем общего IgE (Laitinen et al, 2004). Рецептор GPRA относят к классу А семейства трансмембранных рецепторов, сопряженных с G-белком (GPCRs) (Vendelin et al, 2005). В результате альтернативного сплайсинга образуется несколько изоформ GPRA. На данный момент обнаружено 7 альтернативных вариантов, из них две изоформы длинные, изоформа GPRA-A и GPRA-B, остальные – короткие (Laitinen et al, 2004; Vendelin et al, 2005). Изоформа GPRA-A, также известная как GPRA154 и VRR1, в основном экспрессируется в гладкомышечных клетках дыхательных путей, как у 18 больных БА, так и у здоровых индивидов. Изоформа GPRA-B экспрессируется в большом количестве в эпителиальных и гладкомышечных клетках дыхательных путей больных БА, в отличие от здоровых людей. Таким образом, предполагают, что изоформа GPRA-B играет роль в функционировании эпителия дыхательных путей, (Davies et al, 2002), а также может вносить вклад в развитие бронхиальной гиперреактивности (Postma et al, 2005). Ген GPRA локализован на хромосоме 7p14. Ряд однонуклеотидных маркеров в гене GPRA показал выраженную ассоциацию с БА, бронхореактивностью и повышенным уровнем IgE в разных европейских популяциях (Laitinen et al, 2004; Kormann et al, 2005; Melen et al, 2005). При исследовании ассоциации 133 кб геномного сегмента, захватывающего ДНК с интрона 2 до интрона 5 гена GPRA, обнаружили, что интрон 2 наиболее сильно ассоциирован с БА. Нами были изучены два полиморфных маркера в интроне 2. Первый маркер rs324396 гена GPRA представляет собой однонуклеотидную замену С → Т, второй маркер rs740347 – однонуклеотидную замену G → С. Таблица 13. Распределение аллелей и генотипов полиморфных маркеров rs324396 и rs740347 гена GPRA в группах с наличием (БА+) и отсутствием (БА–) атопической БА. Аллели и генотипы rs324396 Аллель C Аллель Т Генотип CC Генотип CT Генотип TT rs740347 Аллель G Аллель C Генотип GG Генотип CG Генотип CC Частота аллелей и генотипов «БА+» «БА–» p OR и 95% CI В обеих группах отмечено преобладание содержания аллеля С маркера rs324396. В группе больных БА чаще встречался гетерозиготный 0,004 генотип СТ, а в группе 0,008 здорового контроля – > 0,05 гомозиготный генотип СС 0,876 0,906 > 0,05 (Табл. 13). При исследовании 0,124 0,094 распределения частот аллелей 0,766 0,826 > 0,05 0,220 0,161 > 0,05 и генотипов данного 0,014 0,013 > 0,05 полиморфного маркера между группами отмечено увеличение частоты встречаемости аллеля Т и генотипов СТ и ТТ в 0,639 0,361 0,376 0,526 0,098 0,708 0,292 0,504 0,407 0,089 0,02 0,73 [0,56–0,95] 1,37 [1,05–1,78] 0,59 [0,42–0,84] 1,61 [1,14–2,29] - группе больных с одновременным снижением доли аллеля С и генотипа СС в этой же группе по сравнению с группой здорового контроля. Данные различия носят статистически достоверный характер и свидетельствуют об ассоциации гена GPRA с развитием атопической БА у русского населения г. Москвы. При этом носительство аллеля Т и гетерозиготного генотипа СT связано с увеличением риска развития БА (OR=1,37, 95% CI [1,05–1,78] и OR=1,61, 95% CI [1,14–2,29], соответственно). Аллель С и генотип СС, напротив, являются протективными (OR=0,73 95% CI [0,56–0,95] и OR=0,59 95% CI [0,42–0,84], соответственно). 19 В обеих группах отмечено преобладание содержания аллеля G и генотипа GG полиморфного маркера rs740347. Гомозиготный генотип CC встречался в обеих группах примерно с одинаковой частотой (1,3-1,4%) (Табл. 13). При исследовании распределения аллелей и генотипов данного полиморфного маркера в группах отмечено увеличение частоты встречаемости аллеля C и генотипа CG с одновременным уменьшением частоты гомозиготного генотипа GG в группе больных по сравнению с группой здорового контроля. Данные различия не являются статистически достоверными, что свидетельствует об отсутствии ассоциации данного маркера с развитием атопической БА. Таблица 15. Распределение частот встречаемости гаплотипов гена GPRA в группах с наличием Частота (БА+) и отсутствием (БА–) гаплотипов Гаплотипы p OR и 95% CI атопической БА. «БА+» «БА–» Для того чтобы оценить C–G C–C T–G T–C 0,550 0,081 0,328 0,041 0,617 0,087 0,291 0,005 9,47 [1,21–73,94] комбинированный вклад маркеров rs324396 и rs740347 > 0,05 0,008 гена GPRA в патогенез БА нами был проведен анализ частот гаплотипов в группе больных атопической БА и группе здорового контроля. Наиболее часто встречающимся гаплотипом в обеих группах был гаплотип C–G (Табл. 15). Можно отметить повышение частоты гаплотипов T–G и T–C у больных БА по сравнению со здоровым контролем, а также уменьшение частоты встречаемости гаплотипов C–G и C–C в группе больных БА. Только для гаплотипа T–C была обнаружена ассоциация с БА. Данный гаплотип связан с повышенным риском развития атопической БА (ОR=9,47, 95% CI [1,21–73,94]) у русского населения г. Москвы. Не было найдено ассоциации как для полиморфных маркеров rs324396 и rs740347 гена GPRA, так и для их гаплотипов, с тяжестью атопической БА. В нескольких работах обнаружена ассоциация полиморфного маркера rs324396 гена GPRA с БА. Было показано, что минорный аллель Т ассоциирован с сенсибилизацией (OR=0,88), с БА (OR=0,83), а также с аллергической астмой (OR=0,78) у 5-13 летних детей (Melen et al, 2005). В другой работе также было установлено, что минорный аллель Т проявляет защитный эффект по отношению к БА (OR=0,77) у немецких детей в возрасте 9-11 лет (Kormann et al, 2005). В то же время в результате изучения ядерных мексиканских семей, состоящих из 4-17 летних детей, больных БА, и их родителей, не было обнаружено ассоциации маркера rs324396 с развитием БА. В нашем исследовании также показана ассоциация маркера rs324396 с БА, однако минорный аллель Т ассоциирован с повышенным риском развития БА (OR=1,37). Несмотря на выявленную в некоторых работах ассоциацию маркера rs740347 с БА (Vergara et al, 2009; Kormann et al, 2005), другими авторами были получены и > 0,05 20 отрицательные результаты. Так, при изучении европейских детей не обнаружено ассоциации rs740347 ни с сенсибилизацией, ни с БА (Melen et al, 2005). Также в результате анализа мексиканских семей не было установлено ассоциации маркера с развитием БА и атопией у детей (Wu et al, 2008). Данные об отсутствии ассоциации маркера rs740347 с БА согласуются с результатом нашего исследования. Подобные противоречивые результаты исследований могут быть получены вследствие применения различных подходов к формированию выборок больных и здоровых индивидов. Все исследования полиморфных маркеров rs324396 и rs740347 были проведены на выборках, составленных из детей, в отличие от нашей выборки, состоящей из взрослых индивидов. Также выборки могут отличаться по полу, этническим признакам, факторам риска БА, что могло повлиять на полученный результат. Ассоциация полиморфных маркеров rs324396 и rs740347 гена GPRA с тяжестью БА ранее не исследовалась. Также ни в одной работе не изучалась ассоциация гаплотипов рассматриваемых маркеров с развитием БА. На данный момент не известны функциональные полиморфные маркеры гена GPRA, а роль данного гена в патогенезе БА не ясна. Возможно, что маркеры rs324396 и rs740347 гена GPRA, находящиеся в интроне, влияют на процесс сплайсинга. Можно также предположить, что изученные нами маркеры находятся в неравновесии по сцеплению с другими неизвестными на данный момент функциональными маркерами, что служит причиной отсутствия информации о роли маркеров в патогенезе БА. 2.7. Исследование ассоциации полиморфного маркера T(+2497)G гена CCL26 с атопической БА. Эотаксин-3 относится к семейству СС хемокинов. Данный хемокин связан с хемотаксисом эозинофилов, базофилов, Th2-лимфоцитов и тучных клеток (Garcia et al, 2005; Pease, 2006). Продуцируемые клетками Th2, ИЛ-4 и ИЛ-13 увеличивают экспрессию эотаксина-3 (Yamamoto et al, 2004; Shinkai A et al, 1999), который в свою очередь, взаимодействуя со своим рецептором CCR3, приводит к направленной миграции эозинофилов в очаг воспаления (Zimmermann et al, 2000). Большое количество макрофагов, лимфоцитов, эозинофилов, которые накапливаются в месте воспаления, могут стать значительными источниками эотаксина-3 и CCR3 рецепторов. Далее активированные эозинофилы вносят вклад в поддержание воспаления, продуцируя медиаторы – ИЛ-4 и ИЛ-13, а также эотаксины (Rothenberg, 1998). Ген CCL26 локализован на хромосоме 7q11.2 (Guo et al, 1999; Kitaura et al, 1999). Полиморфный маркер T(+2497)G гена CCL26 представляет собой однонуклеотидную замену T → G в положении +2497 3’-нетранслируемой области гена (Chae et al, 2004). На данный момент функциональная роль полиморфного маркера не ясна, однако 21 полагают, что рассматриваемая замена может влиять на стабильность мРНК и эффективность трансляции мРНК (Macdonald, 2001). Таблица 16. Распределение аллелей и генотипов полиморфного маркера T(+2497)G гена CCL26 в группах с наличием (БА+) и отсутствием (БА–) атопической БА. Аллели и генотипы Частота аллелей и генотипов «БА+» «БА–» p Аллель T 0,676 0,691 Аллель G 0,324 0,309 Генотип TT 0,438 0,485 > 0,05 Генотип GT 0,477 0,411 > 0,05 Генотип GG 0,085 0,104 > 0,05 > 0,05 При сравнительном анализе распределения аллелей и генотипов маркера T(+2497)G гена CCL26 наблюдали увеличение содержания аллеля T и генотипов GT и TT в обеих группах. Минорный аллель G и гетерозиготный генотип GT встречались в группе больных БА чаще, чем в группе здорового контроля. При этом носители аллеля T и гомозиготных генотипов GG и TT встречались чаще в контрольной группе, чем в группе больных БА. Однако статистически достоверных различий в частотах аллелей и генотипов между двумя группами выявлено не было, что свидетельствует об отсутствии ассоциации данного маркера с развитием атопической БА. Также не было выявлено ассоциации маркера T(+2497)G гена CCL26 с тяжестью атопической БА. На данный момент известно всего две научных публикации, в которых были представлены результаты анализа ассоциации маркера T(+2497)G с развитием БА. В одной работе установлена ассоциация данного маркера с БА, количеством эозинофилов в периферической крови и уровнем общего IgE у китайцев (Gao et al, 2006), в другой работе обнаружена статистически достоверная связь маркера с БА у корейцев (Chae et al, 2004). Показано, что аллель G является фактором риска развития БА (OR=2,12), а генотип GT ассоциирован с пониженным риском развития БА (OR=0,44). Наличие генотипа TT ассоциировано с пониженным уровнем общего IgE и низким количеством эозинофилов в периферической крови, из чего было сделано предположение о ключевой роли эотаксина-3 в накоплении эозинофилов и поддержании уровня IgE (Chae et al, 2004). Если сравнить частоты генотипов и аллелей между корейцами и русскими, то можно увидеть сильную разницу в значениях частот. Так, у корейцев генотип GG не встречался в обеих группах, в русской же выборке содержание данного генотипа 8,5-10,4%. Как в группе больных, так и в группе здоровых у русских индивидов содержание генотипов GT и TT примерно одинаковое 41-49%, в корейской же популяции число лиц с генотипом TT составляет 80-90%, а с генотипом GT – 9-20%. В настоящее время не известны подобные работы по определению ассоциации маркера T(+2497)G гена CCL26 с БА у европейцев, что не дает возможности сопоставить частоты. Как мы видим, частоты встречаемости аллелей и генотипов данного полиморфного маркера широко варьируют в различных популяциях, что, возможно, 22 говорит о различном вкладе гена CCL26 в генетическую предрасположенность к БА в зависимости от исследуемой популяции. Есть данные, указывающие на то, что эотаксин-3 является первым хемокином у человека, который обладает широкой антагонистической активностью, вследствие чего можно предположить, что эотаксин-3 имеет больше модулирующую функцию, чем воспалительную (Petkovic et al, 2004; Abonyo et al, 2005). 2.8. Исследование ассоциации полиморфного маркера A(–403)G гена CCL5 (RANTES) с атопической БА. CCL5 (RANTES) – регулятор активности нормальной экспрессии и секреции Тклеток. RANTES является модулятором многих аллергических и воспалительных реакций, а также медиатором ангиогенеза. RANTES участвует в миграции и накоплении клеток воспаления, таких как лимфоциты, эозинофильные гранулоциты и моноциты, в воспалительных и патологически поврежденных участках тканей и органов (Campbell et al, 1998; Bradley et al, 1999; Beyan et al, 2007; Mehrad et al, 2007). Описано значительное увеличение уровня RANTES в плазме крови человека при БА, субклиническом хроническом воспалении, опухолях, а также при СПИДе (Ardigo еt al, 2005; Nomura et al, 2007). Эпителиальные клетки дыхательных путей являются главным источником RANTES (Stellato et al, 1995). Ген CCL5 расположен на хромосоме 17q11.2-12 (Donlon et al, 1990). Полиморфный маркер A(–403)G гена CCL5 представляет собой однонуклеотидную замену G → A в положении –403 промоторной части гена. Таблица 18. Распределение аллелей и генотипов полиморфного маркера A(–403)G гена CCL5 в группах с наличием (БА+) и отсутствием (БА–) атопической БА. Аллели и генотипы Частота аллелей и генотипов «БА+» «БА–» p Аллель G 0,759 0,748 Аллель A 0,241 0,252 Генотип GG 0,554 0,570 > 0,05 Генотип AG 0,410 0,355 > 0,05 Генотип AA 0,036 0,075 > 0,05 > 0,05 В обеих исследованных группах отмечено преобладание содержания аллеля G (Табл. 18). Генотип GG встречался наиболее часто как в группе больных, так и в контрольной группе (0,554 и 0,570, соответственно). При этом можно заметить снижение частоты встречаемости аллеля A и генотипов AA и GG с одновременным возрастанием в группе больных доли аллеля G и генотипа АG по сравнению с группой здорового контроля. Данные различия в частотах аллелей и генотипов между двумя группами не являются статистически достоверными, что свидетельствует об отсутствии ассоциации данного маркера с развитием атопической БА. 23 Анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфного маркера A(– 403)G в группах различной степени тяжести БА показал отсутствие ассоциации маркера с тяжестью течения БА. В нескольких аналогичных работах, исследующих маркер A(–403)G гена CCL5, не было обнаружено ассоциации данного маркера с БА и атопией (Yao et al, 2003; Moissidis et al, 2005; Muro et al, 2007). Так, в исследовании Yao et al было установлено отсутствие ассоциации маркера A(–403)G с БА, атопией, количеством эозинофилов в крови и бронхиальной гиперреактивностью у азиатских детей. В Великобритании были проведены два исследования, где была показана ассоциация данного маркера с атопической БА и атопией (Fryer et al, 2000; Al-Abdulhadi et al, 2005). Вполне возможно, такую разницу в результатах можно объяснить различиями в выборках, воздействиях окружающей среды и аллергенов, которые могут быть вовлечены в патогенные механизмы. В двух исследованиях изучалась ассоциация маркера с тяжестью БА, однако такой ассоциации найдено не было (Yao et al, 2003; Muro et al, 2007). Функциональный анализ показал, что замена –403 G→A увеличивает транскрипционную активность промотора, в результате чего повышается продукция RANTES Т-клетками, мегакариоцитами и тучными клетками (Nickel et al, 2000). Однако в этом же исследовании было установлено, что полиморфный маркер A(–403)G не влияет на экспрессию RANTES эпителиальными клетками, которые являются главным источником RANTES в дыхательных путях. Так как не все клетки продуцируют повышенное количество RANTES, возможно такое изменение количества белка не приводит к обострению воспалительных процессов, приводящих к развитию БА. Обобщая полученные результаты, можно сделать следующие предположения о роли исследованных генов-кандидатов в развитии атопической БА у русских пациентов: В большинстве случаев БА является атопическим заболеванием, что обуславливает ее развитие через IgE-зависимый механизм. Активированные аллергеном T-хэлперы 2-го типа продуцируют цитокины, которые стимулируют пролиферацию B-лимфоцитов, вызывают переключение синтеза в В-клетках на IgЕ и активируют развитие воспаления в бронхах. Поэтому ассоциацию с заболеванием можно, прежде всего, ожидать от генов, связанных с дифференцировкой клеток Th2 и эффекторными функциями иммунной системы. Установленная в нашей работе ассоциация маркера C(–1055)T в промоторной области гена IL13 с тяжестью течения БА подтверждает предположение о важности ИЛ-13 в прогрессии аллергического воспаления, повышенной бронхореактивности и развитии фиброза бронхов. 24 В патогенезе БА важную роль играют также продукты генов врожденного иммунитета и генов иммунорегуляции. Показанная в данной работе ассоциация полиморфного маркера M31R гена IL8RA с развитием БА подтверждает тот факт, что изменение количества мигрирующих в очаг воспаления иммунокомпетентных клеток, например, нейтрофилов и лейкоцитов, представляющих первую линию неспецифической защиты организма, может приводить к развитию воспалительного процесса, а в дальнейшем – к хроническому воспалению дыхательных путей. Дисбаланс в образовании клеток Th1 и Th2 из наивных T-хелперов может привести к смещению равновесия в сторону Th2-опосредованного иммунного ответа и развитию аллергических заболеваний. Данную теорию подтверждают полученные нами данные об ассоциации маркера Asp299Gly гена TLR4 с тяжестью атопической БА и гаплотипа T–Ala по маркерам C(–318)T и A(+49)G гена CTLA4 с атопической БА. В настоящей работе показана ассоциация двух маркеров в интроне гена GPRA, открытого позиционным клонированием и ассоциированного с БА, а также их гаплотипа T–C с развитием БА. На данный момент роль данного гена в патогенезе БА не ясна, однако можно предположить, что маркеры находятся в неравновесии по сцеплению с другими неизвестными функциональными маркерами. Эозинофилы играют важную роль в развитии аллергического воспаления при БА. Интерлейкин-5 и эотаксин-3 являются ответственными за активацию и направленную миграцию эозинофилов в очаг воспаления. Установленное в нашем исследовании отсутствие ассоциации маркеров С(–703)Т гена IL5 и A(– 403)G гена CCL26 с атопической БА и ее тяжестью позволяет сделать предположение о том, что гены, ответственные за активацию и хемотаксис эозинофилов, не играют значительной роли в предрасположенности к развитию БА, и, возможно, опосредованно могут влиять на специфические процессы, имеющие место при БА. Нами показано, что маркеры в генах CCL26 и CCL5 не ассоциированы с развитием и тяжестью БА. Вероятно, мутации в генах, экспрессирующихся в клетках эпителия бронхов, не оказывают заметного влияния на патологические процессы, происходящие при БА. 25 ВЫВОДЫ 1. Изучено распределение аллелей и генотипов полиморфных маркеров C(–703)T гена IL5, C(–1055)T и R130Q гена IL13, M31R и R335C гена IL8RA, Asp299Gly гена TLR4, C(–318)T и A(+49)G гена CTLA4, rs324396 (С/Т) и rs740347 (G/C) гена GPRA, T(+2497)G гена CCL26 и A(–403)G гена CCL5 в группе больных атопической БА и в группе здоровых индивидов русского происхождения. 2. Для полиморфных маркеров генов IL5, CTLA4, CCL26 и CCL5 показано отсутствие ассоциации с развитием атопической БА и тяжестью ее течения. 3. Установлено, что носители минорного аллеля Arg и гетерозиготного генотипа Met/Arg полиморфного маркера M31R гена IL8RA имеют повышенный риск развития атопической БА. Наличие аллеля Met и гомозиготного генотипа Met/Met в геноме, напротив, связано с пониженным риском развития заболевания. Обнаружено, что наличие минорного аллеля Т и гетерозиготного генотипа СT полиморфного маркера rs324396 (С/Т) гена GPRA в геноме связано с повышенным риском развития БА, а носительство аллеля С и генотипа СС ассоциировано с пониженным риском. 4. Показана ассоциация гаплотипа T–C гена GPRA по маркерам rs324396 (С/Т) и rs740347 (G/C) с повышенным риском развитием БА. Обнаружено, что гаплотип T– Ala маркеров C(–318)T и A(+49)G гена CTLA4 ассоциирован с пониженным риском развития БА. 5. Для полиморфного маркера C(–1055)T гена IL13 показана ассоциация с тяжестью атопической БА. Носительство генотипа СТ связано с более тяжелым течением БА, а генотипа СС – с легким течением заболевания. Установлено, что минорный аллель Gly полиморфного маркера Asp299Gly гена TLR4 ассоциирован с тяжелым течением БА, а аллель Asp – с легким течением заболевания. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. 2. 3. С.А. Мазурина, Е.В. Зайцева (Дмитриева-Здорова), О.Е. Воронько, Н.В. Бодоев, В.А. Казначеев, Ю.В. Гервазиев. Влияние полиморфизма гена ИЛ13 на основные маркеры атопии у больных бронхиальной астмой. // Российский аллергологический журнал. 2007. 2. стр. 27-31. Дмитриева-Здорова Е.В., Воронько О.Е., Аксенова М.Г., Бодоев Н.В. Ассоциация полиморфных маркеров генов интерлейкина-13 с атопической бронхиальной астмой. // Генетика. 2010. 1. том 46. №1. стр. 111-117. O. Voronko, E. Zaytseva (Dmitrieva-Zdorova), S. Mazurina, Y. Gervaziev, N. Bodoev. Polymorphisms in IL5, IL8RA and IL13 genes contribute to asthma and asthma severity in Russian patients. // Abstracts of WAM’ 2007, June 22-25, Istanbul, Turkey. 26 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. O. Voronko, E. Zaytseva (Dmitrieva-Zdorova), S. Mazurina, Y. Gervaziev, N. Bodoev. Study of association of polymorphisms in IL5, IL8RA and IL13 genes with asthma and asthma severity in Russian patients. // Abstracts of Annual ERS Congress, September 1519, 2007, Stockholm, Sweden, P. 625s. O. Voronko, E. Zaytseva (Dmitrieva-Zdorova), S. Mazurina, Yu. Gervaziev, N. Bodoev .Polymorphisms in cytokine genes are associated with asthma and asthma severity in Russian patients. // Abstracts of 6th Annual Cytokines & Inflammation Conference, January 28-29, 2008, Orlando, USA. Дмитриева-Здорова Е.В., Воронько О.Е., Мазурина С.А., Гервазиев Ю.В., Бодоев Н.В. Полиморфизм в гене GPRA ассоциирован с атопической бронхиальной астмой и тяжестью ее протекания у русских пациентов г. Москвы. // Материалы IV съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, 11-15 мая 2008 г., Новосибирск. Olga E. Voronko, Elena V. Dmitrieva-Zdorova, Nikolai V. Bodoev, Alexander I. Archakov. Analysis of genetic susceptibility for bronchial asthma in Russians. // Abstracts of 4th international conference «Genomics, Proteomics, Bioinformatics and Nanobiotechnologies for Medicine», June 1-7, 2008, Moscow-Nizhny NovgorodMoscow, Russia. Zaytseva (Dmitrieva-Zdorova) E., Voronko O., Latysheva E., Bodoev N., Storozhakov G. I., Archakov A. I Polymorphisms in CC16 and CCL26 genes and atopic bronchial asthma in Russian patients. // Abstracts of Annual ERS Congress, October 4-9, 2008, Berlin, Germany. O. Voronko, E. Zaytseva (Dmitrieva-Zdorova), S. Mazurina, Yu. Gervaziev, N. Bodoev. G-protein coupled receptor gene polymorphism is associated with asthma and asthma severity in Russian patients.// Abstracts of Annual ERS Congress, October 4-9, 2008, Berlin, Germany. О.Е. Воронько, Е.В. Дмитриева-Здорова, Е.В. Латышева, С.А. Мазурина, Ю.В. Гервазиев, Н.В. Бодоев, Г.И. Сторожаков, А.И. Арчаков Анализ генетической предрасположенности к атопической бронхиальной астме у русских пациентов. // II Всемирный форум по астме и респираторной аллергии, 25-28 апреля 2009, СанктПетербург, Россия. Olga E. Voronko, Elena V. Dmitrieva-Zdorova, Elena A. Latysheva, Marina G. Aksenova, Nikolai V. Bodoev, Gennady I. Storozhakov, Alexander I. Archakov Analysis of polymorphism of immune response genes in Russian patients with atopic asthma. // Abstracts of Annual ERS Congress, September 12-16, 2009, Vienna, Austria. Elena Dmitrieva-Zdorova, Olga Voronko, Svetlana Mazurina, Marina Gabaeva, Yuri Gervaziev, Nikolai Bodoev PDCD1 PD-1.3 polymorphism is associated with total IgE and IL-4 levels in Russian patients with atopic asthma. // Abstracts of Annual ERS Congress, September 12-16, 2009, Vienna, Austria. 27
