Повышение цитостатического действия экстракта плодового тела гриба Agaricus

Повышение цитостатического действия
экстракта плодового тела гриба Agaricus
brazei у интактных мышей, имеющих
опухоль, при пероральном введении
Hiroaki Takimoto, Daiko Wakita, Kiichiro Kawaguchi, Yoshio Kumazawa
Факультет биологических наук, Научная школа Университета Kitasato; факультет
Фармацевтических Наук, Университет Kitasato; 1-15-1 Kitasato, Kanagawa 228-8555,
Япония. Полученный 4 ноября 2003; принятый 9 декабря 2003
Когда горячая вытяжка – экстракт из плодового тела гриба Agaricus blazei Murill
вводилась перорально мышам - носителям Meth A., рост опухоли был значительно
ингибирован по сравнению с контрольными группами, которым перорально вводилась
вода. Лечение с применением экстракта Агарика в течении 5 дней последовательно
значительно повысило природную сопротивляемость клеток селезенки у интактных
BALB/c мышей. У BALB/c мышей носителей Meth A экстракт Агарика усилил
индукцию антигенов специфичных цитотоксических Т-лимфоцитов и производство
интерферона γ, указывая на то, что вытяжка Агарика усиливает цитостатическую
деятельность врожденного и адаптивного иммунитета.
Гриб Agaricus brazei Murill, известный как "Cogumelo del Sol", произрастает в одной
из областей города Сан-Паоло, Бразилия, а также выращивается под названием
Kawarihiratake в Японии и Song Rong в Китае. Вытяжки из плодового тела Агарика
использовались для лечения больных раком для уменьшения роста опухоли. Антиопухолевая активность этих вытяжек была выявлена при использовании клеток аллогенной
Саркомы 180 во время внутрибрюшинных инъекций нерастворимого в воде осадка1) и βглюкана2) или перорального введения липидных фракций.3) В изогенных системах клеток
Meth A опухоли как внутриопухолевые инъекции препарата пептида-глюкана так и
пероральное введение β-1,6-D-глюкана привели к снижению роста опухоли.4,5) Однако, какие
механизмы действия вытяжек Агарика и их фракций приводят подобному снижению еще не
ясно. Недавно, мы установили экспериментальные условия когда пероральное введение
горячей вытяжки-экстракта Агарика BALB/c мышам носителям Meth A вызвало
существенное подавление роста опухоли. Чтобы разъяснять причину, почему вытяжки
Agaricus вызывают такое подавление, мы исследовали возможность, когда вытяжки
стимулируют различные типы клеток, вовлеченных во врожденный и адаптивный иммунитет
у интактных и имеющих опухоль мышей.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Мыши
Самки BALB/c мышей были куплены у Japan Clea Inc. (Токио), использовались в 6недельном возрасте и были помещены в определенные антипатогенные условия, в животном
питомнике Научной школы Университета Kitasato. Мышам ежедневно перорально вводился
экстракт Agaricus в дозе 300mg/d/мышь в объеме 0.5 ml/d/мышь по достижению 5 дня после
внутрикожной трансплантации клеток 4x104 Meth A.
Подготовка экстрагирования Agaricus
Доступный на рынке Kohjusen, состоящий только из горячей вытяжки Агарика, была
упакован в Asuke Pharmaceutical Co., Suwa, Нагано, и сушился сублимацией в нашей
лаборатории. Материал сублимационной сушки был перед использованием растворен в
дистиллированной воде. Содержание β-глюкана, было измерено при помощи
колориметрического анализа, при помощи G-test, Seikagaku Corp., Токио, Япония, и
составило 422 нанограмма/мл.
Измерение Размера и Веса Опухолей
Размер опухоли измерялся микрометром три раза в неделю до достижения 21 дня
после трансплантации, и был выражен как значение, короткой длины (мм) умноженной на
длинную (мм). Вес опухоли был измерен на 21 день.
Определение деятельности натуральных клеток-киллеров (NK)
Интактным мышам в течение пяти последовательных дней орально вводилась
вытяжка Agaricus. Деятельность NK клеток селезенки была определена пробой 51Cr-релиза.6)
Кратко, NK-чувствительные YAC-1 клетки в качестве целевых были маркированы с
помощью 3.7MBq Na251CrO4 (определенная деятельность; 7.4-18.5GBq/mg Cr, Amersham
Biosciense Corp., Piscataway, NJ, США) при температуре 37 °C в течение 1 часа и промыты
три раза. Маркированные целевые клетки (1x104) были смешаны с эффекторными клетками
селезенки в обозначенных пропорциях исполнительный элемент (E) и целевые клетки (T).
Супернатанты были собраны после четырехчасовой инкубации. Их радиоактивность была
определена Автоматизированным Гамма Счетчиком (Wizard, Perkin-Elmer).
Пробы клеток цитостатических Лимфоцитов T (CTL)
Клетки селезенки (1 x 106/мл) были удалены из мышей, которым в течение 9
последовательных дней орально вводился экстракт, после достижения размеров опухли 5 d
после прививки, смешанный с клетками Meth A обработанными Митомицином С (ММС) (1 x
105/мл) и выведенный для 5d, чтобы вызвать определенный антиген CTL. Активность
антигенных CTL клеток селезенки была определена, при помощи маркированных клеток 51Cr
Meth A (1 x 104) в качестве целевых, при различном отношении E:T как было упомянуто
выше.7)
Определение IFN-γ при помощи ELISA
Клетки селезенки (1 x 106/мл) были извлечены из мышей, которым в течение 9
последовательных дней орально вводился экстракт, после достижения размеров опухоли 5 d
после прививки, смешанный с клетками Meth A обработанными Митомицином С (lx105/ml) и
выведенные для 3 d, чтобы вызвать производство IFN-γ. Уровни IFN-γ в культивируемых
супернатантах были измерены при помощи ELISA как было описано выше.6)
Статистика
Статистическое значение различий между группами была оценена t-тестом. Значение
p, меньшее чем 0.05 после сравнения с контрольной группой, рассматривалось как
существенное.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Анти-опухолевая деятельность вытяжки Agaricus
Для того, что бы выявить антиопухолевое действие экстракта Agaricus, BALB/c
мышам носителям Meth А орально вводились или 300 мг экстракта (содержащего 211
нанограммов β-глюкана), или дистиллированная воду в объеме 0.5 мл один раз в день, после
достижения размеров опухоли 5 d после ее трансплантации, с начала и до конца
эксперимента. Экстракт Agaricus существенно повлиял на снижение размера опухоли (рис.
1A) и снижения ее веса (рис. 1B).
Усиление деятельности NK
Чтобы оценить, стимулирует ли экстракт Agaricus NK-клетки, интактным мышам в
течение 5 последовательных дней орально вводился испытательный образец. NK активность
клеток селезенки у мышей, которым подавался экстракт, значительно увеличилась, по
сравнению с мышами из контрольной группы (рис. 2).
Активация CTL
Чтобы показать, возрастает ли при лечении экстрактом Agaricus in vivo индукция CTL,
клетки селезенки от мышей носителей Meth A были выведены совместно с клетками Meth A
обработанными MMC для стимуляции специфичных антигенов CTL in vitro. Индукция более
высокой активности CTL была выявлена в клетках селезенки мышей, которым вводился
экстракт Agaricus, чем у мышей из контрольно группы (рис. 3).
Увеличение продукция IFN-γ
Известно, что величина индукции CTL зависит от цитокинов, произведенных
клетками Th1. Так как индукция CTL была положительно отрегулирована лечением
экстрактом Agaricus, она была проверена на предмет того, была ли IFN-γ продукция
положительно отрегулирована, когда клетки селезенки BALB/c мышей носителей Meth A,
которым вводился экстракт Agaricus стимулировались in vitro с MMC-обработанным Meth A
для 3 d. Лечение при помощи экстракта привела к существенному увеличению IFN-γ
продукции (рис. 4), указывая, что это увеличение происходит из-за положительного
регулирования реакции специфичных Т-клеток Meth A вызванных экстрактом Agaricus.
Рис. 1. Влияние орального введения вытяжки Agaricus на регресс опухоли
BALB/c мышами вводили p. o. экстракт Agaricus (черные точки) или вода (белые точки) каждый день для 5d
4
после прививки с 4x10 Meth A фибросаркомы в правую сторону (A), размер опухоли измерялся три раза в
неделю, начиная с пятого дня. (B), вес опухоли был измерен на 21 день. Данные представляют среднее
арифметическое значение ±S.E.M. (n = 10). *p <0.05 и ** p <0.01 (студенческим t-тестом Студента, только
опухоль против контрольной группы).
Коэффициент E/T
Рис. 2. Увеличение NK- активности после лечения экстрактом Agaricus.
BALB/c мышам вводился орально экстракт Agaricus один раз в день для 5d. Спленоциты мышей, которым
вводился экстракт (черные точки) или вода (белые точки) были смешаны с 51Cr-обозначенными клетками
YAC-1 (1x104). Выделение хрома в супернатант было измерено после 4 часов инкубации. Данные показывают
среднее значение ± S.E.M. (n=3) и звездочка показывает существенную разницу (*p <0.05). Данные
представляют два независимых эксперимента с подобными результатами.
Коэффициент E/T
Рис. 3. Расширение влияния предшественников CTL в процессе лечения экстрактом Agaricus.
6
BALB/c мышам были сделаны прививки с 1x10 Meth A фибросаркомы в правую сторону, и затем, один раз в
день, орально вводился экстракт Agaricus (черные точки) или вода (белые точки) от 5 d после прививки опухоли
и впоследствии. Спленоциты, полученные от мышей, которым вводлся экстаркт Agaricus или вода на 14 день
после прививки опухоли, и затем культивировались с Meth A обработанными Митомицином C для 5 d, и затем
51
4
культивировались совместно с Cr-обозначенной Meth A фибросаркомой (1x10 ). Выделение хрома в
супернатант было измерено после 4 часов инкубации. Данные представляют среднее арифметическое ±S.E.M.
(n=3) и звездочки указывают на существенное различие (*** p <0.001). Данные представляют два независимых
эксперимента с подобными результатами.
Рис. 4. Рост воспроизводства IFNAgaricus
Клетки селезенки, полученные от мышей, которым вводился экстракт Agaricus (черный) или вода (белый) на 15
6
день после 1x10 Meth A прививки, стимулировались in vitro MMC-обработанным Meth A для 3 d. Количества
IFN-y в культуре супернатанта были определены ELISA. Данные показывают среднее значение ±S.E.M. (n=3) и
звездочка показывает существенное различие (*p <0.05). Данные представляют два независимых эксперимента
с подобными результатами.
ОБСУЖДЕНИЕ
Натуральные продукты вынуждают нас исследовать их иммуномодуляционные
свойства, с тех пор как горячая выжимка Angelica acutiloba выказала существунную
антиопухолевую активность. Китайские лекарства и экстракты из растений, типа глюканов,
алкалоидов, сапонинов и флавонидов проявляют иммуномодуляционные свойства в виде
антиопухолевой активности, активации макрофагов, подвление лейкопении вызванной γизлучением, усиления сопротивляемости микробным инфекциям, и подавления выработки
TNFα вызванной липополисахаридами. В настоящем исследовании, мы продемонстрировали,
что доступный на рынке экстракт Agaricus, типа Kohjusen в Японии, проявляющий
существенную антиопухолевую активность, когда вводился перорально BALB/c мышам
носителям Meth A в дозе 300mg/d/мышь. Пероральное введение экстракта Agaricus этим
мышам вызвало активацию NK клеток, и побудило CTL наращивать врожденный и
адаптивный иммунитет, соответственно. Положительное регулирование NK-клеток и
деятельности CTL вызваны активацией зависимой от IL-12, еще не ясно, повышает ли
пероральное введние экстракта Agaricus производство IL-12 in vivo. Вообще, имеющие
опухоль мыши имеют тенденцию смещаться к Th2, а не к Th1 в равновесии Thl/Th2. Таким
образом механизмы, при которых оральный ввод экстракта Agaricus привел к значительной
индукции CTL, могли выражаться смещением Thl из-за активации зависимой от IL-12. В
наших предварительных экспериментах, пероральное введение экстракта Agaricus
уменьшило производство специфичного антигена IgE и проникновение ацидофильных
гранулоцитов в легкие, отмечая, что экстракт подавляет эти Th2-смещенные реакции. Кроме
того, способность производства IFN-γ клетками селезенки мышей – носителей Meth A,
которым давался экстракт Agaricus, значительно увеличилась (рис. 4). Таким образом,
возможно, что Agaricus побуждает специальную антиопухолевую активность через
активацию зависимую от IL-12, вследствие индукции реакции Th1. В заключение,
ежедневный прием экстракта Agaricus может быть полезным для лечения человеческих
раковых образований.
Подтверждение Эта работа была частично поддержана дотацией для Научного
Исследования от научной школы Университета Kitasato к Y.K.