Регуляторы роста, мг/л

На правах рукописи
АХМЕТОВА АЛЬБИНА ШАМСУНОВНА
ИНТРОДУКЦИЯ И РАЗМНОЖЕНИЕ ТЮЛЬПАНОВ
IN VIVO И IN VITRO В ЛЕСОСТЕПНОЙ ЗОНЕ
БАШКИРСКОГО ПРЕДУРАЛЬЯ
03.00.05 – ботаника
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Оренбург 2009
2
Работа выполнена в лаборатории популяционной биологии и биотехнологии
растений и лаборатории интродукции и селекции цветочных растений Учреждения
Российской академии наук Ботанический сад-институт Уфимского научного центра
РАН
Научные руководители:
кандидат сельскохозяйственных наук
Миронова Людмила Николаевна
кандидат биологических наук
Байбурина Рима Кашафовна
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор
Плаксина Тамара Ивановна
доктор биологических наук
Федоров Николай Иванович
Ведущая организация:
Главный ботанический сад им. Н.В. Цицина РАН
Защита диссертации состоится « 29 » апреля 2009 г. в 12 часов на заседании
Диссертационного совета Д 212.180.02 при ГОУ ВПО «Оренбургский
государственный педагогический университет» по адресу: 460844, г. Оренбург,
ул. Советская, 19, факс (3532) 772452, e-mail: [email protected]
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Оренбургский
государственный педагогический университет»
Автореферат разослан « 28 » марта 2009 года
Ученый секретарь
Диссертационного совета,
к.б.н., доцент
Мушинская Н.И.
3
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Тюльпаны отличаются большим разнообразием
окраски, размеров и форм цветка, продолжительным и разнообразным сроком
цветения. Однако в лесостепной зоне Башкирского Предуралья интродукционная
работа с тюльпанами не ведется, не разработан зональный ассортимент, поэтому
тюльпаны практически не используются в озеленении. В этой связи актуально
изучение биологических особенностей возможно большего количества видов и
сортов в условиях региона с целью отбора наиболее перспективных для широкой
культуры. Кроме того, остается необходимость ускоренного размножения
тюльпанов для удовлетворения все возрастающего спроса на посадочный материал.
Эта проблема для ряда цветочно-декоративных растений решается использованием
микроклонирования в условиях in vitro.
Цель и задачи исследования. Целью работы является интродукционное
изучение видов и сортов тюльпана в условиях культуры в лесостепной зоне
Башкирского Предуралья, разработка зонального ассортимента, выявление
эффективных методов ускоренного размножения перспективных форм. Для
достижения этой цели было необходимо решить следующие задачи:
1. Изучить биологические особенности интродуцированных в Ботанический
сад-институт видов и сортов тюльпана. Оценить успешность интродукции и
перспективность использования тюльпанов в лесостепной зоне Башкирского
Предуралья;
2. Выявить особенности семенного размножения тюльпанов. Оценить
экзогенное влияние регуляторов роста на развитие зародыша;
3. Апробировать
современные
методы
размножения
тюльпанов
с
использованием культуры органов и тканей in vitro.
Защищаемые положения:
– Изученные сорта и виды тюльпана являются устойчивыми в условиях
лесостепной зоны Башкирского Предуралья за исключением 4-х сортов,
подверженных вирусу пестрения. Наиболее перспективными для пополнения
зонального ассортимента по комплексу признаков признаны 71 сорт.
– Изученные виды тюльпана (Tulipa riparia Knjasev, Kulikov et Philippov sp.
nov., T. patens Agardh. ex Schult. et Schult. fil. и T. tarda Stapf) в условиях культуры
проходят полный цикл развития побегов, характеризуются стабильностью
ритмических процессов, приспособлены к местным климатическим условиям, не
повреждаются болезнями, холодостойки, что позволяет их отнести к группе
перспективных или устойчивых растений. По продуктивности, размерам они
уступают растениям из природных местообитаний, самостоятельно не
возобновляются.
– Определяющим фактором доразвития зародыша и прорастания семян
изученных видов является низкая положительная температура среды (0-10ºС).
Внутрисеменной рост зародыша является длительным процессом и может быть
интенсифицирован с помощью регуляторов роста (гибберелловая кислота, рифтал,
фэтил, крезацин, фитон, гетероауксин).
– Оптимальным сроком изоляции зародышей из семян тюльпанов для
введения в культуру in vitro является 53–56-й день после опыления, размер
зародыша должен достигать 1,5–3,0 мм.
4
– Лучшими эксплантами для микроразмножения тюльпанов путем
мультипликации побегов служат зародыши, чешуи микролуковиц гибридных
сеянцев, пазушные почки луковицы, цветоложе и завязь неокрашенных бутонов.
Научная новизна. Автором впервые обобщен материал по изучению
биологических особенностей сортовых и видовых тюльпанов, их роста и развития в
условиях лесостепной зоны Башкирского Предуралья. Проведена оценка
успешности интродукции и перспективности видов по комплексу биологохозяйственных и декоративных признаков. Изучено влияние стимуляторов роста на
доразвитие зародыша и прорастание семян. Показана возможность эффективного
применения метода культуры тканей для микроразмножения тюльпана с
использованием зародышей, вегетативных и генеративных органов.
Практическая значимость. Наиболее перспективными для пополнения
зонального ассортимента по комплексу признаков признаны 71 сорт и 1 вид
тюльпана. T. riparia, T. patens и T. tarda рекомендованы в качестве источников
хозяйственно-ценных признаков (ранние сроки цветения, оригинальная окраска
цветков и листьев, многоцветковость, устойчивость к болезням) для использования
в селекционной практике. От пяти комбинаций принудительного скрещивания с
участием 9 сортов зарубежной селекции получены гибридные семена тюльпана,
которые могут служить исходным материалом для селекционной практики.
Разработан метод эмбриокультуры тюльпана, позволяющий получать за год
от одного экспланта до 1000 гибридных растений-регенерантов.
Доказана возможность эффективного применения метода культуры
вегетативных и генеративных органов тюльпана in vitro, позволяющего решить
проблему сокращения сроков получения посадочного материала. Выявлены
оптимальные экспланты для микроразмножения путем мультипликации побегов:
пазушные почки луковицы, образующие с одного экспланта до 175 микролуковиц
за год, цветоложе и завязь неокрашенных бутонов, образующие с одного экспланта
до 10-30 регенерантов за год.
Основные результаты и выводы сформулированные в диссертации, могут
быть использованы цветоводами в зеленом строительстве региона, а также служить
методологической основой при изучении тюльпанов другими научноисследовательскими институтами. Разработанные методики могут быть
использованы в учебном процессе на биологических факультетах вузов.
Опубликованы методические рекомендации по использованию ассортимента и
агротехники выращивания тюльпанов в открытом грунте в условиях лесостепной
зоны Башкирского Предуралья.
Апробация работы. Основные результаты и положения диссертации были
представлены на научных конференциях различного уровня: а) международные:
«Природное наследие России: изучение, мониторинг, охрана» (Тольятти, 2004),
«Биоразнообразие: проблемы и перспективы сохранения» (Пенза, 2008),
«Интродукция нетрадиционных и редких растений» (Мичуринск, 2008), «Экологопопуляционный анализ полезных растений: интродукция, воспроизводство,
использование» (Сыктывкар, 2008), «Биология клеток растений in vitro и
биотехнология» (Москва, 2008); б) всероссийские: «Ботанические исследования в
Поволжье и на Урале» (Саратов, 2006; 2008), «Биотехнология как инструмент
сохранения
биоразнообразия
растительного мира» (Волгоград, 2006),
«Биотехнология как инструмент сохранения биоразнообразия растительного мира»
5
(Волгоград, 2008); в) региональные: «Перспективы развития садоводства и
овощеводства на Южном Урале» (Уфа, 2005).
Публикации. Основные положения диссертации опубликованы в 14
печатных работах, в том числе 2 статьи – в ведущих рецензируемых журналах,
определенных ВАК РФ.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 189 страницах,
состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов
исследования, результатов исследований и их обсуждения, заключения и выводов.
Список литературы включает 195 работ, в том числе 29 источников зарубежных
авторов. Приложение 1 состоит из списка сортов тюльпана, рекомендуемых для
включения в зональный ассортимент. Приложение 2 содержит 14 рисунков.
Диссертация иллюстрирована 28 таблицами и 33 рисунками.
*** Пользуясь возможностью, автор выражает искреннюю благодарность
научному руководителю, кандидату биологических наук Риме Кашафовне
Байбуриной и директору Ботанического сада-института, доктору биологических
наук Зиннуру Хайдаровичу Шигапову за подробный содержательный анализ,
объективную и принципиальную оценку диссертационной работы, неоценимую
помощь, внимание и поддержку, которые способствовали выполнению моей
работы.
1. ИНТРОДУКЦИЯ И РАЗМНОЖЕНИЕ ТЮЛЬПАНОВ
(ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР)
В главе рассмотрены основные методы предварительного выбора
интродуцентов
(климатических
аналогов,
флорогенетический,
экологогеографический и др.) и методы оценки успешности интродукции (Базилевская,
1964; Соболевская, 1971; Карписонова, 1985 и др.). Особое внимание уделено
методу родовых комплексов Ф.Н. Русанова (1971), который использовался в
работе. Приводятся ботаническая и садовая классификации и описываются
биологические особенности растений рода Tulipa L. (Введенский, 1935; Hall, 1940;
Бочанцева, 1962; Силина, 1977; Тахтаджян, 1978; Мордак, 1979б; Кудрявцева,
1981; Тахтаджян, 1997; Баранова, 1999). Прослежена история интродукции и
селекции от начала введения тюльпанов в культуру (Персия, XI-XII вв.) и
распространения по всему миру до современного состояния вопроса (Силина, 1953;
Бочанцева, 1962; Шпак, 1962; Кудрявцева, 1981; Карташева, 1998). Описаны
особенности вегетативного и семенного размножения тюльпанов (Зайцева, 1958;
Абрамова, 1968; Николаева, Разумова, 1973; Иванова, 1973; Князев и др., 2001).
Приводятся результаты применения метода культуры органов и тканей для
микроразмножения с использованием в качестве эксплантов изолированных
зародышей и вегетативных органов видовых и сортовых тюльпанов (Bancilhon,
1974; Nishiushi, 1980; Выхристова, Копылов, 1988; Коломиец, 1997). В заключении
обзора делается вывод о перспективности изучения вопросов интродукции и
размножения тюльпанов в регионе.
2. УСЛОВИЯ, ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Вегетационные и лабораторные опыты проводили на базе Ботанического
сада-института Уфимского научного центра РАН (БСИ) в 2001-2007 гг. Территория
БСИ расположена на 54°43 северной широты и 55°56 восточной долготы в
лесостепи на границе правобережья и левобережья Предуралья, в парковой части г.
Уфы на водоразделе рек Белой и Уфы. Высшая точка достигает 177 м над уровнем
6
моря. В климатическом отношении район БСИ характеризуется большой
амплитудой колебаний температуры в ее годовом ходе, неустойчивостью и
недостатком атмосферных осадков, быстрым переходом от суровой зимы к
жаркому лету, поздними весенними и ранними осенними заморозками.
Безморозный период продолжается около 140 дней. Среднегодовая температура
воздуха в районе г. Уфы +2,6°С. Среднегодовое количество осадков 459 мм, а в
летние месяцы – 184 мм.
Объектами исследования являлись 8 видов и 131 сорт рода Tulipa L. Из них 3
вида T. riparia, T. patens и T. tarda прошли полное интродукционное изучение на
базе БСИ. T. riparia и T. patens интродуцированы луковицами из Мелеузовского
района (Южного Урал), а T. tarda – из Москвы. Семена 5 видов (T. kuschkensis B.
Fedtsch., T. micheliana Hoog, T. praestans Hoog, T. biebersteiniana Schult. et Schult.
fil., T. turkestanica Regel) были получены по Делектусу из ботанических
учреждений России, Прибалтики и Германии. Эти виды использованы для
изучения особенностей семенного размножения.
Изучение декоративных и хозяйственно-ценных признаков сортов и видов
тюльпана проводили по методике государственного сортоиспытания декоративных
культур (Былов, 1960).
Для оценки успешности интродукции видовых тюльпанов в культуре
использована комплексная 15-балльная шкала, основанная на определении их
состояния по пяти показателям: плодоношение, количество вегетативных побегов,
размеры побегов, холодостойкость, повреждаемость болезнями (Былов,
Карписонова, 1978; Карписонова, 1985).
Гибридные семена тюльпанов получали методом принудительного
межсортового скрещивания (Кудрявцева, 1981).
В работе использован метод культуры тканей (Катаева, Бутенко, 1983),
основанный на активации развития уже существующих в растении меристем и
индукции образования почек или эмбриоидов заново, непосредственно из
специализированных тканей и каллусной ткани.
В качестве эксплантов испытаны зародыши семян гибридных форм
тюльпана, пазушные почки луковиц, сегменты чешуй микролуковиц и
неокрашенных бутонов. Из бутонов фрагментировали цветоложе, завязь, рыльце и
околоцветники.
Статистический анализ данных проводили в MS Excel 2003 при помощи
пакета статистических программ Statistica 5.0 с использованием стандартных
показателей (Зайцев, 1984; Лакин, 1990).
3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИНТРОДУКЦИОННОГО ИЗУЧЕНИЯ
СОРТОВЫХ И ВИДОВЫХ ТЮЛЬПАНОВ
Интродукционное изучение сортовых тюльпанов
В результате фенологических наблюдений выявлено, что в лесостепной зоне
Башкирского Предуралья отрастание тюльпанов начинается в конце III декады
апреля. В зависимости от сорта количество дней от отрастания до начала цветения
колебалось в пределах 17-37 дней. Все изучаемые сорта тюльпана по срокам
цветения можно разделить на 3 группы: раноцветущие (в I декаде мая),
среднецветущие (во II декаде мая) и поздноцветущие (в III декаде мая).
Выделены 20 сортов с наиболее продолжительным цветением популяций (до
20 дней) и 18 сортов с наиболее продолжительным цветением одного растения (до
7
14 дней). Отмечено, что по годам меняются лишь сроки и продолжительность
цветения тюльпанов, а их последовательность остается неизменной.
Проведены исследования динамики роста генеративных побегов сортовых
тюльпанов из 15 садовых классов.
От начала отрастания до фазы цветения суточный прирост растений из всех
садовых классов не превышает 1,0 см. Наиболее интенсивный рост изученные
сорта имеют в период цветения (II декада мая). В зависимости от сорта и класса
максимальный прирост растений в сутки за данный период у среднерослых
тюльпанов составляет до 3,4 см, у низкорослых – 1,5 см. У большинства сортов
наблюдаются однопиковые графики суточного прироста генеративных побегов.
Однако бывают и исключения (рис.1). Так, например сорт Beauty of Oxford из
класса Дарвиновы гибриды имеет два пика прироста. Его пик, приходящийся на
период бутонизации, выше, чем в период цветения.
Olympic Flame
Beauty of Oxford
Dawnglow
Gans Mayer
Spring Son
Прирост в сутки, см
2,5
2
1,5
1
0,5
0
III дек.
апр.
III дек.
апр.
III дек.
апр.
I дек.
мая
II дек.
мая
II дек.
мая
III дек.
мая
Календарные дни
Рис. 1. Динамика роста тюльпанов из класса Дарвиновы гибриды
При оценке декоративных признаков выявлено, что коллекционные
тюльпаны обладают широким спектром окраски цветка: одноцветные – 7 сортов,
битональные – 36; трехтональные – 45; четырехтональные – 26; пятитональные –
13; шеститональные – 4. Тюльпаны имеют разную форму цветка: 37 сортов –
чашевидную, 5 – овальную, 48 – бокаловидную, 18 – махровую, 13 –
широкобокаловидную, 1 сорт – шаровидную и 9 сортов – лилейную. По высоте
растения выделены 2 группы: среднерослые (выше 50 см) – 70 сортов и
низкорослые (ниже 50 см) – 61 сорт. В коллекции присутствуют сорта с двумя
цветоносами (класс Махровые ранние) и с шестью (Простые поздние).
Проведено интродукционное изучение 131 сорта тюльпана. В результате
комплексной оценки декоративных признаков по 100-балльной шкале выделен 71
сорт, набравших максимальное количество баллов (более 90). Данные сорта
обладали крупными цветками с красивой формой и чистой окраской лепестков,
прочными цветоносами, длительным и обильным цветением. Они рекомендованы
для пополнения зонального ассортимента культурных растений.
Выявлено, что в условиях лесостепной зоны Башкирского Предуралья
сортовые тюльпаны холодостойки и устойчивы к болезням (исключением являются
8
4 сорта, которые были поражены вирусом пестрения). Отмечено, что луковицы
тюльпанов классов Лилиецветные, Махровые ранние, Зеленоцветковые и
Махровые поздние наиболее подвержены повреждению грызунами.
В результате исследования особенностей вегетативного размножения
тюльпанов подземными органами в условиях лесостепной зоны Башкирского
Предуралья выведен средний коэффициент размножения.
Результаты
представлены в таблице 1.
Таблица 1
Коэффициент вегетативного размножения сортовых тюльпанов
Средний коэффициент размножения
Группа I. Раноцветущие тюльпаны
Простые ранние
2,4
Махровые ранние
2,5
Группа II. Среднецветущие тюльпаны
Триумф-тюльпаны
2,8
Дарвиновы гибриды
3.1
Группа III. Поздноцветущие тюльпаны
Простые поздние
3,0
Лилиецветные
3,2
Бахромчатые
2,9
Зеленоцветковые
3,0
Рембрандт тюльпаны
2,8
Попугайные
2,8
Махровые поздние
2,9
Группа IV. Виды тюльпанов и их гибриды
Тюдьпан Кауфмана, разновидности и
2,1
гибриды
Тюльпан Фостера, разновидности и гибриды
2,3
Тюльпан Грейга, разновидности и гибриды
2,2
Виды тюльпанов, их разновидности и
2.2
гибриды
Классы
Выявлено, что более высокий коэффициент размножения (в среднем 3,0)
имели средне- и позднецветущие сорта, характеризующиеся длительным периодом
вегетации. У раноцветущих сортов коэффициент размножения не превышал 2,12,5.
Показано, что изученные сорта тюльпанов являются перспективным
исходным материалом для селекции и могут быть использованы в зеленом
строительстве Республики Башкортостан. Для оформления бордюров, групповых
посадок на газонах, клумбах, рабатках рекомендуются среднерослые сорта
(Простые ранние, Триумф-тюльпаны, Дарвиновы гибриды, Простые поздние,
Бахромчатые, Лилиецветные, Зеленоцветковые, Попугайные). В садово-парковых
ландшафтах, рокариях, при создании каменистых горок, альпинариев лучше
использовать низкорослые сорта (тюльпан Кауфмана, тюльпан Фостера, тюльпан
Грейга, Махровые ранние и Махровые поздние).
9
Интродукционное изучение видовых тюльпанов
Проведено интродукционное изучение видовых тюльпанов: Tulipa riparia, T.
patens и T. tarda.
По результатам фенологических наблюдений за сезонным ритмом развития
выявлено, что они являются рановегетирующими растениями, их весеннее
отрастание начинается в начале III декады апреля. Период от отрастания до начала
цветения составляет 11-13 дней (табл. 2).
Таблица 2
Продолжительность цветения видовых тюльпанов (средняя за 2003-2005 гг.)
Количество дней
от отрастания до
начала цветения
Вид
T. riparia
T. patens
T. tarda
Продолжительность цветения, дни
популяции
одного растения
8 ±1
6±2
10 ± 2
5±2
3±1
8±2
12 ± 1
13 ± 1
11 ± 1
Выявлено, что T. tarda отличается наиболее продолжительным цветением
популяции и одного растения в условиях культуры (10 и 8 дней соответственно).
Наименьшими сроками цветения характеризовался T. patens (6 и 3 дня).
Изученные виды имели наиболее интенсивный рост в фазы бутонизации и
цветения (I декада мая) (рис. 2). Максимальный суточный прирост за данный
период составлял от 0,8 см (T. tarda) до 2,5 см (T. riparia). Во II декаду мая (конец
цветения) рост растений замедлялся, а в начале III декады полностью прекращался.
3
T. patens
T. riparia
T. tarda
Прирост в сутки, см
2,5
2
1,5
1
0,5
0
III
дек.
апр.
III
дек.
апр.
III
дек.
апр.
I дек. I дек. II дек.
мая
мая
мая
III
дек.
мая
Календарные дни
Рис. 2. Динамика роста видовых тюльпанов
В результате проведенной оценки декоративных признаков по 100-балльной
шкале из интродуцированных видов выделен T. tarda. Он получил максимальную
сумму баллов – 90. Декоративность T. riparia оценена 70, T. patens − 63 баллами.
10
Выявлено, что раскрытие цветков обычно приходится на утренние часы (910 часов). Сначала начинают открываться околоцветники, затем пока околоцветник
будет приобретать форму присущую данному виду, постепенно раскрываются
пыльники. Для тюльпанов характерна протерандрия. Разница во времени между
созреванием пыльников и пестиков зависит от температуры окружающего воздуха:
чем она выше, тем меньше промежуток по степени зрелости между генеративными
органами цветка. После полного раскрытия цветка на рыльце начинает выделяться
экссудат (на второй день цветения), сигнализирующий о том, что цветок готов к
восприятию пыльцы. Пыльца у всех трех видов (T. riparia, T. patens и T. tarda)
сохраняется на рыльце пестика в течение 2-3-х дней. Продолжительность жизни
одного цветка зависит от погодных условий и составляет 3-8 дней.
Показано, что в условиях культуры все виды проходят полный цикл
развития побегов, характеризуются стабильностью ритмических процессов,
приспособлены к местным климатическим условиям, не повреждаются болезнями,
однако семенами не возобновляются и имеют низкий коэффициент вегетативного
размножения (менее 2.0). По продуктивности, размерам побегов они уступают
растениям из природных местообитаний. T. riparia, T. patens и T. tarda по
успешности интродукции оценены в 10 баллов, что позволяет их отнести к группе
устойчивых растений.
Проведенная комплексная оценка видовых тюльпанов по декоративным и
хозяйственно-ценным признакам, позволила рекомендовать T. tarda для
использования в озеленении. Кроме того, все три изученных вида можно
применять в селекционной практике в качестве источников ценных признаков и
свойств: ранние сроки цветения, устойчивость к болезням и вредителям,
карликовость, оригинальная окраска цветков и листьев, многоцветковость.
4. РЕЗУЛЬТАТЫ РАЗМНОЖЕНИЯ ТЮЛЬПАНОВ IN VIVO
Вегетативное размножение сортовых тюльпанов
Вегетативный способ размножения является основным для сортовых
тюльпанов, так как он позволяет быстрее, чем при семенном размножении,
получить цветущие растения, и, кроме того, обеспечивает передачу потомству всех
признаков материнского растения. Интенсивность вегетативного возобновления
неодинакова у разных сортов. Она зависит как от биологических свойств растений,
являясь сортовым признаком, так и от условий выращивания.
Проведены исследования по изучению влияния глубины посадки (9, 12, 15,
18 см) луковиц тюльпанов на их рост, развитие и продуктивность на примере сорта
Parade (Дарвиновы гибриды). Выявлено, что глубокая посадка задерживает сроки
весеннего отрастания и цветения растений на 2-6 дней, однако при этом
увеличивается длина цветоносов (на 4,0-12,5 см) и высота цветков (на 1,3-2,1 см).
Показано, что глубина посадки влияет и на коэффициент вегетативного
размножения. Лучшие результаты получены при посадке луковиц на глубину 15-18
см. При этом биологический коэффициент размножения за два года составил 4,2, а
производственный – 2,9. Таким образом, при выращивании сортовых тюльпанов на
серых лесных почвах предпочтительна глубокая посадка луковиц.
Семенное размножение видовых тюльпанов
Особенности семенного размножения изучались на семенах пяти видов,
полученных по Делектусу.
Выявлено, что при оптимальном температурном режиме (0-10ºС) семена у T.
kuschkensis начинают прорастать через 30-32 дня, у T. micheliana − 41-43 дня, у
11
остальных видов (T. praestans, T. biebersteiniana, T. turkestanica) − 61-92 дня (табл.
3). При переменном температурном режиме (0-10ºС и 25ºС) прорастание у пяти
исследуемых видов затягивается и заканчивается через 90-132 дня.
Таблица 3
Продолжительность прорастания и всхожесть семян Tulipa L.
Период прорастания
семян, дни
Вид
T. kuschkensis
T. micheliana
T. praestans
T. biebersteiniana
T. turkestanica
Всхожесть,
%
от посева до
начала
прорастания
123
30-32
от посева
до конца
прорастания
261
75-83
12
98-100
93-96
–
41-43
185-187
–
101-105
81-94
–
98-99
90-92
119
62-63
183-188
246
142-147
79-82
9
91-95
99-102
203-205
84-86
25 (контроль)
постоянный 0-10
переменный
2 и 25, 10 и 25
–
61-64
–
136-144
–
86-90
91-97
200-202
80-81
25 (контроль)
постоянный 0-10
переменный
2 и 25, 10 и 25
–
83-92
–
156-162
–
97-98
127-132
228-229
82-85
Температурный
режим, °С
25 (контроль)
постоянный 0-10
переменный
2 и 25, 10 и 25
25 (контроль)
постоянный 0-10
переменный
2 и 25, 10 и 25
25 (контроль)
постоянный 0-10
переменный
2 и 25, 10 и 25
Период прорастания всех всхожих семян с момента их замачивания при
оптимальном температурном режиме составил у T. kuschkensis, T. micheliana 75-105
дней, у T. praestans, T. biebersteiniana и T. turkestanica – 136-162 дней. При
переменной температуре период прорастания семян увеличивался в 1,2-2,0 раза. В
опытных вариантах у всех пяти видов лабораторная всхожесть семян была высокой
и составляла 79-100 %. В контрольном варианте (25ºС) семена не прорастали или
их всхожесть была незначительной (9-12 %). К моменту прорастания семян во всех
вариантах опыта зародыши увеличились в длину в 1,5-2,5 раза по сравнению с
контролем.
Таким образом, показано, что семена тюльпанов характеризуются глубоким
морфофизиологическим типом покоя. Причина такого покоя заключается в
недоразвитии зародыша и сильном физиологическом механизме торможения
прорастания. Низкая положительная температура (оптимум которой находится в
12
диапозоне от 0 до 10ºС) способствует снятию физиологического покоя зародыша,
следствием чего является его сравнительно быстрый семенной рост.
С целью ускорения процессов доразвития зародыша и прорастания семян
тюльпанов, на пяти видах изучалось действие физиологически активных веществ
(ФАВ). Для этого семена проращивали при низкой положительной температуре в
растворах гибберелловой кислоты (ГК), рифтала, фэтила, фитона, крезацина и
гетероауксина в концентрациях, рекомендуемых производителем. В качестве
контроля использовали воду (табл. 4). Проведенные исследования показали, что
при длительном воздействии ФАВ снижаются показатели всхожести семян. Лишь
семена у T. biebersteiniana, обработанные ГК, рифталом и фэтилом имели более
высокий процент всхожести, чем в контроле. Однако, ФАВ существенно увеличили
длину зародыша к 30-у дню проращивания (в 1,6 раз) и сократили период
прорастания семян трех видов тюльпана (на 1-35 дней).
Таблица 4
Влияние ФАВ на прорастание семян T. biebersteiniana
Обработка физиологически активными веществами
ТемпераДлина
Период
Всхотурный
зародыша на
прорастания
жесть, %
режим, °С 30-й день, мм
семян, дни
0-2
3,9 ± 0,09
136
90
Контроль
8-10
4,3 ± 0,13
144
86
Гибберелловая
0-2
6,4 ± 0,12
101
95
кислота 0.2 %
8-10
5,8 ± 0,15*
111
93
0-2
5,1 ± 0,16
112
94
Рифтал 0,0005 %
8-10
4,8 ± 0,10*
127
94
0-2
4,9 ± 0,14*
113
92
Фэтил 0.0005 %
8-10
5,0 ± 0,17*
120
91
0-2
4,4 ± 0,13
115
85
Крезацин 0.01 %
8-10
4,9 ± 0,16*
119
83
0-2
4,2
±
0,12*
117
75
Фитон 0.001 %
8-10
5,1 ± 0,16*
114
72
Гетероауксин
0-2
4,5 ± 0,08*
121
76
0.001 %
8-10
5,1 ± 0,15*
130
81
* - разница с контролем достоверна при 5 %-ном уровне значимости
5. ИЗУЧЕНИЕ И РАЗМНОЖЕНИЕ ТЮЛЬПАНОВ
В КУЛЬТУРЕ IN VITRO
Культура изолированных зародышей
Биотехнологические исследования показали, что для получения посадочного
материла гибридных форм тюльпана эффективно применение метода культуры
изолированных зародышей.
В качестве исходного материала использовали зародыши семян гибридных
форм тюльпана, полученных нами от 5 комбинаций скрещивания с участием 9
сортов зарубежной селекции из 4 классов: Махровые поздние, Лилиецветные,
Бахромчатые и Простые поздние. В коробочке одного растения образуется от 20 до
160 выполненных семян.
Выявлено, что положительные результаты зависят от размеров и сроков
изоляции зародышей (табл. 5). Оптимальный срок изоляции зародышей семян
13
тюльпана – 53-56-й дни после опыления. Зародыши размером 1,5-3,0 мм были
более жизнеспособными – 45,6–91,0 %.
Таблица 5
Жизнеспособность зародышей тюльпанов in vitro в зависимости от сроков
изоляции на примере комбинации скрещивания New Look x Marietta
Срок изоляции
(число дней
после опыления)
40
50
Введено в
культуру
зародышей, шт.
25
30
53
30
55
30
56
28
60
70
30
30
Размер
зародышей,
мм
до 1,0
до 1,0
до 1,0
1,5-3,0
до 1,0
1,5-3,0
до 1,0
1,5-3,0
3,1-5,0
3,1-6,0
Жизнеспособность
зародышей in vitro, %
15,4
21,9
39,6
45,6
53,2
85,5
47,9
91,0
30,8
33,4
Определены пути получения микропобегов тюльпана с использованием
культуры изолированных зародышей через органогенез и стадию каллусогенеза.
Серия экспериментов с регуляторами роста цитокининовой и ауксиновой природы
позволила выделить комбинацию БАП (6-бензиламинопурин) 3,0 мг/л + НУК (αнафтилуксусная кислота) 0,15 мг/л в питательной среде MS (по Мурасиге и Скуга),
которая обеспечивала высокую частоту органогенеза – 62,5 % и каллусогенеза –
56,3 %.
Число побегов на эксплант к седьмому месяцу культивирования составило в
среднем 5,4 шт., длина побегов – 4,3 см (рис.3).
6
число побегов на эксплант, шт
длина побегов, см
5
4
3
2
1
0
I
II
III
IV
Варианты питательной среды
Рис. 3. Развитие побегов на изолированных зародышах в зависимости от
регуляторов роста на примере New Look x Marietta. Варианты питательной
среды MS: I – БАП 0,5 мг/л + НУК 0,15 мг/л; II – БАП 1,0 мг/л + НУК 0,05 мг/л;
III – БАП 2,0 мг/л + НУК 0,1 мг/л; IV – БАП 3,0 мг/л + НУК 0,15 мг/л.
14
Выявлено, что культивирование растений-регенерантов на питательной
среде MS с 0,5 мг/л ИМК при температуре +4°С в течение 12 нед в темноте
способствовало образованию зачатков микролуковиц. Перенос в условия
освещения и выдерживание при температуре 26°С способствовало полному
формированию микролуковиц, которое длилось от 30 до 120 дней (рис. 4).
Продолжительность периода от опыления до формирования микролуковиц
составила 17-19 мес и зависила от сортовых особенностей родительских форм и
условий культивирования in vitro. Выявлено, что на одном зародыше в культуре in
vitro образуется от 2 до 8 побегов и соответственно микролуковиц. Как было
указано выше в коробочке одного растения образуется от 20 до 160 выполненных
семян. В результате проведенных экспериментов выход микролуковиц от
минимального количества выполненных семян за 1,5 года в среднем составил 160,
максимального до 1000. Показано, что использование метода культуры
изолированных зародышей позволяет не только получать гибридные формы
тюльпана, но и одновременно размножать их.
Рис. 4. Формирование микролуковиц на побегах, полученных из зародышей на питательной среде MS, содержащей
ИМК 0,5 мг/л
Морфогенез в культуре органов тюльпана.
Чешуи стерильных микролуковиц. Исследования показали возможность
эффективного применения метода культуры тканей для микроразмножения
тюльпана с использованием генеративных и вегетативных органов.
Изучалась регенерация растений из чешуй микролуковиц гибридных сеянцев
New Look x Marietta. На поверхности чешуй получена прямая индукция развития
побегов в течение 2,5 мес культивирования. Частота побегообразования была выше
в вариантах БАП 0,5 мг/л + НУК 1,0 мг/л и кинетин 0,5 мг/л + ИУК
(индолилуксусная кислота) 2,0 мг/л (табл. 6).
Таблица 6
Индукция побегообразования на сегментах чешуй микролуковиц гибридных
сеянцев New Look x Marietta на питательной среде MS
Регуляторы роста, мг/л
БАП 0,2 + НУК 0,5
БАП 0,5 + НУК 1,0
Кинетин 0,5
Кинетин 0,5 + ИУК 2,0
Среднее число побегов на
экспланте, шт.
5,7 ± 0,18
8,1 ± 0,37
4,2 ± 0,15
6,9 ± 0,31
Средняя длина
побега, мм
32,4 ± 0,61
49,6 ± 0,82
20,9 ± 0,43
23,7 ± 0,70
15
Неокрашенные бутоны. Для микроразмножения in vitro были использованы
неокрашенные бутоны тюльпана 'Lucky Strike'. Из них фрагментировали
цветоложе, завязь, рыльце и околоцветник. Исследования показали, что в культуре
in vitro наибольшую способность к морфогенезу и каллусогенезу проявили
экспланты неоплодотворенной завязи и цветоложа. Экспериментально показано,
что как для каллусогенеза так и для пролиферации на эксплантах завязи
эффективными оказались питательные среды, содержащие БАП 10,0 мг/л и НУК
1,0 мг/л (43,6 %), БАП 5,0 мг/л и ИУК 1,0 мг/л (20,4 %); для фрагментов цветоложа
– кинетин 0,5 мг/л и НУК 2,5 мг/л (31,5 %), БАП 5,0 мг/л и ИУК 1,0 мг/л (26,8 %)
(табл. 7). Число побегов на эксплант за 2,5-3,0 мес культивирования варьировало от
2 хорошо развитых до 6-8 более мелких.
Таблица 7
Оценка пролиферации эксплантов тюльпана 'Lucky Strike'
на разных средах культивирования
Сегменты
Регуляторы роста, мг/л
завязи
общее из них пролиферирую
число
щих, %
Цветоложа
общее из них пролиферирую
число
щих, %
Кинетин
НУК
БАП
ИУК
0,5
2,5
–
–
30
7,2
30
31,5
–
–
5,0
1,0
20
20,4
20
26,8
–
1,0
10,0
–
15
43,6
15
10,2
Разработанный метод микроразмножения сортового тюльпана позволяет
получать за один год от каждого экспланта от 10 до 30 микролуковиц.
Пазушные почки. Изучался морфогенетический потенциал in vitro пазушных
почек луковицы тюльпана 'Dawnglow'. Выявлены комбинации регуляторов роста и
их концентрации, способствующие оптимизации процессов, проходящих на
отдельных этапах клонального микроразмножения. Показано, что на питательной
среде MS, дополненной НУК 1,0 мг/л и кинетином 0,5 мг/л доля эксплантов с
дифференцированной тканью составила 76,3 %, при этом наблюдался
относительно низкий процент некрозов 23,7 % (табл. 8).
Таблица 8
Органогенез в культуре изолированных пазушных почек тюльпана 'Dawnglow' (на
питательной среде MS с регуляторами роста)
Регуляторы роста, мг/л
НУК 2,5 + кинетин 1,0
НУК 1,0 + кинетин 1,0
НУК 1,0 + кинетин 0,5
Число высаженных эксплантов, шт.
17
21
18
Доля эксплантов, %
некротизирос дифференцированных
ванной тканью
52,4
47,6
34,3
65,7
23,7
76,3
16
При последующем культивировании снижение содержания кинетина в
питательной среде до 0,25 мг/л и НУК до 0,05 мг/л способствовало росту
микропобегов. При этом коэффициент размножения побегов с одного экспланта
через 8 недель культивирования составил 8–10 (рис. 5).
Рис. 5. Образование побегов из пазушной почки
тюльпана 'Dawnglow' на питательной среде MS,
содержащей НУК 1,0 мг/л + кинетин 0,5 мг/л
Для формирования микролуковиц побеги переносили на питательную среду
MS, дополненную ауксинами. Выявлено, что наибольшее количество
микролуковиц формировалось на питательной среде MS с добавлением ИМК 0,5
мг/л и ИМК в сочетании с НУК по 0,2 мг/л. Выход микролуковиц из одного
экспланта (пазушной почки) был достаточно высокий 37,4 и 58,3 %. Вес
микролуковиц, полученных на указанных средах был также высоким (1,32 и 2,03 г
соответственно).
Проведенное исследование показало возможность использования пазушных
почек луковиц тюльпана для микроразмножения in vitro.
Обычно материнская луковица образует 5 пазушных почек за год.
Разработанный нами метод микроразмножения in vitro позволил получить из
одного экспланта до 10 микропобегов, каждая из которых образует по одной
микролуковице. Из одной луковицы тюльпана за год удалось получить до 175
микролуковиц.
ВЫВОДЫ
1. Изучены 131 сорт тюльпана гибридного, относящихся к 15 садовым классам.
По комплексу признаков: по оригинальности и чистоте окраски, крупности и
форме цветка, высоте растения, обилию и продолжительности цветения,
холодостойкости и устойчивости к болезням и вредителям, высокому
коэффициенту вегетативного размножения лучшими признаны 71 сорт. Они
рекомендуются для пополнения зонального ассортимента.
2. Дана оценка успешности интродукции Tulipa riparia, T. patens и T. tarda.
Выявлено, что они устойчивы в условиях культуры Башкирского
Предуралья: проходят полный цикл развития побегов, характеризуются
стабильностью ритмических процессов, приспособлены к местным
климатическим условиям, не повреждаются болезнями и вредителями,
имеют низкий коэффициент вегетативного размножения (менее 2.0). По
продуктивности и размерам побегов они уступают растениям из природных
17
местообитаний. Проведенная комплексная оценка видовых тюльпанов по
декоративным и хозяйственно-ценным признакам, позволила рекомендовать
T. tarda для использования в озеленении. Кроме того, изученные виды
можно использовать в селекционной практике в качестве источников ценных
признаков и свойств: ранние сроки цветения, устойчивость к болезням и
вредителям, карликовость, оригинальная окраска цветков и листьев,
многоцветковость.
3. Подобраны оптимальные условия для проращивания семян видов T.
kuschkensis, T. micheliana, T. praestans, T. biebersteiniana, T. turkestanica.
Подтверждено, что определяющим фактором прорастания семян является
низкая положительная температура среды (0-10ºС). Выявлено, что
внутрисеменной рост зародыша является длительным процессом (30-92 дня)
и может быть интенсифицирован с помощью регуляторов роста
(гибберелловая кислота, рифтал, фэтил, крезацин, фитон, гетероауксин).
4. Получены гибридные семена от 5 комбинаций скрещивания с участием 9
сортов зарубежной селекции из 4 классов: Махровые поздние,
Лилиецветные, Бахромчатые и Простые поздние.
С целью ускоренного размножения гибридов и выхода посадочного
материала, разработан перспективный метод культуры изолированных
зародышей. Выявлен оптимальный срок изоляции зародышей из семян – 53–
56-й день после опыления, при этом размер зародыша должен достигать 1,5–
3,0 мм. Подобрана оптимальная питательная среда (MS, дополненная БАП
3,0 мг/л + НУК 0,15 мг/л), позволяющая размножать тюльпаны с
эффективностью более чем в 125 раз превышающей традиционный способ
вегетативного размножения.
5. Доказана возможность эффективного применения метода культуры
вегетативных и генеративных органов тюльпана in vitro, позволяющего
решить проблему сокращения сроков получения посадочного материала.
Выявлены оптимальные экспланты для микроразмножения путем
мультипликации побегов: пазушные почки луковицы, образующие с одного
экспланта до 175 микролуковиц за год, цветоложе и завязь неокрашенных
бутонов, образующие с одного экспланта до 10-30 регенерантов за год.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
Публикации в научных журналах, рекомендованных ВАК РФ
1. Ахметова А.Ш., Байбурина Р.К., Миронова Л.Н. Культура изолированных
зародышей гибридных форм тюльпана // Цитология. 2006. Т. 48. – С. 742
2. Ахметова А.Ш., Байбурина Р.К., Миронова Л.Н Размножение in vitro клонов
гибридных форм тюльпана // Биотехнология. 2007. № 2. – С. 3-7.
Публикации в других изданиях
1. Ахметова А.Ш., Миронова Л.Н., Байбурина Р.К. Интродукционное изучение
тюльпанов флоры республики Башкортостан // Матер. Междунар. конф.
«Природное наследие России: изучение, мониторинг, охрана». – Тольятти,
2004. – С.15-16.
2. Ахметова А.Ш., Миронова Л.Н., Байбурина Р.К. Перспективы
использования тюльпанов в декоративном садоводстве Республики
Башкортостан // Матер. научно-практ. конф. «Перспективы развития
садоводства и овощеводства на Южном Урале». – Уфа, 2005. –С. 83-85.
18
3. Ахметова А.Ш., Байбурина Р.К. Морфогенез в культуре органов Tulipa L. //
Матер. Всероссийской научн. конф. «Ботанические исследования в
Поволжье и на Урале». Бюллетень Ботанического сада СГУ 5-й выпуск. –
Саратов, 2006. – С. 296-299.
4. Ахметова А.Ш. Культивирование меристем тюльпанов для получения
безвирусного посадочного материала // Матер. Всероссийской научнопрактич. конф. «Биотехнология как инструмент сохранения биоразнообразия
растительного мира». – Волгоград, 2006. – С. 98-101.
5. Ахметова А.Ш., Байбурина Р.К., Миронова Л.Н., Шаяхметов И.Ф.
Эмбриокультура тюльпанов. // Вестник Башкирского университета. 2007. Т.
12, № 4, – С. 33-35.
6. Дорошева З.Н., Ахметова А.Ш., Миронова Л.Н. Тюльпаны. Руководство по
размножению и выращиванию – Уфа: РУНМЦ МО РБ, 2007. – 47 с.
7. Ахметова А.Ш., Миронова Л.Н. Особенности размножения и регенерации
тюльпанов in vitro // Матер. Всероссийской научн. конф. «Ботанические
исследования в Поволжье и на Урале». Бюллетень Ботанического сада СГУ
7-й выпуск – Саратов, 2008. – С. 174-177.
8. Ахметова А.Ш., Миронова Л.Н. Опыт проращивания семян тюльпана в
лабораторных
условиях
//
Матер.
Междунар.
научн.
конф.
«Биоразнообразие: проблемы и перспективы сохранения». – Пенза, 2008. С.
5-6.
9. Ахметова А.Ш., Миронова Л.Н. К вопросу проращивания семян тюльпана //
Матер.
VIII
Междунар.
научно-методич.
конф.
«Интродукция
нетрадиционных и редких растений». – Мичуринск, 2008. – С. 175-177.
10. Ахметова А.Ш., Миронова Л.Н. Проращивание семян тюльпана с
использованием гибберелловой кислоты // Матер. X Междунар. симпозиума
«Эколого-популяционный анализ полезных растений: интродукция,
воспроизводство, использование». – Сыктывкар, 2008. – С. 15-16.
11. Ахметова А.Ш., Миронова Л.Н. Клональное микроразмножение тюльпана
сорта Lucky Strike // Матер. II Всероссийской научно-практич. конф.
«Биотехнология как инструмент сохранения биоразнообразия растительного
мира». – Белгород, 2008. – С. 148-152.
12. Ахметова А.Ш Культивирование зародышей тюльпанов in vitro // Матер. IX
конференция «Биология клеток растений in vitro и биотехнология». –
Звенигород, 2008. – С. 8.