ГОУ ДПО «Иркутский государственный институт
advertisement
ГОУ ДПО «Иркутский государственный институт усовершенствования врачей Министерства здравоохранения и социального развития» ГУЗ Иркутский областной клинический консультативно-диагностический центр Р.Г.Скворцова, Т.И. Трубникова Современные методы электрофореза белков в клинической лабораторной диагностике Пособие для врачей Иркутск, 2011 1 УДК ББК Утверждено Методическим советом ИГИУВа Р е ц е н з е н т ы: доктор медицинских наук, профессор, зав. кафедрой биохимии ГОУ ВПО ИГМУ Л.С.Колесниченко Скворцова Р.Г.,Трубникова Т.И. С 65 Современные методы электрофореза белков в клинической лабораторной диагностике: пособие для врачей. Иркутск: РИО ИГИУВа, 2011. 65 с. В пособии представлены сведения о методах электрофоретического разделения белков сыворотки крови и мочи. Особое внимание уделено наиболее современному, информативному и точному методу электрофореза – капиллярному. Раскрыт диапазон диагностической ценности этого метода, приведены референсные значения наиболее важных фракций белков. Рассмотрена роль метода во фракционировании белков относительно диагностики ряда заболеваний. Особое место в пособии уделено парапротеинемиям, как состояниям, оценить которые на этапе скрининга наиболее вероятно и с наименьшими экономическими затратами применяя метод капиллярного электрофореза. В Приложении к пособию представлены электрофореграммы белков сыворотки крови и мочи, с идентификацией диагноза заболевания. Отдельно представлены электрофореграммы иммунофиксации, способствующие наиболее точной постановке диагноза заболевания. Пособие предназначено для специалистов клинической лабораторной диагностики и врачей-клиницистов. УДК ББК ©Скворцова Р.Г. ,ТрубниковаТ.И. 2011 © ГОУ ДПО ИГИУВ, 2011 © ГУЗ ИОККДЦ, 2011 2 Оглавление ОГЛАВЛЕНИЕ ............................................................................................................... 3 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ .............................................................................................. 4 ВВЕДЕНИЕ .................................................................................................................... 5 КАПИЛЛЯРНЫЙ ЭЛЕКТРОФОРЕЗ ........................................................................... 13 Эффективность и разрешение метода ............................................................. 13 Референсные значения ...................................................................................... 18 Разнообразие электрофоретических фракций белков ................................... 19 Принцип метода иммунофиксации ................................................................. 22 Диапазон диагностической ценности капиллярного электрофореза ........... 26 ПАРАПРОТЕИНЕМИИ (ПП) ........................................................................................ 30 Парапротеинемические гемобластозы ............................................................ 32 Моноклональная гаммапатия ........................................................................... 33 Множественная миелома .................................................................................. 37 Белки мочи ......................................................................................................... 40 Нормальные значения белка в моче ................................................................ 42 Причины появления белка в моче: .................................................................. 42 Моноклональные антитела, как маркеры ....................................................... 42 ЗАКЛЮЧЕНИЕ ............................................................................................................. 45 ПРИЛОЖЕНИЕ ............................................................................................................ 46 ВОПРОСЫ ДЛЯ САМОКОНТРОЛЯ: ......................................................................... 65 ЛИТЕРАТУРА .............................................................................................................. 65 3 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ CZE (англ.) – зональный электрофорез; Ig – иммуноглобулины; АL-амилоидоз – амилоидоз легких цепей; ББД – белок Бенс-Джонса; БДМИ – болезнь депонирования моноклональных иммуноглобулинов; БЛЦ – болезнь легких цепей, болезнь Бенс-Джонса; ЖХВД – жидкостная хроматография высокого давления; ИФ (IFE англ.) – иммунофиксация; ИЭФ (EEP англ.) – иммуноэлектрофорез; КДЛ – клинико-диагностическая лаборатория; ММ – множественная миелома (миеломная болезнь); ОПН – острая почечная недостаточность. ПААГ – полиакриламидный гель; ПП – парапротеинемии; ХПН – хроническая почечная недостаточность; ЭБФ (SPE англ.) - электрофорез белков сыворотки; 4 ВВЕДЕНИЕ Основным видом анализов в клинико-диагностических лабораториях (КДЛ), является исследование белков. Белки состоят из аминокислот и являются важной составной частью всех клеток и тканей. В организме человека насчитывают более150 видов белков с различными функциями. На рисунке 1 представлен только спектр типов белков крови, но и он уже дает представление о грандиозности числа исследований, если их проводить без достаточно обоснованного профилирования. Ферменты Гормоны Двигательные белки Рецепторные белки Регуляторные белки Транспортные белки Токсины Защитные белки Белки крови Структурные белки Антибиотики Запасные белки Концентрация белков в плазме крови – 70-70,5г/л (г %) Рис. 1. Белки плазмы крови Современные методы анализа белков сыворотки крови своевременно выявляют патологические состояния почек, мочевыводящих путей, 5 нарушения обмена веществ, патологии печени и поджелудочной железы, онкологических заболевания и пр. Белки плазмы крови определяют в целях: - Диагностики; - Мониторинга лечения; - Прогноза заболевания. Для клиницистов важно четко ориентироваться в особенностях количественной оценки белков с использованием различных методов исследования. Это, в первую очередь, связано с тем, что наряду с возможностью с высокой специфичностью и чувствительностью, определять индивидуальные белки, имеются и скрининговые методы, применение которых зачастую бывает для клиницистов более ценным на этапе постановки диагноза. За последнее десятилетие в развитии методов анализа белков в сыворотке крови и моче произошли кардинальные изменения, которые существенно повысили скорость и чувствительность традиционных анализов, в основном, за счет их автоматизации. Существенно повысилась скорость и чувствительность традиционных анализов, в основном, за счет их автоматизации, а так же появились разработки, в основе которых лежат новые биомаркеры огромного спектра патологий. Одним из достаточно информативных лабораторных тестов, используемых в настоящее время, является электрофорез белков биологических жидкостей (сыворотка крови, моча, спинномозговая жидкость и др.), диагностическую который позволяет информацию. На получить рисунке значительную 2 представлен электрофоретический профиль белков сыворотки крови. Исследование белкового и липопротеинового спектров сыворотки крови и мочи особенно значимо для диагностики патологических состояний, сопровождающихся нарушениями обмена 6 белков и дислипопротеидемиями. При многих заболеваниях в сыворотке крови изменяется соотношение отдельных белков (диспротеинемия), хотя общее содержание белка может оставаться нормальным. В настоящее время известно сывороточных белков. количественно определить более Значительную часть современными иммунохемилюминесцентными и 150 индивидуальных из них можно иммуноферментными, иммунотурбидиметрическими методами. Но при всей информативности и доказательности таких анализов, для определения большого числа белков потребуется много времени и реактивов. Вместе с тем типовые сдвиги белкового состава сыворотки крови можно определить гораздо более доступным электрофоретическим методом, который к тому же позволяет «одним взглядом» оценить общую картину белкового спектра и получить значимую диагностическую информацию. Существует множество разновидностей и модификаций данного метода, которые используются (или использовались в определённые периоды развития биохимии) в различных областях: Электрофорез в свободных средах (без поддерживающей среды); Электрофорез с подвижной границей; Зональный электрофорез без поддерживающей среды; Капиллярный электрофорез; Зональный электрофорез в поддерживающей среде с капиллярной структурой; Электрофорез на фильтровальной бумаге; Электрофорез белков на ацетат-целлюлозной мембране; Электрофорез в колонках и блоках гранулированной поддерживающей среды; Электрофорез белков в ПААГ; Электрофорез белков в крахмальном геле; 7 Электрофорез белков в агарозном геле. Для идентификации, качественного и количественного анализа иммуноглобулинов, как правило, используют четыре лабораторных метода: электрофорез белков сыворотки (ЭБС, SPE), количественное определение с помощью иммунодиффузии и нефелометрии, иммуноэлектрофорез (ИЭФ, EEP) и иммунофиксацию (ИФ, IFE), электрофорез с иммунофиксацией (JFE). В идеале для демонстрации аномальной концентрации или состава иммуноглобулинов используют SPE. Рис.2 Электрофоретическая диагностический маркер подвижность белков, как Принцип электрофоретического разделения молекул состоит в их движении с различной скоростью в постоянном электрическом поле. 8 Наиболее часто в клинической практике используется электрофорез на поддерживающих средах-носителях – хроматографической бумаге, ацетатцеллюлозных мембранах, различных гелях, а также на комбинированных средах. Электрофорез на бумаге до недавнего времени широко применялся во многих лабораториях, однако он имеет много недостатков. Основной из них состоит в том, что результаты фракционирования белков этим методом могут быть получены лишь на 2-3 день исследования. Электрофорез в агарозном, крахмальном и особенно в полиакриламидном геле, дает существенно лучшие результаты, позволяя идентифицировать большее количество белковых фракций сыворотки (до 30). Но и этому методу присущи недостатки – сложность приготовления геля или дороговизна готовых гелевых пластин. Разработано большое количество модификаций электрофореза белков в полиакриламидном геле для решения разных задач. Наиболее распространён электрофорез белков в полиакриламидом геле, в присутствии додецилсульфата натрия по Лэммли. В разделяющем геле белки мигрируют в зависимости от длины полипептидной цепи, то есть обратно пропорционально молекулярной массе. Использование мембран из ацетата целлюлозы позволило достигнуть компромисса и использовать их главные особенности однородность материала, очень малую емкость слоя, требующую микроколичеств пробы (0,4–2,0 мкл), быстроту разделения и окраски белков (20-80 мин), легкость отмывания фона, а также относительно низкую стоимость пленок и их доступность. В целом применение ацетатцеллюлозных мембран позволило повысить четкость фракционирования и значительно сократить время, требуемое для разделения, окраски и анализа образца. 9 На рисунке 3 представлены для сравнения гелевые технологии электрофореза на приборе PARAGON-APPRAISE (BECKMAN – COULTER) на ацетатцеллюлозных мембранах и визуальный анализ на полиакриламидном геле. Принцип работы прибора основан на движении белковых молекул в электрическом поле. Электрофорез в агарозном геле Полиакриламидный гель, После денситометрии на приборе в котором проводится Paragon-Appraise фирмы разделение белков по BECKMAN молекулярной массе. Маркеры на левой дорожке/ Рис.3. Сравнение автоматизированного и ручного методов электрофореза белков Знак и величина электрического заряда молекул белков сыворотки крови, а следовательно, направление и скорость их движения при электрофоретическом разделении, зависят от значения рН и ионной силы среды. Кроме того, скорость движения белковых молекул определяется их молекулярной массой, ионным окружением 10 (составом и концентрацией буфера), приложенным напряжением и другими факторами. В связи с этим для получения сопоставимых данных электрофорез должен осуществляться при строго определенных значениях указанных параметров. В буферном растворе с рН=8,6 или 8,9 и ионной силой 0,08–0,15 моль/л, все белки сыворотки крови приобретают отрицательный заряд и движутся от катода к аноду, причем дальше всего уходят альбумины, имеющие меньшую молекулярную массу, затем располагаются a1-, a2-, b- и gглобулины. Иногда каждая из этих основных фракций может разделиться на несколько подфракций. Следует указать, что результаты электрофореза на твердых носителях сильно зависят от подготовки пробы и мастерства лабораторного персонала. Сыворотку крови для исследования лучше брать свежей, хранившейся не более нескольких часов. В пробе не должно быть следов гемолиза, в противном случае свободный гемоглобин и его комплекс с гаптоглобином могут образовать дополнительные полосы в области a2- и b-глобулинов. В присутствии ионов кальция и под влиянием некоторых лекарственных веществ возможно расслоение b-фракции на две подфракции, что объясняется нарушением подвижности С3-компонента комплемента. Наконец, в целом качество «картинки» зависит от навыков нанесения пробы (это тоже определенное искусство, формирующееся практикой) и используемых инструментов-аппликаторов. Для электрофореза белков используются различные аппараты, как ручные, так и полуавтоматические. Современные комплексы оснащены микропроцессорными блоками питания и управляются компьютером; в большинстве систем на последней стадии исследования окрашенных мембран или гелевых пластинок (определения относительного количества белков в каждой фракции) 11 используется электронный цветной сканер или миниатюрная фотокамера, что существенно повышает точность и воспроизводимость результатов. Программное обеспечение дает возможность усредненного расчета оптической плотности отдельных фракций путем автоматического определения границ «дорожек» и многократного сканирования каждой из них в нескольких «разрезах», что позволяет исключить ошибки из-за локальных микродефектов и неровного положения носителя, а также до определенной степени нивелировать искривление дорожки и влияние окрашенного фона при неполной отмывке. На экран дисплея и на принтер выводится графикденситограмма с рассчитанным содержанием отдельных белковых фракций. При необходимости маркеры границ фракций на графике можно скорректировать, при этом будет произведен автоматический пересчет их показателей. В компьютере, как правило, создается архив электрофореграмм; их можно в любое время извлечь и просмотреть. При интерпретации результатов клиницисты не должны придавать диагностическое значение, например, снижению содержания альбумина у пациента на 2-3% от справочных данных. Само понятие нормы в лабораторной практике весьма условно; нормальные значения параметров зависят от местных факторов и должны формироваться в первую очередь «на местной базе», т.е. в конкретной лаборатории при обследовании здорового контингента. Вместе с тем для общего контроля качества разделения белков выпускаются специальные контрольные сыворотки, которые желательно иметь в каждой лаборатории, работающей этим методом. Система клинического микропроцессорный экономичная разделения, электрофореза денситометр система, высокую APPRAISE обеспечивающая PARAGON и — и простая великолепное чувствительность и качество прекрасную 12 воспроизводимость, благодаря чему PARAGON-APPRAISE считается эталоном среди аналогичного оборудования, однако у этого метода есть масса недостатков, которые полностью устраняются при использовании ниже описанного метода. Капиллярный электрофорез В последнее время появился уникальный современный метод разделения белков сыворотки крови и мочи - метод капиллярного электрофореза. Метод не требует окраски пленок, менее трудоемкий, позволяющий проводить разделение белков в течение 15-30 минут. Капиллярный электрофорез, известный также как капиллярный зональный электрофорез (CZE), используется для разделения ионов по заряду. В случае обычного электрофореза заряженные молекулы перемещаются в проводящей жидкости под действием электрического поля. В 1960х годах была предложена методика капиллярного электрофореза для разделения молекул по заряду и размеру в тонком капилляре, заполненном электролитом. На рисунке 4 представлена схема внутренней организации капилляра. Эффективность и разрешение метода Эффективность разделения в случае капиллярного электрофореза определяется уравнением: 13 Рис.4. Схема внутренней организации капилляра, заполненного силикагелем в присутствии буферного раствора где N это количество теоретических тарелок, μ это кажущаяся подвижность в среде разделения и Dm это коэффициент диффузии разделяемого вещества. В соответствии с этим уравнением эффективность разделения ограничивается только диффузией и является величиной, пропорциональной силе электрического поля. Эффективность разделения путем капиллярного электрофореза, как правило, значительно выше, чем эффективность других методов разделения, например, жидкостная хроматоргафия высокого давления (ЖХВД). В отличие от ЖХВД, в случае капиллярного электрофореза не происходит перенос масс между фазами. Профиль потока в случае систем электроосмотического потока является плоским, в отличие от ламинарного профиля хроматографических колонок, в которых разделение происходит под давлением. В результате этого при электроосмотическом разделении не происходит расширения полос, как при хроматографии. На рисунке 5 представлена общая схема проведения капиллярного электрофореза. 14 В настоящее время на рынке России представлены как импортные, так и отечественные образцы анализаторов по типу капиллярного электрофореза. Но стоит отметить, что отечественный анализатор «Капель» достаточно редко встречается как аналитический прибор в отчетах медицинского плана (статьи, монографии). Спектр анализаторов капиллярного электрофореза, работающих в России на сегодняшний день пока не очень велик, но и их появление – это уже определенный прорыв в лабораторной диагностике (см. рисунок 6). Рис.5. Система проведения капиллярного электрофореза 15 Система капиллярного электрофореза CAPILLARYS 2 (SEBIA)» Инновационная технология разделения и анализа белковых фракций сыворотки крови, мочи Производитель: SEBIA ELECTROPHORESIS (Франция) Система капиллярного электрофореза V8 – восьмиканальная автоматизированная система капиллярного электрофореза для разделения и анализа белков, цельной крови, сыворотки и мочи. Производитель: HELENA BIOSCIENCES (Великобритания) ИДЦ Система клинического капиллярного электрофореза PARAGON CZE® 2000 для разделения и анализа белковых фракций сыворотки крови, мочи и спиномозговой жидкости Производитель: "Beckman-Coulter", (США) Рис.6. Доступные электрофореза Система капиллярного разновидности систем электрофореза капиллярного PARAGON CZE 2000 разработана специально для клинических лабораторий с большим объемом исследований и позволяет полностью автоматизировать проведение электрофореза белков сыворотки крови и идентификацию моноклональных фракций иммуноглобулинов (методом иммунофиксации по вычитанию). Именно такой анализатор используется для фракционирования и иммунофиксации белков в Иркутском областном диагностическом центре. Капиллярный электрофорез имеет целый ряд - Высокая разрешающая способность; -Высокая производительность; -Автоматическая пробоподготовка; 16 достоинств: -Возможность работы с первичными пробирками; -Компьютерная обработка результатов; -Удобная форма представления результатов; -Набор реактивов для разделения белков сыворотки крови; -Набор реактивов для иммунофиксации; -Одновременно анализируется семь образцов сыворотки крови; -Загрузка образцов (в том числе в первичных пробирках) осуществляется с помощью 7-позиционных секторов; -Автоматическое разведение проб; -Для анализа используется всего несколько нанолитров образца; -Результаты анализа автоматически распечатываются после завершения очередного цикла работы; -Работа системы полностью контролируется компьютером; -Одновременно на борт прибора можно загрузить 70 образцов, которые будут разделяться на фракции со скоростью 42 анализа в час (SPE), и 10 образцов для иммунофиксации (IFE). Иммунофиксация проводится со скоростью 5 анализов в час. Использование такого прибора особенно эффективно при централизованных исследованиях. Экономия средств на контрольных пробах, высокое качество, скорость – это те основные компоненты, которые должны быть оценены клиницистами и руководителями ЛПУ. Для примера, можно сказать, что с такой скоростью проведения исследований даже один прибор полностью бы мог закрыть потребности всех ЛПУ Иркутской области. Система клинического капиллярного электрофореза PARAGON CZE-2000 — новое поколение оборудования, предназначенного для проведения клинического электрофореза белков крови. PARAGON CZE 2000 создан на основе новейшей технологии высокоэффективного разделения макромолекул в полом капилляре под воздействием высокого напряжения. Регистрация результатов 17 разделения осуществляется через прозрачную область капилляра, расположенную непосредственно перед катодом. Современное программное обеспечение позволяет вносить в отчет данные о пациенте, просматривать и редактировать результаты, а также выполнять некоторые специальные функции, в том числе передавать данные в больничную компьютерную сеть. Система капиллярного электрофореза PARAGON CZE 2000 не требует калибровки. Контроль качества исследований с помощью контрольной сыворотки (нормальных и патологических значений) необходимо проводить ежедневно. Референсные значения В таблице 1 представлены средние референсные значения для взрослого населения компанией разработчиком Системы капиллярного электрофореза "Beckman-Coulter", (США), в сравнение с электрофорезом в агарозном геле и с данными Независимой лаборатории «Инвитро» и ИДЦ. Разные данные, в ряде случаев, говорят о том, что результаты исследований методзависимы и для каждой КДЛ должны быть свои референсные значения. Таблица 1 Референсные значения белковых фракций крови для разных лабораторий и методов исследования Белковые фракции, г/л КДЛ Агароза Альбумин Альфа-1 Альфа-2 Бета Гамма 53,8-66,5 2,1-4,8 9,0-14,7 8,4-13,4 10,6-19,5 PARAGON CZE 2000 54,7-68,7 3,7-7,8 5,2-10,7 8,6-13,7 10,7-19,3 18 «Инвитро» 40,2 - 47,6 2,1 - 3,5 5,1 - 8,5 6,0 - 9,4 8,0 - 13,5 ИДЦ 32,8-59,8 2,4-8,8 3,4-13,1 5,2-11,9 6,9-17,0 Разнообразие электрофоретических фракций белков Обычно методом электрофореза выделяют 5 - 6 стандартных фракций. В таблицу 2 сведены все данные о белковых фракциях, повышении и понижении уровня компонентов фракций при различных заболеваниях. Из числа указанных патологических состояний наиболее эффективно и экономически выгодно проводить диагностику парапротеинемических состояний.Связано это с тем, что капиллярный электрофорез не только дает сразу полную характеристику белкового спектра, но и проводит процедуру иммунофиксации. Электрофореграммы, характерные для большинства патологических состояний, полученные при использовании метода капиллярного электрофореза будут приведены в Приложении. Таблица 3 Диагностические характеристики белковых фракций 19 Белковые фракции Повышение/понижение уровня при заболеваниях Повышается при: дегидротации и шоковых состояниях Фракция альбумина Фракция альфа1глобулина Состав фракции острофазные белки: альфа1-антитрипсин (основной компонент этой фракции) ингибитор многих протеолитических ферментов трипсина, химотрипсина, плазмина и т. д., а также альфа1-кислый гликопротеин (орозомукоид). Он обладает широким спектром функций, в зоне воспаления способствует фибриллогенезу. К глобулинам относятся транспортные белки: тироксинсвязывающий глобулин, транкортин (функции связывание и транспорт кортизола и тироксина соответственно), альфа1-липопротеин Понижается при: нарушении питания; синдроме мальабсорбции; болезни печени и почек; опухоли; коллагенозах; ожогах; гипергидратации; кровотечении; анальбуминемии; беременности; Повышается при: патологии паренхимы печени; острых и хронических воспалительных процессах (инфекции и ревматические заболевания); опухоли; травме и хирургическом вмешательстве; беременности (3 триместр); приёме андрогенов. Понижается при: наследственном дефиците альфа1-антитрипсина; болезни Тангера. 20 (функция - участие в транспорте липидов). Фракция альфа2глобулина Состав фракции острофазные белки альфа2макроглобулин, гаптоглобин, церулоплазмин. Альфа2-макроглобулин повышается при: нефротическом синдроме гепатите, циррозе печени, приёме эстрогенов и оральных контрацептивов, хроническом воспалительном процессе, беременности. Гаптоглобин повышается при: воспалении, злокачественной опухоли, некрозе тканей. Альфа2-макроглобулин понижается при: панкреатите, ожогах, травмах. Гаптоглобин понижается при: гемолизе различной этиологии, панкреатите, саркоидозе. Фракция бетаТрансферрин повышается при: приёме эстрогенов, железодефицитной анемии. глобулина Состав фракции Другие компоненты фракции повышаются трансферрин (белокпри: беременности; механической желтухе; переносчик железа), миеломе (IgA-тип). гемопексин (связывает гем, что предотвращает его выведение почками и потерю железа), компоненты Компоненты фракции понижаются при комплемента дефиците IgA. (участвующие в реакциях иммунитета) и часть иммуноглобулинов. Фракция гаммаглобулина Состав фракции иммуноглобулины, (в порядке Повышается при:хронических инфекциях, саркоидозе, паразитарных инвазиях; аутоиммунных заболеваниях (ревматоидный артрит, системная красная волчанка); лимфопролиферативных 21 количественного убывания - IgG, IgA, IgM, IgE). заболеваниях (миелома, лимфома, макроглобулинемия Вальденстрема). . Понижается при: иммунодефицитных состояниях; приёме глюкокортикоидов; плазмаферезе; беременности. Принцип метода иммунофиксации Впервые сообщение о методе иммунофиксационного электрофореза (IFE) было опубликовано Альпером и Джонсоном в 1969 году. Сам метод введен в практику клинических лабораторий Ричи и Смитом в 1976 году. Метод IFE основан на электрофоретическом разделении белков, следующим за добавлением специфической антисыворотки. Комплексы антигенантитело, формирующиеся в результате узнавания иммунореактивных белков остаются в агарозном матриксе (иммунофиксация), а непрореагировавшие белки удаляются буферным раствором, в котором и происходит второй этап электрофореза. Метод вычитания в капиллярном электрофорезе используется для идентификации моноклональных компонентов сыворотки крови человека в целях диагностики моноклональных гаммапатий. IFE - это двухступенчатый процесс, использующий электрофорез протеинов на первом этапе и иммунопреципитацию на втором. В качестве адаптации этой методики для капиллярного электрофореза предложен метод, иммунофиксируются в котором моноклональные компоненты на гранулах сефорозы. проведения Для иммунофиксации, если она была показана в ходе первичного 22 электрофореза сыворотки пациента, на борт анализатора фракций белков “ PARAGON CZE 2000” фирмы “ Beckman Coulter ” устанавливается блок, состоящий из 7-и секций, 6 из которых участвуют в анализе IFE. В 5-и лунках этого сектора содержатся гранулы сефарозы с фиксированными на них моноклональными антителами. Три из этих твердых носителей специфичны к тяжелым цепям (IgG, IgA и IgM), два — к легким цепям (каппа и лямбда). Одна лунка содержит сыворотку без моноклональных антител SPE вариант. Одна лунка пустая (все сектора для SPE анализа рассчитаны на 7 лунок, и сектор для IFE имеет аналогичную конфигурацию)(см. рисунок 7). Рис.7. Сегменты для IFE в системе клинического капиллярного электрофореза Paragon CZE 2000 1- Пустая ячейка 2- Референсный образец SPE 3- Ячейка с антителами против IgG 4- Ячейка с антителами против IgA 5- Ячейка с антителами против IgM 6- Ячейка с антителами против легких цепей каппа 23 7- Ячейка с антителами против легких цепей лямбда Автоматически сыворотка соответствующей крови экспозиции. вводится После чего в эти не лунки для связавшиеся с моноклональными антителами белковые фракции засасываются в капилляры, и проводится электрофорез в 6-и из них (см. рисунок 8). Белки других фракций, оставшиеся в буфере для электрофореза Белки фракции IgG, связавшиеся с моноклональными антителами Моноклональные IgG Гранулы сефарозы на пластике сегмента Рис.8. Схема иммунофиксации метом иммуновычитания Результирующие количественные изменения, наблюдаемые на электрофореграмме (исчезновение определенного пика), позволяют установить моноклональный компонент, связанный антителами. Для качественной визуальной интерпретации электрофореграмм, полученных при иммунофиксации методом вычитания, не требуется никаких вычислений. Моноклональные компоненты могут быть определены визуально при сравнении электрофореграмм, полученных после экспозиции с моноклональными антителами и референсной электрофореграммы (SPE). Пример метода иммуновычитания приведен на рисунке 9. 24 IFE методом вычитания является качественным, методом, поэтому референсные диапазоны отсутствуют. Рис. 9. Пример электрофореграммы IFE 1- поликлональное вычитание 2- Моноклональное вычитание 25 визуальным Диапазон диагностической ценности капиллярного электрофореза Использование электрофоретического разделения белков на фракции позволяет не только оценить степень тяжести заболевания, но и что более важно – прогнозировать его исход. Электрофорез белков, позволяющий определить их количественные сдвиги и физико-химические характеристики, помогает выявить заболевания печени и почек, иммунной системы, некоторые злокачественные новообразования генетические (лейкозы), поломки электрофоретических электрофореграмм, и острые др. хронические Известен "синдромов" характерных и для – ряд инфекции, своеобразных типичных некоторых картин патологических состояний. Среди них можно отметить: 1. Острое воспаление с активацией системы комплемента и увеличением синтеза острофазных белков (a1-антитрипсина, гаптоглобина, фибриногена и др.). Оно проявляется увеличением доли a1- и a2-глобулинов и может быть подтверждено измерением СОЭ, исследованием концентрации С-реактивного белка, фибриногена (в динамике) и других острофазных белков ( рис.11,15,16,17,19). 2. Хроническое воспаление с усилением синтеза ряда острофазных белков, а также иммуноглобулинов; проявляется умеренным возрастанием a2- и b-глобулинов, повышением g-глобулинов и некоторым снижением альбумина. Подобные отклонения могут наблюдаться при хронических инфекциях, коллагенозах, аллергии, аутоиммунных процессах и при малигнизации (см. рис. 12, 13). 26 3. Тяжелые заболевания печени сопровождаются снижением синтеза альбумина и a-глобулинов, что и отражается на электрофореграммах. Как указывалось выше, нужно помнить, что процентная концентрация альбумина может оказаться сниженной лишь относительно, из-за накопления других белков, поэтому оценивать нарушения белково-синтезирующей функции печени следует по абсолютному содержанию альбумина (в г/л). При хронических гепатитах и циррозах печени возрастает как относительное, так и абсолютное количество g-глобулинов (b- и gфракции могут сливаться из-за накопления IgA), причем превышение g-глобулинов над альбуминами является весьма неблагоприятным прогностическим признаком (См. рис. 12,16). Следует, однако, помнить, что печень обладает значительными резервами синтезирующей способности, поэтому выявление данных нарушений будет свидетельствовать о глубоких гепатоцеллюлярных нарушениях. Также, на практике было отмечено, что, например, чувствительность наиболее часто используемых для выявления патологии печени биохимических показателей (АЛТ, ЩФ, ГГТ) при хронических формах (и особенно при циррозе) составляет не более 60 -70 %. 4. Нефротический синдром сопровождается увеличением фильтрации белков в почках и селективной протеинурией – потерей с мочой большого количества альбумина и части низкомолекулярных глобулинов (a1-антитрипсина, трансферрина). При этом в печени усиливается синтез более крупных протеинов семейства a2глобулинов (макроглобулин, апо-В), которые накапливаются в крови и 27 формируют картину со значительным снижением альбумина и повышением a2-глобулинов (См. рис.13,14). 5. Нарушение всасывания или значительная потеря белков возможна как при нефротическом синдроме, так и при массивных ожогах, синдроме Лаэлла, патологии желудочно-кишечного тракта и т.д. В последнем случае снижается абсолютное содержание общего белка и особенно альбумина, а на протеинограмме оказывается уменьшенной доля альбумина при относительно равномерном возрастании всех глобулинов. Введение белковых препаратов (иммуноглобулины, альбумин или плазма крови) в ходе лечения больных немедленно отражается на электрофоретической картине, что позволяет следить за динамикой потерь или выведения поступивших белков (См. рис. 13,14,15,16). 6. Тяжелый иммунодефицит врожденного или приобретенного генеза обычно сопровождается выраженным снижением gглобулиновой фракции. При этом желательно провести дополнительное количественное определение IgG, IgA и IgM (См. рис.14). 7. Парапротеинемия при злокачественных и доброкачественных процессах – симптом, для выявления которого именно электрофорез является методом выбора. При накоплении в крови моноклональных иммуноглобулинов или фрагментов их цепей, как бывает, в частности, при миеломной болезни и некоторых лейкозах, на протеинограмме появляется более или менее острый пик в области бета - и гамма- зон от a2- до g-глобулинов (так называемый М-градиент), хорошо заметный визуально. Электрофорез белков мочи, проведенный параллельно, в этом случае выявит пик, находящийся в той же 28 области. Для дифференцировки парапротеинов и идентификации белковых цепей можно использовать современнейшую модификацию электрофореза – иммунофиксацию, для которой выпускаются специальные наборы антител (См. рис.21-28). Электрофорез белков сыворотки крови может применяться в самых различных клинических случаях, таких как: При подозрении на множественную миелому, макроглобулинемию и амилоидоз. В любом случае необъяснимой слабости или усталости, анемии, повышении СОЭ, болях в спине, остеопорозе или остеолитическом поражении, дефиците иммуноглобулина, гипокальциемии, протеинурии Бенс Джонса, почечной недостаточности или рецидивирующих инфекциях. При периферической невропатии, кистевом туннельном синдроме, застойной сердечной недостаточности, нефротическом синдроме, синдроме мальабсорбции. 29 Парапротеинемии (ПП) В настоящем пособии логично больше внимания уделить именно этой патологии, так как при осуществлении дистанционного забора крови именно диагностика ПП наиболее востребована клиницистами не только как скрининговое исследование, но и как дифференциальная диагностика по иммунофиксации. Электрофорез с иммунофиксацией (IFE) - это двухступенчатый процесс, использующий электрофорез протеинов на первом этапе и иммунопреципитацию на втором. Электрофорез с иммунофиксацией один из современнейших методов в клинической лаборатории для получения характеристик моноклональных иммуноглобулинов. Термин парапротеин в 1940году впервые ввел Апитц, он описывает патологические белки, которые вырабатываются клетками миеломы и определяются в крови, моче и тканях. Парапротеины являются самыми ранними онко -маркерами и остаются неотъемлемой частью диагностики и мониторинга заболеваний. Парапротеины - это иммуноглобулины, легкие или тяжелые цепи иммуноглобулинов, продуцируемые одним клоном В-лимфоцитов. Диагноз ПП ставят, если при электрофорезе, иммуноэлектрофорезе или иммунофиксационном электрофорезе сыворотки или мочи выявляются моноклональные антитела. Моноклональная гаммопатия характеризуется неконтролируемой пролиферацией одного клона плазменных клеток за счет других клеток. Эта дисфункция часто приводит к синтезу большого количества одного иммуноглобулина или его субъединицы со снижением нормальных уровней иммуноглобулинов. При этом на электрофореграмме выявляется один резко увеличенный пик в бета-гамма-области. 30 Электрофорез сыворотки всегда должен сопровождаться измерением концентрации сывороточных IgG, IgA и IgM. Образцы с повышенным содержаним IgA и IgM , которые не могут быть определены, как поликлональные в электрофорез - шаблоне, должны быть проанализированы дополнительно, чтобы исключить иммунофиксацию небольшими группами парапротеинов и закрытие ими нормальной зоны. Частота отдельных форм парапротеинемии соответствует относительному содержанию этих Ig в норме. Так, парапротеинемия, проявляющаяся высоким содержанием IgG, встречается в 60% случаев, IgM - в 20%, IgA - в 10%, IgD - менее чем в 1%, IgE - крайне редко, легких цепей - в 7% при соотношении каппа/лямбда - 2:1. В 30% случаев парапротеинемия обусловлена гемобластозами. Парапротеинемии различаются по типу тяжелых и легких цепей. Обнаружение парапротеиновых групп всегда соответствует определенному типу. Важно определить тяжелые и легкие компоненты цепи, поскольку это является подтверждением моноклональности. Определение типа парапротеина может дать врачу дополнительную информацию об основной опухоли и прогнозе. Электрофоретические показатели в образцах пациента могут меняться в ходе заболевания или лечения, поэтому полученные первичные результаты могут служить в качестве точки отсчета. Полное исчезновение парапротеина - это редкость, но возможно на фоне лечения: химиотерапия, трансплантации стволовых клеток. Олигоклональные группы иногда наблюдаются у пациентов после трансплантации костного мозга, и важно отличать их от истинной парапротеинемии. 31 Существует ряд ситуаций, когда полученные данные нельзя интерпретировать, как выявление моноклональных иммуноглобулинов, например: •дополнительные полосы в альфа-1 регионе в связи с изменением allotypic α 1-антитрипсина; •раскол альфа-2 зоне в связи с нарушением подвижности гаптоглобин -гемоглобинового комплекса после внутрисосудистого гемолиза; •дополнительные полосы в бета-гамма-зоне в связи с высокими концентрациями С-реактивного белка; • дополнительные полосы в гамма-зоне обусловленные наличием фибриногена. Стоит также отметить, что некоторые парапротеины выпадают в осадок при температуре ниже 37 ° С - так называемые криоглобулины. Парапротеинемические гемобластозы - особая группа опухолей лимфатической системы, при которых опухолевые клетки (лимфоциты или плазматические клетки) синтезируют иммуноглобулин. Поскольку эти лейкозы, как и другие, возникают из одной первоначально измененной клетки, вся масса опухолевых клеток производит какой-то один иммуноглобулин, который, даже оставаясь нормальным, оказывается для организма в целом бесполезным или вредным из-за своей крайней избыточности. Как правило, синтез остальных иммуноглобулинов снижен; постепенно нарастает иммунологическая несостоятельность организма. Парапротеинемические гемобластозы встречаются во всех странах мира. Их частота увеличивается с возрастом, максимум заболеваемости отмечается в 50—60 лет. Группу острых лейкозов объединяет общий признак: субстрат опухоли составляют молодые, так называемые бластные клетки. Название 32 форм острого лейкоза происходит от названий нормальных предшественников опухолевых клеток: миелобласты, эритробласты, лимфобласты и др. Острый лейкоз из морфологически неидентифицируемых бластных клеток получил название недифференцируемого. В группу хронических лейкозов входят дифференцирующиеся опухоли системы крови. Основной субстрат этих лейкозов составляют морфологически зрелые клетки – «циты». Будучи зрелоклеточными опухолями, хронические лейкозы обозначаются по названиям зрелых и созревающих клеток, которые составляют субстрат опухоли. Все хронические лейкозы отличает одна особенность: они длительно (за редким исключением) остаются на стадии моноклоновой доброкачественной опухоли. К парапротеинемическим гемобластозам относятся миеломная болезнь, макроглобулинемия Вальденстрема, болезнь тяжелых цепей. Эти лейкозы своим клеточным субстратом имеют преимущественно зрелые элементы - плазмоциты, лимфоциты, поэтому должны относиться к группе хронических лейкозов. Кроме того, способностью к синтезу однотипного, моноклонового (т. е. производимого клетками, происходящими из одной первоначально измененной клетки) иммуноглобулина обладают следующие опухоли кроветворной системы: острый плазмобластный лейкоз, редкие формы лимфосарком и редкие формы зрелоклеточных лимфатических внекостномозговых опухолей - лимфоцитом. Моноклональная гаммапатия Моноклональная гаммапатия — это сборное наименование целого класса заболеваний, при котором происходит патологическая секреция аномальных, измененных по химическому строению, молекулярной массе или иммунологическим свойствам иммуноглобулинов (гамма-глобулинов) одним клоном плазматических 33 клеток или B-лимфоцитов. Эти иммуноглобулины затем нарушают функции тех или иных органов и систем, например, почек, что и приводит к развитию симптомов заболевания. Моноклональные гаммапатии могут быть доброкачественными, когда клональная популяция клеток, секретирующих аномальные иммуноглобулины, не проявляет тенденций к неконтролируемому росту и размножению или к неконтролируемому увеличению продукции аномального белка. А могут быть и злокачественными, когда клональная популяция, производящая аномальный белок, склонна к постоянному неконтролируемому росту и размножению и как следствие к увеличению секреции этого белка. К злокачественным моноклональным гаммапатиям относятся, например, такие заболевания, как макроглобулинемия Вальденстрема, болезнь легких цепей и др. Злокачественные моноклональные гаммапатии в целом, как класс, менее чувствительны к химиотерапии, чем большинство других гемобластозов, но обычно имеют более медленное, менее злокачественное течение. Доброкачественные моноклональные гаммапатии часто развиваются как последствия чрезмерной хронической антигенной стимуляции, приводящей к усиленному размножению определенных клонов плазматических клеток. Макроглобулинемия Вальденстрема встречается изолированно и в сочетании со злокачественными лимфомами, неопластическими процессами, некоторыми инфекционными и воспалительными заболеваниями, а также как стабильная серологическая аномалия при отсутствии признаков злокачественного или другого заболевания (так называемая доброкачественная моноклональная гаммапатия). Макроглобулинемия диагностируется на основании характерных аномалий сывороточных протеинов и типичных изменений крови и костного мозга. Диагноз основывается на данных стернальной пункции или трепанобиопсии, электрофореза белков сыворотки и мочи, 34 иммунохимическом определении моноклонального lgM в крови. Если не увеличены лимфатические узлы, печень, селезенка или нет характерной картины костного мозга и концентрация макроглобулина в крови с годами не увеличивается, можно думать о доброкачественной моноклональной гаммапатии. Поскольку симптоматическая макроглобулинемия иногда встречается при различных опухолях и воспалительных заболеваниях, необходимы тщательные диагностические поиски с целью их исключения. В гемограмме у части больных увеличивается процент лимфоцитов. В 50% случаев выявляется тромбоцитопения. Может наблюдаться гиперурикемия. Лимфоцитоз в пунктатах костного мозга отмечается у 90% больных. Основной клеточный субстрат болезни представлен малыми лимфоцитами, имеющими узкую зону цитоплазмы, чаще базофильной. Гистологическая картина костного мозга и лимфатических узлов характеризуется диффузной или узловатой пролиферацией лимфоидных клеток и наличием белковых, PASположительных флоккулятов в цитоплазме клеток, межклеточных пространствах, пропитыванием белковыми массами стромы и стенок сосудов. Одним из первых лабораторных признаков белковых нарушений является увеличение скорости оседания эритроцитов и образование «монетных столбиков». Наиболее частыми клиническими проявлениями являются синдром повышенной вязкости и кровоточивость. Кроме того, так же, как при множественной миеломе, наблюдаются вторичный иммунодефицит, поражение почек, амилоидоз, периферическая нейропатия. Почечная недостаточность развивается несколько реже. В развернутой стадии у 50% больных отмечаются потеря массы тела, увеличение лимфатических узлов и (или) печени и селезенки. Анемия развивается поздно, содержание лейкоцитов может быть нормальным, 35 лейкоцитарная формула не изменена, нередко встречаются умеренный лейкоцитоз с лимфоцитозом, возможна небольшая нейтропения. Обычно СОЭ резко увеличена. Терминальное обострение часто выражается саркомной трансформацией отдельных групп лимфатических узлов, развитием глубокой анемии и (или) тромбоцитопении, лихорадкой, истощением, возникает резистентность к ранее эффективному течению. Существует генетическая предрасположенность к макроглобулинемии Вальденстрема, которая подтверждается случаями семейной макроглобулинемии, иммуноглобулиновых аномалий у некоторых родственников больных макроглобулинемией (возможно определение с помощью ПЦР-диагностики). Обсуждается роль воспалительных процессов и неоплазм в развитии макроглобулинемии. Задолго до появления выраженных клинических симптомов больные отмечают недомогание, слабость, похудание, нередко у них повышена СОЭ. По мере прогрессирования заболевания развиваются гепато- и спленомегалия, увеличиваются лимфатические узлы. В патологический процесс вовлекаются легкие, почки, центральная нервная система, стенка кишечника; костные боли не являются доминирующим симптомом, диффузный остеопороз чаще служит отражением возраста больных. Может развиваться мочекислая нефропатия и окклюзия гломерулярных капилляров. Амилоидоз первоначально обнаруживается в печени и селезенке, описана амилоидная артропатия. Иммунодефицитный синдром клинически проявляется повышенной наклонностью больных к инфекционным заболеваниям. Синдром, обусловленный повышенной вязкостью сыворотки крови, наблюдающийся у 1/3 больных, характеризуется церебропатией, ретинопатией и кровоточивостью. Геморрагический синдром в виде носовых, десневых, кишечных кровотечений и петехий 36 на коже является следствием повышенной концентрации макроглобулина, который покрывает поверхность тромбоцитов, изменяя активность 3-го фактора тромбоцитов, а также результатом образования комплексов между макроглобулином и VIII фактором свертывания. В стадии прогрессирования заболевания развивается анемия, у некоторых больных наблюдается нейтропения, панцитопения. Множественная миелома Множественная миелома (ММ) (миеломная болезнь, генерализованная плазмоцитома, болезнь Рустицкого — Калера) — самая часто встречающаяся форма ПП. Причины ее развития неясны. Морфологическая картина представлена плазматическими клетками той или иной степени зрелости, часто с чертами атипизма. В развернутой стадии опухоль локализуется в костном мозге (позвонков, костей черепа, ребер, костей таза, проксимальных отделов бедренных и плечевых костей), очень редко в печени, селезенке, лимфатических узлах. По характеру распределения очагов в костном мозге выделяют следующие формы множественной миеломы: диффузно-очаговую, при которой отмечается более или менее равномерное заселение костного мозга плазматическими клетками, расположенными среди нормальных кроветворных клеток, и одновременно образование отдельных узлов опухоли; диффузную форму; множественноочаговую, когда вне опухолевых очагов сохраняется нормальный костный выход плазматических клеток в периферическую кровь нехарактерен для этого лейкоза, хотя иногда возможен. Клиническая картина множественной миеломы разнообразна. Первые признаки (боль, утомляемость, слабость) появляются обычно в III стадии. Остеодеструктивный процесс приводит к развитию болевого синдрома. Чаще боли связаны с поражением позвоночника 37 (компрессионные переломы тел позвонков), крестца. Нередко болят ребра, пораженные опухолью проксимальные отделы бедренных и плечевых костей. В зависимости от класса секретируемых иммуноглобулинов выделяют несколько вариантов множественной миеломы: G-, A-, D-, Е-миелому, миелому Бенс-Джонса типа κ или λ, несекретирующую (или 0) множественную миелому. Самый частый вариант — G-миелома (60 %), наиболее редкие — D-миелома (3—5 %) и Е-миелома (единичные случаи). На основании анализа показателей гемоглобина, рентгенограмм костей, содержания парапротеинов в сыворотке крови и моче, креатинина крови выделяют 3 стадии множественной миеломы. В I стадии масса опухоли менее 600 г/м2, во II стадии — 600—1200 г/м2в III стадии — более 1200 г/м2. В зависимости от наличия или отсутствия почечной недостаточности (определяют по содержанию креатинина крови) каждая стадия имеет соответственно символ В или А. Диагноз устанавливают на основании данных стернальной пункции (определяется плазмоклеточная инфильтрация костного мозга) и выявлении моноклональных иммуноглобулинов в сыворотке крови и (или) моче. Поражения почек весьма характерны для множественной миеломы, и их спектр включает так называемую миеломную почку (цилиндрнефропатия/cast nephropathy), AL-амилоидоз (амилоидоз легких цепей), болезнь депонирования моноклональных иммуноглобулинов (БДМИ), хронический тубулоинтерстициальный нефрит (синдром Фанкони), а также иммунокомплексные нефропатии при криоглобулинемии I и II типов, иногда сопровождающей ММ. При аутопсии пациентов с ММ цилиндр-нефропатия может составлять до 50%, а при биопсии почки, выполненной по поводу ММ, - 63-86%. Несколько реже (6-24%) встречается амилоидоз почек, и лишь 38 примерно в 5% случаев аутопсий находят БДМИ. В то же время анализ материалов почечных биопсий, выполненных у 118 больных с ММ и поражением почек, показал, что в 41% случаев оно было обусловлено цилиндр-нефропатией, в 30% - AL-амилоидозом, в 19% болезнью легких цепей, в 10% -хроническим тубулоинтерстициальным нефритом, и только у одного из 118 больных поражение почек было связано с криоглобулинемией . БДМИ включает болезнь депонирования легких цепей (БЛЦ), именуемую также миеломой Бенс-Джонса, болезнь депонирования легких и тяжелых цепей, болезнь депонирования тяжелых цепей. БЛЦ как иммунохимический вариант ММ встречается в 12-20% случаев. Наличие депозитов L-цепей в других внутренних органах может протекать бессимптомно и выявляться только при аутопсии. Например, поражение печени чаще имеет латентное течение и характеризуется гепатомегалией с небольшим повышением уровня ферментов в крови, в основном щелочной фосфатазы. С другой стороны, возможна и яркая клиническая картина органных поражений. Так, патология сердца, возникающая примерно в 80% случаев БЛЦ, характеризуется диастолической дисфункцией на фоне кардиомегалии, обусловленной развитием инфильтративной кардиомиопатии. На ЭКГ при этом отмечаются снижение вольтажа комплекса QRS, аритмии (мерцание и трепетание предсердий, суправентрикулярная тахикардия и синусовая брадикардия), причем нарушения ритма по типу блокад не характерны. Отложения депозитов могут присутствовать вдоль нервных волокон центральной и периферической нервной системы, в лимфоузлах, костном мозге, селезенке, поджелудочной железе, щитовидной железе, желудочно-кишечном тракте, сосудах брюшной полости, 39 надпочечниках, легких, коже, определяя системный характер заболевания. В диагностике БДМИ важное значение имеет количественное и качественное определение парапротеина. В этом плане скрининговыми методами являются электрофорез и иммуноэлектрофорез белков сыворотки крови. Более информативным является метод иммунофиксации . Однако, как уже отмечалось, при БЛЦ сами L-цепи могут отсутствовать в крови и в моче или присутствовать в крайне низких для диагностики концентрациях. Довольно часто нет клинических данных, позволяющих заподозрить плазмоцитому. Примерно в 40% случаев лимфоплазматические нарушения при БЛЦ могут не выявляться на протяжении 2-17 лет наблюдения. Таким образом, основным опорным пунктом диагностики и определения прогноза БЛЦ является пункционная биопсия почки с электронно-микроскопическим и иммунофлюоресцентным исследованием с использованием сывороток, содержащих антитела к к- и Х-цепям. Исследование пунктата костного мозга может подтвердить диагноз, однако описаны случаи, когда БЛЦ не сопровождалась плазмоцитозом костного мозга. Необходимо также исследование лимфоидной ткани. В целом рекомендовано использование всех четырех методов, а именно - биопсии почки или другого пораженного органа, морфологическое исследование лимфатических узлов и костно-мозгового пунктата, иммуноэлектрофорез сыворотки крови и мочи. Белки мочи Анализ мочи важен при обследовании больных с парапротеинемией или при подозрении на B клетки. Отличительной особенностью дифференциации злокачественной от доброкачественной патологии является наличие иммуноглобулиновых осколков, продуцируеммых 40 опухолевыми клетками. Фрагменты, которые не могут быть обнаружены в сыворотке методом электрофореза, обычно имеют более низкий молекулярный вес, чем неповрежденные молекулы иммуноглобулина. Эти фрагменты легко проходят через почки и могут быть четко видны в моче. Обнаружение моноклональных свободных легких цепочек или белка Бенс-Джонса (ББД), обеспечивает высокий индекс вероятности выявления злокачественной опухоли. Даже низкие концентрации (10 мг / л) могут быть значимыми, и поэтому концентрированная моча (желательно исследовать утреннюю порцию) должна быть проанализирована в сывороточной системе. Независимо от используемой системы, следы белка должны быть видны во всех образцах мочи, в противном случае выборка должна быть повторно проанализирована. При обнаружении ББД в высоких концентрациях (> 100 мг / л) без сопутствующей клубочковой или канальцевой протеинурии, необходимо провести идентификацию методом иммунофиксации. Тем не менее, повреждение почек, связанное с протеинурией БенсДжонса, часто влечет за собой сложные, нестандартные модели, требующие с помощью иммунофиксации решить возможность присутствия ББД. Низкая концентрация ББД может также сопровождаться значительной клубочковой протеинурией у пациентов с амилоидозом почек; моча любого такого пациента должна быть исследована методом иммунофиксации даже в отсутствие полосы обнаруживаемой при ББД. Ряд других белков могут выглядеть, как дискретные полосы при электрофорезе мочи, особенно там, где есть элемент присутствия канальцевой протеинурии. К ним относятся α-и β-микроглобулины, лизоцим (мигрирующие в медленном диапазоне гамма), 41 деградированные фрагменты клубочкового происхождения и реже семенная жидкость, белки. В некоторых образцах β2-микроглобулины будут присутствовать в высоких концентрациях, и давать весьма заметную группу. Нормальные значения белка в моче • Белки обычно не встречаются в больших количествах в моче. Белки мочи условно разделяют на альбумины (менее 50 мг / дл) и глобулины. Электрофорез белков мочи может быть назначен, для определения причины появления белка в моче или в качестве скрининг - теста для измерения различных видов белков в моче. Причины появления белка в моче: • Почечная недостаточность • Снижение функции почек • Диабетическая нефропатия • Острое воспаление • Нефротический синдром • Острая инфекция мочевыводящих путей • Множественная миелома • Амилоидоз Моноклональные антитела, как маркеры В 1975 году была описана методика, позволяющая получать клеточные линии (гибридомы), секретирующие отдельные разновидности антител (моноклональные антитела) с желаемой антигенной специфичностью. Это открытие определило бурный прогресс в использовании антител как для исследовательских, так и для практических целей, и в настоящее время "гибридомная 42 технология" является одним из основных направлений в биотехнологии. Гибридомы являются бессмертными клеточными клонами, продуцирующими антитела одной специфичности. Гибридомы получают при слиянии нормальных лимфоцитов, продуцирующих антитела, с подходящей опухолевой линией B- клеток. Затем гибридомы отбирают в культуральной среде, неспособной поддерживать рост родительских клеток. Путем последовательных разведений и пересевов получают одиночные клоны, которые можно выращивать в роллерных культурах или в форме асцита в брюшной полости мышей. В последнем случае удается получать особенно высокие титры моноклональных антител. При этом, естественно, все молекулы иммуноглобулинов, продуцируемые определенной гибридомой, идентичны: они относятся к одному классу и одному аллотипу, имеют одинаковые вариабельные области, структуру, идиотип, аффинность и специфичность к данному эпитопу. Парапротеины являются первыми описанными опухолевыми маркерами, т.е. отражают объем опухоли. Как и другие онкомаркеры парапротеины встречаются как при онкологических, так и патологических процессах, отражая нарушенное функционирование иммунной возрастом; системы. в Наблюдается бессимптомной увеличение популяции встречаемости большинство с случаев представлено гаммапатии неясного значения. Значение обнаружения парапротеинемии (ПП) в популяции приведено в таблице 3. Таблица 3 Встречаемость парапротеинемий в популяции Характеристика процесса Состояние Вероятность (% ) при ПП 43 Миелома Лимфома Злокачественные Макроглобулинемия процессы Плазмацитома ХЛЛ Амилоидоз Моноклональный Не РФ/криоглобулинемия злокачественные Периферическая нейропатия MGUS(без прогресса за 5 лет) Асимптоматические Транзиторное (пожилой возраст) 61% 5% 4% 3% 1% 2% 2% 1% 18% 1-3% Парапротеин может быть выявлен в сыворотке крови с помощью электорофореза белков сыворотки, количественного определения основных классов иммуноглобулинов сыворотки, а также с помощью метода иммунофиксации. Несомненным преимуществом выполняемого метода является проведение одновременного анализа сыворотки и мочи. Особую важность в дифференциальной диагностике злокачественных и доброкачественных состояний является обнаружение фрагментов иммуноглобулинов, которые секретируются злокачественными клетками. Фрагменты иммуноглобулинов (легкие цепи) могут быть обнаружены в моче благодаря концентрирующему эффекту, но обычно не определяются при электрофорезе белков сыворотки. Таким фрагментом иммуноглобулина является белок Бенс-Джонса (ББД), представляющий агрегаты легких цепей иммуноглобулинов. При доброкачественных парапротеинемиях ББД в моче не обнаруживается, что позволяет использовать его выявление в качестве основного метода скрининга миеломы. В таблице 4 представлены данные о верификации ПП в зависимости от концентрации Ig сыворотки и их место среди всех ПП. 44 Таблица 4 Спектр ПП в зависимости от концентрации Ig сыворотки крови Множественная (% среди Концентрации Ig миелома ПП) сыворотки Миелома IgG 55% Более 30 г/л Миелома IgA 15% Более 15 г/л Макроглобулинемия 2%(у Более 20 г/л пожилых) Вальденстрема(IgM) Миелома IgEи IgD <1% IgE~10 г/л, IgD~14 г/л Биклональная 2.5% миелома Болезнь легких Секреция ББД (>0,1 гр за цепей 24 часа) 20% (часто ALГипогаммаглобулинемия амилоидоз) Болезнь тяжелых цепей <1% Гипергаммаглобулинемия альфа/гамма/мю Гипогаммаглобулинемия, Несекретирующая/ солитарная 5% Определение бета2 плазмацитома микроглобулина Гаммапатия неясного генгеза/ транзиторная Парапротеин менее 10 г/л, ББД отсутствует В Приложении представлены примеры интерпретации данных исследования сыворотки крови нескольких пациентов, проведенного на приборе “ PARAGON CZE 2000” фирмы “ Beckman Coulter ” методом капиллярного электрофореза. Заключение Электрофоретические методы в клинической лабораторной диагностике имеют хорошую перспективу. В целом использование 45 современных электрофоретических анализаторов позволяет с высокой точностью и минимальными затратами исследовать широчайший спектр биохимических параметров с целью уточнения диагноза, мониторинга патологического процесса и обоснования методов терапии заболеваний. На сегодняшний день капиллярный электрофорез является одним из наиболее перспективных методов анализа, он динамично развивается и получает всё более широкое применение в различных областях аналитической химии. Простота и доступность этого метода, а также неоспоримые преимущества, которые он даёт при выполнении измерений, позволяют надеяться на динамичное развитие методического обеспечения и скорейшее включение капиллярного электрофореза в перечень физико-химических методов анализа, наиболее часто применяемых в повседневной лабораторной практике. ПРИЛОЖЕНИЕ Примеры электрофореграмм, полученных с помощью метода капиллярного электрофореза: 46 Рис. 10. Электрофорез белков сыворотки крови в пределах нормы Рис. 11. Гипоальбуминемия. Гиперальфа-2- глобулинемия. Ds: Гломерулонефрит. 47 Рис. 12. Выраженная диспротеинемия, сопровождающаяся поликлональной гаммапатией и снижением фракций альбумина, альфа и бета глобулинов. Ds: Цирроз печени. Рис.13. Гипоальбуминемия. Гиперальфа-2-глобулинемия. Ds: ХПН 48 Рис.14. Резко выраженная гипоальбуминемия. Гиперальфа-2глобулинемия. Гипо-бета и гамма-глобулинемия. Ds: Гломерулонефрит. Иммунодефицитное состояние. Рис.15. Гипоальбуминемия. Гиперальфа-1 и альфа-2 глобулинемия. Ds: Острая крупозная пневмония. 49 Рис. 16. Выраженная диспротеинемия. Гипоальбуминемия. Гаммапатия. Увеличение фракции бета-глобулинов за счет зоны компонента- комплемента. Ds: Вирусный гепатит «C», цирроз печени, асцит. Рис. 17. На электрофореграмме белков сыворотки крови отмечается увеличение зоны компонента-комплемента во фракции бетаглобулинов. Характерно формирование мостика между бета и гамма зонами. Гипергамма-глобулинемия. Ds: Хр. Панкреатит. 50 Рис.18. На электрофореграмме белков сыворотки крови отмечается увеличение зоны трансферрина во фракции бета-глобулинов. Характерно для железодефицитных состояний. 9 Рис. 19. На электрофореграмме белков сыворотки крови отмечается увеличение зоны компонента-комплемента во фракции бетаглобулинов, сопровождающее состояние реактивности организма при острых и хронических заболеваниях. 51 Рис. 20. На электрофореграмме белков сыворотки крови в зоне гамма- глобулинов выявляется маловыраженная моноклональная фракция, составляющая 3,4%( 2,86 г/л) от всех белков сыворотки крови. Для ее идентификации рекомендуется проведение иммунофиксации. Ds: Синдром ускоренного СОЭ. 52 Рис.21. На электрофореграмме белков сыворотки крови в зоне гаммаглобулинов выявляется моноклональная фракция (М-градиент), составляющая 9,1%( 7,47 г/л) от суммы всех белков сыворотки крови. Необходимо идентифицировать состав М-градиента, для чего предлагается иммунофиксация (см. рисунок 22). В случае сомнений в идентификации белковых фракций в областях бета и гамма можно провести дополнительные исследования по выявлению этих белков другими методами, например, с помощью иммунонефелометрии или иммунохемилюминесценции. В этом случае исследования будут оправданы, так как будут проводиться уже прицельно. 53 Kappa Ig М Рис.22. Иммунофиксация: Выявленная в зоне гамма глобулинов моноклональная фракция, идентифицирована как Ig М тип kappa. Предварительный Ds (без иммунофиксации): Ревматоидный артрит. Остеопороз. Заключительный Ds: Миеломная болезнь 54 Рис.23. На электрофореграмме белков сыворотки крови в зоне гаммаглобулинов выявляется выраженная моноклональная фракция (Мградиент), составляющая 45,7%(53,1г/л) от суммы всех белков сыворотки крови. На рисунке 24 представлена идентификация М-градиента для постановки более точного диагноза. 55 IgG Kappa Рис.24. Иммунофиксация: Выявленная в зоне гамма глобулинов моноклональная фракция, идентифицирована как IgG kappa тип. Ds: Множественная миелома 56 Рис.25. На электрофореграмме белков сыворотки крови в зоне гаммаглобулинов выявляется выраженная моноклональная фракция (Мградиент), составляющая 57,3%(63,04 г/л) от суммы всех белков сыворотки крови. Методом иммунофиксации на рисунке 26 выявлен тип моноклональной фракции. 57 IgG Lambda Рис.26. Иммунофиксация : Выявленная в зоне гамма глобулинов моноклональная фракция, идентифицирована как Ig G lambda тип. Ds: Множественная миелома 58 Рис.27. На электрофореграмме белков сыворотки крови в зоне гаммаглобулинов выявляется выраженная моноклональная фракция (Мградиент), составляющая 74,2%(124,г/л)от всех белков сыворотки крови. Рекомендуется проведение иммунофиксации сыворотки крови (см. риунок 28). 59 IgG Lambda Рис.28. Иммунофиксация крови: Выявленная в зоне гамма глобулинов моноклональная фракция, идентифицирована как Ig G lambda тип. На электрофореграмме белков мочи этого же пациента в зоне гаммаглобулинов выявляется моноклональная фракция (BJ), составляющая 24,6%(0,07г/л) от суммы всех белков мочи. 60 Рис.29. Общий белок мочи-0.29 г/л. Неселективная протеинурия. Для идентификации моноклональной фракции рекомендуется проведение иммунофиксации мочи. Электрофорез мочи Рис.30. Электрофорез мочи: Общий белок-0,02г/л. Белок мочи в пределах физиологической нормы. 61 Рис.31. Общий белок мочи-0,79г/л. На электрофореграмме белков мочи неселективная протеинурия. В зоне гамма-глобулинов выявляется моноклональная фракция (белок BJ), составляющая 47,1% (0,37г/л) от суммы всех белков мочи. Коментарий: Рекомендуется проведение иммунофиксации мочи для идентификации моноклональной фракции. 62 Рис.32. Общий белок мочи - 2,36 г/л. Неселективная протеинурия. Выраженная альбуминурия. В зоне гамма-глобулинов выявляется моноклональная фракция (BJ), составляющая 5,6%(0,13г/л) от суммы всех белков мочи. Рекомендуется проведение иммунофиксации мочи. IgG Lambda Рис.33. Иммунофиксация мочи: Выявляется парапротеинурия IgG lambda тип. Ds: Множественная миелома 63 IgA Lambda 64 Рис. 34. Иммунофиксация мочи: Выявленная моноклональная фракция в зоне гамма-глобулинов идентифицирована как IgA lambda тип. Ds: Множественная миелома. Вопросы для самоконтроля: 1.Принцип электрофоретического разделения белков; 2. Фракционный состав типичной протеинограммы; 3. Основная цель электрофореза с иммунофиксацией; 4. Характеристика протеинограмм при парапротеинемиях различного типа; (по Приложению) 5. Современные направления технологий электрофореза. Литература 1. Андреева Н.Е., Балакирева Т.В. Парапротеинемические гемобластозы: Множественная миелома, макроглобулинемия Вальденстрема, болезни тяжелых цепей. В кн.: Руководство по гематологии. Под ред. А.И. Воробьева. Тверь: Триада, 2003: 6-23 2. Духин С.С.,Дерягин Б.В. Электрофорез, М: Наука,1976. 3. Современная гематология и онкология. Под ред. В.Ф. Фербенкса. М.: Медицина, 1987: 244-291 4. Камышников В.С. Справочник по клинико-биохимической лабораторной диагностике (в 2-х томах). Минск, 2000. -463 С. 5. Клиническая онкогематология. Руководство для врачей. Под ред. М.А. Волковой. М.: Медицина, 2001: 420-449. 6. Сергеева Н.А. // Клин. лаб. диагн. – 1999. - № 2. - С. 25-32. 7. Титов В.Н., Амелюшкина В.А. Электрофорез белков сыворотки крови. – М., 1994. 8. Hall C.L., Peat D.S. Light-chain deposition desease: a frequent cause of diagnostic difficulty. Nephrol Dial Transplant 2001; 16: 1939-1941. 9. www.grohmann.ru/phores/phores.htm; 8. Hall C.L., Peat D.S. Light-chain deposition desease: a frequent cause of diagnostic difficulty. Nephrol Dial Transplant 2001; 16: 1939-1941. 9. www.grohmann.ru/phores/phores.htm; 65 66
