Лекция № 2 - Автоматизированная информационная система ГУ
реклама
МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН УМКД 042-18Страница 1 из 116 № от 2015 г. ГОСУДАРСТВЕННЫЙРедакция УНИВЕРСИТЕТ имени ШАКАРИМА города Семей 22.1.10/01-2015 Документ СМК 3 уровня УМКД УМКД УМКД 042-18-22.1.10/03УМКД Редакция № 2015 Учебно-методические от материалы дисциплины «Молекулярная биология» УЧЕБНО-МЕТОДИЧЕСКИЙ КОМПЛЕКС ДИСЦИПЛИНЕ «Молекулярная биология» для специальности: 5В120200 – «Ветеринарная санитария» УЧЕБНО-МЕТОДИЧЕСКИЕ МАТЕРИАЛЫ Семей 2015 УМКД 042-1822.1.10/01-2015 Редакция № от Содержание 1 Глоссарий 2 Лекции 3 Практические и лабораторные занятия 4 Самостоятельная работа обучающегося 2015 г. Страница 2 из 116 УМКД 042-1822.1.10/01-2015 Редакция № от 2015 г. Страница 3 из 116 1 ГЛОССАРИЙ Амстрем Азотистые основания Аденозинтрифосфат Аминокислоты Аллели Аппоптоз Бактерии Белки Биосинтез Вакуоли Вязкость Вирус Водородные связи Гены Геном Гиалуроновая кислота Гидролазы Генетическая информация Дезоксирибоза ДНК-полимераза Денатурация Жировые клетки Закон Менделя Код Кариотип Клеточные оболочки Лизосома Лейцин Липоиды Липопротеиды Мейоз Митоз Макрофаги Мукопротеиды Мутации Наследственность Нуклеазы Нуклеозид Обмен веществ Оперон Обратная транскрипция Опухоли Оплодотворение Организаторы Органелла Осмос Онтоген Основное вещество Полимераза Полипептиды Полисахариды Проницаемость Полиплоидия Пластиды Полимеры Пуриновые основания Протоплазма Полисомы Пурины Протеолитические ферменты Пероксисомы Промессенжер Радиоактивные изотопы Радиография РНК-полимераза Рекомбинация Ренатурация Рибосомы Рибонуклеиновая кислота Синтез Секреция Секреторный цикл Сиаловая кислота Суберин Стероиды Судан Сульфатиды Телофрагма Транскрипция Трансляция Трансдукция Трансформация Терминация Урацил Углеводородные связи Фагосома Фагоцитоз Фермент Ферритин Фосфатазы Фосфолипиды Хромосомы Хемотаксис Хитин Хлоропласт Хлорофилл Хроматиды Хромомеры Хлорофермент Хлорофилл Центриоль Цитозин Циклоз Центромеры Цикл Кребса Цистроны Экзоцитоз Эндоцитоз Эндоплазма Эукариоты Эухроматин Ядрышко Ядерная оболочка Ядерный сок Яичник Ядро Яйцеклетка УМКД 042-1822.1.10/01-2015 Редакция № от 2015 г. Страница 4 из 116 2 ЛЕКЦИИ Лекция – форма учебного занятия, цель которой состоит в рассмотрении теоретических вопросов излагаемой дисциплины в логически выдержанной форме. Модуль 1 Краткая история возникновения и основные этапы развития молекулярной биологии Лекция № 1 Тема: Введение План лекции: Предмет и задачи молекулярной биологии. Роль и место молекулярной биологии в системе наук о жизни. Краткая история возникновения и основные этапы развития молекулярной биологии. Развитие молекулярной биологии в конце ХХ века. Развитие молекулярной биологии в Казахстане. Клетка - молекулярная основа жизни. Оснащение: проектор, слайды Mолекулярная биология - это наука о механизмах хранения, воспроизведения, передачи и реализации генетической информации, о структуре и функциях нерегулярных биополимеров - нуклеиновых кислот и белков. Перед молекулярной биологией стояли и стоят, собственно, те же задачи, что и перед всей биологией в целом,- познание сущности жизни и ее основных явлений, в частности таких, как наследственность и изменчивость. Современная молекулярная биология в первую очередь призвана расшифровать структуру и функцию генов, пути и механизмы реализации генетической информации организмов на разных стадиях онтогенеза и на разных этапах ее считывания. Она призвана вскрыть тонкие механизмы регуляции активности генов и клеточной дифференцировки, выяснить природу мутагенеза и молекулярные основы эволюционного процесса. Внимание современной молекулярной биологии сосредоточено преимущественно на изучении структуры и функции важнейших классов биополимеров - белков и нуклеиновых кислот, первые из которых определяют самую возможность протекания обменных реакций, а вторые - биосинтез специфических белков. В 1869 году Фридрих Мишер открыл ДНК. Вначале новое вещество получило название нуклеин, а позже, когда Мишер определил, что это вещество обладает кислотными свойствами, вещество получило название нуклеиновая кислота. Фридрих Мишер проводил также исследования в области УМКД 042-1822.1.10/01-2015 Редакция № от 2015 г. Страница 5 из 116 строения и состава ядер в желтке куриного яйца, физиологии спинного мозга, состава сперматозоидов лосося (открытие вещества протамин), образа жизни рейнского лосося (изменения в химическом и анатомическом составе разных органов во время образования оварий), движений при дыхании, отношения между высотой над морем и составом крови. Белозерский Андрей Николаевич 29.08.1905 - 31.12.1972 первым открыл ДНК в ряде растений. Обнаружил в ядерных нуклеопротеидах негистоновые бели нещелочного характера (1935). На собранном им обширном научном материале доказал, что ДНК всех представителей органического мира построены из четырёх основных дезоксирибонуклеотидов. Своими исследованиями подтвердил гипотезу об универсальном характере ДНК как компоненте всего живого. Один из создателей современной геносистематики (ДНК-систематики, ДНК-таксономии) и молекулярной биологии в СССР. К началу 50-х годов ХХв. в недрах биохимии были получены фундамнтальные данные об элементарном строении белков и нуклеиновых кислот, включая сведения о способах организации полепептидных цепей белков, и, что особенно важно, о структуре нуклеотидов и закономерностях их количественного содержания в молекулах ДНК и РНК. Создание модели двойной спирали ДНК и открытие принципа комплементарности стали важнейшим событием современной биологии, вскрывшим фундаментальные принципы функционироваия живых систем и определевшим дальнейшие направления исседований современной биологии. Современное естествознание обязано именно молекулярной биологии тем, что в период с середины 50-х до середины 70-х ХХ в. с невероятной быстротой были раскрыты природа и основные пути передачи и реализации генетической информации. Основополагающие открытия молекулярной биологии 1869- Ф. Мишер впервые выделил ДНК из лейкоцитов и молок лосося. 1935- А.Н. Белозерский выделил ДНК из растений 1940- У.Эстбюри получил первую рентгенограмму ДНК 1944- О.Т. Эвери установил, что ДНК является носителем генетической информации 1951- Л.Полинг и Р.Кори обсновали существование основных типов укладки аминокислотных остатков в полипептидных цепях белков 1953- ДЖ.Уотсон и Ф. Крик создали модель двойной спирали ДНК 1960- был открыт фермент транскрипции-РНК –полимераза 1961 – Ф.Жакоб и Дж.Моно разработали модель оперона В результате выдающихся открытий Дж. Уотсона, Ф.Крика и других крупнейших молекулярных биологов, удостоенных нобелевских премий, уже в середине 60-х годов ХХ в. открыли путь реализации генетической информации в клетке: ДНК-РНК-Белок Затем были детально изучены механизмы воспроизведения (репликации) ДНК, транскрипции (биосинтеза РНК) и трансляции (биосинтеза белка). Параллельно развивались работы по изучению внутриклеточной локализации этих процессов, УМКД 042-1822.1.10/01-2015 Редакция № от 2015 г. Страница 6 из 116 что привело к осознанию функционального значения внутриклеточных компонентов (ядра, митохондрий, рибосом) и дало основание Дж. Уотсону в 1968 г. для определения молекулярной биологии: «Молекулярная биология изучает связь структуры биоогических макромолекул и основных клеточных компонентов с их функцией, а также основные принципы и механизмы саморегуляции клеток, которые опосредуют согласованность и единство всех протекающих в клетке процессов, составляющих сущность жизни» Впоследствии центральный постулат молекулярной генетики был дополнен представлениями о существовании процесса обратной транскрипции ( о биосинтезе ДНК на матрице РНК ) и репликации РНК. Открытие и разработка методов целенеправленного использования целого ряда ферментов (обратной транскриптазы, ДНК-рестриктаз и др.) привели к созданию технологии получения рекомбинатных ДНК, возникновению генетической инженерии, что стало поистене революционным событием в истории молекулярной биологии. В конце 70-х и начале 80-х годов ХХ в. молекулярная биология вступает в период расцвета. Активно изучаются структура ферментов и биологических мембран, начинаются работы по расшифровке структуры геном высших организмов, создаются основы новых биотехнологий, возникает белковая инженерия. Бурное развитие молекулярной биологии привело в начале 80-х годов ХХ в. к возникновению новой науки-биоинформатики (вычислительной биологии, компьютерной генетики). В конце ХХ в. расширяются и становятся все более Целенаправленными в научно-практическом отношении задачи молекулярной биологии , среди которых: расшифровка структуры геномов; создание банков генов; геномная дактилоскопия; изучение молекулярных основ эволюции, диффернцировки, биоразнообразия, развития и старения, канцерогенеза, иммунитета и др.; создание методов диагностики и лечения генетических болезней, вирусных заболеваний; создание новых биотехнологий производства продуктов и разнообразных пищевых биологически активных соединений (гормонов, энергоносителей, релизинг-факторов). Вопросы для самоконтроля: 1. Что изучает молекулярная биология? 2. Какие задачи стоят перед молекулярнй биологией 3 Какой формы могут быть клетки и с чем это связано 4 Что из себя представляет прокариотическая клетка? 5. Что из себя представляет эукариотическая клетка? 6. Что входит в молекулярный состав клетки? Литература: 1-7 (основная), 8- 16 (дополнительная) УМКД 042-1822.1.10/01-2015 Редакция № от 2015 г. Страница 7 из 116 Модуль 1 Краткая история возникновения и основные этапы развития молекулярной биологии Лекция № 2 Тема: Межмолекулярные взаимодействия и их роль в функционировании живых систем. Межклеточные и внутриклеточные механизмы сигнальных взаимодействий. План лекции: Методы применяемые в молекулярной биологии. Химическая сигнализация в организме. Белок-белковые взаимодействия и их значение для самосборки белковмультимеров и надмолекулярных структур. Межклеточная химическая сигнализация и ее типы. Рецепторы пептидных гормонов и нейротрансмиттеров. Оснащение: микроскоп, проектор, слайды Микроскопия- имеет давнюю историю, начиная с ХYII когда в 1611 г. Й.Кеплер прделожил принцип создания светового микроскопа, а А.Левенгук впервые наблюдал с его помощью одноклеточные бактерии (1638). Именно световая микроскопия, имеющая предел разрешения 0,4-0,7 мкм., позволила М.Шлейдену и Т. Шванну в 1838 г. создать клеточную теорию. В развитии микроскопии существенными вехами стали изобретения интерференционного (1939), фазово-контрастного (1932) и электронного микроскопов (1939). Электоронная микроскопия имеет предел разрешения до 0,1 нм., что позволяет изучить структуру вирусов, внутриклеточных органелл,белковонуклеиновых комплексов и т.д. Рентгеноструктурный анализ- основан на дифракции рентгеновских лучей, позволяет выявить трехмерное расположение атомов в молекулах (разрешение составляет менее 0,1 нм.). С помощью данного метода были получены сведения о структуре молекул белков, ДНК и РНК. Радиоактивные изотопы- используются для изучения нуклеиновых кислот, белков, углеводов и других молекул в живой клетке. Радиоактивные молекулы используются при изучении самых разнообразных внутриклеточных процессов: синтеза молекул из их предшественников, определения внутриклеточной локализации молекул, времени их функционирования, химических превращениях в отдельных учатсках макромолекул. Ультрацентрифугирование-получило широкое применение после изобретения в 1926 г. Т. Сведбергом аналитической центрифуги, с помощью которой он определил молекулярную массу гемоглобина. В 40-50-е годы А.Клод и Ж. Браше разработали метод дифференциального центрифугирования для разделения органелл клетки, с помощью которого Де Дюва в 1953 г. впервые выделил лизосомы, а затем пероксисомы. Хроматография- В настоящее время существует большое количество вариантов хроматографии, в которых используют матриксы (носители) разных типов, позволяющие раздеить белки по заряду (ионообменная роматография), УМКД 042-1822.1.10/01-2015 Редакция № от 2015 г. Страница 8 из 116 размеру молекул (гель-хроматография) или способности специфически взаимодействовать с определенными химическими группами веществ, предвартельно связанных с матриксом (аффинная хроматография) . Элетрофорез- В основе этого метода лежит способность белков, обладающих определенным суммарным положительным или отрицательным зарядом, перемещаться в элетрическом поле в соответствии с величиной заряда, размером и формой молекул. Электофорез можно проводить в водном (буферном) растворе, крахмальном, агарозном или полиакриламидном геле, на целлюлозных или нитроцеллюлозных пластинах. Культура клеток- этот метод берет начало в 1885 г., кода впервые было обнаружено, что клетки куриного эмбриона сохраняет жизнеспособность в солевом растворе. С 1907 г. стали использовать культуры фргментов тканей. В настоящее время используют диссоциированные культуры клеток, из которых можно получить клетки одного типа. Иногда в культуре клеток появляются мутанты, кторые могут бесконечно размножаться и образовывать клеточну линию. В отличие от раковых клеток, также способных к непрерывному делению, мутантные клетки лучше растут в контакте с какой-то поверхностью. Слиянием двух клеток могут быть получены гетерокарионы- клетки с двумя отдельными ядрами. После митотического деления гетеррокарион превращается в гибридную клетку, у которой все хромосомы объединяются одном ядре. Такие гибридные клетки дают возмжность изучать функции отдельных хромосом взаимодействие внутриклеточных компонентов различных клеток. Бесклеточные системы- назаменимы для изучения механизмов молекулярных процессов, так как исключают различные побочные реакции, протекающие в клетке. В 1954 г. П.Заманчик поучил первую бесклеточную систему для изучения биосинтеза белка (трансляции). Для этого из экстрактов клеток выделяли важнейшие компоненты белок-синтезирующей истемы (м РНК, рибосомы, тРНК и др.), а затем последовательно вводили их в систему и уточняли роль каждого компонента в биосинтезе белка. С помощью бесклеточных систем был расшифрован генетический код, для чего в качестве мРНК использовали использовали ситетические олиго-и полинуклеотиды известного состава. Бесклеточные системы используются для изучения важнейших молекулярно-генетических процессов: репликации и транскрипции ДНК, сплайсинга РНК и др. Моноклональные антитела- очень чувствительный инструмент выявления молекул в сложных смесях, и поэтому они находят широкое применение в молекулярной биологии. Антитела представляют собой белки (иммуноглобулины). Вырабатываемые позвоночными животными для защиты от чужеродных соеинений- антигенов. Каталитические активные белки (ферменты) – важнейшие инструменты биохимических методов исследования. Они нашли широкое применение в молекулярной биологии. Межклеточные и внутриклеточные механизмы сигнальных взаимодействий Эволюция многоклеточных организмов основана на способности клеток УМКД 042-1822.1.10/01-2015 Редакция № от 2015 г. Страница 9 из 116 поддерживать связь друг с другом. Эта способность необходима для регуляции развития клеток и для их организации в ткани, для контроля роста и деления клеток. Специальные сигнальные системы обеспечивают работу в согласованном режиме миллиардов клеток. Сигнал передается вдоль нервного волокна в виде электрического импульса. На границе с клеткой-исполнителем он преобразуется в химический с помощью выделения окончаниями нервных волокон специального посредника — нейромедиатора. Нейроны посылают дискретные «сообщения» определенным клеткам-мишеням, ими могут быть мышечные клетки, клетки желез и другие нейроны. Эти сообщения — нейромедиатор, посылаемый в специальный участок — синапс (от греч. synapsis— соединение). Здесь молекулы нейромедиатора связываются с рецептором (специальной белковой молекулой) на поверхности клетки, воспринимающей сигнал, и вызывают изменения в мембране и внутри клетки. Сигнал за 106 секунд доходит до адресата. Кроме передачи информации нервной системой в организме существует химический канал связи. Клетки сами выделяют вещества, которые через кровь или окружающую среду путем диффузии могут достигнуть других клеток (некоторые из них называют гормонами). Каждая клетка-мишень наделена рецепторами, распознающими молекулы только тех гормонов, которые должны действовать на нее. Рецепторы извлекают гормон из крови, связываются с ним и передают информацию в клетку. Связь через гормоны идет медленнее: ведь гормон, секретируемый специализированной железой, должен отыскать в организме свою мишень, что может занять несколько часов. Молекулы, обладающие гормональной активностью, чаще всего являются пептидами — короткими цепочками аминокислот. Хотя химический канал передает информацию с меньшей скоростью, чем электрический, наличие двух каналов обеспечивает надежность и многообразие связей внутри организма. Обе системы связи между клетками — и нейронная, и гормональная — действуют через специализированные молекулы, контактирующие со специализированными рецепторами клеток-мишеней. Некоторые молекулы-медиаторы активно передают сигналы в обеих системах связи. Например, гормон норадреналин выделяется надпочечниками для стимуляции сердечных сокращений, расширения бронхов и усиления сокращения мышц конечностей. Одновременно он — и нейромедиатор в симпатической нервной системе, где способен вызывать сужение кровеносных сосудов, повышая артериальное давление, т.е. он может передавать различную информацию в обеих системах. Точная координация функций клеток многоклеточного организма осуществляется путем передачи химических сигналов. Большая часть адресованных клетке сигнальных молекул не попадает внутрь нее. По наружной поверхности клетки расставлены молекулы рецепторов, которые играют роль антенн. Они распознают приходящие сигналы и приводят в действие внутриклеточные каналы передачи информации, которые регулируют внутриклеточные процессы — метаболизм, сокращение, секрецию, рост. УМКД 042-1822.1.10/01-2015 Редакция № от 2015 г. Страница 10 из 116 Плазматическая мембрана клетки — барьер для потока информации. На молекулярном уровне передача информации обеспечивается цепочкой мембранных белков, последовательно взаимодействующих друг с другом. Это приводит к перестройке следующего в цепочке белка, а изменение структуры влечет изменение его функции. Вопросы для самоконтроля: 1. В чем состоят сходство и отличия светового и электронного микроскопов, каковы их разрешающие способности и увеличения? 2. Что изучают при помощи рентгеноструктурного анализа, радиоактивных изотопов, хроматографии. 3. Что изучают при помощи культуры клеток, бесклеточных систем. 4. Как протекают механизмы межклеточных и внутриклеточных взаимодействий Литература: 7.1-7.1.7 (основная),7.2.1- 7.2.10 (дополнительная) Модуль 1 Краткая история возникновения и основные этапы развития молекулярной биологии Лекция № 3 Тема: Структура белков План лекции: Белки. Химические структуры основных классов макромолекул. Компоненты белков и соединяющие их хиические связи. Размер и форма белков. Домены в структуре белка и их функциональная роль. Глобулярные и фибриллярные белки. Методы выделения и изучения структуры белков Оснащение: проектор, слайды Белки - самый распостраненый в живой природе класс биополимеров, составлющий большую часть сухового вещества животных (50-80 %), и что самое главное, обладающий наибольшим по сравнению со всеми другими веществами органической природы разнообазием структуры и функции. Белки определяют структуру и форму клетки; кроме того, они служат инструментами молекулярного узнавания и катализа. Каждый из нас состоит примерно из 1015 клеток. Каждая клетка представляет собой миниатюрную фабрику для производства белков. Именно белковые молекулы лежат в основе всех процессов жизнедеятельности организма, и именно их состав и строение определяют индивидуальность организма. Молекулы белков похожи на длинные цепочки бус, в которых роль отдельных звеньев играют 20 различных аминокислот, способных соединяться между собой в любом порядке. Число различных вариантов белков, составленных всего из пяти аминокислот, уже превышает три УМКД 042-1822.1.10/01-2015 Редакция № от 2015 г. Страница 11 из 116 миллиона. В состав же среднего белка входит 100-200 аминокислот. Понятно, что разнообразие цепочек такой длины будет измеряться уже астрономическими числами. Информация об аминокислотном составе белков организма закодирована в молекулах ДНК. Каждые три последовательных нуклеотида молекулы ДНК кодируют одну аминокислоту (так называемые триплеты). При изменении даже одного нуклеотида клетка начнет производить белок, в котором одна аминокислота заменяется на другую. Если же аминокислота играет в данном белке ключевую роль, его работа будет существенно нарушена: в лучшем случае клетка окажется неспособной выполнять необходимую работу, а в худшем – начнет при этом бесконтрольно размножаться, что послужит началом образования опухоли. Нуклеиновые кислоты представляют собой «программное обеспечение» инструкции, полученные клеткой от родительской клетки. Белки составляют «аппаратное обеспечение»- физические механизмы, осуществляющие хранящуюся в памяти программу. Функции белков в клетках очень многообразны. Сокращается мышца, работает мозг, борется организм с попавшими в него бактериями или вирусами, переваривается в желудке и кишечнике пища, бактерия разъедает камень — во всех разнообразных процессах главную роль играют белки. Белки выполняют ряд очень важных и не заменимых функций: 1. Структурную, или строительную, пластическую,- именно белки обуславливают функциональные характеристики органов и тканей. 2. Каталитическую (ферментативную)- по химической природе все ферменты являются белками. 3. Защитную - антитела (белки) связывают различные токсические вещества, кроме того, белки участвуют в сложном процессе свертывания крови. 4. Сократительную функцию - она обеспечивается сократительными белками мышц. 5. Регуляторную роль – она характерна для гормонов белков – пептидной природы, а также различных факторов роста, обеспечивающих деление клеток, активацию определенных генов. 6. Дыхательную функцию, а именно перенос кислорода и углекислого газа, эта функция характерна у млекопитающих для хромопротеидов (гемоглобин, миоглобин). 7. Питательную – аминокислоты не использованные для синтеза белков, пептидов, биологически – активных соединений, потребляются как источники энергии,- при этом они расщепляются (окисляются) до конечных продуктов (СО2, Н2О, NH3, мочевины). 8. Ряд специфических белков участвуют в превращении энергии биоокисления в энергию макроэргических связей АТФ. Белки являются главными компонентами рецепторов, с помощю которых реализуется действие гормонов, биологически активных веществ. В отличии от углеродов и липидов белки в виде запаса УМКД 042-1822.1.10/01-2015 Редакция № от 2015 г. Страница 12 из 116 Единой общепринятой классификации белков не существует, поэтому встречаются белки по сложности строения (простые и сложныедвухкомпонентные), по форме (глобулярные и фибриллярные) , по месту нахождения (структурные и плазменные), полноценные и неполноценные и.т.д. Белки являются важнейшими молекулами живого организма. Классификация белков. 1. Классификация белков по структуре: фибриллярные- выполняют в клетках и в организме структурные функции ( к этой групп относятся коллаген, миозин, фиброин, кератин), глобулярные – выполняют в организме функции ферментов (инсулин), промежуточные- к ним относится фибриноген. 2. Классификация белков по составу: простые ( состоят только из аминокислот), сложные (состоят из глобулярных белков и небелкового материала ). 3. Классификация белков по функциям: структурные белки (коллаген, кератин, эластин ), ферменты (трипсин, глутамисинтеаза), гормоны ( инсулин, глюкагон), дыхательные пигменты (гемоглобин, миоглобин), транспортные белки ( сывороточный альбумин), защитные белки (антитела, фибриноген, тромбин), сократительные белки (миозин, актин), запасные белки (казеин), токсины (змеиный яд, дифтерийный токсин). Структурная организация белков. В 1959г. датский биохимик К.Линдерстрем-Ланг предложил различать четыре уровня структурной организации белков: первичную, вторичную, третичную и четвертичную структуры, которые, обозначают аминокислотную последовательность упорядоченное строение основной цепи полипептида, трехмерную структуру белка и структуры белковых агрегатов. Первичная структура: под первичной структурой понимают последовательность аминокислот в полипептидной цепи. Эта структура , достаточно жестко запрограммированная в определенной нуклеотидной последовательности соответствующих структурных генов ДНК, переписываются (транскрибируются ) в комплементарные нуклеотидные последовательности мРНК, которые служат матрицами для биосинтеза полипептидных цепей в процессе декодирования (трансляции) генетической информации в рибосомной системе клетки. Уникальность первичной структуры впервые была выявлена при исследовании бычьего инсулина, а затем подтверждена в результате анализа тысяч других белков разного размера. Первичная структура белка детерминируется первичной структурой соответствующего гена. Поэтому при изменении нуклеотидной последовательности гена, кодирующего данный белок, изменяется и первичная структура белка. Вторичная структура: - это упорядочноое расположение отдельных участков основной цепи полипептида, без учета расположения боковых цепей . Исследования вторичной структуры, основанные на данных рентгеноструктурного анализа, показали наличие в белках регулярно свернутых и закономерно закрученных участков полипептидной цепи. УМКД 042-1822.1.10/01-2015 Редакция № от 2015 г. Страница 13 из 116 Третичная структура: - под третичной структурой понимают трехмерную структуру белков, характеризующуюся определенной укладкой в пространстве всех звеньев полипептидной цепи. Четверичная структура — взаимное расположение нескольких полипептидных цепей в составе единого белкового комплекса Модификация белков. После отделения от рибосом многие белки подвергаются какой либо ковалентной модификации. Известно более 100 типов модификации боковых групп аминокислотных остатков. Зачастую эти модификации обратимы и служат для регуляции биологической активности белка. Фосфорилирование белков обратимо, поскольку в цитозоле присутствуют многочисленные фосфотазы. Другие ковалентные модификации белков, необходимые для нормального функционирования некоторых белков, необратимы. Так, со многими ферментами ковалентно связаны коферменты, играющие существенную роль в ферментативных реакциях. К числу необратимых модификации относится ацетилирование N- концов многих белков в цитозоле и избирательное метилирование аминогрупп некоторых остатков лизина. Одним модификациям белки подвергаются в эндоплазматическом рнтикулуме, а другим – в аппарате Гольджи. Специализированные секреторные клиники выделяют разнообразные белки; например, некоторые эндокринные клетки секретируют пептидные гормоны, а ацинарные клетки поджелудочной железы- пищеварительные ферменты. Многие из этих белков первоначально существуют в виде длинных полипептидов, которые, прежде чем стать активными, расщепляются специальными протеазами. В зависимости от вида белка расщепление происходит либо в аппарате Гольджи, либо в образующихся секреторных пузырьках, либо после секреции. Некоторые из этих модификации можно считать регуляторными. Целый ряд секретирующих ферментов синтезируется и секретируется в форме неактивных предшественников, называемых зимогенами, поскольку эти ферменты были бы весьма опасны, если бы появились внутри клетки в активном состоянии. Поэтому они активируются вне клетки только после модификации, заключающейся в их специфическом протеолитическом расщеплении в одном или нескольких местах.Размер и форма белков. Размеры полипептидов очень сильно различаются: число составляющих их аминокислот колеблется от 50 до нескольких тысяч. Поскольку с каждой аминокислотой масса белка увеличивается примерно на 110 дальтон, мол. масса белков может варьировать от 104 до 106 дальтон. Одни белки состоят только из одной полипептидной цепи, другие - из нескольких одинаковых цепей, третьи - из нескольких цепей разного типа. Примером белка, представленного одной полипептидной цепью, служит миоглобин; глутаматсинтетаза бактерий содержит 12 идентичных полипептидных цепей. Гемоглобин - тетрамер, состоящий из цепей двух разных видов, а УМКД 042-1822.1.10/01-2015 Редакция № от 2015 г. Страница 14 из 116 функциональная форма ДНК-полимеразы Е. coli состоит из полипептидных цепей по крайней мере четырех разных видов. В растворе белки имеют строго определенную конформацию, или трехмерную структуру. Биологическая активность почти всех без исключения белков, будь то белки-катализаторы, структурные белки, белки, ответственные за транспортные процессы, белки, участвующие в формировании опорнодвигательного аппарата, или белки-регуляторы, зависит от сохранения их природной, или активной, конформации. Белки в соответствии с их конформацией можно разделить на две категории. Глобулярные белки имеют компактную, примерно сферическую форму, образующуюся в результате нерегулярной укладки полипептидных цепей. В фибриллярных белках полипептидные цепи располагаются параллельно друг другу, образуя длинные нити или слои. Большинство ферментов и растворимых белков имеют глобулярную структуру; такие белки, как коллаген и кератин, обнаруживаемые в структурных и соединительных тканях, принимают фибриллярную конформацию. Фибриноген и мышечный миозин могут встречаться как в одной, так и в другой форме. Вопросы для самоконтроля: 1. Дайте определение белкам. 2. Перечислите простые белки. 3. Перечислите сложные белки. Литература: 7.1-7.1.7 (основная),7.2.1- 7.2.10 (дополнительная) Модуль 2 Нуклеиновые кислоты Лекция № 4 Тема: Молекулярная организация генетического аппарата. Структура и организация генома. План лекции: Общие представления о геноме. Хромосомные карты. Размеры эукариотических геномов. Псевдогены. Особенности состава, локализация в хромосомах и возможная роль. Последовательности ДНК в области центромер и теломер хромасом. Упаковка ДНК в хромасомах. Структура хроматина. Характеристика гистонов. Фракции гистонов. Роль разных фракций гистонов в структуре хроматина. Компактизация в струтуре хроматина. Строение нуклеосомы. Оснащение: проектор, слайды УМКД 042-1822.1.10/01-2015 Редакция № от 2015 г. Страница 15 из 116 Термином «геном» принято обозначать совокупность всех генетических элементов (ДНК хромосом, митохондрий, плазмид), являющихся постоянными для организмов данного вида. Размеры геномов имеют существенные различия у организмов, стоящих на разных уровнях эволюционного развития. По существующим современным представлениям структурные гены прокариот (бактерий) представлены участками молекулы ДНК, вся информация которых используется при синтезе кодируемых полипептидных цепочек. У некоторых мелких вирусов была обнаружена необычная организация генетического материала в форме перекрывающихся генов (по принципу «ген в гене»), которая позволяет осуществлять еще более экономное использование ограниченных информационных возможностей генома. В отличие от прокариот для эукариот типичным является прерывистый характер организации генов. Гены эукариот состоят из участков ДНК, несущих информацию о структуре белка (экзонов) и инертных нуклеотидных последовательностей (интронов), не принимающими прямого участия в кодировании белковой молекулы. Т.е. гены эукариотических организмов представляют собой мозаику из нескольких чередующихся в определенном порядке экзонов и интронов. Размеры интронов в составе таких генов колеблются от 10 до более 1000 пар нуклеотидов. 1.Все наследственные свойства живых организмов определяются материальными, дискретными, т. е. отделяемыми друг от друга, частицами. Их назвали генами. Именно гены передаются из поколения в поколение при делении клеток. 2. При каждом делении клеток гены должны удваиваться в числе. Иначе они просто потеряются. 3. Гены у высших организмов — эукариот — расположены в ядрах клеток; лишь немногие встречаются в цитоплазме клеток и определяют так называемый матроклинный тип наследования — по женской линии. 4. В ядрах гены лежат не «россыпью», а образуют линейные структуры хромосомы, хорошо различимые в оптический микроскоп. Термин хромосома был предложен в 1888г. немецким морфологом Вальдейером. В переводе с греческого хромосома – окрашенное тело. Хромосома — самостоятельная структура, которая имеет плечи и центромеру и включающая две хроматиды. В хромосоме расположены в линейном порядке гены. Это — структурная единица ядра клетки, содержащая ДНК, в которой заключена вся наследственная информация организма. Процесс самоудвоения и распределение хромосомы по дочерним клеткам при клеточном делении обеспечивает передачу наследственных признаков организма следующему поколению. Совокупность хромосом в каждой клетке организма создает хромосомный набор. Такой набор постоянен и характерен для данного организма. В половых клетках каждая хромосома встречается один раз, а в большинстве соматических клеток большинства видов имеется двойной набор хромосом. Переход от белковой к нуклеиновой трактовке природы гена УМКД 042-1822.1.10/01-2015 Редакция № от 2015 г. Страница 16 из 116 произошел в конце 40-х гг. Но еще в 1928 г. Н. Н. Кольцов предположил, что при размножении клеток происходит матричная ауто-репродукция материнских молекул. В 1936 г. А. Н. Белозерский получил из растения тимонуклеиновую кислоту, вьщеляемую ранее только в животных организмах. Так было доказано на молекулярном уровне единство растительного и животного миров. Гены — элементарные единицы на молекулярно-генетическом уровне организации. Еще до открытия многих молекулярных составляющих биологи поняли, изучая передачу наследственных признаков при скрещивании, что каждый признак определен отдельной частичкой — геном. Потом установили, что гены находятся в клеточном ядре, в хромосомах. 5. При половом размножении, при слиянии мужской половой клетки с женской, потомок получает один набор хромосом от отца, другой — от матери. Редко наблюдается партеногенетическое размножение (без оплодотворения), когда начало организму дает неоплодотворенная яйцеклетка или клетка тела (соматическая). 6. При образовании половых клеток (гамет) число хромосом уменьшается вдвое. Нормальное (диплоидное число) восстанавливается при слиянии половых клеток. 7. Парные хромосомы, одна из которых происходит от материнского организма, а другая от отцовского, называют гомологичными хромосомами. Расхождение отцовских и материнских хромосом по новым гаметам — процесс случайный. Это исключает вероятность возникновения совершенно одинакового потомства. 8. Случайное расхождение хромосом при мейозе не единственная причина возникновения разнообразия в потомстве. Выстроившись попарно, гомологичные хромосомы могут обмениваться частями. Этот процесс получил название кроссинговера (перекреста). В результате гены, полученные от отца и матери (из разных гомологичных хромосом), могут оказаться сцепленными в одной хромосоме. —5 9. Изредка, с частотой в среднем 10 на поколение, гены способны изменяться. Такие наследственные изменения назвали мутациями. Удалось установить, что частота мутаций возрастает при воздействии жесткого излучения, например рентгеновских лучей и некоторых химических веществ. 10. Случайные превращения генов приводят к тому, что практически каждый ген оказывается представлен несколькими разновидностями. Эти формы генов назвали аллелями. 11. Основной путь наследования - геномный, при котором информация передается через хромосомы. Однако при зачатии материнская яйцеклетка, в десятки раз превышающая по размеру сперматозоид, передает дополнительную информацию дочерней клетке. Такое наследование называется цитоплазматическим. Открытие последнего типа наследования принадлежит молекулярному генетику А.К. Уилсону. То есть при рождении ребенок получает 50% генов от матери, 50% от отца и дополнительную информацию, УМКД 042-1822.1.10/01-2015 Редакция № от 2015 г. Страница 17 из 116 хранящуюся в цитоплазме материнской яйцеклетки. Хромосома прокариотической клетки представляет собой одну длинную двуцепочечную молекулу ДНК, собранную в компакнное образованиенуклеотид. Эукариотические клетки содержат большое число молекул ДНК, которая неравномерно распределена по нескольким хромасомам в виде комплексов с многочисленными белками. Вирусы также содержат в качестве генетического материала нуклеиновые кислоты: у одних это ДНК , у других РНК. Схема строения хромосомы в поздней профазе — метафазе митоза: 1—хроматида; 2—центромера; 3—короткое плечо; 4—длинное плечо Изучение химической организации хромосом эукариотических клеток показало, что они состоят в основном из ДНК и белков, которые образуют нуклеопротеидный комплекс – хроматин, получивший свое название за способность окрашиваться основными красителями. Белки составляют значительную часть вещества хромосом. На их долю приходится около 65% массы этих структур. Все хромосомные белки делятся на две группы: гистоны и негистоновые белки. Гистоны представлены пятью фракциями: Н1, Н2А, Н2В,Н3, Н4. Являясь положительно заряженными основными белками, они достаточно прочно соединяются с молекулами ДНК, чем препятствуют считыванию заключенной в ней биологической информации. В этом состоит их регуляторная роль. Кроме того, эти белки выполняют структурную функцию, обеспечивая пространственную организацию ДНК в хромосомах. Число фракций негистоновых белков превышает 100. Среди них ферменты синтеза и прессинга РНК, редупликации и репарации ДНК. Помимо ДНК и белков в составе хромосом обнаруживаются также РНК, липиды, полисахариды, ионы металлов. РНК хромосом представлена отчасти продуктами транскрипции ,еще УМКД 042-1822.1.10/01-2015 Редакция № от 2015 г. Страница 18 из 116 не покинувшими место синтеза. Регуляторная роль компонентов хромосом заключается в «запрещении» или «разрешении» списывания информации с молекулы ДНК. В интерфазе при световой микроскопии он выявляется в виде глыбок, рассеянных в нуклекоплазме ядра. При переходе клетки к митозу, особенно в метафазе, хроматин приобретает вид хорошо различимых телецхромосом. В процессе электронно-микроскопических и физико-химических исследований в составе интерфазного хроматина и метафазных хромосом были выявлены нити (фибриллы) диаметром 3,0-5,0, 10, 20-30 нм. Наиболее распостраненной является точка зрения, согласно которой хроматин (хромосома) представляет собой специализированную нить. При этом выделяется несколько уровней спирализации хроматина. Нуклеосомная организация хроматина. Этот уровень организации хроматина обеспечивается четырьмя видами нуклеосомных гистонов: Н2А, Н2В,Н3, Н4. Они образуют напоминающие по форме шайбу белковые телакоры, состоящие из восьми молекул ( по две молекулы каждого вида гистонов). Вдоль нуклеосомной нити, напоминающей цепочку бус, имеются области ДНК, свободные от белковых тел. Эти области, расположенные с интервалами в несколько тысяч пар нуклеотидов, играют важную роль в дальнейщей упаковке хроматина, так как содержат нуклеотидные последовательности, специфически узнаваемые различными негистоновыми белками. Хроматиновая нить. Дальнейшая спирализация нуклеосомной нити обеспечивается гистоном Н1, который, соединяясь с линкерной ДНК и двумя соседними белковыми телами, сближают их друг с другом. В результате образуется более компактная структура, построенная, по типу соленоида. Интерфазная хромонема. Следующий уровень структурной организации генетического материала обусловлен укладкой хроматиновой фибриллы в петли. В их образовании принимают участие белки, которые способны узнавать специфические нуклеотидные последовательности вненуклеосомной ДНК, отдаленные друг от друга на расстояние в несколько тысяч пар нуклеотидов. Эти белки сближают указанные участки с образованием петель из расположенных между ними фрагментов хроматиновой фибриллы. В результате такой упаковки хроматиновая фибрилла диаметром 20-30 нм. Преобразуется в структуру диаметром 100-200 нм. ,называемую интерфазной хромонемой. Отдельные участки интерфазной хромонемы подвергаются дальнейшей спирализации, образуя структурные блоки, объединяющие соседние петли с одинаковой организацией. Они выявляются в интерфазном ядре в виде глыбок хроматина. В зависимости от состояния хроматина выделяют эухроматиновые участки хромосом, отличающиеся меньшей плотностью упаковки в неделящихся клетках и потенциально транскрибируемые, и гетерохроматиновые участки, характеризующиеся компактной организацией и генетической инертностью. Различают структурный и факультативный гетерохроматин. Структурный гетерохроматин содержится в околоцентромерных и теломерных участках всех хромосом, а также на протяжении некоторых внутренних фрагментов УМКД 042-1822.1.10/01-2015 Редакция № от 2015 г. Страница 19 из 116 отдельных хромосом. Его роль заключается в поддержании общей структуры ядра, прикреплении хроматина к ядерной оболочке, взаимном узнавании гомологичных хромосом в мейозе, разделении соседних структурных генов, участиии в процессах регуляции их активности. Примером факультативного гетерохроматина служит тельце полового хроматина, образуемое в норме в клетках организмов гомогаметного пола (ту человека гомогаметным является женский пол) Метафазная хромосома. Вступление клетки из интерфазы в митоз сопровождается суперкомпактизацией хроматина. Отдельные хромосомы становятся хорошо различимы. Митотическая суперкомпактизация хроматина делает возможным изучение внешнего вида хромосом с помощью световой микроскопии. В первой половине митоза они состоят из двух хроматид, соединенных между собой в области первичной перетяжки ( центромеры или кинетохора) особым образом организованного участка хромосомы, общего для обеих сестринских хроматид. Во второй половине митоза происходит отделение хроматид друг от друга. Из них образуются однонитчатые дочерние хромосомы, распределяющиеся между дочерними клетками. В зависимости от места положения центромеры и длины плеч, расположенных по обе стороны от нее, различают несколько форм хромосом: равноплечие, или метацентрические, неравноплечие , или субметацентрические, палочковидные , или акроцентрические, и точковые-очень небольшие , форму которых трудно определить. Упаковка ДНК в хромосомах. В клетках или вирусах ДНК, по-видимому, никогда не находится в свободной, вытянутой форме. Она связана с низкомолекулярными катионами - ионами двухвалентных металлов либо с дии полиаминами или белками, а возможно, с теми и с другими. Взаимодействие осуществляется с помощью электростатических сил - отрицательно заряженные фосфатные группы частично нейтрализуются положительно заряженными ионами металлов и полиаминами или основными аминокислотными остатками белков. В результате таких взаимодействий происходит конденсация ДНК с уменьшением объема, занимаемого молекулой, иногда в тысячу раз. Кольцевая ДНК Е. coli длиной 1,4 мм заключена в клетку, имеющую форму палочки диаметром 1 мкм и длиной 2 мкм; у эукариотических клеток ядерная ДНК длиной почти 2 м в стадии интерфазы заключена в ядре диаметром менее 10 мкм. Ядерная ДНК в клетках, находящихся в стадии митоза, конденсирована еще больше и в световом микроскопе имеет вид очень компактной структуры. Вопросы для самоконтроля: 1. Что из себя представляют хромосомы? 2. Каково строение ДНК? 3. Что входит в состав генетического аппарата? Литература: 7.1-7.1.7 (основная),7.2.1- 7.2.10 (дополнительная) УМКД 042-1822.1.10/01-2015 Редакция № от 2015 г. Страница 20 из 116 Модуль 2 Нуклеиновые кислоты Лекция № 5 Тема: Структура и физико-химические свойства ДНК и их значение в реализации наследственной информации План лекции: ДНК общая характеристика. Доказательства генетической роли нуклеиновых кислот. Центральная догма. Строение нуклеиновых кислот. Модель Уотсона- Крика. ДНК - как передатчик генетической информации. Оснащение: пректор, слайды История открытия нуклеиновых кислот. ДНК открыта швейцарским врачом И.Ф. Мишером в клеточных ядрах лейкоцитов, отсюда и название нуклеиновая кислота, что в переводе с лат. означает (nucleus – ядро). В 20-30-х годах XX в. определили, что ДНК – полимер (полинуклеотид),в эукариотических клетках она сосредоточена в хромосомах. В 1944 г. группа американских бактериологов из Рокфеллеровского института во главе с О. Эвери показала, что способность пневмококков вызывать болезнь передается от одних к другим при обмене ДНК (плазмидами). Таким образом, было доказано, что именно ДНК является носителем наследственной информации. Пиккард в конце 19 века открыл азотистое основание – гуанин. Позже были обнаружены тимин, аденин и урацил. В 1912 г. Леви обнаружил, что в состав нуклеиновых кислот входит углевод пентоза. В начале 20 века был полностью изучен состав всех нуклеиновых кислот, однако вопрос об их строении оставался открытым до 50-х г. 20 века. В 1936 г. советский ученый Белозерский доказал что в проростках конского каштана содержится тимонуклеиновая кислота, которая относится только к животным кислотам. Девидсон и Брамс доказали, что растительные нуклеиновые кислоты существуют и животных клетках. С 1936 г. стали различать дезоксирибонуклеиновую и рибонуклеиновую кислоты. Уотсон Джеймс Дьюи (1928) Американский биофизик, молекулярный биолог, предложил гипотезу о том, что ДНК имеет форму двойной спирали, выяснил молекулярную структуру нуклеиновых кислот и принцип передачи наследственной информации. Крик Френсис Харри Комптон (1916.) Английский физик, биофизик, специалист в области молекулярной биологии, выяснил молекулярную структуру нуклеиновых кислот; открыв основные типы РНК, предложил теорию передачи генетического кода и показал, как происходит копирование молекул ДНК при делении клеток. УМКД 042-1822.1.10/01-2015 Редакция № от 2015 г. Страница 21 из 116 Таким образом , почти полвека тому назад, в 1953 г., Д. Уотсон и Ф. Крик открыли принцип структурной (молекулярной) организации генного вещества – дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК). Структура ДНК дала ключ к механизму точного воспроизведения - редупликации - генного вещества. Так возникла новая наука - молекулярная биология. За выдающийся вклад за это открытие Фрэнсису Крику, Джеймсу Уотсону, Морису Уилкинсу была присуждена Нобелевская премия по физиологии или медицине 1962 г. Розалинд Франклин, которая получила рентгенограммы, без которых Уотсон и Крик не имели бы возможность сделать выводы о структуре ДНК, умерла в 1958 г., а Нобелевскую премию не дают посмертно. Нуклеиновые кислоты биополимеры, состоящие из остатков фосфорной кислоты, сахаров и азотистых оснований (пуринов и пиримидинов). Имеют фундаментальное биологическое значение, поскольку содержат в закодированном виде всю генетическую информацию любого живого организма, от человека до бактерий и вирусов, передаваемую от одного поколения другому. Различают два нуклеиновых кислот ДНК и РНК, которые различаются составом молекулы, локализацией в клетке и функцией в организме. ДНК присутствует в ядрах всех растительных и животных клеток, где она находится в комплексе с белками и является составной частью хромосом. У особей каждого конкретного вида содержание ядерной ДНК обычно одинаково во всех клетках, кроме гамет (яйцеклеток и сперматозоидов), где ДНК вдвое меньше. Таким образом, количество клеточной ДНК видоспецифично. ДНК найдена и вне ядра: в митохондриях («энергетических станциях» клеток) и в хлоропластах (частицах, где в растительных клетках идет фотосинтез). Чем сложнее организм, тем большую массу имеет ДНК его клеток. Количество ДНК в клетке зависит от функции и обычно составляет 1-10%. Больше всего ДНК в половых клетках (60%), меньше (0,2%) в миоцитах. Биологическое значение нуклеиновых кислот заключается в том, что они обеспечивают: 1) хранение наследственной информации в виде генетического кода, 2) передачу ее при размножении дочерним организмам,3) ее реализацию при росте и развитии организма в течение жизни в виде участия в очень важном процессе – биосинтезе белков. Модель ДНК Уотсона и Крика – была предложена в 1953 г. Данная модель была основана на следующих фактах: 1. ДНК – двойная спираль, в которой 2 полинуклеотидные цепи удерживаются водородными связями между комплементарными основаниями. 2. ДНК представляет собой полимер, состоящий из нуклеотидов, соединенных 3-5 фофорноэфирыми связями. 3. Данные химического анализа (ДНК – полинуклеотид); 4. Состав нуклеотидов ДНК подчиняется правилам Чаргаффа: в любой ДНК содержание пуриновых нуклеотидов (А,G) всегда равно содержанию УМКД 042-1822.1.10/01-2015 Редакция № от 2015 г. Страница 22 из 116 пиримидиновых нуклеотидов (Т,С); число остатков А всегда равно числу остатков Т, число остатков G равно числу остатков С. 5. Рентгенограммы волокон ДНК , впервые полученные М. Уилкинсом и Р. Франклин, указывают на то, что молекула обладает спиральной структурой и содержит более одной полинуклеотидной цепи. Именно модель Уотсона-Крика позволила объяснить, каким образом при делении клетки в каждую дочернюю клетку попадает идентичная информация, содержащаяся в материнской клетке. Это происходит в результате удвоения молекулы ДНК, то есть в результате репликации. Структура ДНК: С помощью физико-химических, электронномикроскопических и рентгеноструктурных методов показано, что большинство молекул ДНК представляют собой протяженные, гибкие, нитевидные структуры. Этими же методами установлено, что молекула ДНК имеет почти постоянный диаметр и состоит из регулярно расположенных повторяющихся звеньев, причем ее структура не зависит от нуклеотидного состава. На основании этих данных , Уотсон и Ф.Крик предложили трехмерную модель ДНК, которая объясняла результаты рентгеноструктурного анализа и характерную для ДНК парность оснований. Согласно их модели молекула ДНК напоминает винтовую лестницу. Ее боковины составлены из чередующихся остатков сахара и фосфатных групп; каждый остаток сахара в одной боковине соединен со своим партнером в другой с помощью «перекладины», состоящей из пурина (аденина или гуанина) и пиримидина (цитозина или тимина), при этом аденин соединяется только с тимином, а гуанин – с цитозином. Диаметр спирали постоянен вдоль всей ее длины равен 2,0. Гидрофильные пентотозофосфатные остовы цепей расположены на внешней стороне двойной спирали. Гидрофобные пуриновые и пиримидиновые основания обеих цепей уложены стопкой с интервалом 0,34 нм и направлены внутрь спирали, плоскости колец гетероциклических оснований перпендикулярный главной оси спирали. Длина витка спирали (полный оборот спирали), который соответствует ее периоду идентичности, составляет 3,40 нм. На один виток спирали приходится 10 нуклеотидных остатков в одной цепи. Двойная спираль стабилизируется с помощью водородных связей между пуринами одной цепи ДНК и пермидинами другой, а именно, между А и Т, G и С. Оснований образующие пары, которых они сочитаются водородными связями, получили название комплементарных пар. В АТ-паре основанием соединены двумя водородными связями: одна- между амино- и кетогруппами, другая –между двумя атомами азота пурина и пиримидина. В GC- паре имеются 3 водородные: две из них образуются между амино- и кетогруппами соответствующих оснований, а третья между атомами пурина и пиримидина. В связи с этим последовательность онований в одной цепи определяет их последовательность в другой. Комплеметарность последовательности оснований в двухполинуклеотидных цепях - ключевое свойство ДНК. Позднее было устанвленно, что модель Д.Уотсона и Ф.Крика описывает структуру одной из УМКД 042-1822.1.10/01-2015 Редакция № от Страница 23 из 116 2015 г. нескольких форм двойной спирали, названной В-формой. Это основная форма двуспиральной ДНК, в которой большая часть ее молекул существует в клетке. Параметры ДНК. 1) диаметр – 2 н; 2) расстояние между соседними парами оснований – 0,34 нм; 3) полный оборот – через 10 пар нуклеотидов; 4) длина: простейшие вирусы – несколько тысяч звеньев, бактерии – несколько миллионов звеньев, высшие организмы – миллиарды звеньев. Если все молекулы ДНК одной клетки человека вытянуть в одну линию, то получится нить длиной около 2 метров! Молекула ДНК несет на себе отрицательный заряд, причем величина заряда пропорциональна длине цепочки. Это следствие обычной электролитической диссоциации фосфатных остатков. Каждому отрицательному заряду фосфатной группы соответствует положительный заряд катиона. Обычно это ион Na+, а не H+, поэтому хотя ДНК и называют кислотой, на самом деле она всегда – соль. Альтернативные формы двойной спирали ДНК В зависимости от концентрации ионов и нуклеотидного состава молекулы, двойная спираль ДНК в живых организмах существует в разных формах. На рисунке представлены формы A, B и Z (слева направо) А В Z УМКД 042-1822.1.10/01-2015 Редакция № от 2015 г. Страница 24 из 116 А-форма, существующая только при пониженной влажности, отличается от Вформы тем, что плоскости оснований составляют с перпендикуляром к оси спирали угол 20°. Поэтому расстояние между парами оснований по вертикали уменьшается до 0,29 нм, а число пар на виток увеличивается до 11-12. Какова биологическая функция А-формы ДНК-пока неясно. Характерной особенностью В-формы ДНК является то, что сахарофосфатные остовы обеих цепей образуют правую спираль. Однако при определенных условиях участки ДНК, для которых характерно чередование пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов, принимают форму левой спирали. При этом расстояние между соседними парами оснований увеличивается до 0,77 нм, а число пар на один виток-до 12. Остов молекулы ДНК имеет зигзагообразный вид, поэтому подобная форма получила название Z-ДНК. Вопрос о том, существует ли ZДНК в естественных условиях и образуется ли она в определенных участках Вспирали под действием специфических белков, способных переводить В-форму в Z-форму, сейчас интенсивно исследуется. Разнообразие форм ДНК. ДНК может находиться в линейной или кольцевой форме. Бактериальные плазмиды, хромосомы некоторых бактерий, большинство митохондриальных и хлоропластных ДНК, геномы вирусов млекопитающих представлены единственной ковалентно замкнутой кольцевой дуплексной молекулой ДНК. Геномы некоторых мелких вирусов бактерий, растений и животных представляют собой ковалентно замкнутые кольца, состоящие только из одной цепи. Третичная структура и линейных и кольцевых форм ДНК характеризуется спирализацией и супер(сверх)сперализацией. Различают 4 уровня структурной организации ДНК: Первичная структура нуклеиновых кислот. Первичная структура ДНК- это определенная последовательность дезоксирибонуклеотидов в полинуклеотидной цепи, связанных 3’,5’-фосфодиэфирными связями. Вторичная структура ДНК. В 1953 г. Дж. Уотсоном и Ф. Криком была предложена модель пространственной структуры ДНК. Согласно этой модели, молекула ДНК имеет форму спирали, образованную двумяполинуклеотидными цепями, закрученными относительно друг друга и вокруг общей оси. Двойная спираль правозакрученная, полинуклеотидньхе цепи в ней антипараллельны т.е. если одна из них ориентирована в направлении 3'→5', то вторая - в направлении 5'→3'. Поэтому на каждом из концов молекулы ДНК расположены 5'-конец одной цепи и УМКД 042-1822.1.10/01-2015 3'-конец друго Редакция № от 2015 г. Страница 25 из 116 й цепи. Третичная структура ДНК – Каждая молекула ДНК упакована в отдельную хромосому. В диплоидных клетках человека содержится 46 хромосом. Общая длина ДНК всех хромосом клетки составляет 1,74 м, но она упакована в ядре, диаметр которого в миллионы раз меньше. Чтобы расположить ДНК в ядре клетки, должна быть сформирована очень компактная структура. Компактизация и суперспирализация ДНК осуществляются с помощью разнообразных белков, взаимодействующих с определёнными последовательностями в структуре ДНК. Все связывающиеся с ДНК эукариотов белки можно разделить на 2 группы: гисгоновые и негистоновые белки. Комплекс белков с ядерной ДНК клеток называют хроматином. Различают 5 видов гистонов: Н1, Н2А, Н2В, Н3, Н4. Гистоны Н2А и Н2В богаты лизином, а гистоны Н3 и Н4 богаты аргинином. 4 пары молекул этих белков (2Н2А, 2Н2В, 2Н3, 2Н4) образуют шаровидные утолщения — октамеры, на которые наматывается участок ДНК (140 пар оснований образуют 2 витка суперспирали). Образуется нуклеосома, это неактивная часть молекулы ДНК. Между нуклеосомами располагаются участки ДНК, неспирализованные, но они связаны с гистоном Н1. Это активная, т.е работающая часть ДНК. В процентном соотношении больше неактивной части (97%), а активной части ДНК всего 3%. В сборке нуклеосомы участвует особый ядерный белок – нуклеоплазмин. Это кислый (анионный) пентамерный белок, не связывающийся ни с ДНК, ни с хроматином, но способный обратимо соединяться с гистоновым октамером, блокируя способность гистонов к неспецифическому взаимодействию с ДНК. После завершения сборки нуклеосом нуклеоплазмин высвобождается из гистонового комплекса. Четвертичная структура – это укладка нуклеосом в хроматин, так что молекула ДНК длиной в несколько см складывается до 5 нм. Хроматин в химическом плане состоит на 2/3 из простых белков (гистонов – 55%, и негистоновых белков – альбуминов, глобулинов и ферментов – 45%) и 1/3 из ДНК. Хроматин содержит также 10% РНК. Ферменты хроматина участвуют в репликации (например, ДНК-топоизомеразы) и транскрипции (РНКполимеразы). В фазе покоя хроматин равномерно распределен по всему объему УМКД 042-1822.1.10/01-2015 Редакция № от 2015 г. Страница 26 из 116 ядра и не обнаруживается обычными микроскопическими методами. В фазе деления клетки хроматин образует компактные частицы – хромосомы, которые видны в обычный микроскоп. Хроматин, содержащий активные гены, называется эухроматином (транскрипционно-активным). ДНК в активном хроматине содержит длинные участки (около 100000 пар оснований), чувствительные к действию нуклеаз, например, к ДНК-азе I. Внутри большой области активного хроматина обнаружены короткие участки (100-300 нуклеотидов) с еще более высокой чувствительностью к ДНК-азе I. Эти участки называются гиперчувствительными сайтами, или энхансерными элементами. Такие сайты обеспечивают доступность кодирующей цепи для белков, участвующих в процессе транскрипции. Транскрипционно-неактивный хроматин (гетерохроматин) плотно упакован. Существуют 2 типа гетерохроматина: конститутивный и факультативный. Конститутивный гетерохроматин всегда конденсирован и, следовательно, неактивен. Конститутивный гетерохроматин найден в областях, близких к цетромерам и к концевым участкам (теломерам) хромосом. Факультативный гетерохроматин временами конденсирован, а временами разуплотнен, активно транскрибируется, т.е. сходен с эухроматином. Функциональными особенностями молекулы ДНК являются: 1. Стабильность. Она обеспечивается водородными, гликозидными и фосфодиэфирными связями, а также механизмом репарации спонтанных и индуцированных повреждений; 2). Способность к репликации. Благодаря этому механизму в соматических клетках сохраняется диплоидное число хромосом. Схематично псе перечисленные особенности ДНК как генетической молекулы изображены на рисунке. 3). Наличие генетического кода. Последовательность оснований в ДНК с помощью процессов транскрипции и трансляции преобразуется в последовательность аминокислот в полипептидной цепи; 4) . Способность к генетической рекомбинации. Благодаря этому механизму образуются новые сочетания сцепленных генов. Общие свойства НК. Молекулы нуклеиновых кислот содержат множество отрицательно заряженных фосфатных групп и образуют комплексы с ионами металлов; их калиевая и натриевая соли хорошо растворимы в воде. Концентрированные растворы нуклеиновых кислот очень вязкие и слегка опалесцируют, а в твердом виде эти вещества белые. Нуклеиновые кислоты сильно поглощают ультрафиолетовый свет, и это свойство лежит в основе определения их концентрации. С этим же свойством связан и мутагенный эффект ультрафиолетового света. Длинные молекулы ДНК хрупки и легко ломаются, например при продавливании раствора через шприц. Поэтому работа с высокомолекулярными ДНК требует особой осторожности. Вопросы для самоконтроля: 1. Что из себя представляет молекула ДНК? 2. В чем заключается макромолекулярная структура ДНК. Литература: 7.1-7.1.7 (основная),7.2.1- 7.2.10 (дополнительная) УМКД 042-1822.1.10/01-2015 Редакция № от 2015 г. Страница 27 из 116 Модуль 2 Нуклеиновые кислоты Лекция № 6 Тема: Нуклеиновые кислоты. Структура и функции РНК и их значение в реализации наследственной информации План лекции: РНК общая характеристика. Структура и свойства основных классов РНК- информационных, рибосомальных и транспортных, функции РНК и их значение в реализации наследственной информации, физико-химические свойства. Щелочной гидролиз РНК. Доказательства генетической роли нуклеиновых кислот. Центральная догма. Оснащение: проектор, слайды Рибонуклеиновые кислоты (РНК) — нуклеиновые кислоты, полимеры нуклеотидов, в состав которых входят остаток ортофосфорной кислоты, рибоза (в отличие от ДНК, содержащей дезоксирибозу) и азотистые основания — аденин, цитозин, гуанин и урацил (в отличие от ДНК, содержащей вместо урацила тимин). Эти молекулы содержатся в клетках всех живых организмов, а также в некоторых вирусах. Содержание РНК в любых клетках в 5-10 раз выше содержания ДНК. Основная роль РНК состоит в трансляции генетической информации с образованием белков, а также в осуществлении некоторых специализированных эндонуклеазных функций, регулирующих различные этапы экспрессии генов. Структура РНК. Первичная структура РНК - порядок чередования рибонуклеозидмонофосфатов (НМФ) в полинуклеотидной цепи. В РНК, как и в ДНК, нуклеотиды связаны между собой 3',5'-фосфодиэфирными связями. Концы полинуклеотидных цепей РНК неодинаковы. На одном конце находится фосфорилированная ОН-группа 5'-углеродного атома, на другом конце - ОНгруппа 3'-углеродного атома рибозы, поэтому концы называют 5'- и 3'-концами цепи РНК. Гидроксильная группа у 2'-углеродного атома рибозы делает молекулу РНК нестабильной. Так, в слабощелочной среде молекулы РНК гидролизуются даже при нормальной температуре, тогда как структура цепи ДНК не изменяется. Вторичная структура РНК. Молекула рибонуклеиновой кислоты построена из одной полинуклеотидной цепи. Отдельные участки цепи РНК образуют спирализованные петли - "шпильки", за счёт водородных связей между комплементарными азотистыми основаниями A-U и G-C. Участки цепи РНК в таких спиральных структурах антипараллельны, но не всегда полностью комплементарны, в них встречаются неспаренные нуклеотидные остатки или УМКД 042-1822.1.10/01-2015 Редакция № от 2015 г. Страница 28 из 116 даже одноцепочечные петли, не вписывающиеся в двойную спираль. Наличие спирализованных участков характерно для всех типов РНК. Третичная структура РНК. Одноцепочечные РНК характеризуются компактной и упорядоченной третичной структурой, возникающей путём взаимодействия спирализованных элементов вторичной структуры. Так, возможно образование дополнительных водородных связей между нуклеотидными остатками, достаточно удалёнными друг от друга, или связей между ОН-группами остатков рибозы и основаниями. Третичная структура РНК стабилизирована ионами двухвалентных металлов, например ионами Mg2+, связывающимися не только с фосфатными группами, но и с основаниями. Основные типы РНК. В цитоплазме клеток присутствуют 3 типа рибонуклеиновых кислот - транспортные РНК (тРНК), матричные РНК (мРНК) и рибосомальные РНК (рРНК). Они различаются по первичной структуре, молекулярной массе, конформации, продолжительности жизни и, самое главное, по функциональной активности. Во всех клетках присутствуют следующие виды РНК: рибосомная РНК, транспортная РНК и информационная, или матричная, РНК. Большинство клеток содержат также много других малых цитоплазматических РНК, а в клетках эукариот присутствует еще и множество малых ядерных РНК. Около 80% массы клеточных РНК составляют три или четыре вида рРНК, а около 15% - почти 100 видов тРНК. На долю нескольких тысяч различных матричных РНК приходится менее 5% клеточной РНК, а на долю малых ядерной и цитоплазматической РНК, число видов которых пока неизвестно, - менее 2% от общего количества. 1)транспортные РНК (т-РНК) - это самые маленькие по размерам РНК. Главной функцией транспортной (тРНК) является акцептирование аминокислот и перенос их в белоксинтезирующий аппарат клетки. Они выступают в роли затравки (праймера) в процессе обратной транскрипции. Последовательность тРНК включают 70-90 нуклеотидов и около 10% минорных компонентов. Она образует вторичную структуру, известную под названием «клеверный лист». Это структура состоит из 4 или 5 двуцепочечнных спиральных стеблей и трех петель. Каждый стебель содержит 4-7 уотсон-криковских пар,образующих двойные спирали. РНК, доставляющие аминокислоты к рибосоме в процессе синтеза белка, называются транспортными. Эти небольшие молекулы, форма которых напоминает лист клевера, несут на своей вершине последовательность из трех нуклеотидов – антикодоны. С их помощью т-РНК будут присоединяться к кодонам и-РНК по принципу комплементарности. Противоположный конец молекулы т-РНК присоединяет аминокислоту, причем только определенный вид, который соответствует его антикодону . 2) матричные РНК (м РНК) или информационные РНК (и-РНК) - они в 10 раз больше тРНК. Их функция состоит в переносе информации о структуре белка от ДНК к месту синтеза белка. УМКД 042-1822.1.10/01-2015 Редакция № от 2015 г. Страница 29 из 116 Матричные РНК (м РНК) считают РНК, которая в последовательности нуклеоидных остатков в молекуле несет информацию, обеспечивающую синтез специфического белка непосредственно на ней самой, а также информацию о времени, количестве, месте и условиях синтеза этого белка. Строение мРНК эукариот специфично, в их составе есть информативные, т.е. работающие как матрицы в процессе биосинтеза белка, зоны и неинформативные участки. Рассмотренные выше структуры и функции ДНК и РНК способствуют о значительно более разнообразных функциональных возможностях РНК по сравнению с ДНК, существование которой связано исключительно с необходимостью сохранения и передачи из поколения в поколение наследственных признаков. Современные знания о структурном и функционльном разнообразии РНК показывает, что РНК может служить матрицей не только для воспроизведения своей собственной структуры в РНКсодержащих вирусных геномах, но и для биосинтеза ДНК у высших организмов. Уже это открытие формально поставило РНК в центр основного постулата молекулярной генетики, так как , показало, что поток генетической информации распостраняется не в одном, а в в двух направлениях: не только к белку, но и к ДНК. РНК учатсвует в репликации ДНК, выступая в роли затравок, необходимых для инициации синтеза комплемнтарных цепей ДНК. РНК выполняет роль матричной молекулы в процессах обратной транскрипции (биосинтезе ДНК на матрице РНК). В биосинтезе белка (трансляции) РНК формирует основу субчастиц при сборке полной рибосомы. Рибосомные РНК (р-РНК) - синтезируются в основном в ядрышке и составляют примерно 85-90% всех РНК клетки. В комплексе с белками они входят в состав рибосом и осуществляют синтез пептидных связей между аминокислотными звеньями при биосинтезе белка. Образно говоря, рибосома – это молекулярная вычислительная машина, переводящая тексты с нуклеотидного языка ДНК и РНК на аминокислотный язык белков. Распространение и локализация нуклеиновых кислот. Доля ДНК в целой клетке в значительной мере определяется ее видовыми и функциональными особенностями. Так, например, в некоторых одноклеточных паразитических организмах и половых клетках, находящихся в такой фазе развития, когда обмен веществ крайне редуцирован и когда весь смысл фазы состоит в сохранении вещества наследственности и в наиболее компактной и устойчивой форме, доля ДНК (или генетической РНК) может быть очень большой. У Т четных колифагов она достигает 50%, у вируса ящура – 40%, в сперматозоидах позвоночных – 60% (на сухой вес клеток). Напротив, в клетках с очень развитой и интенсивно функционирующей цитоплазмой она может быть очень низкой. В мышцах, например, она близка к 0,2%. Чаще всего отмечается содержание ДНК порядка 1 – 7%. РНК в живом существе может не быть вообще. У таких паразитических организмов, как ДНК- содержащие вирусы, нет РНК. Нет негенетической РНК и в тех вирусах, у которых хромосомы построены из РНК. Истинные вирусы, таким образом, содержат только генетические нуклеиновые кислоты. Если же в УМКД 042-1822.1.10/01-2015 Редакция № от 2015 г. Страница 30 из 116 клетках есть негенетическая РНК, то ее содержание варьирует еще шире, чем ДНК, причем оно в большей мере зависит от условий существования и функционального состояния организма. Физико-химические свойства весьма гармонично увязываются с особенностями их состава и их структуры. Известна высокая плотность нуклеиновых кислот. Она близка к 1,7 и является естественным следствием значительного содержания фосфора. Денатурированная ДНК, в которой интимная связь между цепями нарушено, обладает даже несколько большой плотностью, чем нативная, 1,71-1,75, причем опять - таки плотность находится в линейной зависимости от молярной доли Г+Ц. Cедиментационные - характеристики нуклеиновых кислот отражают чрезвычайно высокий молекулярный вес многих из них и некоторые особенности вторичной и третичной структур. Знание зависимости между коэффицентом седиментации и молекулярным весом разных типов нуклеиновых кислот необходимо либо для определения последнего, либо для комплексной оценки конформации. Вязкость - растворов нуклеиновых кислот является особенно ценным для характиристики двуцепочных ДНК. Упругие нитевидные молекулы большой длины определяют, очень ее высокую вязкость а также такую ее зависимость от молекулярного веса, которая является весьма удобной для объективных оценок последнего. Оптическая плотность беспиральной ДНК примерно на 40% меньше чем соответствующего числа не свазанных друг с другом нуклеотидов. Явление это называемое гипохромным эффектом, обусловлено строго упорядочным параллельным расположением плоскостей гетероциклических колец оснований в беспиральной ДНК. Оптические свойства отражают также упругость, гибкость молекул нуклеиновых кислот. Вопросы для самоконтроля: 1 В чем значение РНК ? 2. Перечислите типы РНК 3. Дайте характеристику седиметационным свойствам нуклеиновых кислот. 4. Что подразумевается под вязкостью нуклеиновых кислот. 5. Чему равна плотность нуклеиновых кислот? Литература: 7.1-7.1.7 (основная),7.2.1- 7.2.10 (дополнительная) Модуль 3 Биосинтез белков Лекция № 7 Тема: Генетический код. Основные свойства генетического кода. Структура кодонов. Аппарат трансляции План лекции: Трансляция, сворачивание белков, модификация. Подготовка аминокислот к трансляции, рекогнации. Регуляция экспрессии генов. Генетический код Оснащение: проектор, слайды УМКД 042-1822.1.10/01-2015 Редакция № от 2015 г. Страница 31 из 116 Понимание механизма синтеза белка—результат длительной и сложнейшей работы многих ученых. Это блестящее достижение сейчас является одним из основных положений биологической науки. Синтез белка является основой жизнедеятельности клетки. Для осуществления этого процесса в клетках всех без исключения организмов имеются специальные органеллы — рибосомы. Рибосомы представляют собой рибонуклеопротеидные комплексы, построенные из 2 субъединиц: большой и малой. Функция рибосом заключается в узнавании трёхбуквенных (трехнуклеотидных) кодонов мРНК, сопоставлении им соответствующих антикодонов тРНК, несущих аминокислоты, и присоединении этих аминокислот к растущей белковой цепи. Двигаясь вдоль молекулы мРНК, рибосома синтезирует белок в соответствии с информацией, заложенной в молекуле мРНК. Таким образом биосинтез белка — сложный многостадийный процесс синтеза полипептидной цепи из аминокислот, происходящий на рибосомах с участием молекул мРНК и тРНК. Процесс биосинтеза белка требует значительных затрат энергии. Для биосинтеза белка необходимы следующие условия: 1) нуклеиновые кислоты, 2) много ферментов, 3) много энергии (АТФ), 4) рибосомы, 5) аминокислоты, 6) ионы магния. К этапам биосинтеза белка относятся: 1) транскрипция, 2) трансляция, 3) инициация, 4) элонгация, 5) терминация, 6) постранциляционная модификация Первый этап биосинтеза белка это транскрипция. Транскрипция – это переписывание информации с последовательности нуклеотидов ДНК в последовательность нуклеотидов РНК. У эукариот транскрипция происходит в ядре, а также в митохондриях и пластидах. Информационная РНК (иРНК) становится матрицей для синтеза белка. Транспортная РНК доставляет в рибосому строительный материал для синтеза белка — аминокислоты. После того, как иРНК и аминокислоты попали в рибосому, тРНК переводит генетический код аминокислоты, считывая кодон РНК (т.к. имеет антикодон). А специфичное присоединение аминокислот к соответствующей тРНК обеспечивает особый фермент — аминоацил-тРНК-синтетаза. Энергию для синтеза обеспечивает гидролиз молекул ГТФ. К одной молекуле РНК часто присоединяется множество рибосом, образуя "бусы" из рибосом — полирибосому, или полисому. Рибосомы одна за другой "ползут" по нити иРНК. Когда рибосома достигает стоп-кодона, она распадается на половинки субъединицы. Для того чтобы понять, каким образом состав и последовательность расположения нуклеотидов в гене могут быть "переписаны" на РНК, вспомним принцип комплементарности, на основании которого построена двухспиральная молекула ДНК. Нуклеотиды одной цепи обусловливают характер противолежащих нуклеотидов другой цепи. Если на одной цепи находится А, то на том же уровне другой цепи стоит Т, а против Г всегда находится Ц. Других комбинаций не бывает. Принцип комплементарности действует и при синтезе информационной РНК. УМКД 042-1822.1.10/01-2015 Редакция № от 2015 г. Страница 32 из 116 Этапы транскрипции. На всех этапах трнскрипции необходимо участие специальных белковых факторов: А, В- факторов инициации, Е, H, F- факторов элонгации, р-фактор- фактор терминации. Инициация. ДНК- зависимая РНК- полимераза связывается с ДНК и «ищет» промотор, перемещаясь от 3'-конца кодирующей цепи ДНК. РНК- полимераза находит промотор связывается с ним с помощью G--фактора. При этом цепь ДНК не раскручена. Цепь ДНК раскручивается с помощью РНК- полимеразы от «10» до «1» участка, образуя открытый промоторный комплекс, который затем с помощью ионов магния еще более расширяется. Первый нуклеозидтрифосфат который «ставит» РНК- полимераза всегда пуриновый: АТФ или ГТФ. Таким образом, синтез РНК всегда начинается с пуринового нуклеозидтрифосфата. Элонгация. РНК-полимераза движется по матрице антипраллельно в направлении 3’ 5’. Следующий НТФ выбирается РНК-полимеразой комплиментарно нуклеотиду матричной цепи ДНК и соединяется 3’ – 5’ – связью с предыдущим, «выщепляя» Ф~Ф, который далее гидролизуется, что делает реакцию необратимой. После синтеза первых 10 нуклеотидов G-фактор отщепляется и РНК-полимераза продолжает «ползти» по цепи ДНК, выбирать комплиментарный НТФ и присоединять их к растущей цепи РНК, одновременно раскручивая ДНК впереди себя и скручивая матрицу позади себя. По мере продвижения кор-фермента происходит расплетание ДНК – как бы движется «пузырь транскрипции», содержащий около 18 п.о. в расплетенном виде. Как только одна п.о. становится раскрученной перед 3’концом растущей цепи РНК, одна п.о. скручивается за «хвостом» РНКполимеразы. В результате элонгации образуется гибрид ДНК-РНК. Регуляция транскрипции Транскрипция генов может подавляться или активироваться, следовательно, синтез белков может репрессироваться или индуцироваться. Оперон - это участок ДНК, кодирующий строение, как правило, функционально связанных белков и содержащий регуляторную зону, контролирующую синтез этих белков. Второй этап биосинтеза– трансляция перевод последовательности нуклеотидов в последовательность аминокислот белка. Трансляция происходит с участием рибосом и в ее осуществлении принимают участие три класса РНК (мРНК, рРНК, тРНК), а также группа особых белковых факторов трансляции. Процесс трансляции разделяют на: 1) инициацию — узнавание рибосомой стартового кодона и начало синтеза. элонгацию — собственно синтез белка. терминацию — узнавание терминирующего кодона (стоп-кодона) и отделение продукта. Процесс трансляции разделяют на: 1) инициацию — узнавание стартового кодона (AUG), сопровождается присоединением тРНК аминоацилированной метионином (М) и сборкой рибосомы из большой и малой субъединиц; УМКД 042-1822.1.10/01-2015 Редакция № от 2015 г. Страница 33 из 116 2) элонгацию — собственно синтез белка; 3) терминация— узнавание терминирующего кодона (стоп-кодона) и отделение продукта. В цитоплазме аминокислоты под строгим контролем ферментов аминоацил-тРНК-синтетаз соединяются с тРНК, образуя аминоацил-тРНК. Это очень видоспецифичные реакции: определенный фермент способен узнавать и связывать с соответствующей тРНК только свою аминокислоту. Далее тРНК движется к и-РНК и связывается комплементарно своим антикодоном с кодоном и-РНК. Затем второй кодон соединяется с комплексом второй аминоацил-тРНК, содержащей свой специфический антикодон. Антикодон– триплет нуклеотидов на верхушке тРНК. Кодон– триплет нуклеотидов на и-РНК. После присоединения к мРНК двух тРНК под действием фермента происходит образование пептидной связи между аминокислотами; первая аминокислота перемещается на вторую тРНК, а освободившаяся первая тРНК уходит. После этого рибосома передвигается по нити для того, чтобы поставить на рабочее место следующий кодон. Такое последовательное считывание рибосомой заключенного в и-РНК «текста» продолжается до тех пор, пока процесс не доходит до одного из стопкодонов (терминальных кодонов). Такими триплетами являются триплеты УАА, УАГ,УГА. Одна молекула мРНК может заключать в себе инструкции для синтеза нескольких полипептидных нитей. Кроме того, большинство молекул и-РНК транслируется в белок много раз, так как к одной молекуле и-РНК прикрепляется обычно много рибосом. Элонгация. В процессе наращивания полипептидной цепи принимают участие два белковых фактора элонгации. Первый (EF1a у эукариот, EF-Tu — у прокариот) переносит аминоацилированную (заряженную аминокислотой) тРНК в А (аминоацил)-сайт рибосомы. Рибосома катализирует образование пептидной связи, происходит перенос растущей цепи пептида с Р-сайтовой тРНК на находящуюся в А-сайте, пептид удлиняется на один аминокислотный остаток. Затем второй белок (EF2 у эукариот, EF-G — у прокариот) катализирует так называемую транслокацию. Транслокация — перемещение рибосомы по мРНК на один триплет, в результате которого пептидил-тРНК оказывается вновь в Р-сайте, а «пустая» тРНК из P-сайта переходит в Е-сайт (от слова exit). Цикл элонгации завершается, когда новая тРНК с нужным антикодоном приходит в A-сайт. Терминация — окончание синтеза белка, осуществляется, когда в А-сайте рибосомы оказывается один из стопкодонов — UAG, UAA, UGA. Из-за отсутствия тРНК , соответствующих этим кодонам, пептидил-тРНК остаётся связанной с Р-сайтом рибосомы. Здесь в действие вступают специфические белки RF1 или RF2, которые катализируют отсоединение полипептидной цепи от мРНК, а также RF3, который вызывает диссоциацию мРНК из рибосомы. RF1 узнаёт в А-участке UAA или UAG; RF2 — UAA или UGA. С UAA терминация эффективнее, чем с другими стопкодонами. УМКД 042-1822.1.10/01-2015 Редакция № от 2015 г. Страница 34 из 116 Генетический код и его свойства. Ген— это участок молекулы ДНК, определяющий порядок аминокислот в молекуле белка. Следовательно, от порядка нуклеотидов в гене зависит порядок аминокислот в полипептиде, т.е. его первичная структура, от которой в свою очередь зависят все другие структуры, свойства и функции белковой молекулы. Система записи генетической информации в ДНК (и - РНК) в виде определенной последовательности нуклеотидов называется генетическим кодом. Генетический код ДНК состоит из триплетов, то есть из тройных комбинаций нуклеотидов. При транскрипции генетический код «переписывается» в последовательность нуклеотидов иРНК. Тройки нуклеотидов иРНК, кодирующие аминокислоты, называются кодонами. Всего генетический код включает 64 кодона, из них 61 кодирующий и 3 некодирующих (кодоны-терминаторы, свидетельствующие об окончании процесса трансляции). Кодоны-терминаторы в и - РНК: УАА, УАГ, УГА, в ДНК: АТТ, АТЦ, АЦТ. Начало процесса трансляции определяет кодон-инициатор (АУГ, в ДНК — ТАЦ), кодирующий аминокислоту метионин. Этот кодон первым входит в рибосому. Впоследствии метионин, если он не предусмотрен в качестве первой аминокислоты данного белка, отщепляется. Генетический код обладает характерными свойствами. 1. Универсальность — код одинаков для всех организмов. Один и тот же триплет (кодон) в любом организме кодирует одну и ту же аминокислоту. 2. Специфичность — каждый кодон шифрует только одну аминокислоту. 3. Вырожденность — большинство аминокислот могут кодироваться несколькими кодонами. Исключение составляют 2 аминокислоты — метионин и триптофан, имеющие лишь по одному варианту кодона. 4. Между генами имеются «знаки препинания» — три специальных триплета (УАА, УАГ, УГА), каждый из которых обозначает прекращение синтеза полипептидной цепи. 5. Внутри гена «знаков препинания» нет. Регуляция синтеза белка: Общую теорию регуляции синтеза белка разработали Ф. Жакоб и Ж. Моно. Сущность этой теории сводится к «выключению» или «включению» генов как функционирующих единиц, к возможности или невозможности проявления их способности передавать закодированную в структурных генах ДНК генетическую информацию для синтеза специфических белков. Эта теория, доказанная в опытах на бактериях, получила широкое признание, хотя в эукариотических клетках механизм регуляции синтеза белка вероятно более сложный. У бактерий доказана индукция ферментов (т. е. синтез ферментов de novo) при добавлении в питательную среду субстратов этих ферментов. Добавление конечных продуктов реакции, образование которых катализируется этими же ферментами, напротив, вызывает уменьшение количества синтезируемых ферментов. Это последнее явление получило название репрессии синтеза ферментов. Оба явления — индукция и репрессия — взаимосвязаны. Согласно УМКД 042-1822.1.10/01-2015 Редакция № от 2015 г. Страница 35 из 116 теории Жакоба и Моно в биосинтезе белка у бактерий участвуют по крайней мере три типа генов: структурные гены, ген-регулятор и ген-оператор. Структурные гены определяют первичную структуру синтезируемого белка. Именно эти гены в цепи ДНК являются основой для биосинтеза мРНК, которая затем поступает в рибосому и, как было указано выше, служит матрицей для биосинтеза белка. Синтез мРНК на структурных генах молекулы ДНК непосредственно контролируется определенным участком, называемым геном-оператором. Он служит как бы пусковым механизмом для функционирования структурных генов. Ген-оператор локализован на крайнем отрезке структурного гена или структурных генов, регулируемых им. «Считывание» генетического кода, т. е. формирование мРНК, начинается спромотора— участка ДНК, являющегося точкой инициации для синтеза мРНК, и далее распространяется последовательно вдоль оператора и структурных генов. Координированный одним оператором одиночный ген или группа структурных генов образует оперон. В свою очередь деятельность оперона находится под контролирующим влиянием другого участка цепи ДНК, получившего название гена-регулятора. Поскольку структурные гены и ген-регулятор находятся в разных участках цепи ДНК, связь между ними, как предполагают Ф. Жакоб и Ж. Моно, осуществляется при помощи вещества-посредника, оказавшегося белком и названного репрессором. Образование репрессора происходит в рибосомах ядра на матрице специфической мРНК, синтезированной на гене-регуляторе. Репрессор имеет сродство к гену-оператору и обратимо соединяется с ним в комплекс. Образование такого комплекса приводит к блокированию синтеза мРНК и, следовательно, синтеза белка, т.е. функция гена-регулятора состоит, в том, чтобы через белок-репрессор прекращать деятельность структурных генов, синтезирующих мРНК. Репрессор, кроме того, обладает способностью строго специфически связываться с определенными низкомолекулярными веществами, называемыми индукторами, или эффекторами. Когда такой индуктор соединяется с репрессором, последний теряет способность связываться с геном-оператором, который таким образом выходит из-под контроля гена-регулятора, и начинается синтез мРНК. Это типичный пример отрицательной формы контроля, когда индуктор, соединяясь с белкомрепрессором, вызывает изменения его третичной структуры настолько, что репрессор теряет способность связываться с геном-оператором. Этот процесс аналогичен взаимоотношениям аллостерического центра фермента с эффектором, под влиянием которого изменяется третичная структура фермента и он теряет способность связываться со своим субстратом. Механизм описанной регуляции синтеза белка и взаимоотношения репрессора со структурными генами были доказаны в опытах на Е. coli, на примере синтеза Ргалактозидазы (лактазы) — фермента, гидролизующего молочый сахар на глюкозу и галактозу. Дикий штамм Е. coli, обычно растущий на глюкозе, не может расти, если вместо глюкозы в питательную среду добавить лактозу (новый источник энергии и углерода) до тех пор, пока не будут синтезированы УМКД 042-1822.1.10/01-2015 Редакция № от 2015 г. Страница 36 из 116 соответствующие ферменты (адаптивный синтез). При поступлении в клетку лактозы (индуктора) молекулы ее связываются с белком-репрессором и блокируют связь между репрессором и геном-оператором. При этом геноператор и структурные гены начинают снова функционировать и синтезировать необходимую мРНК, которая «дает команду» рибосомам синтезировать р-галактозидазу. Одновременно ген-регулятор продолжает вырабатывать репрессор, но он блокируется новыми молекулами лактозы, поэтому синтез фермента продолжается. Как только молекулы лактозы будут полностью расщеплены, репрессор освобождается и, поступив в ДНК, связывает ген-оператор и блокирует синтез мРНК, а следовательно, синтез Ргалактозидазы в рибосомах. Таким образом, биосинтез мРНК, контролирующий синтез белка в рибосомах, зависит от функционального состояния репрессора. Если репрессор, который представляет собой белок, построенный из 4 субъединиц с общей молекулярной массой около 150000 Да, находится в активном состоянии, не связан с индуктором, то он блокирует геноператор и синтез мРНК не происходит. При поступлении метаболитаиндуктора в клетку его молекулы связывают репрессор, превращая его в неактивную форму (или, возможно, снижая его сродство к гену-оператору). Структурные гены выходят из-под запрещающего контроля и начинают синтезировать нужную мРНК. Выше было указано, что концентрация ряда ферментов в клетках резко снижается при увеличении концентрации отдаленных конечных продуктов, образующихся в цепи последовательных ферментативных реакций. Такой эффект, получивший название репрессии ферментов, часто наблюдается при реакциях биосинтеза. В этих случаях оказалось, что молекулы репрессора, также образующиеся в рибосомах ядра по «команде» гена-регулятора, являются неактивными и сами по себе не обладают способностью подавлять деятельность гена-оператора и, следовательно, всего оперона, но приобретают такую способность после образования комплекса с конечным или одним из конечных продуктов биосинтетического процесса. Конечный продукт выступает, таким образом, в качестве корепрессора. Имеются данные, показывающие, что в качестве корепрессоров в синтезе ферментов обмена аминокислот выступает не свободная аминокислота как конечный продукт биосинтетической реакции, а комплекс ее с тРНК — аатРНК. В регуляции экспрессии структурных генов специфическое участие принимает особый белок, получивший название катаболитный генактивирующий белок (от англ, catabolite gene activation protein, сокращенно обозначаемый САР); этот белок взаимодействует с цАМФ, образуя комплекс, способствующий прикреплению РНК-полимеразы к промоторному участку генома. В присутствии комплекса САР-цАМФ фермент может начать транскрипцию оперона, включая структурные гены, т. е. в клетках имеется еще один, дополнительный САР-цАМФ регулятор, действующий скорее всего в качестве положительного регулятора, поскольку его присутствие необходимо для начала экспрессии гена. Таким образом, концепции Жакоба и Моно о УМКД 042-1822.1.10/01-2015 Редакция № от 2015 г. Страница 37 из 116 механизме проявления активности генов признана одним из блестящих достижений молекулярной биологии. Она явилась логическим развитием многочисленных исследований, проведенных генетиками и биохимиками в предшествующие десятилетия. В заключение следует вкратце рассмотреть вопрос о регуляции процессов дифференцировки клеток высших организмов. ДНК, присутствующая во всех соматических клетках, вероятнее всего, имеет одинаковую первичную структуру у данного организма и соответственно располагает информацией для синтеза любых или всех белков тела. Тем не менее клетки печени, например, синтезируют сывороточные белки, а клетки молочной железы — белки молока. Нет сомнения в том, что в дифференцированных клетках, очевидно, существует тонкий механизм контроля деятельности ДНК в разных тканях, обеспечивающий синтез многообразия белков. Механизмы, лежащие в основе этой регуляции, пока неизвестны. Для объяснения их имеется ряд гипотез. Предполагается, что контроль осуществляется на уровне транскрипции по аналогии с индукцией ферментов у бактерий и что в этом случае в клетках животных должны функционировать аналогичные репрессоры.. Поскольку с молекулой ДНК у зукариот связаны гистоны, считается, что именно они выполняют роль репрессоров. Однако прямые доказательства их роли в качестве репрессоров отсутствуют, как и точные данные о существовании и природе каких-либо репрессоров в клетках эукариот. Высказано предположение, что в ядре синтезируется гигантская молекула мРНК, содержащая информацию для синтеза широкого разнообразия белков, но в цитоплазму, как было показано выше, попадает только небольшая часть зрелой мРНК, а основная часть распадается. Неясны, однако, биологический смысл и назначение этого механизма избирательного распада и, соответственно, траты огромной части молекулы мРНК. Существует еще одно предположение, что на ДНК клетки синтезируются все возможные мРНК, которые поступают в цитоплазму, и процесс трансляции регулируется путем специфического и избирательного взаимодействия с определенными молекулами мРНК. Вопросы для самоконтроля: 1.Как протекает биосинтез белка? 2.Что такое генетический код? 3. Каким свойствам обладает генетический код? Литература: 7.1-7.1.7 (основная),7.2.1- 7.2.10 (дополнительная) Модуль 3 Биосинтез белков Лекция № 8 Тема: Репликация ДНК, молекулярные механизмы репликации План лекции: Молекулярные механизмы репликации. Роль ДНК в наследственности. Воспроизведение генетической информации. УМКД 042-1822.1.10/01-2015 Редакция № от 2015 г. Страница 38 из 116 Принцип комплементарности и его биологическая роль. Основные принципы репликации. Оснащение: проектор, слайды Репликация ДНК — это процесс синтеза дочерней молекулы дезоксирибонуклеиновой кислоты, который происходит в процессе деления клетки на матрице родительской молекулы ДНК. При этом генетический материал, зашифрованный в ДНК, удваивается и делится между дочерними клетками. Репликацию ДНК осуществляет фермент ДНК-полимераза. Репликация проходит в 3 этапа: 1) фермент разрывает водородные связи в ДНК и она начинает разматываться; 2) сразу после этого к размотанным частям ДНК начинают подходить и соединяться (по принципу комплементароности) нуклеотиды, образуя вторую цепочку спирали; 3) две дочерние днк закручиваются в спираль. В результате репликации от одной материнской ДНК получаются две совершенно одинаковые дочерние (иначе если по какимто причинам произойдёт нарушение порядка, то получится мутация ДНК). Механизм репликации и репарации по Уотсону и Крику . В основе механизма репликация лежит ферментативный синтез дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) или рибонуклеиновых кислот (РНК), осуществляемый по матричному принципу. Предложенная в 1953 Дж. Уотсоном и Ф. Криком модель строения ДНК — так называемая двойная спираль — с одной стороны, объяснила, каким образом записана генетическая информация в молекуле ДНК, с другой — позволила понять и экспериментально изучать химические механизмы удвоения генетического материала. Строгая специфичность спаривания азотистых оснований в молекуле ДНК обусловливает комплементарность последовательностей оснований в двух цепях и обеспечивает высокую точность Репликация Пара гуанин — цитозин стабилизируется тремя водородными связями, пара аденин — тимин — двумя, что резко снижает вероятность неправильного спаривания оснований. Согласно Уотсону и Крику, процесс Репликация ДНК предусматривает: 1) разрыв водородных связей и расплетение нитей двойной спирали; 2) синтез на одиночных нитях комплементарных цепей. В результате из одной двухцепочечной ДНК возникают две подобные молекулы, причём в каждой из дочерних молекул одна полинуклеотидная цепь родительская, а другая — синтезированная заново (полуконсервативный механизм Репликация). У высших организмов — эукариотов, клетки которых содержат сформированное ядро, основную генетическую функцию несут сложно организованные структуры — хромосомы, состоящие из ДНК, РНК, белков и других веществ. В интерфазе, предшествующей делению клеток осуществляется Репликация ДНК и других компонентов хромосом; затем удвоенные хромосомы разъединяются и распределяются равномерно между дочерними клетками. Таким образом вся наследственная информация в относительно неизмененном виде передаётся от клетки к клетке, от поколения к поколению. Хеликаза, топоизомераза и ДНКсвязывающие белки расплетают ДНК, удерживают матрицу в разведённом состоянии и вращают молекулу ДНК. Правильность репликации УМКД 042-1822.1.10/01-2015 Редакция № от 2015 г. Страница 39 из 116 обеспечивается точным соответствием комплементарных пар оснований и активностью ДНК-полимеразы, способной распознать и исправить ошибку. Репликация у эукариот осуществляется несколькими разными ДНКполимеразами. Далее происходит закручивание синтезированных молекул по принципу суперспирализации и дальнейшей компактизации ДНК. Синтез энергозатратный. Цепи молекулы ДНК расходятся, образую репликационную вилку, и каждая из них становится матрицей, на которой синтезируется новая комплементарная цепь. В результате образуются две новые двуспиральные молекулы ДНК, идентичные родительской молекуле. Процесс репликации ДНК. Репликация состоит из большого числа последовательных этапов, которые включают узнавание точки началу репликации, расплетание исходного дуплекса (спирали), удержание его цепей в изолированном друг от друга состоянии, инициацию синтеза на них новых дочерних цепей, их рост (элонгацию), закручивание цепей в спираль и терминацию (окончание) синтеза. Все эти этапы репликации, протекающие с высокой скоростью и исключительной точностью, обеспечивает комплекс, состоящий более чем из 20 ферментов и белков, – так называемая ДНК-репликазная система, или реплисома. Функциональная единица репликации – репликон, представляющий собой сегмент (участок) хромосомы или внехромосомной ДНК, ограниченный точкой начала, в которой инициируется репликация, и точкой окончания, в которой репликация останавливается. Скорость репликации контролируется на стадии инициации. Однажды начавшись, репликация продолжается до тех пор, пока весь репликон не будет дуплицирован (удвоен). Частота инициации определяется взаимодействие специальных регуляторных белков с точкой начала репликации. Бактериальные хромосомы содержат один репликон: инициации в единственной точке начала репликации ведет к репликации всего генома. В каждом клеточном цикле репликация инициируется только один раз. Плазмиды и вирусы, являющиеся автономными генетическими элементами, представляют собой отдельные репликоны, способные к многократной инициации в клетке – хозяине. Эукариотичные хромосомы (хромосомы всех организмов, за исключением бактерий и синезеленых водорослей) содержат большое число репликонов, каждый из которых также однократно инициируется за один клеточный цикл. Структура, которая образуется во время репликации, называется репликативной вилкой. УМКД 042-1822.1.10/01-2015 Редакция № от 2015 г. Страница 40 из 116 Репликация у прокариотов и эукариотов. Процесс реплдикации осуществляется с помощью ферментов, которые получили название ДНКполимераз. Участок молекулы ДНК, в котором начали расплетаться комплементные нити, называется вилкой репликации. Она образуется у прокариот в определенной генетически детерминированной точке. В молекуле ДНК у эукариот таких точек инициации репликации («стартовых точек») бывает несколько. У эукариот процесс репликации ДНК идет неодинаково. Объясняется это тем, что полинуклеотидные цепи в молекуле ДНК антипараллельны, т. е. 5'-конец одной цепи соединяется с 3'-концом другой, и наоборот. Материнская цепь, на которой синтез идет от точки старта 5'->3' в виде сплошной линии, называется лидирующей, а вторая цепь, на которой синтез идет от 3'->5' (в противоположном направлении) отдельными фрагментами получила название запаздывающей. Синтез этой цепи сложнее синтеза лидирующей цепи. Он протекает с участием фермента лигазы отдельными фрагментами. Эти фрагменты (участки кодовой нити ДНК) содержат у эукариот 100-200, а у прокариот 1000-2000 нуклеотидов. Они получили название фрагментов Оказаки, по имени открывшего их японского ученого.У прокариот одна из нитей ДНК разрывается и один конец ее прикрепляется к клеточной мембране, а на противоположном конце происходит синтез дочерних нитей. Такой синтез дочерних нитей ДНК получил название «катящегося обруча». Репликация ДНК протекает быстро. Так, у бактерии скорость репликации составляет 30 мкм в минуту. За минуту к ниткематрице присоединяется около 500 нуклеотидов, у вирусов за это время - около 900 нуклеотидов. У эукариот процесс репликации протекает медленно. У них дочерняя нить удлиняется на 1,5-2,5 мкм в минуту. Репарация ДНК, коррекция ДНК и мутации. Как уже упоминалось, между завершением репликации и началом митоза проходит около 1 ч. Все это время в клетке идут активные процессы репарации и коррекции ДНК. Если во время репликации к нуклеотиду материнской цепи ДНК присоединяется некомплементарный нуклеотид дочерней цепи, то с помощью ферментов он будет вырезан и заменен на комплементарный. Эти ферменты представляют собой те же самые УМКД 042-1822.1.10/01-2015 Редакция № от 2015 г. Страница 41 из 116 ДНК-полимеразы и ДНК-лигазы, которые используются в процессе репликации. Этот процесс называют коррекцией ДНК. Благодаря репарации и коррекции ДНК ошибки транскрипции, называемые мутациями, встречаются очень редко. Появление мутаций приводит к синтезу в клетке дефектных белков вместо нормальных, вследствие этого ее функции часто нарушаются, и она может даже погибнуть. Геном человека содержит не менее 30000 генов, и период между двумя поколениями составляет в среднем 30 лет, поэтому любой геном, унаследованный от родителей, должен нести не менее 10 мутаций. Однако от этих мутаций можно найти защиту. Как известно, человеческий геном представлен двойным набором хромосом, поэтому из двух аналогичных генов хотя бы один почти наверняка будет нормальным. Вопросы для самоконтроля: 1. Что подразумевают под репликацией? 2. Перечислите механизм репликации 3. С помощью каких веществ осуществляется репликаця? Литература: 7.1-7.1.7 (основная),7.2.1- 7.2.10 (дополнительная) Модуль 3 Биосинтез белков Лекция № 9 Тема: Процесс транскрипции ДНК с образованием РНК План лекции: Процесс транскрипции ДНК с образованием РНК. Принцип и механизмы транскрипции ДНК в РНК. Ассиметричность считывания с цепей ДНК. Инициация, элонгация и терминация транскрипции. Модели регуляции транскрипции у высших животных. Оснащение: проектор, слайды Транскрипция. Для синтеза белка в рибосомы должна быть доставлена программа синтеза, т. е. информация о структуре белка, записанная и хранящаяся в ДНК. Для синтеза белка в рибосомы направляются точные копии этой информации. Это осуществляется с помощью РНК, которые синтезируются на ДНК и точно копируют ее структуру. Последовательность нуклеотидов РНК точно повторяет последовательность в одной из цепей гена. Таким образом, информация, содержащаяся в структуре данного гена, как бы переписывается на РНК. Этот процесс называют транскрипцией (лат. "транскрипция" - переписывание). С каждого гена можно снять любое число копий РНК. Эти РНК, несущие в рибосомы информацию о составе белков, называют информационными (и-РНК). В процессе транскрипции можно выделить три этапа. Первый этап инициация транскрипции – начало синтеза нити РНК, образуется первая связь между нуклеотидами. Затем идет наращивание нити, ее удлинение – элонгация, и, когда синтез завершен, происходит терминация, освобождение УМКД 042-1822.1.10/01-2015 Редакция № от 2015 г. Страница 42 из 116 синтезированной РНК. РНК-полимераза при этом «слезает» с ДНК и готова к новому циклу транскрипции. Бактериальная РНК-полимераза изучена очень подробно. Она состоит из нескольких белковых-субъединиц: двух αсубъединиц (это маленькие субъединицы), β- и β΄-субъединиц (большие субъединицы) и ω-субъединицы. Вместе они образуют так называемый минимальный фермент, или кор-фермент. К этому кор-ферменту может присоединяться σ-субъединица. σ-субъединица необходима для начала синтеза РНК, для инициации транскрипции. После того, как инициация осуществилась, σ-субъединица отсоединяется от комплекса, и дальнейшую работу (элонгацию цепи) ведет кор-фермент. При присоединении к ДНК σ-субъединица распознает участок, на котором должна начинаться транскрипция. Он называется промотор. Промотор - это последовательность нуклеотидов, указывающих на начало синтеза РНК. Без σ-субъединицы кор-фермент промотор распознать не может. σ-субъединица вместе с кор-ферментом называется полным ферментом, или холоферментом. Связавшись с ДНК, а именно с промотором, который распознала σсубъединица, холофермент расплетает двунитевую спираль и начинает синтез РНК. Участок расплетенной ДНК – это точка инициации транскрипции, первый нуклеотид, к которому должен комплементарно быть присоединен рибонуклеотид. Инициируется транскрипция, σ-субъединица уходит, а корфермент продолжает элонгацию цепи РНК. Затем происходит терминация, корфермент освобождается и становится готов к новому циклу синтеза. Как происходит элонгация транскрипции? РНК наращивается на 3΄-конце. Присоединением каждого нуклеотида корфермент делает шаг по ДНК и сдвигается на один нуклеотид. Так как все в мире относительно, то можно сказать, что кор-фермент неподвижен, а сквозь него «протаскивается» ДНК. Понятно, что результат будет таким же. Но мы будем говорить о движении по молекуле ДНК. Размер белкового комплекса, составляющего кор-фермент, 150 Ǻ. Размеры РНК-полимеразы 150×115×110Ǻ. То есть это такая наномашина. Скорость работы РНКполимеразы – до 50 нуклеотидов в секунду. Комплекс кор-фермента с ДНК и РНК называется элонгационным комплексом. В нем находится ДНК-РНК УМКД 042-1822.1.10/01-2015 Редакция № от 2015 г. Страница 43 из 116 гибрид. То есть это участок, на котором ДНК спарена с РНК, и 3΄-конец РНК открыт для дальнейшего роста. Размер этого гибрида – 9 пар оснований. Расплетенный участок ДНК занимает примерно 12 пар оснований. РНК-полимераза связанна с ДНК перед расплетенным участком. Этот участок называется передним дуплексом ДНК, его размер – 10 пар оснований. Полимераза связана также с более длинной частью ДНК, называемой задним дуплексом ДНК. Размер матричных РНК, которые синтезируют РНКполимеразы у бактерий, могут достигать 1000 нуклеотидов и больше. В эукариотических клетках размер синтезируемых РНК может достигать 100000 и даже нескольких миллионов нуклеотидов. Правда, неизвестно, существуют ли они в таких размерах в клетках, или в процессе синтеза они могут успеть процессировать. Элонгационный комплекс довольно стабилен, т.к. он должен выполнить большую работу. То есть, сам по себе он с ДНК не «свалится». Он способен перемещаться по ДНК со скоростью до 50 нуклеотидов в секунду. Этот процесс называется перемещение (или, транслокация). Взаимодействие ДНК с РНКполимеразой (кор-ферментом) не зависит от последовательности этой ДНК, в отличие от σ-субъединицы. И кор-фермент при прохождении определенных сигналов терминации завершает синтез ДНК. Разберем более подробно молекулярную структуру кор-фермента. Как было сказано выше, кор-фермент состоит из α- и β-субъединиц. Они соединены так, что образуют как бы «пасть» или «клешню». α-субъединицы находятся в основании этой «клешни», и выполняют структурную функцию. С ДНК и РНК они, по-видимому, не взаимодействуют. ω-субъединица – небольшой белок, который также выполняет структурную функцию. Основная часть работы приходится на долю β- и β΄-субъединиц. На рисунке β΄-субъединица показана наверху, а β-субъединица - внизу. Внутри «пасти», которая называется главным каналом, находится активный центр фермента. Именно здесь происходит соединение нуклеотидов, образование новой связи при синтезе РНК. Главный канал в РНК-полимеразе – это то место, где во время элонгации находится ДНК. Еще в этой структуре УМКД 042-1822.1.10/01-2015 Редакция № от 2015 г. Страница 44 из 116 сбоку есть так называемый вторичный канал, по которому подаются нуклеотиды для синтеза РНК. Распределение зарядов на поверхности РНК-полимеразы обеспечивает ее функции. Распределение очень логично. Молекула нуклеиновой кислоты заряжена отрицательно. Поэтому полость главного канала, где должна удерживаться отрицательно заряженная ДНК, выложена положительными зарядами. Поверхность РНК-полимеразы выполнена отрицательно заряженными аминокислотами, чтобы ДНК к ней не прилипала. РНКполимераза работает как молекулярная машина, и в ней есть различные детали, каждая из которых выполняет свою функцию. Например, нависающая над "пастью" часть β΄- субъединицы удерживает передний ДНК-дуплекс. Эта часть называется "заслонкой". После связывания с ДНК заслонка опускается, проходя путь в 30 ангстрем, и зажимает ДНК так, чтобы она не могла выпасть в процессе транскрипции. внутри "пасти" находится активный центр РНК-полимеразы, то есть то место, где непосредственно происходит комплементарное взаимодействие поступившего по боковому каналу рибонуклеоиздтрифосфата с ДНК-матрицей. Если вновь прибывший нуклеотид комплементарен матрице, то он ферментативно пришивается к свободному 3' –концу РНК. По характеру реакция образования новой связи в РНК относится к реакциям нуклеофильного замещения. В ней участвуют два иона магния. Один ион постоянно находится в активном центре, а второй ион магния поступает с нуклеотидом и после образования новой связи между рибонуклеотидами уходит, затем поступает новый нуклеотид со своим новым ионом магния. При выходе из РНК-полимеразы ДНК-РНК гибрид должен быть расплетен. В этом участвует структура, называемая "шип". В транслокации, то есть перемещении РНК-полимеразы по нити ДНК, участвует α-спиральная структура, снизу вверх торчащая из β-субъединицы. Как же узнали, какая часть фермента какую роль выполняет. Молекулярные биологи поступают следующим образом. Они удаляют часть белковой последовательности и смотрят, какая функция исчезла. Было показано, что если выбросить фрагмент зажима (когда его выбрасывали, еще не знали, что он держит ДНК), то ДНК держаться не будет. Такой же результат получается, если удалить ДНК переднего дуплекса. Оставшаяся часть - РНК-ДНК гибрид и задний дуплекс – оказываются слабо связанными с РНК-полимеразой. Известно, что магний координирует связь между фосфатами растущей молекулы ДНК и фосфатами вновь входящих нуклеотидов. При этом происходит последовательность реакций, называемых реакциями нуклеофильного замещения. Известно, каким образом меняются связи внутри этого комплекса. Новый нуклеотид приходит, будучи связанным с еще одним ионом магния. Новый нуклеотид таким образом взаимодействует с растущей цепью ДНК. В конце реакции, второй ион магния выводится из активного центра фермента. УМКД 042-1822.1.10/01-2015 Редакция № от 2015 г. Страница 45 из 116 РНК-полимераза является представителем молекулярных машин. Помимо того, что в начале синтеза ДНК опускается заслонка, меняется конформация других частей РНК-синтазы, в ней во время роста цепи РНК происходят циклические изменения, не такие сильные, как при начале синтеза цепи. В начале заслонка опускается на 30 Ǻ, а при каждом шаге фермента ДНК протягивается на один нуклеотид. В перемещении по ДНК участвует элемент РНК-полимеразы Fспираль (альфа-спиральная структуры, точащая из бета-субъединицы вверх в главный канал). F-спираль при этом изгибается, перемещается вместе с комплексом РНК-ДНК, освобождается от них и опять выпрямляется. Перемещается F-спираль за один шаг на 3,4 Ǻ. Именно такой шаг у РНКполимеразы. Изменение конформации различных частей РНК-полимеразы происходит за счет изменения потенциальной энергии, что связано с электростатическими и гидрофобными взаимодействиями. Можно провести следующую аналогию. Если взять поднос с горкой яблок, то после того, как мы этот поднос потрясем, яблоки будут рассыпаться ровным слоем по подносу. У них при этом изменится потенциальная энергия, связанная с действием силы тяжести. Если молекулу РНК-синтазы «потрясти» (а «трясет» ее, также как и все другие молекулы в клетке, броуновское движение), то она начнет принимать конформацию с более низкой потенциальной энергией. То есть, источником движения молекулярной машины является энергия теплового движения отдельных ее составляющих, а устройство машины таково, что это движение приводит к нужному результату. При этом молекулярная машина потребляет энергию, которая, в основном, идет на изменение состояния тех или иных связей. Остановимся на инициации транскрипции. Как уже говорилось, инициация осуществляется с участием σ-субъединицей. Она взаимодействует со структурой ДНК, которая называется промотор. Она имеет у кишечной палочки такую структуру. За десять нуклеотидов до точки инициации находится ТАТА-бокс. Не обязательно стоит именно такая последовательность, но она является "идеальной" последовательностью для взаимодействия с σсубъединицей, то есть такой, с которой транскрипция инициируется наиболее эффективно. Замена отдельных нуклеотидов в этой последовательности снижает эффективность инициации транскрипции. Еще примерно за 35 нуклеотидов до него находится структура, называемая «-35». Эту последовательность также распознает σ-субъединица. Эту структуру (сочетание последовательностей "–10" и "–35") назвали классическим промотором, т.к. она была описана первой. Но оказалось, что устройство промотора может быть и другим. Этот вариант включает в себя тот же ТАТАбокс, но нет последовательности «-35», однако есть дополнительно два нуклеотида, и этого достаточно, чтобы σ-субъединица распознала промотор. Эта структура называется расширенным промотором. σ-субъединица РНКполимеразы садится на промотор в ДНК и разными частями белковой молекулы взаимодействует с частями промотора. Распознает его σ-субъединица УМКД 042-1822.1.10/01-2015 Редакция № от 2015 г. Страница 46 из 116 через большую бороздку ДНК. После того, как σ-субъединица в составе корфермента связалась с промотором, ДНК на этом участке начинает плавиться (расплетаются нити ДНК). На прошлой лекции обсуждалось, что в паре А-Т связи между нуклеотидами разрываются легче, чем в паре Г-Ц, так как последняя содержит 3 водородных связи, а первая – две. Промотор содержит пары А-Т, поэтому плавится он достаточно легко. И затем начинается синтез РНК, растущая цепь РНК выталкивает σ-субъединицу и происходят еще другие изменения, которые вызывают диссоциацию σ-субъединицы от кор-фермента. Теперь приведем пример, как изучают функции разных частей белка. Если небольшой кусочек белка отрезать и посмотреть, как изменились функции белка, то можно понять, какие были функции у отрезанного кусочка. В нашем случае сделали по-другому. Взяли две ДНК-полимеразы, одну взяли из кишечной палочки, а другую – из теплолюбивой бактерии (термофильной), которая растет при 800 С, (в лабораторных условиях их растят в колбе, которая находится в термостате в почти кипящей воде, в естественных условиях они живут в горячих источниках, есть такие, которые могут жить при 98оС), следовательно оптимум работы ее РНК-полимеразы и σ-субъединицы – 80оС, (на рисунке σ-субъединица термофильной бактерии показана красным, а кишечной палочки - желтым), а у кишечной палочки наиболее эффективная работа идет при температуре человеческого тела, (так как она живет в кишечнике). У ее σ-субъединицы всего четыре части, разрезали белок и сшивали эту σ-субъединицу с кусочком от σ-субъединицы термофильной бактерии. И потом разные кусочки от термофильной бактерии вставляли, заменяя ими разные фрагменты σ-субъединицы. Затем смотрели, активен ли полученный гибридный белок при 200 С или нет. Термофильная бактерия при такой температуре не работает, для нее это слишком холодно, а кишечная палочка активна. На рисунке видно, что при данной температуре работает только та комбинация, при которой у σ-субъединицы первая и вторая часть от кишечной палочки, а третья и четвертая от термофильной бактерии. Таким образом, делают вывод, что температуру работы σ-субъединицы определяют первая и вторая составные части. На самом деле разрезают не белок, а ДНК, потом кусочки ДНК от разных бактерий сшивают вместе и затем вводят в бактерию, там при активизации этой части ДНК синтезируется гибридный белок. Эта технология относится к генной инженерии, она была разработана в 70-х годах. Еще одной особенностью транскрипции является то, что кор-фермент бактериальной клетки один и тот же, а σ-субъединицы могут быть разными. У кишечной палочки всего 7 σ-субъединиц, они узнают разные промоторы. Зачем это нужно? Если клетке срочно нужно переключить синтез белков с одной группы генов на другую, она может использовать разные σ-субъединицы. Например, есть гены теплового шока, если кишечную палочку подогреть до состояния, когда жить ей станет очень тяжело, она включает аварийную систему сопротивления тепловому шоку, сопротивления тем разрушениям, которые произошли в клетке. В эту систему входит тот набор генов, который в УМКД 042-1822.1.10/01-2015 Редакция № от 2015 г. Страница 47 из 116 норме работать не должен, перед этими генами свой особый промотор. И тогда другая σ-субъединица , не основная, синтезируется и активирует эти гены. То есть смена субъединицы – это смена программы работы генов. Это способ регуляции работы генов. Вопросы для самоконтроля: 1. Дайте определение транскрипции 2. Как протекает инициация транскрипции? 3. Как протекает элонгация транскрипции? 4. Как протекает транскрипция? Литература: 7.1-7.1.7 (основная),7.2.1- 7.2.10 (дополнительная) Модуль 4 Денатурация и ренатурация нуклеиновых кислот Лекция № 10 Тема: Денатурация и ренатурация нуклеиновых кислот План лекции: Кооперативность процесса денатураци. Методы оценки денатурации. Ренатурация и молекулярная гибридизация Денатурация нуклеиновых кислот – это процесс нарушения водородных и вандерваальсовых связей между отдельными основаниями и полинуклеотидными цепями в целом. Денатурация нуклеиновых кислот может быть связана целым рядом воздействий: нагреванием, значительными изменениями рН, крайним снижением ионной силы и др. Наибольший интерес представляет термическая денатурация. Ее значение и высокая степень изученности привели к тому, что нередко вместо наиболее широкого термина “денатурация” пользуются термином “плавление”, даже в случаях, когда разъединение цепей вызывается не нагреванием, а другими факторами. Термическая денатурация нуклеиновых кислот регистрируется с помощью целого ряда показателей: оптической плотности, оптической активности, и ряда других, непосредственно связанных со спирализацией. Естественно также, что денатурация, снижая жесткость нитей, может регистрироваться по вязкости, по дисперсии оптического вращения, по двойному лучепреломлению и т.п. Наиболее показательно и удобно измерение оптической плотности при 260 ммк. Максимальное повышение оптической плотности составляет обычно около 80% от того, которое наблюдается при полном распаде нуклеиновой кислоты до мононуклеотидов. При температуре, которая вызывает почти 100% гиперхромный эффект, сохраняется существенная доля водородных связей, которые еще удерживают цепочки друг возле друга, хотя биспиральной структуры уже не существует. Это доказывается, в частности, с помощью экспериментов по скорости обмена УМКД 042-1822.1.10/01-2015 Редакция № от 2015 г. Страница 48 из 116 водорода аминных и иминных групп со средой, так как водород, вовлеченный в Н – связи, обновляется гораздо медленнее. В то же время вандерваальсовы связи между основаниями полностью нарушаются при этой температуре, что демонстрирует важную их роль в стабилизации биспитральной структуры. Только нагревание до температур, на 5 – 7 градусов превышающих ту, при которой прекратилось повышение оптической плотности, вызывает полное расхождение цепей с образованием клубков, характерных для одноцепочечных ДНК. Нагревание, как уже было сказано, отнюдь не является единственным агентом, денатурирующим ДНК. Подкисление до значений рН, меньших 4,0, а надежнее – до рН<3,0, или подщелачивание до значений рН, больших 11,0, резко повышает либо вероятность образования NН3+- групп, либо перехода кетогрупп в енольные, что нарушает водородные связи между основаниями и ведет к более или менее полному расхождению цепей. Биспиральные структуры устойчивы к снижению ионной силы, но при µ, меньшем 10-4 , экранирование фосфатных групп солями нарушается в такой степени, что наступает расхождение цепей. В отличие от рН можно отметить влияние ионной силы на температуру плавления в широком интервале значений µ. Это обстоятельство используется в тех случаях, когда необходимо исследование кривых плавления ДНК при низких температурах, например в экспериментах с хроматином, содержащим ряд белковых компонентов, денатурирующихся уже при 50 – 600С. Снижая ионную силу от физиологических знаний до примерно 10-3, удается уменьшить Тпл ДНК до 500С и ниже. Существует и ряд других агентов, денатурирующих нуклеиновые кислоты или, чаще, способствующих денатурации. К последним относятся многие соединения, склонные к образованию водородных связей: мочевина, гуанидин – хлорид, спирты и многие другие. Полагают, что их эффект обусловлен не прямым воздействием на межнуклеотидные Н – связи, а стабилизацией уже разъединившихся цепей. Содействуют, естественно, денатурации и агенты, модифицирующие основания так, что нарушается их способность к образованию водородных связей. Весьма показательно сопоставление процессов денатурации двуцепочечных ДНК и биспиральных участков в одноцепочечных РНК. Во – первых, меньшая доля и неполноценность этих участков проявляются в меньшем значении Тпл и меньшей абсолютной величине гиперхромного эффекта. Во – вторых, большая внутримолекулярная гетерогенность спирализованных участков несколько «растягивает» кривую плавления вдоль оси абсцисс. В – третьих, наконец, в случае РНК могут наблюдаться соотношения между изменениями оптической плотности и вязкости, обратные тем, которые наблюдаются при плавлении ДНК. В самом деле, денатурация ДНК сопровождается снижением упругости молекул, переходом гигантских клубков или палочковидных структур к малым клубкам, что выражается в резком падении вязкости. В случае РНК небольшие спирализованные участки, чередующиеся с одноцепочечными участками, даже УМКД 042-1822.1.10/01-2015 Редакция № от 2015 г. Страница 49 из 116 способствуют повышению компактности клубка при средних значениях ионной силы. Поэтому плавление РНК может приводить, наряду с гиперхромностью, не к понижению, а к повышению вязкости за счет разрыхления клубка. Процесс денатурации нуклеиновых кислот оказался обратимым. Постепенное охлаждение раствора денатурированной ДНК или выдерживание его при температуре, примерно на 200 меньшей температуры плавления, позволяет полностью восстановить нативность молекулы. Напротив, быстрое охлаждение до низких температур (0÷ - 200С и ниже) фиксирует денатурированное состояние на длительное время. Скорость ренатурации тем больше, чем выше концентрация и однородность, гомогенность молекул исходной ДНК по их нуклеотидной последовательности. В растворе денатурированной абсолютно гомогенной ДНК вероятность того, что столкнувшиеся полинуклеотидные цепочки окажутся комплементарными, равна 0,5. Присутствие других молекул, с иной последовательностью оснований, исключающей сплавление с цепочками первой ДНК, снижает вероятность встреч, которые заканчивались бы ренатурацией. Следовательно, быстрота ренатурации ДНК поможет служить мерой ее гомогенности. Это обстоятельство послужило основой для разработки метода сравнительной оценки разнообразия нуклеотидных последовательностей в природных ДНК из разных организмов. Своеобразным следствием процесса ренатурации, с одной стороны, и наличия большого числа повторяющихся нуклеотидных последовательностей в ДНК высших организмов, с другой, явился феномен, открытый недавно Thomas и сотр. (1970). Если большие фрагменты ДНК, состоящие из повторяющихся участков, подвергнуть кратковременному воздействию специфических нуклеаз, например, так, чтобы с обоих концов фрагмента удалить часть нуклеотидов с 3΄конца, то обнаружившиеся 5΄- концевые цепочки будут способны замыкаться друг на друга, сплавляться и давать биспираль. При этом фрагмент ДНК образует кольцо. Размеры и среднее число колец, образующихся из ДНК, устанавливают с помощью электронного микроскопа и другими методами. Если свести вместе продукты денатурации целых молекул ДНК, лишь частично совпадающих по нуклеотидным последовательностям, то в условиях ренатурации будут возникать двуцепочечные молекулы не только из гомологичных цепей, но и из цепей разных ДНК. Естественно, в последнем случае биспиральные структуры будут возникать не на всем протяжении молекул. Этот процесс часто называют молекулярной гибридизацией. Вообще говоря, термин этот неоднозначен, ибо молекулярной гибридизацией можно было бы назвать обмен биспиральными фрагментами между молекулами ДНК. Однако общепринятым является именно первое значение термина. Чем ближе по первичной структуре сводимые ДНК, чем более они гомологичны, тем будет больше протяженность спирализированных участков в гибридной молекуле. По доле последних можно количественно оценивать сходство нуклеотидных последовательностей ДНК разных организмов. Если же учесть, что УМКД 042-1822.1.10/01-2015 Редакция № от 2015 г. Страница 50 из 116 последовательность нуклеотидов большей части ДНК – это и есть материализованная генетическая информация, то становится очевидным, что таким способом можно получить ценнейшие данные о степени генетической близости разных организмов и подойти к решению труднейших проблем таксономии и эволюции. Предложен целый ряд методов количественной оценки степени гомологии разных ДНК при молекулярной гибридизации. При этом можно идти либо по пути гибридизации наиболее высокомолекулярных ДНК, измеряя далее тем или иным способом долю образовавшихся биспиральных участков, либо предварительно дробить обе или одну из сравниваемых ДНК на фрагменты, близкие по размеру к минимальным цистронам (генам), и оценивать далее, какая доля фрагментов может гибридизироваться. Более практичным оказался второй путь, хотя вначале внимание исследователей привлек первый. Так, четкие результаты без предварительного дробления ДНК были получены, когда одна из ДНК «утяжелялась» введением N15 (через среды выращивания данного организма), затем гибридизировалась с «легкой» ДНК из второго организма, и смесь разделялась ультрацентрифугированием в градиенте плотности Cs Cl. Гибридная ДНК, содержащая лишь одну нить с N15, занимала промежуточное положение между ДНК I и II, которые также частично ренатурировались. Вероятность встречи полинуклеотидной цепочки из каждой ДНК с цепочкой из своей или чужой ДНК легко рассчитать. Она оказалась в удовлетворительном соответствии с действительным количественным распределением ДНК при градиентном ультрацентрифугировании между тремя пиками: тяжелой, легкой и промежуточной ДНК. Исключением были лишь случаи, когда степень гомологии ДНК I и II была столь низкой, что гибридная ДНК оказывалась крайне нестабильной, и вновь разъединившиеся цепи рано или поздно сталкивались и спирализовались с полностью гомологичной цепью из своей ДНК. Однако, даже получив выраженный пик гибридной ДНК, еще нельзя было сделать заключения о том, какова в ней доля биспиральных участков и какова количественно степень гомологии. Один из наиболее эффективных приемов, позволивших решить эту задачу, был основан на существовании нуклеаз, расщепляющих только одноцепочечные нуклеиновые кислоты, но неспособных атаковать биспиральные участки. Обработка смеси продуктов ренатурации такими нуклеазами (перед ультрацентрифугированием в градиенте) позволяла разрушить неспирализовавшиеся и, следовательно, некомплементарные участки в гибридных ДНК. После разделения смеси количество оставшихся биспиральных фрагментов могло быть измерено, что позволяло рассчитывать долю гомологичных участков. Широкое применение этого метода было ограничено, прежде всего, относительной малодоступностью и громоздкостью градиентного ультрацентрифугирования, а также трудностью получения гибридной ДНК при низкой степени гомологии. Тот же метод оказался более эффективным в случае предварительного дробления ДНК. Однако это не снимало технических осложнений. Поэтому наибольшее распространение получила группа методов, количественно регистрировавших молекулярную гибридизацию фрагментов УМКД 042-1822.1.10/01-2015 Редакция № от 2015 г. Страница 51 из 116 либо без разделения продуктов ренатурации, либо с более практичной техникой разделения – при посредстве фиксации одной из сравниваемых ДНК. Так, количественную оценку молекулярной гибридизации предварительно раздробленных и денатурированных ДНК разных организмов можно произвести, изучая кинетику процесса с помощью тех же приемов, что были описаны выше для ренатурации гомологичных ДНК. Если сводимые ДНК совсем не гомологичны и вовсе не образуют гибридных фрагментов, то они будут ренатурироваться в смеси независимо друг от друга. Изложенный способ оценки гомологии является прямым следствием углубленного изучения кинетики ренатурации и технически не очень сложен. Однако по чувствительности, а также по применимости для оценки гомологии не только между ДНК, но и между ДНК и РНК, он значительно уступает наиболее распространенным и апробированным методам другого типа, основанным на измерении количества гибридизировавшейся нуклеиновой кислоты по радиоактивности. При этом одна из взаимодействующих нуклеиновых кислот фиксируется либо в агар – агаре, либо на целлюлозном фильтре. Ее не дробят, а лишь подвергают денатурации. Полинуклеотидная цепочка с молекулярным весом несколько миллионов и более неспособна диффундировать из агарового геля (ее вводят в гель, смешивая денатурированную ДНК с расплавленным агаром, и затем охлаждают) и полностью задерживается целлюлозными фильтрами специальных марок. В таких условиях исключена ренатурация этой ДНК, ибо в результате отсутствия диффузии невозможны столкновения нитей. Напротив, вторая из сравниваемых ДНК не только денатурируется, но и дробится с таким расчетом, чтобы ее фрагменты могли свободно диффундировать в агаровом геле или переходить через целлюлозный фильтр и, встречаясь с комплементарными им участками на фиксированной ДНК первого организма, гибридизироваться с ней. Молекулярный вес фрагментов второй ДНК измеряется сотнями тысяч. В тоже время суммарные молекулярные веса ДНК геномов обоих сравниваемых организмов обычно измеряются многими миллионами. Поэтому, оценив, какое количество второй ДНК прочно связалось с первой, легко рассчитать долю гомологичных нуклеотидных последовательностей. Вторую ДНК метят путем синтеза из радиоактивных предшественников (in vivo или in vitro). Реакцию проводят в условиях, оптимальных для ренатурации (около 700С). Негибридизировавшиеся фрагменты отмываются, и измеряется радиоактивность связанной ДНК. Далее был разработан еще более чувствительный и тонкий вариант метода Bolton и McCarthy – так называемая конкурентная гибридизация. Сущность его состоит в сведении двух сравниваемых фрагментированных РНК (или двух ДНК) с денатурированной и фиксированной ДНК. Одна из РНК помечается радиоактивным изотопом. Если обе РНК комплементарны ДНК, но обладают несовпадающими нуклеотидными последовательностями, то они будут взаимодействовать с разными ее участками и не будут взаимно препятствовать УМКД 042-1822.1.10/01-2015 Редакция № от 2015 г. Страница 52 из 116 гибридизации. Если же РНК идентичны, то отмечается небольшая степень взаимного подавления гибридизации. Наконец, промежуточные по интенсивности проявления конкуренции позволяют количественно оценить долю общих нуклеотидных последовательностей сравниваемых РНК. Этот прием оказался особенно эффективным при сравнении разных НК в наиболее трудных ситуациях. Вопросы: 1. Что подразумевается под ренатурацией нуклеиновых кислот? 2. Что подразумевается под денатурацией нуклеиновых кислот? 3. Что означает молекулярная гибридизация? Литература: 7.1-7.1.7 (основная),7.2.1- 7.2.10 (дополнительная) Модуль 4 Денатурация и ренатурация нуклеиновых кислот Лекция № 11 Тема: Биосинтез и деградация нуклеиновых кислот План лекции: Матричный и нематричный синтез. Ингибиторы матричного синтеза. Оснащение: проектор, слайды Любая живая клетка способна синтезировать белки, и эта способность представляет одно из наиболее важных и характерных ее свойств. С особенной энергией идет биосинтез белков в период роста и развития клеток. В это время активно синтезируются белки для построения клеточных органоидов, мембран. Синтезируются ферменты. Биосинтез белков идет интенсивно и во многих взрослых, т. е. закончивших рост и развитие, клетках, например в клетках пищеварительных желез, синтезирующих белки-ферменты (пепсин, трипсин), или в клетках желез внутренней секреции, синтезирующих белки-гормоны (инсулин, тироксин). Способность к синтезу белков присуща не только растущим или секреторным клеткам: любая клетка в течение всей жизни постоянно синтезирует белки, так как в ходе нормальной жизнедеятельности молекулы белков постепенно денатурируются, структура и функции их нарушаются. Такие пришедшие в негодность молекулы белков удаляются из клетки. Взамен синтезируются новые полноценные молекулы, в результате состав и деятельность клетки не нарушаются. Способность к синтезу белка передается по наследству от клетки к клетке и сохраняется ею в течение всей жизни. При биосинтезе новых молекул нуклеиновых кислот и белков носителями такой программы являются нуклеиновые кислоты; в этой роли их называют матрицами. Матрица в ходе матричного синтеза не расходуется и может использоваться многократно; в этом отношении она сходна с катализатором. Различают три основных типа матричных биосинтезов: УМКД 042-1822.1.10/01-2015 Редакция № от 2015 г. Страница 53 из 116 1) биосинтез ДНК (репликация ДНК) с использованием в качестве матрицы уже существующих молекул ДНК; 2) биосинтез РНК на матрице ДНК (транскрипция); 3) биосинтез белков с использованием мРНК в качестве матрицы (трансляция). Основная роль в определении структуры белков принадлежит ДНК. Сами ДНК непосредственного участия в синтезе не принимают. ДНК содержится в ядре клетки, а синтез белков происходит в рибосомах, находящихся в цитоплазме. В ДНК только содержится и хранится информация о структуре белков. На длинной нити ДНК следует одна за другой запись информации о составе первичных структур разных белков. Отрезок ДНК, содержащий информацию о структуре одного белка, называют геном. Молекула ДНК представляет собрание нескольких сот генов. Чтобы разобраться в том, каким образом структура ДНК определяет структуру белка, приведем такой пример. Многие знают об азбуке Морзе, при помощи которой передают сигналы и телеграммы. По азбуке Морзе все буквы алфавита обозначены сочетаниями коротких и длинных сигналов - точкам и тире. Буква А обозначается .--, Б -- --. и т. д. Собрание условных обозначений называют кодом или шифром. Азбука Морзе представляет собой пример кода. Получив телеграфную ленту с точками и тире, знающий код Морзе легко расшифрует написанное. Макромолекула ДНК, состоящая из нескольких тысяч последовательно расположенных четырех видов нуклеотидов, представляет собой код, определяющий структуру ряда молекул белка. Так же как в коде Морзе каждой букве соответствует определенное сочетание точек и тире, так и в коде ДНК каждой аминокислоте соответствует определенное сочетание точек и тире, так и в коде ДНК каждой аминокислоте соответствует определенное сочетание последовательно связанных нуклеотидов. Код ДНК удалось расшифровать почти полностью. Сущность кода ДНК состоит в следующем. Каждой аминокислоте соответствует участок цепи ДНК из трех рядом состоящих нуклеотидов. Например, участок Т-Т-Т соответствует аминокислоте лизину, отрезок А-Ц-А - цистеину, Ц-А-А - валину и. т. д. Допустим, что в гене нуклеотиды следуют в таком порядке: А-Ц-А-Т-Т-Т-А-А-Ц-Ц-А-А-Г-Г-Г Разбив этот ряд на тройки (триплеты), мы сразу расшифруем, какие аминокислоты и в каком порядке следуют в молекуле белка: А-Ц-А - цистеин; Т-Т-Т - лизин; А-А-Ц - лейцин; Ц-А-А - валин; Г-Г-Г - пролин. В коде Морзе всего два знака. Для обозначения всех букв, всех цифр и знаков препинания приходится брать на некоторые буквы или цифры до 5 знаков. Код ДНК проще. Разных нуклеотидов 4. Число возможных комбинаций из 4 элементов по 3 равно 64. Разных аминокислот всего 20. Таким образом, различных триплетов нуклеотидов с избытком хватает для кодирования всех аминокислот. Нарушение или выпадение любого звена, участвующего в синтезе белка, почти всегда приводит к развитию патологии, причем клинические проявления УМКД 042-1822.1.10/01-2015 Редакция № от 2015 г. Страница 54 из 116 болезни будут определяться природой и функцией белка, синтез которого оказывается нарушенным (структурный или функциональный белок). Иногда синтезируются так называемые аномальные белки как результат действия мутагенных факторов и соответственно изменения генетического кода (например, гемоглобин при серповидно-клеточной анемии). Последствия этих нарушений могут выражаться в развитии самых разнообразных синдромов или заканчиваться летально. Следует отметить, однако, что организм располагает мощными механизмами защиты. Подобные изменения генетического аппарата быстро распознаются специфическими ферментами – рестриктазами, измененные последовательности вырезаются и вновь замещаются соответствующими нуклеотидами при участии полимераз и лигаз. Одним из путей выяснения механизмов синтеза нуклеиновых кислот и белков в клетках является использование таких лекарственных препаратов, которые могли бы избирательно тормозить эти процессы у бактерий, не оказывая влияния на организм человека. Некоторые препараты действительно обладают таким действием, однако многие из них оказываются токсичными и для человека. В настоящее время в медицинской практике применяются многие антибиотики, часть из которых будет рассмотрена ниже с целью выяснения механизма их действия на ключевые химические реакции синтеза белка и нуклеиновых кислот. Одним из мощных ингибиторов белкового синтеза является пуромицин. В результате структурного сходства с концевым остатком АМФ в аминоацил-тРНК' он легко взаимодействует с А-участком пептидилтРНК с образованием пептидил-пуро-мицина. Поскольку пептидил-пуромицин не несет на себе триплета антикодона, он тем самым тормозит элонгацию пептидной цепи, вызывая обрыв реакции. При помощи пуромицина было доказано, например, что гормональный эффект в ряде случаев зависит от синтеза белка de novo. Укажем также, что пуромицин тормозит синтез белка как у прокариот, так и у эукариот. Белковый синтез тормозится актиномицином D, обладающим противоопухолевым эффектом, который вследствие высокой токсичности применяется редко. Он оказывает тормозящее влияние на синтез всех типов клеточной РНК, в особенности мРНК. Это свойство вызвано тормозящим влиянием актиномицина D на ДНК-зависимую РНК-полимеразу, поскольку он связывается с остатками дезоксигуанозина цепи ДНК, выключая матричную функцию последней. Можно считать, что актиномицин D ингибирует транскрипцию ДНК. Другим антибиотиком, также тормозящим синтез клеточной РНК, является используемый при лечении туберкулеза рифамицин. Этот препарат тормозит ДНК-зависимую РНК-полимеразу путем связывания с ферментом. Наиболее чувствительна к нему бактериальная РНКполимераза. На организм животных этот антибиотик оказывает незначительное влияние. По механизму действия он резко отличается от актиномицина t). Следует указать на недавно открытое противовирусное действие рифамицина, в частности, он успешно используется при лечении трахомы, которая вызывается ДНК-содержащим вирусом. По-видимому, этот антибиотик найдет применение УМКД 042-1822.1.10/01-2015 Редакция № от 2015 г. Страница 55 из 116 в лечении опухолей, вызываемых вирусами. Выяснены механизмы действия ряда других антибиотиков, применяемых при лечении тифозных инфекций. Так, хлорамфеникол оказывает ингибирующее влияние на пептидилтрансферазную реакцию (на стадии элонгации) синтеза белка в 70S рибосоме бактерий. На этот процесс в 80S рибосоме он не действует. Противоположное тормозящее действие на синтез белка в 80S (без поражения процесса в 70S рибосоме) оказывает циклогексимид, являющийся ингибитором транслоказы. Противотуберкулезные и антибактериальные антибиотики, в частности стрептомицин и неомицин, действуют на белоксинтезирующий аппарат чувствительных к ним -штаммов бактерий. Высказано предположение, что эти антибиотики вызывают ошибки в трансляции мРНК, приводящие к нарушению соответствия между кодонами и включаемыми аминокислотами; например, кодон УУУ вместо фенилаланина начинает кодировать лейцин — в результате образуется аномальный белок, что приводит к гибели бактерий. Широко применяемые в клинике тетрациклины также оказались ингибиторами синтеза белка в 70S рибосоме (меньше тормозится синтез в 80S рибосоме). Они легко проникают через клеточную мембрану. Считается, что тетрациклины тормозят связывание аминоацил-тРНК с аминоацильным центром в 50S субчастице рибосомы. Возможно, что тетрациклины химически связываются с этим центром, выключая тем самым одну из ведущих стадий процесса трансляции. Пенициллины не являются истинными ингибиторами синтеза белка, однако их антибактериальный эффект связан с торможением синтеза гексапептидов, входящих в состав клеточной стенки. Механизм их синтеза отличается от рибосомального механизма синтеза белка. Эритромицин и олеандомицин тормозят активность транслоказы в процессе трансляции, подобно циклогексимиду, исключительно в 80S рибосомах, т. е. тормозят синтез белка в клетках животных.Следует еще раз подчеркнуть, что нарушение или выпадение любого звена, участвующего в синтезе белка, почти всегда приводит к развитию патологии, причем клинические проявления болезни будут определяться природой и функцией белка, синтез которого оказывается нарушенным (структурный или функциональный белок). Иногда синтезируются так называемые аномальные белки как результат действия мутагенных факторов и, соответственно, изменения генетического кода (например, гемоглобин при серповидно-клеточной анемии). Последствия этих нарушений могут выражаться в развитии самых разнообразных синдромов или заканчиваться летально. Следует отметить, что организм располагает мощными механизмами защиты: подобные изменения генетического аппарата быстро распознаются специфическими ферментами — рестриктазами, измененные последовательности вырезаются и вновь замещаются соответствующими нуклеотидами при участии полимераз и лигаз. УМКД 042-1822.1.10/01-2015 Редакция № от 2015 г. Страница 56 из 116 Стимулом для поисков и изучения ингибиторов синтеза ДНК служит надежда найти средства для избирательного подавления ключевых реакции размножения ряда вирусов и опухолевых клеток. По интенсивности синтеза ДНК опухолевые клетки, как правило, резко превосходят другие ткани. Известно большое число веществ, более или менее избирательно подавляющих синтез ДНК in vivo. Однако многие из них угнетают синтез ДНК косвенно, например нарушая синтез оснований, нуклеозидов, нуклеозидтрифосфатов и т. п.. Относительно немногочисленны ингибиторы, которые непосредственно тормозят процесс редупликации. Они делятся на агенты: 1. Подавляющие реакцию в результате связывания с матрицей; 2. Собственные ингибиторы ДНК – полимеразы, взаимодействующей непосредственно с энзимом; 3. Соединения, тормозящие синтез за счет включения вместо очередного нуклеотида аналога, структура которого исключает дальнейшее присоединение обычных нуклеотидов. К первым относят ряд агентов, обратимо блокирующих матрицу за счет образования водородных или ионных связей. Таковы, например, широко применяемые антималярийные средства и в особенности хлорокин и хинокрин (O Brien et al., 1966; Ciak, Hahn, 1966) Они известны также, как иммунодепрессорные и антивирусные агенты (Durand et al 1971). Хинакрин является производным акридина. Следствия взаимодействия производных акридина с ДНК. В основе их лежит способность акридина внедрятся между основаниями ДНК. Сравнивая формулы хлорокина и хинокрина, можно заметить, что основная роль принадлежит хинолиновым кольцам. Эти соединения подавляют не только редупликацию ДНК, но и синтез РНК на матрице ДНК. Близки к ним по характеру действия фенатридины, например, этидиумбромид (Hirschman, 1971), обладающий трипаноцидным действием. К этой же группе ингибиторов относятся и антрациклиновые антибиотики (даумомицин, ногаламицин). Однако они в большей мере подавляют синтез РНК. Избирательно блокируют ДНК – матрицу антибиотмки пептидной природы – флеомицин и блеомицин. Некоторая общность их структуры не ведет, однако, к общности взаимодействия с ДНК: флеомицин обладает большим сродством с ДНК, богатым АТ – парами, связывается с 2 – карбонилом тимина и повышаеттемпературу плавления ДНК, а блеомицин, напротив, особенно энергично связывается с полидезоксирибонуклеотидами типа поли – дГ. поли – дЦ, снижает температуру плавления ДНК и даже вызывает ее деградацию (Goldberg, Friedman, 1971). Антибиотики эти интересны также своей универсальностью в отношении про - и эукариотов. Ряд других интересных антибиотиков широкого спектра действия, обратимо блокирующих матрицу, - рубифлавин, гедамицин, плюрамицин, новобиоцин – изучены поеа недостаточно. УМКД 042-1822.1.10/01-2015 Редакция № от 2015 г. Страница 57 из 116 Обратимо блокируют ДНК – матрицу и тормозят редупликацию основные белки – гистоны и протамины, связывающиеся с кислыми радикалами рибозофосфатного скелета ДНК и являющиеся, одним из компонентов естественной системы регуляции биосинтеза. Существенное угнетение редупликации отмечают обычно при отношении гистон: ДНК близком к единице или еще большем. Необратимо связываясь с ДНК и повреждая ДНК – матрицу, довольно избирательно подавляет редупликацию антибиотик митомицин С, обладающий некоторым противоопухолевым действием, но довольно таксичный. Поэтому терапевтического применения он не получил. Будучи бифункциональным алкирующим агентом, он вызывает образование ковалентных мостиков между различными участками комплементарных цепей ДНК. Далее in vivo следует интенсивная деградация поврежденной ДНК. Избирательно подавляет редупликацию ДНК и такие противоопухолевые агенты, как карцинофиллин и стрептонигрин, ковалентно связывающиеся с ДНК – матрицей и опять – таки вызывающие её деградацию (Misuno et al 1970). К группе прочно блокирующих матрицу агентов относится весьма эффективный ингибитор синтеза и ДНК, и РНК как у бактерий, так и у эукариотов – антрамицин. Недавно предложенный в качестве противоопухолевых агентов соединения платины, например cisPt(II) (NH3)2 Cl2, избирательно подавляющих синтез ДНК за счет образования поперечных сшивок между полинуклеотидными цепями (Roberts,Pascoe, 1972). Весьма эффективными ингибиторами синтеза ДНК являются налидиксовая кислота и близкая к ней по структуре пиромидиевая кислота. Что касается ингибиторов, действующих непосредственно на ДНК – полимеразу, то достаточно определенные данные имеются об N – этилмалеимиде и родственных ему соединениях, которые подавляют активность ДНК – полимеразы II и особенно III, но не ДНК – полимеразы I, Они интенсивно изучаются в связи с противоопухолевыми эффектами in vitro. N – этилмалеимид особенно интересен как пример агента, избирательно действующего только на часть известных ДНК – полимераз. Большой интерес представляют данные о подавлении ДНК – полимеразы (ДНК – зависимой) вируса лейкемии одноцепочечными гомополирибонуклеотидами. Они обратимо блокируют участок энзима, ответственный за связь с матрицей. По эффективности гомополимеры разного состава образуют ряд: поли У> поли Г> поли А> поли Ц (Tuominen, Kenney,1971). Начальный синтез ДНК у онкогенных РНК – вирусов определяется РНК – зависимой ДНК - полимеразой – обратной транскриптазой. Замечательно, что она подавляется ингибиторами РНК – полимеразы, т. е. прямой транскриптазы – рифамицинами и стрептоварицином, - но не ингибиторами ДНК – зависимой ДНК – полимеразы (Gurgo et al 1971 Brockman et al 1971). Обратная УМКД 042-1822.1.10/01-2015 Редакция № от 2015 г. Страница 58 из 116 транскриптаза угнетается также некоторыми производными тиосемикарбазона, например N – метилизатин – ß – тиосемикарбазоном – довольно известным противовирусным агентом. А priori можно также предположить возможность непосредственного подавления ДНК – полимеразы или искажения структуры ДНК – матрицы некоторыми аналогами оснований и их нуклеозидами. Оказалось, что многие из них включаются в состав ДНК, но не снижают значительно ее матричной активности. В тоже время эти и очень большое число других аналогов оснований, в частности азопроизводных и нуклеозидов с необычным или модифицированном углеводным компонентом, подавляют и искажают синтез нормальных оснований, нуклеозидов и нуклеотидов, косвенно тормозя, синтез ДНК in viva. Однако в настоящее время можно все же назвать некоторые аналоги основания и нуклеозидов, для которых установлено непосредственное, значительное подавление матричного синтеза ДНК. Особого упоминания заслуживает подавляющее действие бромдезоксиуридина на процесс обратной транскрипции. Этот эффект используют в качестве одного из тестов для дифференциации РНК – зависимых и ДНК – зависимых ДНК – полимераз, так как последнии не ингибируются этим аналогом. Некоторые довольно избирательные ингибиторы синтеза ДНК, применяемые в качестве антибактериальных и антимитотических агентов, механизм действия которых пока не ясен. К ним относятся фенилэтиловый спирт применяемый как антибактериальный агент при лечении глазных болезней, саркомицин и колхицин, обладающии противоопухолевой активностью. Фенилэтиловый спирт подавляет начало синтеза ДНК хромосомы, нарушая взаимодействие с мембранами клетка (Masker, Eberle,1972). Вопросы: 1. В чем отличие в формулах хлорокина и хинокрина? 2. Какие антибиотики избирательно блокируют ДНК – матрицу? 3. Какие основные белки обратимо блокируют ДНК – матрицу и тормозят редупликацию? 4. Какой эффективный ингибитор синтеза и ДНК, и РНК как у бактерий, так и у эукариотов относится к группе прочно блокирующих матрицу агентов? Литература: 7.1-7.1.7 (основная),7.2.1- 7.2.10 (дополнительная) Модуль 4 Денатурация и ренатурация нуклеиновых кислот Лекция № 12 Тема: Молекулярные механизмы переноса и обмена вещества наследственности. Генетическя инженерия План лекции: Репарация ДНК. УМКД 042-1822.1.10/01-2015 Редакция № от 2015 г. Страница 59 из 116 Генетическая рекомбинация, трансдукция, трансформация. Методы генетической инженерии Оснащение: проектор, слайды Репарация ДНК. Известны два типа репарации: прямая и эксцизионная (от англ. excision - вырезание). Прямая репарация - наиболее простой путь устранения повреждений в ДНК, в котором обычно задействованы специфические ферменты, способные быстро (как правило, в одну стадию) устранять соответствующее повреждение, восстанавливая исходную структуру нуклеотидов. Эксцизионная репарация включает удаление поврежденных азотистых оснований из ДНК и последующее восстановление нормальной структуры молекулы. Передача наследственной информации в неискаженном виде – важнейшее условие выживания как отдельного организма, так и вида в целом. Большинство изменений в структуре ДНК совершенно недопустимы: они либо ведут к вредным мутациям, либо блокируют репликацию ДНК и вызывают гибель клеток. ДНК постоянно подвергаеся химичским изменениям в результате воздействия как спонтанных, так и индуцированных факторов среды. К спонтанным повреждениям относятся: ошибки репликации (в результате появляются некомплементрные пары нуклеотидов - мисмэтчи); апуринизация (отщепление азотистых оснований от сахаро-фосфатного остова- образование АРсайтов) и дезаминирование (отщепление аминогруппы от азотистого основания). К индуцируемым повреждениям относят: димеризацию (сшивание соседних пиримидиновых оснований с образованием димера); размыкание пуринового кольца; однонитевые и двунитевые разрывы в ДНК; сшивки между цепями ДНК. В ходе эволюции выработалась система, позволяющая исправлять нарушения в ДНК, вызанными ошибками репликации или повреждающими агентами внешней среды – система репаации ДНК Исторически первым объектом генетических исследований явилась гибридизация животных и растений. Основой её является сочетание хромосомы отцовского и материнского организмов , а также кроссинговер, обеспечивающий различные сочетания частей хромосом и теровнов применяемых в этой области, генетическая рекомбинация является наиболее общим. Она подразумевает различные устойчивые сочетания фрагментов вещества наследственности, образуемые при половых процессах или их эквивалентах и передающиеся потомству. Рекомбинация у вирусов – наиболее простой из этих процессов. Нужно учитывать, что простота эта относится главным образом к рекомбинирующим ДНК. Энзиматические же механизмы рекомбинации вирусов могут быть сложными за счет возможного использования вирусом энзимов клетки-хозяина. В силу особенностей методов гибридизации и клонирования наиболее удобным объектом оказались бактериальные вирусы- фаги. Чрезвычайно высокий темп их размножения ( минуты-десятки минут), относительная простота отбора потомства одной вирусной частицы, а также популяции, образовавшейся на одной клетке-хозяине, наличие удобных для регистрации генетических маркеров и, наконец, высокая интенсивность УМКД 042-1822.1.10/01-2015 Редакция № от 2015 г. Страница 60 из 116 рекомбинации- для Т чётных колифагов около 5 актов за генерацию-всё это определило выбор именно фаговой модели. Наиболее вероятными механизмами рекомбинации фагов: 1)выборочным копированием; 2) разрывом рекомбинирующих двуцепочных молекул в строго одинаковых местах по обеим цепям сразу и последующим воссоединением отрезков из разных ДНК;3) разрывом ДНК в местах близких, но не совпадающих ни в обеих цепях, ни в рекомбинирующих молекулах, опять таки с дальнейшим перекрестным соединением. Наиболее простым являются первые два гипотетических механизма, но оба они связаны с предположениями, которые по мере изучения процессов редупликации ДНК представлялись всё менее и менее естественными. «Переброска» синтеза с одной матрицы на др. необъяснима с точки зрения закономерностей действия ДНК-полимеразы. Также очень трудно допустить координированные разрывы сразу по обеим цепям точно совпадающих в местах. Для таких сложных образований, как хромосомы многоклеточных предположение о включение каких то специфических механизмов в месте синопса имеет определенную вероятность, но для вирусных ДНК оно представляется искусственным. Вместе с тем принятие третьего механизма требует объяснения процессов заполнения брешей, которые неизбежно выявятся при воссоединение неровно и неточно “обрезанных” концов. Различные эксперементы исследователей позволили отвергнуть предположение о необходимости редупликации всей хромосом для образования рекомбинации, а следовательно отвергнуть механизм выборочного копирования. Различные данные позволяют отклонить механизм выборочного копирования, но не позволяют сделать выбор между механизмами совпадающими и несовпадающими местами разрыва цепей. В летиратуре также немало данных и о том, что протекание процессов синтеза ДНК является непременным условием рекомбинации. Подавление их ядами репликации останавливает и рекомбинацию. Следует обратить внимание на общность ряда механизмов рекомбинации и репарации. Простешие вирусы типа РНК - фагов могут использовать для этого часть энзимов репарации заражаемой клетки (полимераза может быть собственной) а сложноорганизованные ДНК-вирусы могут индуцировать синтез собственных нуклеаз, лигаз и ДНК - полимераз. Пока очень мало известно о тонких биохимических механизмах Кроссинговера хромосом у высших организмов. Можно лишь полагать, что, кроме использование обычных систем репарации, эволюция создала специальные сисетмы активирующие процессы разрезания из шивки хромосом в области их синапсов. Возможно такие специализированные механизмы способны обеспечивать разрезание в очень близких, если не совсем совпадающих, точках хромосом, что должно уменьшить размер гетерозиготной области или вообще свисти ее на нет. К настоящему времени разрезание биспиральной ДНК при соматическом Кроссинговере у высших организмов доказано генетическими методами Н.П.Дубининым. Однако в отличие от предложения с прокариотами здесь еще нет обоснованных гипотез о биохимических механизмов процесса. УМКД 042-1822.1.10/01-2015 Редакция № от 2015 г. Страница 61 из 116 Трансдукция. Основой трансдукции является существование особой категории вирусов, хромосома которых способна временно включаться в хромосому заражаемой клетки. У бактерий обнаружено немало таких фагов, а у животных таким свойством обладают опухолеродные вирусы. Войдя в состав хромосомы хозяина, вирусная ДНК (её называют провирусом), не оказывает ни какого влияния на физиологическое состояние клетки. Выходя из состава хромосомы хозяина, провирус способен захватить с собой довольно значительный её фрагмент-до нескольких десятков миллионов дальтон, т.е. около 1% хромосомы. Этим фрагментом он замещает часть своей собственной хромосомы, что делает его дефектным по ряду признаков, хотя заражающую способность он сохраняет. Перед выходом трансдуцирующего провируса из хромосомы образуется петля, в которой наряду с большей частью вирусной ДНК оказывается и часть ДНК хозяина. Отделяясь от хромосомы, петля замыкается в кольцевую молекулу ДНК. При заражении следующей клетки кольцевая ДНК контактирует с хромосомой в области, где содержатся аналогичные переносимым гены, и после разрывов в близких точках происходит не обмен, а именно некоторое дополнение хромосомы в клетке реципиенте. Различают трансдукцию неспецифическую и специфическую. Первая характеризуется тем, что ДНК вируса внедряется в любую область хромосомы заражаемой клетки. Поэтому могут переносится самые разнообразные участки хромосомы донора. Большой интерес представляет специфическая трансдукция, при которой ДНК вируса присоединяется к строго определённому месту хромосомы хозяина. Трансформация. Под трансформацией подразумевается наследуемое изменение свойств организма, наступающее в результате захвата клеткой фрагмента ДНК другого организма. При этом фрагмент ДНК взаимодействует с клеткой как таковой, не будучи связан с каким -либо «помощниками»,-факторами, облегчающими проникновение ДНК в клетку и внедрение в хромосому хозяина. Возможность и вероятность трансформации у бактерий определяется в основном двумя факторами: 1)степенью родства донора и реципиента и 2) так называемой компетентностью клеток реципиента. Сравнительная характеристика разных форм генетического переноса В заключении сравним особенности основных форм переноса и обмена вещества наследственности, встречающихся в природе. Прежде всего они существенно различаются по количеству переносимого, обмениваемого и интегрируемого генетического материала. Практически нет ограничений в размере переносимых фрагментов хромосом при рекомбинациях у вирусов и высших организмов. Очень значительные могут быть переносимые фрагменты и при сексдукции, хотя перенос целой хромосомы в этом случае -редкость. Напротив при трансформации и трансдукции переносятся и интегрируются лишь очень небольшие части хромосом. При сексдукции, в отличие от рекомбинации у вирусов и высших организмов, отмечается преобладание количества переносимой ДНК над количеством ДНК, вступающей в УМКД 042-1822.1.10/01-2015 Редакция № от 2015 г. Страница 62 из 116 рекомбинацию. Сексдукция отличает также необходимость предварительной репликации хромосомы у донора и достройка одиночной цепи донора до биспиральной молекулы после переноса. Трансформацию существенно отличает от всех других сравниваемых процессов то, что она ведет в основном к замещению только одной из цепей в хромосоме хозяина. Подобная ситуация при других процессах возникает лишь в небольших по размеру гетерозиготных участках соединения цепей при рекомбинации фрагментов ДНК. Трансдукция отличается именно тем, что она сопровождается включением дополнительного фрагмента, а не обменом. Наконец, очень резкими являются различия вспомогательных механизмов, подготовляющих или провоцирующих тот или иной процесс. У вирусов такого специального механизма практически нетнеобходимо лишь совместное синхронное заражение одной клетки. Для трансформации эволюция, по-видимому, так же не выработала специальных обеспечивающих систем. Трансдукция при всём своём значении не может рассматриваться в числе ведущих естественных механизмов обмена и переноса вещества наследственности. Сексдукция включает процесс конъюгации простейший из известных половых процессов. Очевидно, однако, что он не сопряжён с процессом размножения бактерий и имеет, так сказать, весьма необязательный характер. Только у высших организмов половые процессы жёстко сопряжены с размножением, и при каждом слиянии мужской и женской половых клеток создаются условия для обмена веществом наследственности. Из представленного сопоставления следует заключение о наибольшем совершенстве механизмов генетического переноса у высших организмов, поскольку отсутствие ограничений в размерах обмениваемых фрагментов хромосом сочетается у них с обязательностью или преобладанием полового размножения, обеспечивающего наибольшую вероятность обмена хромосом и их фрагментов. Генетическая инженерия. Датой рождения генетической инженерии считают 1972 г. Создание генетической инженерии имело огромное значение для молекулярной биологии. Благодаря ее методам практически структура и функции любого гена и продуктов экспрессии (РНК и белки) стали доступны для исследования. Триумф генетической инженерии в конце ХХ в. связан с развитием в ее недрах новых, быстро совершенствовававшихся методов исследований. Среди этих методов следует выделить основные пять: - расщепление ДНК (рестрикция) , что необходимо для выделения генов и манипуляции с ними; - гибридизация нуклеиновых кислот, которая благодаря их способности связываться друг с другом комплементарному принципу , позволяет выявлять специфические последовательности ДНК и РНК , а также совмещать различные генетические элементы; используется в цепной полимеразной реакции для амплификации ДНК in uitro; - клонирование ДНК, осуществляется путем введения фрагментов ДНК или их групп в быстро реплицирующиеся генетические элементы (плазмиды и УМКД 042-1822.1.10/01-2015 Редакция № от 2015 г. Страница 63 из 116 вирусы) что дает возможность размножать гены в клетках бактерий, дрожжей или эукариот; - определение нуклеотидных последовательностей (секвенирование) вклонируемом фрагменте вДНК, что позволяет определить структуру генов и аминокислотную последовательность кодируемых белков; -химико- фермнтативный синтез полинуклеотидов, часто необходимый для целенаправленной модификации генов и облегчает манипуляции с ними. Следует отметить, что возникновение генетической инженерии было напрямую связано с открытим целой серии ферментов, оказавшихся незаменимыми инструментами для манипулирования с генами, ввиду практически полного отсутствия соответствующих химических методов, позволющих получить , модифицировать и амплифицировать рекомбинатные молекулы ДНК. Вопросы для самоконтроля: 1.Что такое трансформация? 2.Что такое трансдукция? 3. Что изучает генетическая инженерия 4. Перечислите методы генетической инженерии Литература: 7.1-7.1.7 (основная),7.2.1- 7.2.10 (дополнительная) Модуль 4 Денатурация и ренатурация нуклеиновых кислот Лекция № 13 Тема: Мутационные изменения нуклеиновых кислот План лекции: Мутационные изменения нуклеиновых кислот. Мутагены и механизмы их действия. Генные мутации. Гены мутаторы. Генотипическая изменчивость, комбинативная изменчивость, мутационная изменчивость. Классификация мутаций Оснащение: проектор, слайды Мутагенез - процесс возникновения в организме наследственных изменений — мутаций, в основе которого лежат изменения в молекулах нуклеиновых кислот, хранящих и передающих наследственную информацию. Мутации – это качественные изменения генетического материала, приводящие к изменению тех или иных признаков организма. В основе мутагенеза лежит изменение или исключение фрагмента генетической нуклеиновой кислоты. При этом может возникнуть, во-первых, обрыв транскрипции на измененном участке ДНК. Он может быть обусловлен и разрывом цепи ДНК, и выпадением фрагмента ДНК (деления), и различного рода наследуемыми превращениями оснований. Если эти изменения затрагивают акцепторные участки оперона, то образование соответствующих мРНК и, далее, белков будет исключено полностью. Если изменения возникают в структурных цистронах, то возможно образование неполной УМКД 042-1822.1.10/01-2015 Редакция № от 2015 г. Страница 64 из 116 мРНК и, соответственно, некоторых количеств неполных, недостроенных пептидов. Во- вторых, мутация, затрагивающая только одно основание ( так называемая тосковая мутация) может, в конечном счете, вызвать такую замену оснований в одном из триплетов, что образуются нонсенс-кодоны, т.е. кодоны терминации ( УАГ, УАА, УГА). В этом случае образуется мРНК, соответствующая всему цистрону, но трансляция этой мРНК оборвется на нонсенс-кодоне, и пептид опять-таки окажется недостроенным. Такие мутации называют нонсенс-мутациями. Далее, при замене оснований возможно преобразование триплета в кодон другой аминокилоты. Эти мутации, изменяющие смысл информации, называют миссенс - мутациями. Особое положение занимают мутации, обусловленные вставкой или потерей нуклеотида, -так называемые мутации со сдвигом рамки. Генотипическая изменчивость. Генетика изучает процессы преемственности жизни на молекулярном, клеточным, организменном и популяционном уровне. Генетика человека говорит о законах наследственности и изменчивости у человека в норме и при патологиях. Так что же такое изменчивость? Генотипическая изменчивость – изменения, произошедшие в структуре генотипа и передаваемые по наследству. К этому типу изменчивости относят комбинативную и мутационную изменчивости, которые ведут к увеличению внутривидового разнообразие в природе. Предполагалось, что именно изменчивости таких типов мутаций и сыграли немаловажную роль в мировой эволюции. Комбинативная изменчивость. Комбинативная изменчивость возникла с появлением полового размножения, она связана с различными вариантами перекомбинации родительских задатков и является источником бесконечного разнообразия сочетаемых признаков. Так, дети, рожденные в разное время у одной родительской пары, похожи, но всегда отличаются рядом признаков. Кобинативная изменчивость обуславливается вероятностным участием гамет в оплодотворении, имеющих различные перекомбинации хромосом родителей. При этом минимальное число возможных сортов гамет у мужчин и женщин огромно, оно равно 223 (без учета кроссинговера). Поэтому вероятность рождения на земле двух одинаковых людей ничтожно мала. Большой вклад в комбинативную изменчивость вносит как раз кроссинговер, приводящий к образованию новых групп сцепления благодаря рекомбинации аллелей. Этот закон окончательно был сформулирован в 1908 английским математиком Харди и немецким врачом-биологм Венбергом. И теперь этот закон носит имя закон Харди-Венберга. Мутационная изменчивость. Мутационная изменчивость связана с процессом образования мутаций. Мутации – это внезапные скачкообразные стойкие изменения в структуре генотипа. Организмы у которых произошла мутация называются мутунтами. Мутационная теория была создана, как говорилось выше, Гуго де Фризом в 1901-1903 гг. На основных ее положениях строица современная генетика: мутации, дискретные изменения наследственности, в УМКД 042-1822.1.10/01-2015 Редакция № от 2015 г. Страница 65 из 116 природе спонтанны, мутации передаются по наследству, встречаются достаточно редко и могут быть различных типов. В зависимости от того какой признак положен в основу, на сегоднешний день существует несколько систем классификации мутаций. Классификация мутаций 1. По способу возникновения. Различают спонтанные и индуцированные мутации. Спонтанные мутации — это возникновение мутаций под влиянием обычных природных факторов внешней среды или в результате физиологии, и биохимических изменений в самом организме. Индуцированные мутации— процесс возникновения наследственных изменений под влиянием направленного, специального воздействия определенных факторов внешней и внутренней среды (ионизирующей радиации, химических веществ, экстремальных условий и т.д.). 2. По отношению к зачатковому пути. Существуют соматические и генеративные мутации. Генеративные мутации возникают в репродуктивных тканях и поэтому не всегда выявляются. Для того, чтобы выявилась генеративная мутация, необходимо, чтобы мутантная гамета учавствовала в оплодотворении. 3. По адаптивному занчению. Выделяют положительные, отрицательные и нейтральные мутации. Эта классификация связана с оценкой жизнеспособности образовавшегося мутанта. 4. По изменению генотипа. Мутации бывают генные, хромосомные и геномные геномные. 5. По локализации в клетке. Мутации делятся на ядерные и цитоплазматические. Плазматические мутации возникают в результате мутаций в плазмогенах, находящихяс в митохондриях. Полагают, что именно они приводят к мужскому бесплодию. Причем такие мутации в основном наследуются по женской линии. Генные ( точковые ) мутации затрагивают, как правило, один или несколько нуклеотидов, при этом один нуклеотид может превратиться в другой, может выпасть(делеция), продублироваться, а группа нуклеотидов может развернутся на 180 градусов. Например, широко известен ген человека, ответственный за серповидно – клеточную анемию, который может привести к летальному исходу. Соответствующий нормальный ген кодирует одну из полипептидныз цепей гемоглобина. У мутантного гена нарушен всего один нуклеотид (ГАА на ГУА). В результате в цепи гемоглобина одна аминокислота заменена на другую( вместо глутамина – валин). Казалось бы ничтожное изменение, но оно влечет за собой роковые последствия: эритроцит деформируется, приобретая серповидно – клеточную форму, и уже не способен транспортировать кислород, что и приводит к гибели организма. Генные мутации приводят к изменению аминокислотной последовательности белка. Наиболее вероятное мутация генов происходит при спаривание тесно связанных организмов, которые унаследовали мутантный ген у общего предка. По этой причине вероятность возникновения мутации повышается у детей, чьи родители являются УМКД 042-1822.1.10/01-2015 Редакция № от 2015 г. Страница 66 из 116 родственниками. Генные мутации приводят к таким заболеваниям, как амавротическая идиотия, альбинизм, дальтонизм и др. Интересно, что значимость нуклеотидных мутаций внутри кодона неравнозначна: замена первого и второго нуклеотида всегда приводит к изменению аминокислоты, третий же обычно не приводит к замене белка. К примеру, "Молчащая мутация"- изменение нуклеотидной последовательности, которая приводит к образованию схожего кодона, в результате аминокилотная последовательность белка не меняется. Хромосомные мутации приводят к изменению числа, размеров и организации хромосом, поэтому их иногда называют хромосомными перестройками. Хромосомные перестройки делятся на внутри- и межхромосомные. К внутрехромосмным относятся: Дубликация – один из участков хромосомы представлен более одного раза. Делеция – утрачивается внутренний участок хромосомы. Инверсия –повороты участка хромосомы на 180 градусов. Межхромосомные перестройки (их еще называют транслокации) делятся на: Реципрокные – обмен участками негомологичных хромосом. Нереципрокные – изменение положения участка хромосомы. Дицентрические – слияние фрагментов негомологичных хромосом. Центрические – слияние центромер негомологичных хромосом. Хромосомные мутации проявляются у 1% новорожденных. Однако интересно, исследования показали, что нестабильность соматических клеток здоровых доноров не исключение, а норма. В связи с этим была высказана гипотеза о том, что нестабильность соматических клеток следует рассматривать не только как патологическое состояние, но и как адаптивную реакцию организма на измененные условия внутренней среды. Хромосомные мутации могут обладать фенотипическими явлениями. Наиболее распостраненный пример - синдром "Кошачьего крика" (плачь ребенка напоминает мяукание кошки). Обычно носители такой делеции погибают в младенчестве. Хромосомные мутации часто приводят к паталогическим нарушениям в организме, но в то же время хромосомные перестройки сыграли одну из ведущих ролей в эволюции. Так, у человека 23 пары хромосом, а у обезьяны - 24. Таким образом различие составляет всего одна хромосома. Ученые предполагают, что в процессе эволюции произошла хотя бы одна перестройка. Подтверждением этого может служить и тот факт, что 17 хромосома человека отличается от такой же хромосомы шимпанзе лишь одной перецентрической инверсией. Такие рассуждения во многом подтверждают теорию Дарвина. Геномные мутации.Главная отличительная черта геномных мутаций связана с нарушением числа хромосом в кариотипе. Эти мутации так же подразделяются на два вида: полиплоидные анеуплоидные. Полиплоидные мутации ведут к изменению хромосом в кариотипе, которое кратно гаплоидному набору хромосом. Этот синдром впервые был лишь обнаружен в 60-ых годах. Вообще полиплодия характерна в основном для человека, а среди животных встречается крайне редко. При полиплоидии число УМКД 042-1822.1.10/01-2015 Редакция № от 2015 г. Страница 67 из 116 хромосом в клетке насчитывается по 69 (триплодие), а иногда и по 92 (тетраплодие) хромосомы. Такое изменение ведет практически к 100 % смерти зародыша. Триплодие имеет не только многочисленные пороки, но и приводит к потере жизнеспособности. Тетраплодие встречается еще реже, но так же зачастую приводит к летальному исходу. Анеуплоидные же мутации приводят к изменению числа хромосом в кариотипе, некратное гаплоидному набору. В результате такой мутации возникают осыби с аномальным чилом хромосом. Как и триплодия, анеуплодия часто приводит к смерти еще на ранних этапах развития зародыша. Причиной же таких последствий является утрата целой группы сцепления генов в кариотипе. В цело же, механизм возникновения геномных мутаций связан с патологией нарушения нормального расхождения хромосом в мейозе, в результате чего образуются аномальные гаметы, что и ведет к мутации. Изменения в организме связаны с присутствием генетически разнородных клеток. Такой процесс называется мозаицизм. Геномные мутации одни из самых страшных. Они ведут к таким заболеваниям, как синдром Дауна (трисомия, возникает с частотой 1 больной на 600 новорожденных), синдром Клайнфельтера и др. Спонтанные мутации. Мутации, помимо качественных свойств, характеризует и способ возникновения. Спонтанные (случайные) – мутации, возникающие при нормальных условиях жизни. Спонтанный процесс зависит от внешних и внутренних факторов (биологические, химические, физические). Спонтанные мутации возникают у человека в соматических и генеративных тканях. Метод определения спонтанных мутаций основан на том, что у детей появляется доминантный признак, хотя у его родителей он отсутствует. Проведенное в Дании исследование показали, что примерно одна из 24000 гамет несет в себе доминантную мутацию. Ученый же Холдейн рассчитал среднюю вероятность появления спонтанных мутаций, которая оказалась равна 5*10-5 за поколение. Другой ученый Курт Браун предложил прямой метод оценки таких мутаций, а именно: число мутаций разделить на удвоенное количество обследованных индивидов. Индуцированный мутагенез – это искусственное получение мутаций с помощью мутагенов различной природы. Впервые способность ионизирующих излучений вызывать мутации была обнаружена Г.А. Надсоном и Г.С. Филлиповым. Затем, проводя обширные исследования, была установлена радиобиологическая зависимость мутаций. В 1927 году американским ученым Джозефом Мюллером было доказано, что частота мутаций увеличивается с увеличением дозы воздействия. В конце сороковых годов открыли существование мощных химических мутагенов, которые вызывали серьезные повреждения ДНК человека для целого ряда вирусов. Одним из примеров воздействия мутагенов на человека может служить эндомитоз – удвоение хромосом с последующим делением центромер, но без расхождения хромосом. УМКД 042-1822.1.10/01-2015 Редакция № от 2015 г. Страница 68 из 116 Мутационный процесс является главным источником изменений, приводящим к различным патологиям. Задачи науки на ближайшие время определяются как уменьшения генетического груза путем предотвращения или снижения вероятности мутаций и устранения возникших в ДНК изменений с помощью генной инженерии. Генная инженерия - новое направление в молекулярной биологии, появившееся в последние время, котоое может в будущем обратить мутации на пользу человеку, в частности, эффективно бороться с вирусами. Уже сейчас существуют вещества называемые антимутагены, которые приводят к ослаблению темпов мутирования. Успехи современной генетики находят применение в диагностики, профилактике и лечении ряда наследственных патологий. Так, в 1997 году в США была получена рекомбинативная ДНК. С помощью генной инженерии уже сконструированы искусственные гены инсулина, интерферона и других веществ. Вопросы для самоконтроля: 1.Что такое мутационные изменения нуклеиновых кислот? 2.Перечислите виды мутацй Литература: 7.1-7.1.7 (основная),7.2.1- 7.2.10 (дополнительная) Модуль 4 Денатурация и ренатурация нуклеиновых кислот Лекция № 14 Тема: Технология рекомбинантных ДНК План лекции: Понятие о рекомбинантных ДНК. Клонирование генов. Гибридизация нуклеиновых кислот. Задачи и достижения биотехнологии. Биотехнология растений. Трансгенные животные. Битехнология микроорганизмов. Лечение молекулярных болезней. Образование опухолей у растений. Опухоли вызываемые ДНК-вирусами, РНК-вирусами Оснащение: проектор, слайды В конце 70-х годов в биохимии был разработан ряд новых методологических подходов, ознаменовавших начало эры генетической инженерии. Методы рекомбинантных ДНК, перевернувшие наши представления о возможностях биотехнологии в сфере удовлетворения потребностей человека, позволяют направленно конструировать генетический материал, вводить его в живые клетки и с помощью последних реализовать эту генетическую информацию. Кроме того, благодаря технологии рекомбинантных ДНК значительно ускорились темпы расширения и развития наших знаний о функциях ДНК, организации генов, регуляции их экспрессии, первичной структуре белков, что в свою очередь создает основу для понимания природы различных заболеваний и борьбы с ними. Возможность введения УМКД 042-1822.1.10/01-2015 Редакция № от 2015 г. Страница 69 из 116 любых сегментов ДНК. в клетки позволяет создавать промышленные микроорганизмы, способные синтезировать ценнейшие белки. В этом разделе мы уделим основное внимание применению генетической инженерии в промышленности и использованию в качестве организма-хозяина бактерии Escherichia coli. Технология рекомбинантных ДНК - изменение с помощью биохимических и генетических методик хромосомного материала - основного наследственного вещества клеток. Хромосомный материал состоит из дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК). Биологи изолируют те или иные участки ДНК, соединяют их в новых комбинациях и переносят из одной клетки в другую. В результате удается осуществить такие изменения генома, которые естественным путем вряд ли могли бы возникнуть. Молекула ДНК, собранная из кусочков ДНК различных организмов, называется рекомбинантной. Получение рекомбинантных ДНК в количестве, необходимом для проведения генетической модификации, позволяет прейти к трансформации растительных клеток. Благодаря тому, что многие клетки растений тотипотентны (Тотипотентность способность клетки путем деления дать, начало любому клеточному типу организма.), то есть из любой растительной клетки может вырасти целое плодоносящее растение, получение трансгенных растений из трансформированных клеток не представляет затруднений. Под рекомбинантными ДНК понимают образованные объединением in vitro (вне организма) (в пробирке) двух или более фрагментов ДНК, выделенных из различных биологических источников. Определенные фрагменты ДНК, в т.ч. и фрагменты, содержащие гены, получают с использованием рестриктаз. Рестриктазы могут образовывать фрагменты, как с «тупыми», так и с «липкими» концами. Соединение фрагментов ДНК в единую молекулу производится несколькими методами, зависящими от того, какие концы имеют фрагменты сшиваемых ДНК. Технология рекомбинантных ДНК или молекулярное клонирование — это совокупность экспериментальных процедур, позволяющая осуществлять перенос генетического материала (ДНК) из одного организма в другой. Часто эксперименты с рекомбинантной ДНК проводят по следующей схеме: -из организма - донора нужных генов экстрагируют нашивную (чужеродную, клонируемую) ДНК; подвергают ее ферментативному гидролизу (расщепляют, разрезают) и соединяют (лигируют, сшивают) с другой ДНК (вектор для клонирования) с образованием новой рекомбинантной молекулы (конструкция «клонирующий вектор - встроенная ДНК»); -эту конструкцию вводят в клетку-хозяина (реципиент), где она реплицируется и передается потомкам. Этот процесс называется трансформацией; -идентифицируют и отбирают клетки, несущие рекомбинантную ДНК (трансформированные клетки); УМКД 042-1822.1.10/01-2015 Редакция № от 2015 г. Страница 70 из 116 -получают специфический белковый продукт, синтезированный клетками хозяевами, что служит подтверждением клонирования искомого гена. Ключевой операцией в генетической инженерии является введение в клетку и стабильное поддержание генетической информации, содержащейся в рекомбинантных молекулах ДНК. Это достигается при помощи векторных молекул, или векторов. Векторами называются молекулы ДНК, способные встраивать чужеродную ДНК и обеспечивающие ее репликацию и трансформацию (перенос в другие организмы). Таким образом, вектор позволяет осуществить введение в клетку дополнительной генетической информации. В качестве векторов используют, как правило, плазмиды, бактериофаги, вирусы, космиды, мобильные элементы По профилю использования их можно разделить на несколько типов. Современные векторные системы часто бывают полифункциональными, совмещая несколько функций в одном векторе. К векторной молекуле предъявляются следующие основные требования: -вектор должен содержать уникальные сайты рестрикции для нескольких рестриктаз, что делает возможным встроить в него фрагмент чужеродной ДНК; - вектор должен обладать определенной емкостью и не абортировать встроенный фрагмент; - вектор должен реплицироваться в определенных клетках; - вектор должен содержать последовательность маркерного гена, облегчающего селекцию клеток, несущих векторную конструкцию. Впервые плазмида в качестве вектора была использована в 1973 г. в лаборатории П.Берга. Эксперименты проводились с небольшой плазмидой E.coli, несущей ген устойчивости к антибиотику тетрациклину. Она содержала только один сайт рестрикции. Под действием рестриктазы Eco R 1 кольцевая плазмида превращалась в линейную молекулу с «липкими» концами. Такую ДНК плазмиды смешивали с фрагментом чужеродной для кишечной палочки ДНК (ДНК золотистого стафилококка). Вирусы часто используют в качестве векторов, проникающих в животные клетки. Наиболее широко в генетической инженерии используют обезьяний онкогенный вирус ОВ-40. Он относится к мелким вирусам, его ДНК состоит из 5200 н.п. Геном этого вируса обладает способностью встраиваться в хромосомы клеток млекопитающих. Иногда вирус ОВ-40 превращается в вирион, в котором внутри белковой оболочки содержится не ДНК вируса, а ДНК клетки - хозяина. С помощью вируса ОВ-40 гены Р - цепи гемоглобина мыши и кролика были перенесены в клетки обезьян, где они активно функционируют. Возникновение злокачественных (раковых) опухолей может иметь различные причины, однако во всех случаях к этому причастен генетический материал клетки – ее ДНК. Что бы ни привело к образованию опухоли (раковому перерождению), последующим ростом ткани управляет ДНК безудержно делящихся опухолевых клеток. В основе превращения нормальной УМКД 042-1822.1.10/01-2015 Редакция № от 2015 г. Страница 71 из 116 клетки в злокачественную – опухолевой трансформации – лежит перенос или иное изменение ДНК. Агент, вызывающий пролиферацию клеток, - это продукт гена. До сих пор, правда, не удается создать общую теорию, которая охватывала бы все формы ракового перерождения, однако изучение злокачественных опухолей, вызванных вирусами и плазмидами, уже сейчас позволяет сделать далеко идущие выводы. «Злокачественный рост-это не дикий, хаотичный, неорганизованный и атипичный рост, а упорядоченный рост с закономерной дифференцировкой, Рассмотрим три примера онкогенеза: 1) образование опухолей у растений, 2) развитие опухолей у животных под воздействием ДНК-вирусов 3) развитие опухолей у животных под воздействием РНК-вирусов (ретровирусов). Образование опухолей у растений У многих растений встречаются опухоли корневой шейки. Эти разрастания ткани уменьшают поток питательных веществ между подземными и надземными частями. У многих растений такие опухоли можно вызвать экспериментально; типичные результаты получаются больше чем у половины изученных видов. Возбудителем является Agrobacterium tumefaciens – грамотрицательная почвенная бактерия с перитрихальными жгутиками, сходная с представителем рода Rhizobium. Бактерии проникают в ткань через поврежденные участки и размножаются в межклетниках. Бывают вирулентные и авирулентные штаммы A. tumefaciens; вирулентные содержат большую плазмиду, так называемую Ti-плазмиду (Ti – Tumor Inducing, индуцирующая опухоль). После заражения ткани плазмиды проникают в растительные клетки. Плазмидная ДНК прочно интегрируется в хромосомную ДНК растительных клеток и вызывает их опухолевый рост. Путем прививки таких клеток можно передать опухоль здоровому растению; таким образом, после того как клетки претерпели опухолевую трансформацию, бактерия и ее плазмида становятся уже ненужными. Интегрированная ДНК плазмиды ответственна также за способность клеток, вырабатывать новые ферменты, с помощью которых синтезируются аминокислоты октопин и нопалин, так называемые опины. Эти аминокислоты могут использоваться бактерией A. tumefaciens в качестве источника углерода и азота. Благодаря Ti-плазмиде Agrobacterium получает, таким образом, преимущественный доступ к продуктам фотосинтеза растения: Ti-плазмида обеспечивает образование аминокислот, которые могут быть усвоены только этой бактерией. Наряду с этим Ti-плазмида представляет собой естественный генный вектор для переноса чужеродной ДНК в растения. Гены, определяющие опухолевый рост, можно выделить из плазмиды и заменить другими генами. Из тканей, состоящих из клеток, трансформированных видоизмененной плазмидой, удавалось регенерировать целые растения табака, которые росли совершенно нормально и вдобавок ко всему синтезировали опины. Таким образом, гены чужеродной ДНК передавались как доминантные факторы в соответствии с обычными законами наследственности. УМКД 042-1822.1.10/01-2015 Редакция № от 2015 г. Страница 72 из 116 Поиски путей введения чужеродных генов в клетки высших растений интенсивно ведутся во всем мире с начала 70-х годов. Одним из импульсов к развитию методов переноса чужеродных генов в растения стали результаты детального изучения молекулярно-генетических основ опухолевого роста у растений при участии бактерий рода Agrobacterium. В результате этих исследований оказалось, что опухолеобразующие плазмиды агробактерий, представляющие собой мини-кольцевые ДНК, являются природной векторной системой, которую сейчас используют для переноса генов в растения. Плазмида агробактерии переносит часть своей ДНК в ДНК растительной клетки, в ДНК встраивается "нужный" ген. С помощью этого уникального вектора уже получено большое число трансгенных растений. Важно также то, что методы генной инженерии сейчас используют не только в практике, это важнейшая методология для познания фундаментальных основ организации и функционирования растительного генома. Опухоль, вызываемый у животных ДНК-вирусами Исследования канцерогенеза у животных нередко проводятся на культурах тканей. Если перенести клетки животных, например из органов кур или хомячков, или фибробласты человека в подходящую питательную среду, то на внутренней стенке культурального сосуда они начнут размножаться. Обычно клетки продолжают расти лишь до тех пор, пока не начнут соприкасаться между собой. Из-за контактного торможения образуется только однослойный клеточный газон. Если же эти нормальные клетки инфицировать опухолеродным вирусом, то контактное торможение снимается, клетки продолжают размножаться и начинают надвигаться друг на друга. Многослойный рост наблюдается только у клеток, претерпевших опухолевую трансформацию. Из клеточной массы легко выделить отдельные клетки и таким путем получить чистые линии (клоны) трансформированных клеток. Вирусы полиомы и SV40 ("Обезьяний вирус 40") относятся к группе паповирусов. Они содержат двухцепочечные кольцевые молекулы ДНК. В эксперименте вирус можно перенести для размножения в клетки тканевой культуры. Размножаясь в некоторых (так называемых пермиссивных) клетках, вирус вызывает их лизис, и по мере его размножения клетки гибнут. В других (непермессивных) клетках вирус ведет себя иначе. В этом случае размножение вируса подавляется, и примерно в одной из 105 клеток вирусная ДНК интегрируется в клеточную ДНК. Такое включение вирусной ДНК в геном клетки-хозяина может приводить к опухолевой трансформации. В трансформированной клетке образуется белок (Т-антиген), который запускается репликацию клеточной ДНК, и в результате начинается размножение клеток. Инъекция такого рода трансформированных клеток животым приводит к быстрому образованию опухолей. Опухоль, вызываемый у животных РНК-вирусами. К образованию опухолей у животных могут быть причастны также и РНКвирусы – ретровирусы. Они относятся к икосаэдрическим вирусам с оболочкой и содержат (+)РНК-геном (одноцепочечную РНК). В качестве онкогенных УМКД 042-1822.1.10/01-2015 Редакция № от 2015 г. Страница 73 из 116 вирусов они, например, вызывают саркому Рауса у кур и лейкемию у мышей. Название "ретровирусы" связано с тем, что в их размножении участвует обратная транскриптаза. РНК этих вирусов не может воспроизводиться путем простой репликации – необходима ее предварительная транскрипция в ДНК с последующей интеграцией этой ДНК в одну их хромосом клетки-хозяина. Интеграция – необходимый этап репродукции вируса; только интегрированная вирусная ДНК будет транскрибироваться. Так как интеграция в клеточную ДНК входит в жизненный цикл вируса, частота интеграции очень велика. Вероятно, вирусная ДНК может включаться в клеточную в любом месте. Размножение вируса не приводит к лизису клетки. Нуклеокапсид образуется внтури клетки, перемещается затем к плазматической мембране и выходит наружу, одетый в оболочку из этой мембраны. Интегрированная ДНК ретровируса реплицируется вместе с геномом клетки-хозяина и поэтому содержится в каждой клетке опухоли (саркомы). Опухолевый рост клеток обусловлен экспрессией вирусного гена "src". Этот ген кодирует белок, который по-видимому, представляет собой киназу, фосфорилирующую белки. Можно думать, что эта киназа участвует в преобразовании дифференцированной клетки в клетку эмбрионального типа. Недавно была выяснена последовательность оснований в вирусной РНК. Оказалось, что она сходна в последовательностью одного из генов человека. Отсюда можно заключить, что src – это ген животного происхождения, который в результате неточной транскрипции был включен в РНК вируса вместе с вирусными генами и закрепился в ней. Это мог быть ген, кодирующий важный для эмбриональной клетки фактор роста. Таким образом, опухоли, вызываемые ретровирусами, в конечном счете обусловлены переносом какогото гена животного происхождения в клетку животного. "Рак вызывается вирусами". Это некогда сумасшедшая идея Л. А. Зильбера высказанна еще в середине 30-х годов. То, что вирусы могут вызывать опухоли у мышей, у крыс, у кур - доказано. Но при чем тут человек? Загадка происхождения рака волновала ученых с тех пор, как медики научились распознавать это страшное заболевание. Что вызывает злокачественное перерождение клеток, стремительный лавинообразный их рост, когда, вторгаясь в здоровые ткани и органы, они душат, опутывают, убивают все живое?В начале нашего века выяснилось, что рак может возникнуть под влиянием разных химических веществ, их стали называть канцерогенами. Ртуть и мышьяк, дым сигареты и анилиновые красители, каменноугольная смола и минеральные масла, типографская краска и асбест... Подчас кажется, что лишь горстке из нас каким-то чудом удается выжить в этом канцерогенном океане. Ушел в историю XIX век с его блестящими открытиями в микробиологии, закончился и ХХ, вместе со вторым тысячелетием, с лавиной открытий во всех областях науки и техники. Однако воз и ныне там. До сих пор о причинах развития рака (по научному - этиологии), до сих пор ничего не известно. Конечно, мы знаем, что может служить фактором риска, но почему и у кого завтра разовьется опухоль - никто сказать, к сожалению, пока не может. УМКД 042-1822.1.10/01-2015 Редакция № от 2015 г. Страница 74 из 116 Иммунотерапия опухолей базируется на том, что в организме образуется антитела против чужеродных антигенов. Есть основание думать, что в процессе инволюции иммунная система первично выполняла роль защитного механизма и по отношению к опухолевым клеткам. По этому новообразование могло развиться лишь «в обход» иммунной системе. Отдельные соображение по этому вопросу приставлены на рис. 51.8. Как только размер опухали превысит некоторый придел, иммунной системе перестает быть хозяина положении. По этому, используя иммунотерапию в клинической практики, приходится в начале хирургическим путём удалять опухолевый, а затем преступать к неспецифической стимуляции иммунной системе. Для этого использует, на пример, митоген ВЦЖ, вводя его непосредственно в остатке опухолевой ткани. Этот метод часто применяют при раке кожи (меланоме и др.), но из-за побочного действия это не безопасно. Несмотря на отмеченные обстоятельство, иммунотерапия опухолевой представляется одним из многочисленных методов, но на ее пути встретился ряд непредвиденных трудностей. И. и К. Хеллсрем с сотрудниками обнаружили в сыворотке мышей с опухолью группу так называемых блокирующих факторов, которые препятствовали образование специфические антител против определенных опухолевых клеток (Hellstrom et al., 1978). Такое же наблюдается было сделано впоследствии на животных других видов. Описанные факторы найдены и в клиники у больших раком. Это поставило иммунологов перед почти непреодолимыми трудностями. Блокирующие факторы – это растворимые опухолевые антигены, антитела в комплексы антиген – антител. Их следовало бы удалить из сыворотки перед началом иммунотерапии, но это пока легче сказать, чем сделать. Вопросы для самоконтроля: 1.Какие изменения происходят в клетке при появлении опухолей? 2.Что из себя представляют опухоли у растений? 3. Что подразумевают под иммунотерапией опухолей? 4. Какие изменения вызывает опухоль, вызываемый у животных ДНКвирусами. 5 Какие изменения вызывает опухоль, вызываемый у животных РНК-вирусами. Литература: 7.1-7.1.7 (основная),7.2.1- 7.2.10 (дополнительная) Модуль 4 Денатурация и ренатурация нуклеиновых кислот Лекция№ 15 Тема: Апоптоз . Регуляция апоптоза План лекции: Генетическая запрограммированная смерть клетки. Трансдукция сигнала аппоптоза. Молекулярные механизмы регуляции аппоптоза. Оснащение: проектор, слайды УМКД 042-1822.1.10/01-2015 Редакция № от 2015 г. Страница 75 из 116 В организме здорового человека клеточный гомеостаз определяется балансом между гибелью и пролиферацией клеток. Апоптоз программированная клеточная гибель, энергетически зависимый, генетически контролируемый процесс, который запускается специфическими сигналами и избавляет организм от ослабленных, ненужных или повреждённых клеток. Ежедневно, примерно около 5% клеток организма подвергаются апоптозу, а их место занимают новые клетки. В процессе апоптоза клетка исчезает бесследно в течение 15-120 минут. Морфологически апоптоз проявляется гибелью единичных, беспорядочно расположенных клеток, что сопровождается формированием округлых, окруженных мембраной телец (“апоптотические тельца”), которые тут же фагоцитируются окружающими клетками. Апоптоз - это биохимически специфический тип гибели клетки, который характеризуется активацией нелизосомных эндогенных эндонуклеаз, которые расщепляют ядерную ДНК на маленькие фрагменты. Апоптоз встречается при: 1) устранении клеток во время эмбриогенеза; 2) инволюции гормонально-зависимых органов после снижения действия соответствующего гормона (отторжение эндометрия во время менструации); смерть клеток в опухолях (р53); 4) смерть иммунных клеток В- и Тлимфоцитов после прекращения стимулирующего действия на них цитокинов; 5) атрофия паренхиматозных органов; 6) клеточные повреждения при некоторых вирусных инфекциях (тельца Каунсильмена при вирусном гепатите В); 7) клеточная смерть (при умеренных термических повреждениях, радиации, гипоксии, под действием цитотоксических противоопухолевых препаратов); 8) роговая дистрофия (кератинизация) – вариант апоптоза. Морфологические проявления апоптоза. Апоптоз имеет свои отличительные морфологические признаки, как на светооптическом, так и на ультраструктурном уровне. При окраске гематоксилином и эозином апоптоз определяется в единичных клетках или небольших группах клеток. Апоптотические клетки выглядят как округлые или овальные скопления интенсивно эозинофильной цитоплазмы с плотными фрагментами ядерного хроматина. Поскольку сжатие клетки и формирование апоптотических телец происходит быстро и также быстро они фагоцитируются, распадаются или выбрасываются в просвет органа, то на гистологических препаратах он обнаруживается в случаях его значительной выраженности. К тому же апоптоз - в отличие от некроза - никогда не сопровождается воспалительной реакцией, что также затрудняет его гистологическое выявление. Выделяют три основные характеристики апоптоза: 1)Клетка уменьшается в размерах; цитоплазма уплотняется; органеллы, которые выглядят относительно нормальными, располагаются более компактно. Предполагается, что нарушение формы и объема клетки происходит в результате активации в апоптотических клетках трансглютаминазы. Этот фермент вызывает прогрессивное образование перекрестных связей в цитоплазматических белках, что приводит к формированию своеобразной УМКД 042-1822.1.10/01-2015 Редакция № от 2015 г. Страница 76 из 116 оболочки под клеточной мембраной, подобно ороговевающим клеткам эпителия; 2) конденсация хроматина и образование пузырьков в мембране; 3) фрагментация ДНК на нуклеосомные частицы. Регуляция апоптоза .Апоптоз - это генетически контролируемая смерть клетки. В настоящее время выявлено большое число генов, которые кодируют вещества, необходимые для регуляции апоптоза. Многие из этих генов сохранились в ходе эволюции - от круглых червей до насекомых и млекопитающих. Некоторые из них обнаруживаются также в геноме вирусов. Таким образом, основные биохимические процессы апоптоза в разных экспериментальных системах (исследования ведутся на круглых червях и мухах) являются идентичными, поэтому результаты исследований можно прямо переносить на другие системы (например, организм человека). Апоптоз может регулироваться:1) внешними факторами 2) автономными механизмами. Воздействие внешних факторов: апоптоз может регулироваться действием многих внешних факторов, которые ведут к повреждению ДНК. При невосстановимом повреждении ДНК путем апоптоза происходит элиминация потенциально опасных для организма клеток. В данном процессе большую роль играет ген супрессии опухолей р53. К активации апоптоза также приводят вирусные инфекции, нарушение регуляции клеточного роста, повреждение клетки и потеря контакта с окружающими или основным веществом ткани. Апоптоз - это защита организма от персистенции поврежденных клеток, которые могут оказаться потенциально опасными для многоклеточного организма. Автономные механизмы: При стимуляции тканей каким-либо митогеном ее клетки переходят в состояние повышенной митотической активности, которая обязательно сопровождается некоторой активацией апоптоза. Судьба дочерних клеток (выживут они или подвергнутся апоптозу) зависит от соотношения активаторов и ингибиторов апоптоза: ингибиторы включают факторы роста, клеточный матрикс, половые стероиды, некоторые вирусные белки; активаторы включают недостаток факторов роста, потерю связи с матриксом, глюкокортикоиды, некоторые вирусы, свободные радикалы, ионизирующую радиацию. Нарушения апоптоза: Повышение выживаемости клеток; снижение выживаемости клеток; вступление клеток в некроз Тип индукторов:1) физиологические активаторы (цитокины, глюкокортикоиды, отсутствие фактора роста), 2) при повреждении (свободные радикалы, Т- лимфоциты, токсины, УФ-излучение. G- излучение); 3) защитные (ТSG р 53). Ингибиторы апоптоза: физиологические ингибиторы (ростовые факторы, гормоны, регуляторные белки, недостаток кислорода в кардиомиоцитах,антиоксиданты); чужеродные ингибиторы (продукты трансляции вирусов, ингибиторы энергетики митохондрий). УМКД 042-1822.1.10/01-2015 Редакция № от 2015 г. Страница 77 из 116 Механизмы насильственной смерти до конца не ясны. Но очевидно, что многие болезни вызваны нарушением нормального хода гибели клеток выделяют болезни, связанные с замедлением апоптоза (опухолевые заболевания, аутоиммунные заболевания, вирусные инфекции, бронхиальная астма, шизофрения), и болезни, опосредованные ускорением апоптоз (СПИД, анемия, инфаркты, инсульты, некоторые заболевания печени и почек, лучевая болезнь). Запрограммированную смерть клетки следует отличать от насильственной или некроза, который наступает вследствие химических или физических воздействий на клетку. При некрозе в первую очередь страдает внеядерная часть клетки, при апоптозе, наоборот, в первую очередь, страдает ядро клетки (предполагается, что в ядре имеется специальная программа, которая нацелена на уничтожение клетки). В ряде лабораторий мира усиленно ведутся поиски сигнальной молекулы, регулирующей программу, гибели клеток, Из клеток Drosophila melanogaster были выделена такая белковая молекула, которую назвали риппером (от. англ. reaper-жнец- при этом имелась в виду старухасмерть с косой в руках). На повестке дня – выделение риппера из клеток человека. Ускорение гибели клеток провоцирует патологические процессы в организме. Так, показано, что при инфаркте миокарда и инсульте обширное поражение тканей происходит не столько из-за гибели клеток в результате кислородного голодания, сколько из-за того, что сигналы, посылаемые гибнущими клетками, вызывают гибель близлежащих клеток по механизму цепной реакции. На поверхности клеток имеются специальные рецепторы смерти, которые в норме заблокированы. Сигналы, посылаемые гибнущими клетками, могут провоцировать гибель здоровых клеток. Можно полагать, что молекула-рипера из гибнущей клетки поступает в межклеточное пространство и с помощью паракринного эффекта воздействует на соседние клетки. Отсюда одна из проблем дня - найти факторы, блокирующие сигналы смерти. Многие вирусы умеют блокировать процесс апоптоза в зараженных клетках, в результате чего такие вирусы (аденорвирусы, вирус гриппа) получают возможность размножаться и распространяться дальше. Вирус СПИДа провоцирует процесс апоптоза в иммунных клетках, вызывая их гибель. Одним из индикаторов апоптоза является сфингеозин, который подавляет образование опухолей, особенно при комбинированном применении с известными противоопухолевыми препаратами. Другим перспективным направлением с нарушением апоптоза является поиск средств, которые могли бы оказывать воздействие на клеточные мембраны и регулировать работу рецепторов, регулирующих на молекулы апоптоза. Вопросыдля самоконтроля: 1. Что такое апоптоз? 2. Дайте характеристику стадиям апоптоза 3. Какие изменения происходят при апоптозе в клетке? Литература: 7.1-7.1.7 (основная),7.2.1- 7.2.10 (дополнительная) УМКД 042-1822.1.10/01-2015 Редакция № от 2015 г. Страница 78 из 116 3 ПРАКТИЧЕСКИЕ И ЛАБОРАТОРНЫЕ ЗАНЯТИЯ Практические занятия – одна из форм учебного занятия, направленная на развитие самостоятельности студентов и приобретения умения и навыков. Темы практических занятий: Тема 1. История развития молекулярной биологии. Клетка- основа жизни Цель занятия: 1. Изучить виды клеток 2. Усвоить строение клеточных и неклеточных структур Задание 1. Изучить строение прокариотической клетки. Зарисовать в тетрадь. Задание 2. Заполнить таблицу 1 Таблица 1 Признаки Морфофункциональные признаки Бактерии Микоплазма Синезеленые водоросли Задание 3. Изучить строение эукариотической клетки. Заполнить таблицу 2. Таблица 2. эукариотических Сравнительная характеристика прокариотических и микроорганизмов Признаки Прокариоты Эукариоты УМКД 042-1822.1.10/01-2015 Редакция № от 2015 г. Страница 79 из 116 Задание 3. Изучите строение неклеточных структур на препаратах и микрофотографиях. Зарисуйте их в тетрадь Межклеточное Симпласт Синцитий вещество Вопросы: 1. Что собой представляют эукариотические клетки? 2 Что собой представляют прокариотические клетки? 3. Какой формы могут быть клетки и с чем это связано? Приведите примеры. 4. Перечислите неклеточные структуры Литература: 7.1-7.1.7 (основная),7.2.1- 7.2.10 (дополнительная Тема 2. Современные методы в молекулярной биологии. Межмолекулярные взаимодействия и их роль в фукнционировании живых систем. Цель занятия: 1.Изучить современные методы в молекулярной биологии. 2.Изучить механизмы межклеточных и внутриклеточных химических сигнализаций в организме. Задание 1. Изучить методы молекулярной биологии Запомнить название и назначение отдельных частей микроскопов разных моделей, предназначенных для изучения различных объектов, усвоить приемы использования его (организация рабочего места, установка освещения, центрировка, фокусировка, выбор фильтров) для изучения гистологических препаратов (рисование) и в исследовательских целях (измерение объектов). Задание 2. Изучить межклеточные механизмы взаимодействий Задание 3. Изучить внуриклеточные механизмы взаимодействий Вопросы: 1. Какие методы применяют в молекулярной биологии? 2. Что собой представляют межклеточные механизмы взаимодействий 3. Что собой представляют внутриклеточные механизмы взаимодействий Литература: 7.1-7.1.7 (основная),7.2.1- 7.2.10 (дополнительная) Тема 3. Белки Цель занятия: 1. Изучить структурную организацию белков. 2. Изучить аминокислотный состав. 3. Усвоить молекулярный состав клетки УМКД 042-1822.1.10/01-2015 Редакция № от 2015 г. Страница 80 из 116 Задание 1. Переписать в тетрадь классификацию белков Таблица 3 Классификация белков по типу строения по форме простые и сложные круглые нитевидные по свойствам растворимости или в воде, кислотах, щелочах растворимые альбумины, в спитрах растворимые — проламиндер, в кислотах и щелочах растворимые глутелины по выполняемой функции строительные, защитные и т.д. Задание 2. Зарисовать в тетрадь уровни структуры белков 1 — первичная, 2 — вторичная, 3 — третичная, 4 — четвертичная Задание 3. Изучить структуру простых и сложных белков.переписать в тетрадь таблицу. Простые белки – состоят только из остатков аминокислот. Сложные белки – состоят из простого белка и небелковой части – простатической группы. УМКД 042-1822.1.10/01-2015 Редакция № от 2015 г. Страница 81 из 116 Таблица 4 Сложные белки Свойства Нуклеопротеиды Полинуклеопротеиды, состоящие из большого числа мононуклеотидов, связанных между собой через фосфодиэфирные связи. ДНК и РНК (и- РНК, т-РНК, р-РНК). В воде и в кислотах хорошо растворяются Простатическая группа белка включает различные красители и они относятся к хромопротеинам. К красителям относятся порфирин, флавин, аденин динуклеотид (ФАД) . К предствителям хромопротеинов относятся гемоглобин крови, хлорофил, миоглобин, цитохромы, флавиноферменты Похожи на липиды. Роль простетической группы выполняют липиды: триацилглицерины - ТАГ, фосфолипиды, холестерин и его эфиры(холестириды) в различных соотношениях. В истинных ГП содержатся нейтральные, нерегулярные, мукополисахариды, гексозы. В протеогликанах содержатся регулярные, кислые мукополисахариды, которые чаще обозначаются как гликозаминогликаны, или ГАГи. Хромопротеиды Липопротеины Гликопротеиды Металлопротеиды Роль простетической группы выполняют атом металлов: Fe , Cu , Zn , Co и др. Фосфопротеиды Роль простетической группы выполняют остатки фосфорной кислоты, присоединенные сложноэфирной связью к остаткам УМКД 042-1822.1.10/01-2015 Редакция № от Простые белки Альбумины Глобулины Гистоны Протамины Страница 82 из 116 2015 г. серина, треонина и тирозина, содержащихся в белковой части. Фосфорилирование белков катализируют ферменты протеинкиназы цАМФ, цГМФ, Са2+ , или продукты онкогенов (факторы роста). Свойства Растворяются в воде, растворах кислот и щелочей. Много аспирина и глутамина. Молекулярная масса относительно не большая. Встречаются в растительных и животных организмах. В воде не растворяются, растворяются в растворах кислот, солей и щелочей. Молекулярная масса относительно большая. Встречаются в растительных и животных организмах. Растворяются в воде и растворах кислот. Встречаются в животных организмах. Растворяются в воде и растворах кислот. Встречаются в животных организмах. Задание 4. Переписать в тетрадь свойства и функции белков Таблица 5. Свойства Существуют белки нерастворимые в воде Малоактивные и химически устойчивые к воздействию агентов Есть белки, имеющие вид нитей или молекулы в виде жирков диаметром 57 мм. Функции Строительная Каталитическая Сигнальная Двигательная Транспортная Защитная Энергитическая Задание 5. Изучить молекулярный состав клетки УМКД 042-1822.1.10/01-2015 Редакция № от Неорганические соединения Вода 70-80% Минеральные соли 2015 г. Страница 83 из 116 Таблица 6. Органические соединения Белки 10-20% Углеводы 0,2-2,0% Жиры 1-5% Нуклеиновые кислоты (РНК, ДНК) Вопросы: 1. Дайте определение белкам. 2. Перечислите простые и сложные белки. 3. Как осуществляется биосинтез белка? Литература: 7.1-7.1.7 (основная),7.2.1- 7.2.10 (дополнительная) Тема 4. Молекулярная организация генетического аппарата. Структура и организация генома Цель занятия: Понятие гена и генетической информации в молекулярой биологии. Хромосомы и хроматин 1. Изучить молекулярную организацию генетического аппарата 2. Изучить строение хромосомы, ДНК- хроматина. Задание 1. Изучить строение ДНК хроматина. Переписать в тетрадь таблицу Таблица 6 Фибрилла Степень укорочения Диаметр, нм По сравнению с По сравнению с предшествующей молекулой ДНК структурой ДНК 1 1 1-2 Нуклеосомная нить 7 7 10 Элементарная хроматиновая фибрилла 6 42 20-30 Интерфазная хромонема 40 1600 100-200 Метафазная хроматида 5 8000 500-600 Задание 2. Изучить строение хромосомы. Зарисовать субметацентрическую хромосому и обозначить: 1- хроматиды, 2-центромера, 3-вторичная перетяжка, 4- матрикс хромосом. УМКД 042-1822.1.10/01-2015 Редакция № от 2015 г. Страница 84 из 116 Задание 3. Изучить и зарисовать в тетрадь различные виды хромосом 1-метацентрическая; 2-субметацетрическая; 3-акроцентрическая; 4виды ядрышка Задание 4. Изучить схему упаковки ДНК и гистонов с образованием хроматина и зарисовать в тетрадь Вопросы: 1. Каково значение хромосомы? 2. Поясните строение хромосомы, хроматина? 3. Что входит в состав генетического аппарата? УМКД 042-1822.1.10/01-2015 Редакция № от 2015 г. Страница 85 из 116 Литература: 7.1-7.1.7 (основная),7.2.1- 7.2.10 (дополнительная) Тема 5. Нуклеиновые кислоты. Структура и функции ДНК и их значение в реализации наследственной информации Цель занятия: Генетическая роль нуклеиновых кислот. Структура ДНК. Модель Уотсона-Крика. 1. Изучить генетическую роль нуклеиновых кислот 2. Изучить строение молекулы ДНК. Химический состав ДНК. Задание 1. Изучить и зарисовать схему модели ДНК. Задание 2. Зарисоватьв тетрадь схему строения ДНК Задание 3. Изучить схему моделей ДНК УМКД 042-1822.1.10/01-2015 Редакция № от А- модель В- модель 2015 г. Страница 86 из 116 Z- модель Задание 4. Переписать в тетрадь отличительные признаки нуклеиновых кислот (РНК, ДНК, АТФ) Таблица 7 ДНК Представляет собой две спирали замкнутые одна вокруг другой. ДНК содержится в ядре клетки, в митохондриях и хлоропластах. И является носителем наследственности. ДНК состоит из остатков фосфорной кислоты, дезоксирибоза и азотистого основания ( аденин, тимин, цитозин, гуанин) РНК Односпиральная молекула, нуклеотид состоит из: рибозы, остатков фосфорной кислоты, азотистого основания (аденин, гуанин, цитозин. урацил). Более короткая молекула. Находится в ядре, цитоплазме и митохондриях. Виды РНК: Транспортные РНК (т-РНК) связывают аминокислоты и транспортируют их к месту синтеза белка. Информационные (и-РНК). Переносят информацию о структуре белка от ДНК к месту АТФ По химическому строение относится к нуклеотидам, состоящим из трех остатков фосфорной кислоты, рибозы и остатков азотистого основания (аденины). АТФ играет центральную роль в энергетическом обмене клетки. Является непосредственным источником энергообеспечения любой клеточной функции. Под влиянием специфических ферментов она подвергается гидролизу. Эта реакция сопровождается освобождением энергии. УМКД 042-1822.1.10/01-2015 Редакция № от 2015 г. Страница 87 из 116 синтеза белка. Рибосомные РНК (р-РНК). Входят в м состав рибосом. Вопросы: 1. Опишите строение ДНК 2. Перечислите виды ДНК 3. В чем отличие ДНК от РНК Литература: 7.1-7.1.7 (основная),7.2.1- 7.2.10 (дополнительная) Тема 6. Структура и физико-химические свойства РНК, и их значение в реализации наследственной Цель занятия: Структура и свойства основных классов РНК-иРНК, рРНК, тРНК. Функции РНК и их значение в реализации наследственной информации, физикохимические свойства. 1.Изучить структуру РНК 2. Изучить физико-химические свойства РНК 3. Изучить типы РНК Задание 1. Изучить и зарисовать в тетрадь строение РНК УМКД 042-1822.1.10/01-2015 Редакция № от 2015 г. Задание 2. Изучить физико-химическое строение РНК Задание 3. Изучить типы- РНК Страница 88 из 116 УМКД 042-1822.1.10/01-2015 Редакция № от т-РНК 2015 г. Страница 89 из 116 р-РНК и-РНК Вопросы: 1. Каково строение РНК? 2. Перечислите функции РНК. 2. Где локализуются РНК? 3.Перечислите типы РНК Литература: 7.1-7.1.7 (основная),7.2.1- 7.2.10 (дополнительная) Тема 7. Биосинтез белка Цель занятия: Генетический код . Биосинтез белка. Аппарат трансляции. Трансляция мРНК у про- и эукариот, этапы трансляции, ее механизмы и регуляция. 1.Изучить этапы биосинтеза белка 2. Изучить механизм транскрипции 3. Изучить механизм трансляции 4. Изучить генетический код УМКД 042-1822.1.10/01-2015 Редакция № от 2015 г. Страница 90 из 116 Задание 1. Зарисовать в тетрадь этапы и необходимые условия для биосинтеза белка Этапы биосинтеза белка: Задание 2. Изучить по схеме стадии биосинтеза белка УМКД 042-1822.1.10/01-2015 Редакция № от 2015 г. Страница 91 из 116 Схема бисинтеза белка: 1 — и-РНК; 2 - субъединицы рибосомы; 3 — т-РНК с аминокислотами; 4 — т-РНК без аминокислот; 5 — полипептид; 6 — кодон иРНК; 7- антикодон т-РНК. Задание 3. Изучить по схеме механизм трансляции Задание 4. Переписать в тетрадь схему и свойства генетического кода УМКД 042-1822.1.10/01-2015 Редакция № от 2015 г. Страница 92 из 116 Вопросы: 1. Как осуществляется биосинтез белка 2. Что такое кодон, цистрон и ген? 3. Перечислите механизмы синтеза белка Литература: 7.1-7.1.7 (основная),7.2.1- 7.2.10 (дополнительная) УМКД 042-1822.1.10/01-2015 Редакция № от 2015 г. Страница 93 из 116 Тема 8. Репликация ДНК, молекулярные мехнизмы репликации Цель занятия: Имзучить Молекулярные механизмы репликации. Роль ДНК в наследственности. Воспроизведение генетической информации. Принцип комплементарности и его биологическая роль. Основные принципы репликации. Репликация ДНК. Задание 1. Изучить репликацию ДНК Задание 2. Изучить механизм репликации Вопросы: 1. Как осуществляется механизм репликации ДНК УМКД 042-1822.1.10/01-2015 Редакция № от 2015 г. Страница 94 из 116 2. Перечислите белки и ферменты участующие в репликации Литература: 7.1-7.1.7 (основная),7.2.1- 7.2.10 (дополнительная) Тема 9. Молекулярные механизмы реализации генетической информации Цель занятия: Общий механизм и стадии транскрипции, участники этого процесса. Регуляция транскрипции. Современные представления о механизмах транскриции. Процесс транскрипции ДНК с образованием РНК. Задание 1. Изучить и зарисовать по схеме транскрипцию РНК на матричной цепи ДНК Задание 2. Изучить по схеме этапы транскрипции УМКД 042-1822.1.10/01-2015 Редакция № от 2015 г. Страница 95 из 116 1. инициация транскрипции; 2 элонгация транскрипции; 3 терминации транскрипции Задание 3. Изучить по схеме элонгацию Вопросы: 1. Как осуществляется механизм трансляции ДНК 2. Перечислите механизм инициации и элонгации Литература: 7.1-7.1.7 (основная),7.2.1- 7.2.10 (дополнительная) Тема 10 Денатурация ренатурация нуклеиновых кислот Цель занятия: Понятие и денатурации и ренатурации Задание 1. Изучить и зарисовать в тетрадь схему денатурации и ренатурации нуклеиновых кислот. Задание 2. Изучить молекулярную гибридизацию ДНК. УМКД 042-1822.1.10/01-2015 Редакция № от 2015 г. Страница 96 из 116 Вопросы: 1. Что подразумевается под денатурацией и ренатурацией нуклеиновых кислот? 2. Что означает молекулярная гибридизация? Литература: 7.1-7.1.7 (основная),7.2.1- 7.2.10 (дополнительная) Тема: 11. Биосинтез и деградация нуклеиновых кислот. Цель занятия: Изучить матричный и нематричный синтез. Ингибиторы матричного синтеза Задание 1. Изучить группу веществ, ингибирующая синтез ДНК, РНК или белков. Некоторые из них нашли применение в медицине для лечения инфекционных болезней и опухолевых новообразований, а другие для человека оказались токсинами. Антибиотики из семейства рифамицинов Задание 2. Переписать в тетрадь Антибиотики - ингибиторы матричных биосинтезов как лекарственные препараты Таблица 8 Антибиотики Механизм действия УМКД 042-1822.1.10/01-2015 Редакция № от 2015 г. Страница 97 из 116 Ингибиторы репликации Дауномицин Доксорубицин Внедряются («интеркалируют») между парами оснований ДНК и нарушают репликацию и транскрипцию Актинрмицин D Мелфалан Алкилирует ДНК и нарушает репликацию Номермицин Новобиоцин Ингибируют ДНК-топоизомеразу П, ответственную за суперспирализацию ДНК, нарушают репликацию и транскрипцию Ингибиторы транскрипции Рифамицины Связываются с бактериальной РНК-полимеразой и препятствуют началу транскрипции Ингибиторы трансляции Тетрациклины Ингибируют элонгацию: связываются с 30S субъединицей рибосомы и блокируют присоединение аа-тРНК в А-центр Левомицетин Присоединяется к 50S субъединице рибосомы и ингибирует пептидилтрансферазную активность Эритромицин Присоединяется к 50S субъединице рибосомы и ингибирует транслокацию Стрептомицин Ингибирует инициацию трансляции. Связывается с 30S субъединицей рибосомы, вызывает ошибки в прочтении информации, закодированной в мРНК Вопросы: 1. Что такое нематричный синтез нуклеиновых кислот? 2. Что такое матричный синтез ДНК на РНК? 3. Как осуществляется матричный синтез РНК? Литература: 7.1-7.1.7 (основная),7.2.1- 7.2.10 (дополнительная) Тема: 12. Молекулярные механизмы и обмена вещества наследственности Генетическая инженерия Цель занятия: Репарация ДНК .Типы репарации. Генетическая рекомбинация, трансдукция, трансформация. Методы генетической инженерии Задание 1.Изучить по схеме этапы репарации УМКД 042-1822.1.10/01-2015 Редакция № от 2015 г. Страница 98 из 116 Задание 2. Изучить методы генетической инженерии Вопросы: 1. Перечислите молекулярные механизмы и обмена вещества наследственности 2. Что изучает генетическая инженерия Литература: 7.1-7.1.7 (основная),7.2.1- 7.2.10 (дополнительная) Тема:13.Молекулярные механизмы мутагенеза, репарации ДНК и кроссинговера Цель занятия: Изучить молекулярные механизмы мутагенеза и репарации. Мутационные изменения нуклеиновых кислот. Мутагены и механизмы их действия. Генные мутации. Генотипическая изменчивость, мутационная изменчивость. Задание 1. Изучить по схеме виды мутаций УМКД 042-1822.1.10/01-2015 Редакция № от Комбинативная мутация Страница 99 из 116 2015 г. Геномная мутация Задание 2. Перепишите в тетрадь классификацию мутаций Таблица 9 По способу образования: 1.Спонтанные 2.Индуцированные Поотношению к зачатковому пути: 1.Соматические 2.Генеративные По адаптивным признакам: 1.Положительные 2.Отрицательные 3.Нейтральные По изменению генотипа: 1.Генные 2.Хромосомные 3.Геномные По расположению в клетке: 1. Ядерные 2. Цитоплазматические Вопросы: 1. Перечислите виды мутаций 2. Какие факторы влияют на возникновение мутаций Литература: 7.1-7.1.7 (основная),7.2.1- 7.2.10 (дополнительная) Тема: 14 . Технология рекомбинантных ДНК Цель занятия: Понятие о рекомбинантных ДНК. Рестрикция ДНК. Рестириктазы и их виды, свойства и особенности воздействия на ДНК. Клонирование генов. Биотехнология манипуляций с генами. Задание 1. Изучить рекомбинантные ДНК Задание 2. Изучить методы клонирования генов УМКД 042-1822.1.10/01-2015 Редакция № от 2015 г. Страница 100 из 116 Вопросы: 1. Что подразумевается под понятием рекомбинантные ДНК 2. Какие методы клонирования Вы знаете? Литература: 7.1-7.1.7 (основная),7.2.1- 7.2.10 (дополнительная) Тема 15. Аппоптоз. Общие представления о программированой клеточной смерти. Регуляция аппоптоза. Цель занятия: Генетическая запрограммированная смерть клетки. Трансдукция сигнала аппоптоза. Молекулярные механизмы регуляции аппоптоза. Задание 1. Изучить виды апоптоза Задание 2. Изучить факторы вызывающие апоптоз 1)токсины; 2) ишемия; 3) радиация; 4) оксидант; 5) гипоксия; 6) гиподермия; 7) гипердермия Задание 3. Изменения в клетке при апоптозе. Изучить и зарисовать в тетрадь УМКД 042-1822.1.10/01-2015 Редакция № от 2015 г. Страница 101 из 116 Вопросы: 1. Что такое аппоптоз? 2. Какие изменения происходят при аппоптозе Литература: 7.1-7.1.7 (основная),7.2.1- 7.2.10 (дополнительная) 4. САМОСТОЯТЕЛЬНАЯ РАБОТА ОБУЧАЮЩЕГОСЯ План практических занятий в рамках самостоятельной работы под руководством преподавателя (СРОП) Тема 1. Предмет и задачи молекулярной биологии (3 часа) Задание 1. Изучить цель дисциплины молекулярная биология Задание 2. Изучить задачи молекулярной биологии Задание 3. Изучить новые достижения в молекулярной биологии Вопросы: 1. Что изучает молекулярная биология? 2. Какие достижения молекулярной биологии Вы знаете? Литература: 7.1-7.1.7 (основная),7.2.1- 7.2.10 (дополнительная) Тема 2 Методы исследования в молекулярной биологии (3 часа) Задание 1. Изучить методы молекулярной биологии Задание 2. Изучить методы микроскопирования гистологических препаратов. Вопросы: 1.Какие современные методы используют в молекуляной биологии? Тема 3 Молекулярные основы кроссинговера (3 часа) Задание 1.Изучить молекулярные основы кроссинговера Вопросы: 1.Дайте определение кроссинговеру 7.1-7.1.7 (основная),7.2.1- 7.2.10 (дополнительная) Тема 4. Химический состав клетки (3 часа) Задание1. Используя лекционный курс и основную литературу изучите химический состав клетки. Заполните таблицу Таблица Содержание химических веществ в клетке Вещества Содержание в % Задание 2 Усвоить структуру простых и сложных белков. Вопросы: УМКД 042-1822.1.10/01-2015 Редакция № от 2015 г. Страница 102 из 116 1. Перечислите органические вещества 2. Перечислите неорганические вещества Литература: 7.1-7.1.7 (основная),7.2.1- 7.2.10 (дополнительная) Тема 5 Экзоцитоз. Эндоцитоз (3 часа) Задание 1. Изучить диффузию и пассивный перенос. Задание 2. Изучить проницаемость клетки и активный перенос. Задание 3. Изучить явление фагоцитоза и пиноцитоза. Задание 4. Изучить значение лизосом в распределении веществ между клеткой и средой. Вопросы: 1.Что такое экзоцитоз? 2.Что такое эндоцитоз? Литература:7.1-7.1.7 (основная),7.2.1- 7.2.10 (дополнительная) Тема 6 Обмен веществ в клетке (3 часа) Задание 1 Изучить виды обмена веществ в организме. Задание 2 Изучить значение метаболизма в организме. Вопросы: 1.Дайте определение метаболизму 2.Какие виды обмена веществ Вы знаете? Литература: Литература:7.1-7.1.7 (основная),7.2.1- 7.2.10 (дополнительная) Тема 7. Молекулы генетического аппарата (3 часа) Задание 1. Изучить ультромикроскопическое строение хромосомы по микрофотографиям и схемам. Зарисовать и обозначить: 1-хроматиды, 2центромера, 3- вторичная перетяжка, 4- матрикс хромосом. Задание 2. Изучить и переписать в тетрадь виды хроматина. Вопросы: 1.Поясните строение хромосомы 2.Перечислите типы хроматина? Литература: Литература:7.1-7.1.7 (основная),7.2.1- 7.2.10 (дополнительная) Тема 8 Структура и функция генов (3 часа) Задание 1. Изучить химическую организацию гена Задание 2. Изучить генный уровень организации генетического аппарата Вопросы: 1.Какова химическая организация гена? УМКД 042-1822.1.10/01-2015 Редакция № от 2015 г. Страница 103 из 116 2.Из каких компонентов состоит генный аппарат? Литература: Литература:7.1-7.1.7 (основная),7.2.1- 7.2.10 (дополнительная) Тема 9 Нуклеотидный состав, коэффициент специфичности ДНК у разных организмов (3 часа) Задание 1. Изучить структуру ДНК. Задание 2. Изучить коэффициент специфичности ДНК у разных организмов Вопросы: 1.Перечислите структурные компоненты ДНК Литература: 7.1-7.1.7 (основная),7.2.1- 7.2.10 (дополнительная) Тема 10. Мутагены и механизм их действия (3 часа) Задание 1. Изучить основные мутагены влияющие на наследственность Задание 2. Изучить виды мутаций Вопросы: 1.Дайте определение мутагенезу 2. Перечислите виды мутаций Литература: Литература:7.1-7.1.7 (основная),7.2.1- 7.2.10 (дополнительная) Тема 11. Нуклеиновые кислоты (3 часа) Задание 1. Изучить значение нуклеиновых кислот в организме Задание 2.Изучить распостранение и локализацию нуклеиновых кислот в организме. Вопросы: 1.Перечислите значение НК 2. Где распостранены НК в организме Литература: Литература:7.1-7.1.7 (основная),7.2.1- 7.2.10 (дополнительная) Тема 12. Структура нуклеиновых кислот (3 часа) Задание 1 Изучить компоненты нуклеиновых кислот. Переписать названия и обозначения компонентов нуклеиновых кислот по схеме. Задание 2 Зарисовать А- и В- формы биспиральной молекул ДНК. Задание 3. Зарисовать в тетрадь отличительные признаки мРНК, рРНК, тРНК Вопросы: 1.Перечислите типы НК 2. По каким признакам отличаются ДНК от РНК Литература: Литература:7.1-7.1.7 (основная),7.2.1- 7.2.10 (дополнительная) Тема 13. Физико-химические свойства нуклеиновых кислот (3 часа) Задание 1. Изучить оптические свойства нуклеиновых кислот. Задание 2. Изучить плотность и вязкость нуклеиновых кислот. Вопросы: 1.Перечислите физико-химические свойства НК Литература: Литература:7.1-7.1.7 (основная),7.2.1- 7.2.10 (дополнительная) Тема 14. Денатурация и ренатурация нуклеиновых кислот (3 часа) Задание 1. Изучить денатурацию нуклеиновых кислот. Задание 2. Изучить ренатурацию нуклеиновых кислот. Литература: Литература:7.1-7.1.7 (основная),7.2.1- 7.2.10 (дополнительная) УМКД 042-1822.1.10/01-2015 Редакция № от 2015 г. Страница 104 из 116 Тема 15 Биосинтез и деградация нуклеиновых кислот ( 3часа) Задание 1. Изучить схему синтеза РНК на матрице ДНК. Задание 2. Усвоить процессы синтеза РНК. Переписать синтез РНК: 1присоединение энзима к матрице; 2- инициация синтеза; 3- наращивание синтезируемой цепи РНК –элонгация; 4-завершение синтеза РНК - терминация. Задание 3Изучить ингибиторы матричного синтеза. Литература: 7.1-7.1.7 (основная),7.2.1- 7.2.10 (дополнительная) Планы занятий в рамках самостоятельной работы студентов (СРО) Тема 1. Репарация ДНК (3 часа) Задание 1. Изучить передачу наследственной информации Задание 2. Изучить факторы вызывающие репарацию ДНК Литература: 7.1-7.1.7 (основная),7.2.1- 7.2.10 (дополнительная) Тема 2. Типы молекулярной эволюции (3 часа) Задание 1. Изучить типы молекулярной эволюции Литература: 7.1-7.1.7 (основная),7.2.1- 7.2.10 (дополнительная) Тема 3. Первичная структур нуклеиновых кислот, разнообразие форм ДНК (3 часа) Задание 1. Изучить перичную структуру ДНК Задание 2. Изучить разнообразие форм ДНК Литература: 7.1-7.1.7 (основная),7.2.1- 7.2.10 (дополнительная) Тема 4.Типы генетического материала и механизм его репликации у различных вирусов (3 часа) Задание 1. Изучить РНК-содержащие вирусы Задание 2. Изучить ДНК-содержащие вирусы Литература: 7.1-7.1.7 (основная),7.2.1- 7.2.10 (дополнительная) Тема 5. Типы взаимодействия вируса с клеткой-хозяином (3 часа) Задание 1. Изучить типы взаимодействия вируса с клеткой- хозяином Задание 2. Характеристика вирусов Литература: 7.1-7.1.7 (основная),7.2.1- 7.2.10 (дополнительная) Тема 6. Структура бактериальной хромосомы (3 часа) Задание 1. Изучить структуру бактериальной хромосомы Задание 2. Изучить структуры связанные с репликацией Литература: 7.1-7.1.7 (основная),7.2.1- 7.2.10 (дополнительная) Тема 7. Структура прокариотических геном (3 часа) Задание 1. Изучить структуру прокариотических геном Литература: 7.1-7.1.7 (основная),7.2.1- 7.2.10 (дополнительная) Тема 8. Бактериальные плазмиды (3 часа) Задание 1. Изучить структуру бактериальных плазмидд Литература: 7.1-7.1.7 (основная),7.2.1- 7.2.10 (дополнительная) Тема 9. Кинетика реоссоциации денатурированной ДНК (3 часа) Задание 1. Изучить кинетику реоссоциации денатурированной ДНК Литература: 7.1-7.1.7 (основная),7.2.1- 7.2.10 (дополнительная) Тема 10. Структура эукариотических генов (3 часа) Задание 1. Изучить гены кодирующие белки УМКД 042-1822.1.10/01-2015 Редакция № от 2015 г. Страница 105 из 116 Литература: 7.1-7.1.7 (основная),7.2.1- 7.2.10 (дополнительная) Тема 11. Онкогены и антионкогены (3 часа) Задание 1. Изучить онкогены и антионкогены Литература: 7.1-7.1.7 (основная),7.2.1- 7.2.10 (дополнительная) Тема 12. Подвижные генетические элементы эукариот (3 часа) Задание 1. Изучить подвижные генетические элементы эукариот (траспозоны , ретротраспозоны) Литература: 7.1-7.1.7 (основная),7.2.1- 7.2.10 (дополнительная) Тема 13. Программа «геном человека» (3 часа) Задание 1. Изучить генетическое картирование Литература: 7.1-7.1.7 (основная),7.2.1- 7.2.10 (дополнительная) Тема 14. Геномы органелл эукариот (3 часа) Задание 1. Изучить ДНК митохондрий и хлоропластов Литература: 7.1-7.1.7 (основная),7.2.1- 7.2.10 (дополнительная) Тема 15. Белки и ферменты, участвующие в репликации ДНК (3 часа) Задание 1. Изучить белки и ферменты, участвующие в репликации ДНК Литература: 7.1-7.1.7 (основная),7.2.1- 7.2.10 (дополнительная) 5. Содержание самостоятельной работы студентов под руководством преподавателя (СРОП) и самостоятельной работы студентов (СРО). Планы СРОП и СРО Таблица 6 № п/п 1 2 3 4 СРОП Аудиторная Предмет и задачи молекулярной биологии. Клеткамолекулярня основа жизни Методы в молекулярной биологии. Межклеточные и внутриклеточные механизмы сигнальных взаимодействий Белки. Молекулярная организация генетического аппарата СРО Внеаудиторная Предмет и задачи Репарация белков молекулярной биологии Методы исследования в Белки молекулярной биологии Клетка-молекулярная основа жизни Химический клетки Первичная структур нуклеиновых кислот, рахнообразие форм ДНК состав Типы генетического материала и УМКД 042-1822.1.10/01-2015 Редакция № от 2015 г. Страница 106 из 116 механизм репликации различных вирусов 5 6 7 8 9 10 Нуклеиновые кислоты. Экзоцитоз. Эндоцитоз Структура и функции ДНК и их значение в реализации наследственной Нуклеиновые кислоты. Обмен веществ в клетке Структура и функции РНК и их значение в реализации наследственной информации Биосинтез белка Молекулы генетического аппарата Репликация ДНК, молекулярные механизмы репликации. Процесс транскрипции ДНК с бразованием Процесс транскрипции ДНК с образованием Денатурация и ренатурация нуклеиновых кислот Структура генов и его у Типы взаимодействия вируса с клеткойхозяином Структура бактериальной хромосомы Структура генома эукариот функция Структура прокариотических геном Структура и функция генов Мутагены и механизм их действия Бактериальные плазмиды Кинетика реоссоциации денатурированной ДНК 11 Биосинтез и деградация Нуклеиновые кислоты нуклеиновых кислот Онкогены антионкогены 12 Молекулярные механизмы переноса и обмена вещества наследственности. Генетическая инженерия Мутационные изменения нуклеиновых кислот Программа «геном человека» 13 14 и Структура нуклеиновых Подвижные кислот генетические элементы эукариот Физико-химические свойства нуклеиновых кислот Значение клеток в Денатурация и опухолевых процессах ренатурация Геномы органелл эукариот УМКД 042-1822.1.10/01-2015 15 Аппоптоз. аппоптоза Редакция № от 2015 г. Страница 107 из 116 нуклеиновых кислот Регуляция Биосинтез и деградация Белки и нуклеиновых кислот ферменты, участвующие в репликации ДНК Экзаменационные вопросы по курсу: «Молекулярная биология» 1. Предмет молекулярной биологии. Методы исследования. Цели и задачи молекулярной биологии 2. Свойство ДНК, молекулярная основа ДНК. Модель Уотсон-Крика. 3. Прокариотические клетки 4. В чем состоит сходство и отличие светового и электронного микроскопов. Каковы их разрешающие способностиМолекулярная биология ферментов. Комплекс «фермент-субстрат» 5. Строение и виды РНК 6. Строение белка. Структура белка 7. Какой формы могут быть клетки и с чем это связано 8. Молекулярный состав клетки 9. Клетка- основа жизни. Эукариотическая клетка 10.Синтез белка. Трансляция 11.Чем представлены аминокислоты и белки 12.Достижения молекулярной биологии 13.Экзоцитоз. Эндоцитоз 14.Обмен веществ метаболизм 15.Транкрипция. Принципы транскрипции 16.Нуклеиновые кислоты. Функции. Распространение. Локализация. 17.Летальный ген. Виды мутаций 18.Новые направления в молекулярной биологии 19.Репликация молекулы ДНК. Особенности репликации молекулы ДНК у эукариот 20.Виды метаболизма 21.Физико-химические свойства нуклеиновых кислот 22.Синтез белка. Классификация т-РНК 23.Денатурация. Ренарурация нуклеиновых кислот 24.Молекулярные основы онкологии 25.Функция белков 26.Строение белка 27.Молекулярная гибридизация 28.Возникновение злокачественных опухолей 29.Биосинтез и деградация нуклеиновых кислот 30.Состав и функции белка 31.Кодирование аминокислот, цистон, ген 32.Строение нуклеиновых кислот УМКД 042-1822.1.10/01-2015 Редакция № от 2015 г. 33.Лечение молекулярных болезней 34.Реакция полимеразы, при синтезе гена 35.Свойства кодона 36.Генетический код. Его свойство 37.Основные пути и этапы передачи генетической информации 38.Мутагенные механизмы их воздействия 39.Матричная РНК. Транскрипция 40.Строение, функция т –РНК 41.Биосинтез белка 42.Денатурация белка. Изменение пектиновых связей 43.Мутационные изменения нуклеиновых кислот 44. ДНК – полимераза. Принцип репликации 45.Строение рибосом про - и эукариот 46.Трансдукция 47.Трансформация 48.Хлоропласты и синтез белка 49.Характеристика, классификация микро- и макромолекул 50.Апоптоз и некоторые его механизмы 51.Регуляция синтеза белка у вирусов 52.Виды ферментов 53.Вирусы как объект молекулярной биологии 54.Регуляция синтеза белка у бактерий 55.Значение клеток в опухолевых процессах 56.Достижения генной инженерии 57.Регуляция синтеза белка у многоклеточных животных 58.Биосинтез белка 59.Механизм регуляции синтеза белка 60.История открытия нуклеиновых кислот 61.Биологическое строение рибосом и митохондрий 62.Т-РНК роль, строение 63.Роль РНК в синтезе белка 64.Образование опухолей у растений 65.Активные центры ферментов 66.Молекулы генетического аппарата 67.Ферменты- биологические катализаторы 68.Формы ДНК 69.Глобулярные белки. Формы, функции 70.Реакция антиген –антитело 71.Отличие молекулы ДНК от РНК 72.Структура и функции генов 73.Биологическая роль нуклеиновых кислот 74.Методы молекулярной биологии 75.Дифференциация, рост, обновление и старение клеток 76.Явление трансформации Страница 108 из 116 УМКД 042-1822.1.10/01-2015 Редакция № от 2015 г. 77.Ферменты и метаболизм клетки 78.Место молекулярной биологии среди биологических наук 79.Белки- объект исследования молекулярной биологии 80.Физико-химические свойства нуклеиновых кислот 81.Комплиментарный принцип –его биологическая роль 82.Белки - объект исследования молекулярной биологии 83.Транскрипция. Трансляция 84.Бактерии –как объект исследования молекулярной биологии 85.И-РНК и синтез белка. Теория Ф.Жакоба и Ж.Моно 86.Структура кодонов. Ген. 87.Клетка основа жизни. Эукариотическая клетка 88.Синтез белка. Аппарат трансляции 89.Факторы вызывающие мутации Страница 109 из 116 УМКД 042-1822.1.10/01-2015 Редакция № от 2015 г. Страница 110 из 116 УМКД 042-1822.1.10/01-2015 Редакция № от 2015 г. Страница 111 из 116 УМКД 042-1822.1.10/01-2015 Редакция № от 2015 г. Страница 112 из 116 УМКД 042-1822.1.10/01-2015 Редакция № от 2015 г. Страница 113 из 116 УМКД 042-1822.1.10/01-2015 Редакция № от 2015 г. Страница 114 из 116 УМКД 042-1822.1.10/01-2015 Редакция № от 2015 г. Страница 115 из 116 УМКД 042-1822.1.10/01-2015 Редакция № от 2015 г. Страница 116 из 116
