молекулярные технологии в диагностике инфекционных болезней

МОЛЕКУЛРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ ПОДХОД В АНАЛИЗЕ
ВНУТРИБОЛЬНИЧНОЙ СТАФИЛОКОККОВОЙ ИНФЕКЦИИ, ВЫЗВАННОЙ КОС В
УЧРЕЖДЕНИЯХ РОДОВСПОМОЖЕНИЯ.
Воронина О.Л., Кунда М.С., Дмитренко О.А., Лунин В.Г.
ФГБУ «НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи» Минздравсоцразвития России, Москва, Россия
Введение.
Ведущими гнойно-воспалительными заболеваниями, развивающимися у
новорожденных в родовспомогательных учреждениях, являются конъюнктивиты и
омфалиты. Еще в 1975 г. Johnson D., McKenna H. доказали значение
коагулазоотрицательных стафилококков (КОС) в возникновении этих заболеваний.
Продолжительные исследования Сенцовой Т.Б. и соавт. (1985-1995) подтвердили, что
причиной возникновения конъюнктивитов и омфалитов у 474 новорожденных наряду с S.
aureus был S. epidermidis.
Однако длительное время практически существовало равенство терминов КОС и
эпидермальные стафилококки, несмотря на то, что в 1975 г. Kloos W.E. и Schleifer K.H.
детально описали 7 новых видов КОС. Развитие систем идентификации, основанных на
сахаролитических свойствах КОС, способствовало улучшению видовой дифференциации
внутри КОС, но в то же время не могло преодолеть высокого процента ошибок,
заложенного самой биологией микробной клетки. Наши данные показывают, что для
наиболее совершенных и основанных на статистических сведениях систем
идентификации КОС фирм «bioMérieux», Франция, и Becton Dickinson, США, точность
идентификации до вида составляет 78 и 86 %, соответственно. На неоднозначность
результатов фено- и фаготипирования в видовой идентификации КОС обращал внимание
еще Акатов А.К. Он же призывал к развитию новых геномных методов и
мультилокусного электрофореза в типировании стафилококков.
Понимая значимость видовой и штаммовой идентификации КОС для выбора
правильной стратегии борьбы с внутрибольничными инфекциями в учреждениях
родовспоможения, мы привлекли молекулярно-генетические методы, основанные на
амплификации и секвенировании фрагментов генома, к идентификации видов и штаммов
КОС.
Цель и задачи.
Оценить роль разных видов КОС в возникновении ведущих гнойновоспалительных заболеваний новорожденных. Охарактеризовать штаммы S. epidermidis,
ставшие причиной внутрибольничных инфекций в родовспомогательных учреждениях.
Материалы и методы.
В работе исследовали изоляты КОС из родильных домов Нижнего Новгорода и
Научного центра акушерства гинекологии и перинатологии им. академика В.И. Кулакова
Минздрасоцразвития РФ (НЦАГиП)
Видовую идентификацию изолятов проводили на основе амлификации и
секвенирования фрагментов генов tuf (translation elongation factor Tu) и gap
(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase).
Для дифференциации штаммов S. epidermidis использовали протокол MLST
(multilocus sequence typing), разработанный Thomas J.C. et al..
Секвенирование фрагментов ДНК проводили на приборе 3130 Genetic Analyzer
(Applied Biosystems / Hitachi), используя наборы BigDye Terminator v 3.1 Cycle Sequencing.
Электрофорез продуктов реакции осуществляли в капиллярах длиной 50 см с полимером
POP-7
Анализ последовательностей и выравнивание выполняли с помощью программы
CLUSTAL W (1.83). Консенсусные последовательности фрагментов генов сравнивали с
известными аллелями с помощью MLST веб-сайта (http://www.mlst.net). Новые
последовательности аллелей и ST регистрировали у куратора сайта Thomas J.C..
Для построения дерева сходства штаммов S. epidermidis на основе аллельных
профилей использовали алгоритм UPGMA из пакета PHYLIP ver. 3.69 для визуализации
результатов анализа – программу Phylodendron ver. 0.8d, beta. Для кластерного анализа
штаммов S. epidermidis - программу построения дерева минимальных расстояний
(minimum-spanning tree) на основе аллельных профилей и алгоритма DJP в сочетании с
опцией BURST кластеризации.
Основные результаты.
Результаты видовой идентификации изолятов показали, что причиной
возникновении омфалитов новорожденных являются КОС видов S. epidermidis и S.
haemolyticus практически в равных долях, существенно реже - S warneri.
При конъюнктивитах, несмотря на более широкий спектр видов возбудителя (S.
epidermidis, S. haemolyticus, S warneri, S hominis, S pasteuri), ведущая роль принадлежала S.
epidermidis. Следует отметить, что в структуре всех заболеваний, вызванных S. epidermidis
в нашей выборке, конъюнктивиты составляли более 60%.
Разнообразие штаммов эпидермальных стафилококков, выделенных от заболевших
новорожденных, оказалось достаточно велико. По результатам MLST выборка была
распределена по 11 ST (sequence type). Следует отметить, что штаммы с ST 5 были
выделены как из крови заболевшего новорожденного, так и из смыва с пеленального
столика в том же роддоме. Штаммы с ST 59, превалировавшие в выборке, были
обнаружены в разных учреждениях и в течение всего срока наблюдения. Они преобладали
среди возбудителей конъюнктивита, но были зарегистрированы также при омфалите,
флегмоне; изолированы из мочи заболевших новорожденных и из легких умершего
младенца. Как показал анализ анитибиотикорезистентности штаммов данного аллельного
профиля, чувствительные к оксацилину стафилококки достаточно быстро элиминировали
из стационара, а резистентные сохранялись в течение всего срока наблюдения.
Тропизм к определенному виду заболеваний не был обнаружен и у штаммов
других ST. При конъюнктивите изолировали штаммы 9 ST, а при омфалите – 3-х.
Штаммы ST 265 и 59 вызывали оба вида гнойно-воспалительных заболеваний.
Анализ гомологии выборки эпидермальных стафилококков и кластерный анализ
показали, что штаммы 8 ST из 11 формируют единый кластер, т.е. отличаются только по
одной или двум позициям аллельного профиля. З ST представляли собой синглетоны,
причем 2 из них были нами зарегистрированы впервые.
Полиморфность и изменчивость популяции эпидермальных стафилококков в
учреждениях родовспоможения подтвердили также данные по выявлению новых аллелей.
Мы обнаружили их для генов arcC, gtr, pyr, tpi, yqiL.
Заключение. Проведенное исследование показало, что у новорожденных, как и у
взрослых, что раннее было отмечено Акатовым А.К., ведущая роль в патологии
принадлежит S. epidermidis как по частоте вызываемых им инфекций, так и по широкому
кругу нозологических форм, при которых он является возбудителем заболевания. Однако
другим видам КОС, все чаще встречающимся в учреждениях родовспоможения, следует
уделить особое внимание.
В период наблюдений среди возбудителей заболеваний новорожденных
преобладали эпидермальные стафилококки с ST 59. Изучение свойств этого штамма
поможет в дальнейшем в выработке стратегии борьбы с внутрибольничной
стафилококковой инфекцией в отделениях новорожденных.