Полисахариды, извлеченные из Agaricus blazei стимулируют подмножество лимфоцитных Т-клеток у мышей

Полисахариды, извлеченные из Agaricus
blazei стимулируют подмножество
лимфоцитных Т-клеток у мышей
Masashi Mizuno, Mikio Morimoto, Ken-ichiro Minato и Hironobu Tsuchida
Научное отделение биологических ресурсов, Аспирантура науки и технологий,
Университет Kobe, Kobe 657-8501, Япония
Получено 14 июля 1997 года
Субпопуляционный анализ селезеночных лимфоцитов с использованием проточного
цитометрического анализа показал, что процентное содержание положительных клеток
Thyl.2-(пан T-клетки), L3T4-(CD4, T-клетки помощники) и Lyt2-(CD8, цитотоксичные Tклетки) у мышей, орально принимавших растворенную в воде фракцию Agaricus blazei,
значительно увеличилось в сравнении с данными мышей, принимавших только солевой
раствор. Данные13C-NMR указывают на то, что основным компонентом активного
полисахарида является соединение a-1,6-и a-l,4-глюканов, которая, как было выявлено ранее,
обладает противоопухолевым воздействием на Саркому 180. Из этого можно предположить,
что Agaricus blazei может быть эффективным средством профилактики рака у людей
благодаря стимуляции лимфоцитов, таких как цитотоксичные Т-клетки.
Ключевые слова: Agaricus blazei; субпопуляция T-клеток; проточный
цитометрический анализ; иммуномодулирующее воздействие; грибы.
В последнее время грибы стали привлекать внимание не только как функциональная
пища, но и для разработки лекарств. Многие исследователи изолировали и
идентифицировали противоопухолевые полисахариды из грибов.1"51 Противоопухолевое
воздействие этих полисахаридов вызвано повышением иммунной реакции, что включает в
себя активацию лимфоцитов. 2'6' Hamuro et a/.7>8 заявил, что лентинан, 0 (1 ->3) глюкан,
активизирует увеличение аллореактивных цитотоксичных Т- лимфоцитов у мышей и крыс и
повышает образование цитотоксичных Т-лимфоцитов в клетках селезенки. А Sakagami et
al.9) заявил, что шизофилан, 0 (1 -* 6) разветвленный 0 (1 -»3) глюкан, активизирует
макрофаги, после чего следует усиление Т-клеток киллеров благодаря цитокину. Таким
образом, можно сказать, что обычно воздействие противоопухолевых полисахаридов
проявляется в стимулировании субпопуляции Т-клеток в клетках селезенки.
Mizuno et al.if5 заявил, что полисахариды Agaricus blazei обладают противоопухолевым
воздействием на мышей, носителей Саркомы 180. Основным компонентом структуры
полисахарида является 0-1,6-глюкопираносиловый остаток. 3' Ito et al.l0) заявил, что
активизация макрофага и изменение третьего компонента комплимента необходимы для
стимулирования противоопухолевого воздействия, когда противоопухолевые полисахариды
Agaricus blazei вводятся внутрибрюшинно мышам с имплантированной опухолью. Помимо
этого, было объявлено, что процентное содержание селезеночных клеток Thyl.2-, L3T4-, и
асиало GMl- положительных клеток в субпопуляции Т-клеток было значительно выше у
мышей, орально принимавших растворимую в воде фракцию Agaricus blazei, чем у мышей,
которые принимали только солевой раствор. 11' Соответственно, можно предположить, что
изменение модели Thyl.2-, L3T4-, и асиало GMl- положительных клеток тесно связано с
противоопухолевым воздействием Agaricus blazei. Данные результаты показывают, что
полисахариды Agaricus blazei стимулируют противоопухолевое воздействие посредством
модуляции иммунной реакции у мышей, носителей опухоли.
Хотя эксперименты показали воздействие полисахаридов как лекарств на противоопухолевую
деятельность у мышей, носителей опухоли, мы считаем, что более важно прояснить их
воздействие на иммунную реакцию у здоровых мышей, а не у мышей, носителей опухоли,
принимая во внимание, что эти полисахариды могут стать профилактическим средством, а
также физиологически функциональной пищей. В этом докладе мы сконцентрируем
внимание на структуре полисахаридов, извлеченных из Agaricus blazei и их воздействии на
субпопуляцию Т-клеток в клетках здоровых мышей.
Материалы и методы
Животные. В качестве источника селезеночных лимфоцитных подмножеств
использовались особи женского пола в возрасте 8 недель C3H/He (Япония SLC, Shizuoka)
Материалы. Сухие плодовые тела Agaricus blazei были пожертвованы Институтом
Iwade Mushroom (Mie, Япония).
Извлечение горячей, растворимой в воде, фракции. Сухие плодовые тела Agaricus
blazei были гомогенизированы жидким азотом в Warning blender (миксере), а потом
лиофилизированы. Лиофилизированные грибы (10 г) были извлечены 6 раз с 80% этанолом
(100 мл) при 80°C в течение 6 часов. Остатки после извлечения с этанолом были извлечены 4
раза с горячей водой (200 мл) в течение 4 часов, а потом отфильтрованы. Раствор был
лиофилизирован, и далее он будет называться горячей, растворимой в воде, фракцией (ГРВ).
Извлечение активного полисахарида из ГРВ фракции. ГРВ фракцию (100 мг),
извлеченную из Agaricus blazei, растворили в 100 мл воды. Для осаживания белков в раствор
добавили 5% трихлороацетичную кислоту, а после этого он прошел центрифугу в течение 15
мин при120 x д. Осадок на поверхности (FA) и осадок внизу (FB) были диализированы от
дистиллированной воды через целлюлозовую трубу. Остаточные растворы был
сконцентрированы до небольшого объема посредством испарения и лиофилизации. Водный
раствор FA (5 мг) прошел анионообменную хромотографию на колонне DEAE-Sepharose CL6B (2.6 x 34 см) со ступенчатым элюированием 300 мл 1 /15 м фосфатного буфера (pH 7.2),
400 мл того же самого буфера, содержащего 0.25 м NaCl, и 300 мл того же буфера,
содержащего 1 м NaCl. Далее активная фракция была разделена с помощью колонны
Sepharose 6B (1.6 x 94 см), уравновешенной 1/15 м фосфатного буфера (pH 7.2). Колонна
была элюирована с помощью того же буфера.
Прием образца. Каждый тестируемый образец был разбавлен физиологическим
раствором до адекватной концентрации. 0.2 мл-доза была введена прямо в живот мышам.
Таким же способом контрольной группе был введен физиологический раствор. Проточная
цитометрия. Процедура проточной цитометрии была аналогична Mizuno et al.U), но слегка
модифицирована. Селезеночные клетки мышей C3H/ были помещены в окрашивающий
буфер в концентрации 1 x 106/мл (среда Dulbecco's modified Eagle's, 2% зародышевая
сыворотка крупного рогатого скота, 0.1% азид натрия) и были инкубированы с помощью
флюоресцеин изотиоцианат (FITC)-сопряженный анти-Thyl.2 (пан T-клетки, клон; 30-H12),
анти-Lyt2 (CD8; цитоксичные Т-клетки, клон; 53-6.7), или фикоэритрин (PE)-сопряженный
анти-L3T4 (CD4; хелперные T-клетки, клон; GK1.5) моноклональными антителами
(Моноклональный Центр Becton Dickinson, Калифорния) в течение 30 мин при 4°C для
выявления каждой субпопуляции T-клеток. Позднее клеточные суспензии были дважды
промыты и снова помещены в окрашивающий буфер. Клеточные суспензии,
отреагировавшие на антитела были проанализированы на поточном цитометре (EPICS
PROFILE-II). Количество положительных клеток было вычислено интегрированием 10,000
клеточно-логарифмических флуоресцентных гистограмм свыше канала, в котором не
наблюдалось заметной флуоресценции для негативного контролирования. Каждое значение
представляет собой среднее ±S.D. квинтупликатного анализа. Статистическая значимость
была определена с помощью теста Student's, при p<0.05 и p<0.01 в качестве критерия.
13 Анализ C-NMR. Спектр13 C-NMR измерялся с помощью спектрометра Brucker
AC250, работающего при 62.8 МГц за (в) импульс. 13C-химический сдвиги выражены в ppm
(промилях)от наружнего диоксана.
Результаты
Иммуномодулирующее воздействие одиннадцати видов грибов было протестировано
в тот момент, когда ГВР-фракция была введена в перитональный канал. Семь из этих видов
обладают иммуномодулирующим воздействием (данные не предоставлены). У 2 из этих 7
грибов, Agaricus blazei и Glifora frondosa, уже ранее наблюдалось противоопухолевое
воздействие на Саркому 18O.1-35' Для того, чтобы измерить влияние этих 2 грибов как
продуктов питания, ГВР-фракции были введены прямо в желудки мышей. Фракции обоих
грибов проявили иммуномодулирующее воздействие в сравнении с контрольной группой
(Таблица 1). ГВР-фракция Agaricus blazei обладает наиболее высоким воздействием, а также
процентным содержанием Thyl.2, L3T4 (CD4), и Lyt2 (CD8), которые составили 40.3, 25.0 и
14.3%, соответственно. FA-фракция Agaricus blazei проявила более высокое воздействие, чем
FB-фракция (Таблица 2). Например, процентное содержание L3T4 (CD4) и Lyt2 (CD8) при
приеме FA-фракции составило 30.6 и 17.3% , а в контрольной группе оно же составило 23.5 и
26.0% соответственно.
Таблица I. Количество клеток подмножественных селезеночных T-лимфоцитов после орального приема
ГВР-фракции, извлеченный из Agaricus blazei, Grifora frondosa, и Grifora frondosa Mutant.
Грибы
Процентное содержание положительных клеток (%, среднее ±S.D.)
Thy 1.2
L3T4
Lyt2
Agaricus blazei
Grifora frondosa Grifora frondosa mutant Контрольная группа
4O.3±7.8** 35.7±5.6 39.5±4.9** 29.4±7.8
25.0+2.9** 14.3 ±2.3**
21.9±4.9* 13.7±2.5
24.5±3.0* 14.3+2.2**
19.4±5.4 10.3±3.4
Значительные отличия от контрольной группы: *, p<0.05: ""*, p<0.01. Каждая ГВР-фракция
давалась орально каждые 3 дня в течение 4 недель в дозировке 100 мг/кг веса мыши. Каждая
группа состояла из 5 мышей.
Таблица II. Количество субпопуляций селезеночных T-лимфоцитов после орального приема фракций
FA и FB.
Фракции
Lyt2
Процентное содержание положительных клеток (%, среднее ±S.D.)
L3T4
Thy 1.2
FA-фракция FB-фракция Контрольная группа
47.5 ±4.9*
42.2±4.0
35.2±2.2
3O.6±2.5* 27.6 + 3.1 23.4±1.9
17.3±1.6*
14.8±1.8
12.8±1.8
Значительные отличия от контрольной группы: *, p<0.01.
Условия эксперимента были аналогичны описанным в Таблице 1
Далее, FA-фракция была разделена на более мелкие фракции с помощью анионообменной
хромотографии на колонне DEAE-Sepharose CL-6B. FA-фракция состоит из полисахаридов и
белков в концентрации 629.2 и 43.5 зг/мг соответственно (данные не приведены). Это
доказывает, что FA-фракция в основном протеоглюканная . Как показано на рис.1 FAфракция в основном произвела 3 фракции, FA-I, II и III, и выход каждой фракции составил
66.6, 19.8, и 3.4%, соответственно. При приеме FA-I количество Thyl.2, L3T4 (CD4), и Lyt2
(CD8) увеличилось до 25.6, 28.4, и 34.3% в сравнении с приемом необработанного
полисахарида из Agaricus blazei, соответственно. FA-I проявляла иммуномоделирующее
воздействие, обладала наименьшим содержанием белка (Таблица III) и была разделена на
еще более мелкие фракции с помощью гелевой фильтрации на Sepharose 6B. Одна фракция
была илюирована в полном объеме, а другая, состоявшая из протеоглюканов, показала
молекулярный вес 170,000 с использованием следующих стандартных пуллуланов (Showa
Denko K.K., Japan): P-400 (M.W.; 380,000), P-200 (186,000), P-100 (100,000), P-50 (48,000), P20 (23,700) и P-10 (12,200).
Данные "C-NMR для протеоглюкана в D2O обладают сигналами в 69%.%, 85.8, 80.2, 77.8,
74.9, 74.0, 71.6, 70.4, 69.2, и 61.4. Аномерический углеродный сигнал наблюдается при
«598.8, который соотносится с a-глюкопероносиловым остатком.13' Сигналы при «S74.0,
74.9, 80.2, 71.6, и 69.2 соотносятся с C-2, 3, 4, 5, и 6 a-l,6-глюкопероносиловым,
соответственно, (Таблица IV), а сигналы при <577.8 и 61.4 могут быть предписаны к C-3 и 6
a-l,4-глюкопероносиловыми остатками, соответственно.14'. Основываясь на сравнении
других соответствующих полисахаридов, моносахаридов, описанных в литературе, данный
иммуномоделирующий полисахарид считается Аl,4-глюкан-связаным -1,6- глюкану в
основной цепи.
Рис. 1. Профиль элюирования FA-фракции на колонне DEAE-Sepharose.
Содержание сахара в каждой фракции измерялось при 620 потоке методом anthron-H2SO4.
На каждой пластине изображен ряд фракций, собранных для иммуномоделирующего
исследования.
Вывод
Мы наблюдали увеличение количества подкожных T-клеток после орального приема
полисахаридов, извлеченных из Agaricus blazei (a-1,6- и a-l,4-glucan) у мышей. Процентное
содержание Thyl .2-, и Lyt2 (CD8)-положительных клеток среди селезеночных лимфоцитов
значительно увеличилось в сравнении с контрольной группой (Таблица III). Процентное
содержание положительных клеток Thyl .2-, L3T4 (CD4)-, и Lyt2 (CD8)-было выше, чем у
контрольной группы до 43.8, 37.2, и 50.0%, соответственно. Тем не менее, соединение a-1,6и a-l,4-глюкан не обладает митогенным воздействием, что было выявлено методом MTT с
использованием селезеночных клеток, а также не приводит к изменению количества
селезеночных клеток (данные не приведены). Из этого можно сделать вывод, что
полисахариды не влияют на пролиферацию клеток. Уровень L3T4/Lyt2 немного уменьшился,
а уровень Lyt2/Thyl.2 показал тенденцию к увеличению в группе, которая принимала
фракцию FA-I. Данные результаты также дают возможность предположить особенное
увеличение положительных клеток Lyt2 (CD8), которые считаются маркерами
цитотоксичных T-клеток. С помощью внутрибрюшинной инъекции полисахаридов,
извлеченных из Agaricus blazei, мы обнаружили, что они увеличивают количество асиало
GM1 –положительных клеток (данные не приведены), которые считаются маркерами
природных T-клеток-киллеров
Таблица IV. Химический сдвиг "C-NMR полисахаридов, извлеченных Agaricus blazei в
сравнении с аутентичными моносахаридами и полисахаридами
Химический сдвиг
(промиль
ppm)
C-l
C-2
C-3
C-4
C-5 C-6
Активный
полисахарид
98.8
74.0
74.9
80.2
71.6 69.2
α-глюкоза*
92.9
72.5
73.8
70.6
72.3 61.6
β-глюкоза*
96.7
75.1
76.7
70.6
76.8 61.7
Ламинарин†
102.9 72.8
86.2
68.3
76.2 60.8
FA-l-a-α↨
100.9 74.2
75.2
80.2
72.0 69.0
FIII-2b╒
106.5 76.6
80.1
73.2
78.6 72.2
*: Данные приведены у Bock and Pedersen 15)
†: Данные приведены у Muller et al.'16)
↨: Данные приведены у Mizuno et al. 14)
╒ Данные приведены у Kawagishi et al.3)
Таким образом, полисахарид обладает способностью менять модель подмножеств
селезеночных лимфоцитов, особенно цитотоксичных и природных клеток-киллеров.
Полисахариды, извлеченные из грибов, являлись предметом многих исследований, т.к.
демонстрировали противоопухолевое воздействие на имплантированные мышам опухоли.
Недавно Mizuno et a/.14) заявил, что полисахариды, извлеченные из Agaricus blazei, обладают
противоопухолевым воздействием и основным компонентом одного из этих полисахаридов
является a 1,6- и 1,4-a-глюкановое соединение, похожее на иммуномодулирующий
полисахарид, исследуемый нами (Таблица IV). Также было объявлено, что процентное
содержание Thyl.2-, L3T4-, и асиало GM1-положительных клеток было значительно выше у
мышей, носителей опухоли, которые принимали полисахариды, извлеченные из Agaricus
blazei (/M,6-глюкан), чем у тех, кто принимал солевой раствор.11' Мы продемонстрировали,
что прием этих полисахаридов (a-1,6- и a-l,4-глюкановое соединение) увеличивает
количество субпопуляции селезеночных лимфоцитов даже у здоровых мышей. Т.к.
количество цитотоксичных и природных Т-клеток-киллеров особенно увеличилось благодаря
этому полисахариду, существует вероятность того, что эти лимфоциты убивают раковые
клетки. Это дает возможность предположить, что полисахариды, извлеченные из Agaricus
blazei, могут стать действенным средством для профилактики рака, а также функциональной
пищей.
Благодарность
Авторы выражают благодарность Akira Shimizu и Jun-ichi Kawano за помощь в
измерении субпопуляций Т-клеток. for their kind guidance in the measurement of T-cell subsets.
Данное исследование было проведено при поддержке Института Iwade Mushroom, Япония.
Таблица Ш. Количество субпопуляций селезеночных T-лимфоцитов после орального приема трех
фракций, отделенных с помощью DEAE-Sepharose
FA-I
FA-II
FA-III
Контрольная
группа
CL-6B и содержание сахара и белка в каждой фракции
Процентное
содержание
положительных
клеток
(%,
среднее ±S.D.)
Содержание
(//г/мг)
Thyl.2
L3T4
Lyt2
Полисахариды
Белки
50.6 ±4.0*
51.8±9.1*
39.7±6.8
35.2±2.2
32.1 ±3.2*
33.0±5.6*
25.9 ±4.0
23.4±1.9
19.2±2.1*
19.8±3.6*
14.9±2.6
12.8±2.6
731.5
778.6
134.1
2.3
7.7
16.9
Значительные отличия от контрольной группы: * p<0.01.
Содержание полисахаридов и белков высчитывалось как глюкоза и альбумин сыворотки
крупного рогатого скота соответственно. Условия эксперимента были аналогичны
описанным в Таблице 1