Методическое пособие 3

УДК
ББК
340.67:615,07:615.212
58:52.84 О -201
ОГЛАВЛЕНИЕ
Авторы:
I I . Н. ПЕТУХОВА - ассистент кафедры токсикологической химии ГЬОУ НПО
11ГФА Минздравсоцразвития России
Т.Л. МАЛКОВА - заведующий кафедрой токсикологической химии ГБОУ ВПО
11ГФА Минздравсоцразвития России
Н.М. САЛОМАТИН -- главный научный сотрудник лаборатории химикотоксикологических исследований РЦСМЭ, доктор фармацевтических наук,
профессор
ОБНАРУЖЕНИЕ
И
КОЛИЧЕСТВЕННОЕ
ОПРЕДЕЛЕНИЕ
КЕТОРОЛАКА ДЛЯ ЦЕЛЕЙ ХИМИКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКОГО
АНАЛИЗА
Информационное письмо разработано для врачей судебно-медицинских
экспертов, врачей клинической лабораторной диагностики, студентов
медицинских и фармацевтических ВУЗов и других специалистов, работающих в
области анализа наркотических средств, токсических и сильнодействующих
веществ.
Информационное письмо рекомендовано к изданию Ученым советом ФГБУ
РЦСМЭ Минздравсоцразвития России (протокол № 4 от 22 ноября 2011 г)
Рецензенты:
А.А. Никоноров
заведующий
кафедрой биохимии
с курсом
токсикологической химии ГБОУ ВПО «Оренбургская государственная
медицинская академия», д.м.п., профессор
Г.В. Береговых - доцент кафедры фармацевтической и токсикологической
химии ГБОУ ВПО Кемеровской государственной медицинской академии,
кандидат фармацевтических паук
О Н.Н. Петухова, Т.Л. Малкова, К.М. Са.иоматин, 2011
© ФГБУ РЦСМЭ Минздравсоцразвития России
2
ВВЕДЕНИЕ ................................................................................................................. 4
1. КРАТКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА КЕТОРОЛАКА ................................................ 8
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ .................................................................................. 11
2.1. Приготовление рабочих растворов (реактивов) ........................................... 12
2.2. Спектральные методы анализа ....................................................................... 13
2.3. Хроматографические методы анализа ........................................................... 14
2.3.1. Тонкослойная хроматография ................................................................... 14
2.3.2. Высокоэффективная жидкостная хроматография.................................... 15
2.3.3. Газовая хроматография с масс-селективным детектированием.............. 15
3. ИССЛЕДОВАНИЕ ................................................................................................ 17
3.1. Способ обнаружения кеторолака с помощью метода ТСХ .......................... 18
3.2. Способ обнаружения кеторолака методом спектрофотометрии .................. 19
3.3. Способ обнаружения и количественного определения кеторолака методом
ВЭЖХ ...................................................................................................................... 23
3.4. Способ обнаружения кеторолака методом ГХ/МС ....................................... 24
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ:...
...31
ВВЕДЕНИЕ
Несмотря на несомненную клиническую эффективность, применение
Боль является важнейшим
защитным феноменом,
мобилизующим
НПВП имеет свои ограничения. Это связано с тем, что даже кратковременный
функциональные системы организма. Волевой синдром сопровождает около
прием этих препаратов в небольших дозах может приводить к развитию
90% заболеваний, от 7 до 64% населения периодически испытывают чувство
побочных эффектов, которые в целом встречаются примерно в 25% случаев,
боли, от 7,6 до 45% страдают рецидивирующей или хронической болью,
а у 5% больных могут представлять серьезную угрозу для жизни [1,3,6].
поэтому врачи часто используют нестероидныс противовоспалительные
Наиболее частые побочные эффекты НПВП - поражения желудочно-
препараты (НПВП) для симптоматической и патогенетической терапии. Только
кишечного тракта, нарушение агрегации тромбоцитов, функции почек,
на российском фармацевтическом рынке насчитывается более 500
негативное влияние на систему кровообращения. Частота НПВП - гастропатий
наименований нестероидных противовоспалительных препаратов (НПВП).
составляет 1 % у пациентов, принимающих НПВП в течение 3 - 6 месяцев, и 2 -
Их стандартно назначают при боли в спине, менструальной боли,
головной
боли,
в
качестве
компонентов
предоперационной
4%-у пациентов, принимающих их в течение года. Другие побочные эффекты
и
вероятно, определяются индивидуальной непереносимостью того или иного
послеоперационной анальгезии, при подагре и при болях, вызванных
лекарственного средства. "Индивидуальный" ответ на НПВП у разных
растяжениями. Но чаще всего их применяют в лечении ревматоидного артрита,
пациентов может различаться. Причины этого до конца не ясны. Обсуждается
остеоартрита и других ревматических состояний [3, 4, 5, 6].
значение индивидуальных особенностей всасывания, распределения и
Круг этих лекарственных препаратов постоянно расширяется, а спрос из
аптечных организаций на данные препараты возрастает с каждым годом.
метаболизма.
Особенно высок риск развития побочных эффектов улиц пожилого
Методом выборочного опроса нами были получены данные по динамике
и старческого возраста, которые составляют более 60% потребителей НПВП.
продаж некоторых препаратов группы НПВП от аптек сети «Опека» г. Перми за
Необходимо также отметить, что при многих заболеваниях сущесгиус!
2008-2010 гг.
необходимость длительного приема препаратов. Поэтому в последние годы
особое внимание привлечено к проблеме безопасного применения НПВП.
Нередко
пациенты
применяют
обезболивающие
препарлп.1
самостоятельно, поскольку лекарственные средства данной группы отпускаю I с ч
в аптеке без рецепта. Рынок препаратов группы НПВП в настоящее время
настолько насыщен, что каждый пациент сам решает, как ему справиться со
своим недугом, и какое средство для него лучше. Эту задачу «облегчаю I >•
провизоры и фармацевты, отпускающие данные препараты без рецепта врача.
Рисунок 1. Динамика продаж препаратов группы НПВП на примере аптеки сети «Опека»
г. Перми за 2008-2010 п
4
Все это в конечном итоге заканчивается инвалидностью. Употребление
завышенных доз приводит к возникновению острых отравлений данными
лекарственными средствами, вплоть до летальных исходов.
По данным годовой статистической отчетности центра по лечению
острых отравлений МУЗ «МСЧ № 9 им. М.А. Тверье» г. Перми (количество
обслуживаемого населения - 2904,7 тыс. человек) следует отметить:
• общее число отравлений на территории составило
в 2009 году - 1524
случая;
• из них лекарственными средствами, медикаментами и биологическими
веществами (сохранена формулировка фразы) - 832 случая, что составляет
55%;
• веществами, преимущественно немедицинского назначения (сохранена
формулировка фразы) - 692 случая, что составляет 45%.
Рисунок 3. Диаграмма структуры отравлений по нозологическим формам
«МСЧ № 9 им. М.А. Тверье» г. Перми за 2009 год
Особое место в группе препаратов НПВП занимает препарат Кеторолак очень мощный анальгетик с полезной противовоспалительной активностью.
Применяется при болях различной этиологии, наиболее популярен у
стоматологов. Ведется практика использования данного препарата при лечении
наркологической зависимости для купирования «абстинентного синдрома».
При пероральном приеме кеторолака наблюдаются те же побочные
реакции, что и у других препаратов НПВП. Кеторолак не рекомендуси и
принимать длительно (более 5 дней).
Передозировка и неконтролируемый прием препарата могут привести к
трагическим
последствиям.
Зарегистрированы
случаи
возникнонешп
токсического гепатита на фоне приема кеторолака. Данный препарат запрещен
к продаже в ряде стран Европы.
Рисунок 2. Диаграмма годовой статистической отчетности отделения острых отравлений
«МСЧ № 9 им. М.А. Тверье» г. Перми за 2009 год
Из общего количества отравлений лекарственными средствами,
медикаментами и биологическими веществами отравления препаратами группы
НПВП были зафиксированы в 50 случаях, что составляет- 6%.
Кеторолак в последние годы широко используется в немедицинских целях
в комбинации с наркотическими средствами для облегчения абстинентною
синдрома.
В связи с этим направление по разработке методик анализа дин
обнаружения кеторолака в биологических объектах является актуальным и
практике судебно-химического и химико-токсикологического анализа.
7
1. КРАТКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА КЕТОРОЛАКА
Основные показания для применения - посттравматические боли, все
Лекарственный препарат Кеторолак (Ке1ого1ас) внесен в Государственный
виды хирургических и ортопедических вмешательств и травм, при болевом
реестр отечественных и зарубежных лекарственных средств, разрешенных к
синдроме у стоматологических больных. Выявлена его активность при
медицинскому применению и ввозу на территорию РФ [2].
купировании альгической симптоматики в структуре (героинового)
Фирма-производитель: «Аи Си Эн Октябрь ОАО, ФармстандартЛексредства ОАО, Фармстандарт - Октябрь ОАО; КапЬаху ЬаЬогаШпез Не!.,
Синонимы: адолор, долак, доломин, кеталгин, кетанов, кетолак, кеторол,
гиперчувствительность,
"аспириновая"
Фармакологическое действие: препарат целесообразно рассматривать в
ряду нестероидных противовоспалительных препаратов. Он является
простагландинов,
оказывает
выраженное
анальгезирующее и противовоспалительное действие. По силе анальгетического
гипокоагуляция (в т.ч. гемофилия), кровотечения или высокий риск их
печеночная недостаточность, период родов, период лактации, детский возраст
(до 16 лет - безопасность и эффективность не установлены).
Негативное действие на организм: аналогично действиям препаратом
группы НПВП.
эффекта сопоставим с морфином.
Фармакокинетика:
абсорбция
триада
развития, тяжелая почечная недостаточность (креатинин плазмы выше 50 мг/л),
тородол, торолак, кетродол, кетофрил.
синтеза
Противопоказания:
гиповолемия, эрозивно-язвенные поражения ЖКТ в стадии обострения,
Индия; Вг. КесШу '5 ЬаЬогаюпез \Лб., Индия; Лекхим-Харьков АО - Украина».
ингибитором
абстинентного синдрома.
быстрая,
хорошо
всасывается
из
Лекарственная форма:
желудочно-кишечного тракта; пища не влияет на всасываемость препарата,
• раствор для внутривенного и внутримышечного введения
биодоступность 80-100% при введении внутрь; максимальная концентрация в
• раствор для внутримышечного введения
плазме через 50 минут, после внутримышечного введения и приема внутрь.
• раствор для инъекций
Период полувыведения (Т1/2) у молодых - 3,8 - 6,3 ч, у пожилых - 4,7 - 8,6 ч.
• таблетки
Обладает высокой степенью связывания с белками (приблизительно 99%).
Менее 10 % кеторолака метаболизируется в печени, превращаясь в парагидрокси-метаболит, который обладает лишь частичной активностью по
сравнению с исходным веществом. Подвергается глубокому метаболизму в
почках с образованием неактивного ацетилглюкуронида. Выводится с мочой на
90 % в неизмененном виде и в виде метаболитов.
• таблетки, покрытые оболочкой
• таблетки, покрытые пленочной оболочкой
Химическое
название:
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
(±)-5-бензоил-2,3-дигидро-Ш-пирролизин-1-
При
карбоновая кислота (в виде соединения с 2-амино-2-гидроксиметил-1.3-пропан-
химико-токсикологическом
и
судебно -химическом
исследовании используется комплекс современных физико-химических
диолом) (1:1)
методов в сочетании с традиционными химическими реакциями. В
таблице 1 приведены реактивы, которые могут быть использованы для
постановки качественных реакций и детектирования в методе тонкослойной
хроматографии (ТСХ) при исследовании извлечений, содержащих кеторолак.
Таблица 1. Реактивы для постановки цветных качественных реакций и
детектировании при использовании метода ТСХ
Рисунок 4. Структурная формула кеторолака
САS-код: 74103-06-3
Брутто формула: С15Н13NОз соответствует молекулярной массе - М.М. 255
Молекулярная формула: С|5Н,зNО3 • С4Н11NОз соответствует молекулярной
массе - М.М. 376,41
По физическим свойствам исследуемое вещество представляет собой
белый кристаллический порошок, который хорошо растворим в эфире и
этилацетате.
УФ- спектры кегоролака в метаноле имеют максимумы абсорбции при 254,
312нм.
Коэффициент распределения 1оg Р (октанол-вода) - 2.32.
Константа диссоциации (рКа) - 3.49.
Согласно библиотечным данным в масс-спектре кеторолака наблюдаются
характеристические ионы: 105, 210, 255. 77, 51, 78, 132, 91[7, 8, 9,10].
1.
2
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
И.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
26.
27.
28.
Степень чистоты
Наименование
№ п/п
Аммония сульфат
Аммония ванадат
Аммония молибдат
Ацетон
Ацето нитрил
Висмута нитрат основной
Гек сан
Железа хлорид (III)
Иод кристаллический
Кадмия иодид
Калия иодид
Калия перманганат
Калия хлорид
Кислота серная кон ц.
Кислота уксусная ледяная
Кислота хлористоводородная конц.
Метанол
Молибдат аммония
Натрия нитрит
Натрия сульфат (безводный)
Нингидрин
Ртути хлорид (II)
Спирт этиловый 96%
Толуол
Формалин
Хлороформ
Этилацетат
Эфир диэтиловый
ч.д.а.
ч.д.а.
ч.д.а.
х.ч.
х.ч.
ч.д.а.
х.ч
ч.д.а.
ч.д.а.
ч.д.а.
ч.д.а.
ч.д.а.
ч.д.а.
х.ч.
х.ч.
х.ч.
о.с.ч.
ч.д.а.
ч.д.а.
ч.д.а.
х.ч.
ч.д.а.
х.ч.
х.ч.
х.ч.
х.ч.
х.ч.
х.ч.
2.1. Приготовление рабочих растворов (реактивов)
2.2. Спектральные методы анализа
Реактив Драгендорфа (модифицированный по Мунье): в 10 мл ледяной
Одним из универсальных методов, позволяющих определить
уксусной кислоты растворяют 0,85 г основного нитрата висмута и прибавляют
лекарственные вещества в извлечениях из биологических объектов, является
40 мл воды. К этой жидкости прибавляют раствор, содержащий 8 г йодида
спектрофотометрия в УФ-области. Он дает возможность получать электронные
калия в 20 мл воды. Перед употреблением берут 1 мл указанного раствора,
спектры поглощения исследуемых веществ, ч го может быть использовано для
прибавляют к: нему 2 мл ледяной уксусной кислоты и 10 мл воды.
целей идентификации. Необходимым условием применения метода служит
Реактив Либермана: к 0,5 г порошка натрия нитрита при
перемешивании добавляют 10 мл кислоты серной концентрированной.
Реактив Марки: к 10 мл кислоты серной концентрированной прибавляют
10 капель формалина и охлаждают. Реактив используют свежеприготовленным.
Реактив Манделина: к 0,05 г ванадата аммония прибавляют 10 мл
кислоты
серной
концентрированной.
Реактив
используют
свежеприготовленным.
Раствор нингидрина в спирте этиловом 1,0 %.
Реактив Фреде: к растертому в порошок молибдату аммония (или
натрия) прибавляют концентрированную серную кислоту. Смесь интенсивно
взбалтывают. Полученный насыщенный раствор молибденовой кислоты в
концентрированной серной кислоте сливают с осадка. Реактив используют
свежеприготовленным.
способность вещества поглощать свет в определенном интервале длин волн, что
связано с наличием в структуре вещества хромофорных групп, в качестве
которых чаще всего выступают сопряженные кратные связи.
Зависимость величины поглощения от длины волны записывается в виде
электронного спектра. УФ-спектры снимают в области 190-380 нм. Образец
анализируемого вещества при спектрофотометрических определениях обычно
растворяют в соответствующем растворителе.
Для этих целей пригодны многие растворители, в том числе вода, спирты,
хлороформ. Низшие углеводороды, жиры, разведенные растворы аммония
гидроксида, натрия гидроксида, кислот хлористоводородной или серной. Выбор
растворителя проводят таким образом, чтобы его собственное поглощение не
накладывалось на спектр поглощения вещества.
УФ-спектрометрические
исследования
выполнялись
раствора кислоты хлорной 20,0% и 50 мл раствора кислоты азотной 50,0%
УФ-
спектрофотометре СФ-103. Спиртовые растворы кеторолака различной
концентрации имеют максимум поглощения при 254 и 322 нм.
Реактив ГРМ: к 5мл раствора хлорида железа (III) прибавляют 45 мл
на
2.3. Хроматографические методы анализа
Проявление (детектирование) хроматографических зон осуществляли
2.3.1. Тонкослойная хроматография
путем облучения пластин УФ-светом (254 нм) до и после обработки
В настоящее время тонкослойная хроматография (ТСХ) является хорошо
разработанной областью физико-химических методов анализа. Этот метод
незаменим при производстве и анализе лекарственных препаратов, определении
устойчивости лекарств, разделении многокомпонентных смесей и веществ
природного
происхождения,
проведении
химико-токсикологических
исследований, очистке и идентификации веществ при извлечении из
биообъекта.
Весь процесс хроматографирования может быть сведен к пяти основным
операциям: подготовка пробы, нанесение пробы на пластинку, разделение
(хроматографирование), проявление (детектирование) и интерпретация
результатов.
Для проведения исследования методом тонкослойной хроматографии
использовались пластинки «Silufol UV 254». «Sorbfil ПТСХ - АФ - В - УФ»,
«Мегск DС - А1ufolien RР - 18 F 254». Нанесение на пластины исследуемых
извлечений и метчика (стандарта) осуществляли при помощи микрошприца на
0,01 мл (Аgilent Technologies, США) в несколько приемов с использованием
столика (с подогревом) УСП 1М № 007-04.
Подвижную фазу готовили путем смешивания требуемых соотношений
растворителей в колбе с притертой пробкой при помощи интенсивного
перемешивания. Смеси заливали в хроматографические камеры, стенки
проявляющими агентами, опрыскивания или капельного нанесения химических
реагентов.
Идентификацию проводили по величине Rf и Rst.
2.3.2. Высокоэффективная жидкостная хроматография
Из всех хроматографических методов анализа высокоэффективная
жидкостная хроматография (ВЭЖХ) в настоящее время наиболее
распростарнена благодаря появлению специальной хроматографической
аппаратуре и мелкозернистых сорбентов с привитыми фазами.
Важнейшее преимущество ВЭЖХ
возможность исследовать
практически любые объекты без каких-либо ограничений по их физикохимическим свойствам, например, по температурам кипения или молекулярным
массам. ВЭЖХ предполагает разделение в потоке подвижной фазы (элюента).
Большая
скорость
процесса,
минимальная
степень
размывания
хроматографических зон, высокая степень механизации и автоматизации
разделения и обработки информации определяют основные признаки ВЭЖХ.
Для метода высокоэффективной жидкостной хроматографии был
использован жидкостной хроматограф «Милихром А-02» (г. Новосибирск ЗАО
Институт хроматографии «Эконова»).
которых прокладывали фильтровальной бумагой. Исследование проводили в
стеклянных
хроматографических
камерах
(Мегek
КGаА,
Германия)
2.3.3. Газовая хроматография с масс-селективным детектированием
прямоугольной формы, размером 18x6x18 см. Камеры герметически закрывали
В настоящее время компьютеризированный метод газовой хроматографии
крышкой и оставляли на 30 мин. для установления равновесия. Для каждой
с масс-спектральным детектированием (ГХ/МС) как высокоспецифичный,
новой пластинки готовили новую хроматографическую систему. В составе
чувствительный и достаточно быстрый имеет широкое применение. ГХ/МС -
подвижной фазы использовали растворители квалификации «хч» и «чда».
это метод анализа веществ путем определения массы (чаще отношения массы к
14
заряду т/г) и относительного количества ионов, получаемых при ионизации
15
исследуемых веществ или уже присутствующих в изучаемой смеси.
3. ИССЛЕДОВАНИЕ
Совокупность значений m/z и относительных величин токов этих ионов
Предварительно были исследованы цветные и осадочные реакции
представляет собой график, который называют масс-спектром вещества.
Для проведения газовой хроматографии в эксперименте использовалось
обнаружения кеторолака с целью выбора оптимального детектирующего агента
для
метода ТСХ и определения возможности использования их в качестве
следующее оборудование: газовый хроматограф с масс-селективным
предварительных испытаний.
детектором Аgilent 5975С (Аgilent Technologies, США). Данный прибор
Полученные результаты представлены в таблице 2.
Таблица 2. Реакции обнаружения кеторолака с использованием некоторых
реактивов, применяемых в химико-токсикологическом анализе
представляет собой аналитический комплекс функционально объединенных
устройств, обеспечивающих разделение смесей веществ методом ГЖХ,
детектирование, идентификацию и количественный анализ компонентов.
16
Вещество
Кеторолак
Название реактива
Эффект реакции
Кислота серная конц.
Раствор нингидрина в спирте
этиловом 1 ,0 %
Желтое окрашивание
Желто-бурое окрашивание
Реактив Драгендорфа
(модифицированный по Мунье)
Темно-оранжевый осадок
Реактив Либермана
Желтое окрашивание
Реактив Манделина
Розово-бурое быстро
исчезающее окрашивание
Реактив Марки
Желто-оранжевое
окрашивание
Реактив Фреде
Грязно -зеленое окрашивание
Реактив РРК
Слабое желтое окрашивание
Наиболее чувствительными являются реакции с реактивами Драгендорфа
(5 мкг вещества в пробе) и Марки (5 мкг вещества в пробе). Данные реактивы
могут использоваться для обнаружения зон локализации кеторолака при ТСХ.
3.1. Способ обнаружения кеторолака с помощью метода ТСХ
В качестве метчика используют стандартный хлороформный раствор
кеторолака с концентрацией 1 мг/мл.
Методика ТСХ анализа кеторолака. На линию старта пластинки наносят
микрошприцом 1 мкл извлечения и параллельно такое же количество метчика.
Пятна диаметром 3-5 мм. Расстояние между пробами не менее 1 см. Отмечают
линию финиша, которая соответствует длине пробега фронта растворителя, от
старта - 10 см. Пластинки высушивают в токе воздуха, затем помещают в
хроматографические
камеры,
заполненные
соответствующими
системами
растворителей и предварительно насыщенные ими в течение 30 мин.
При окончании процесса хроматографирования пластинки извлекают из
камер, высушивают в токе воздуха до полного испарения растворителя и
проявляют с помощью различных детекторов.
3.2. Способ обнаружения кеторолака методом спектрофотометрии
Просматривают пластины в УФ-свете при длине волны 254 нм. На
хроматограммах обнаруживают зону абсорбции кеторолака с четкими
границами,
далее
обрабатывают
хроматографические
пластинки
детектирующими растворами. Полученные при проведении исследования
оптимальные результаты представлены в таблице 3.
Широкое использование данного метода связано со специфичностью,
чувствительностью, относительной простотой и точностью определений,
достигаемых с помощью относительно недорогой и доступной современной
аппаратуры. Поглощение при определенной длине волны является
информацией о структуре, качественном и количественном составе
определяемого вещества.
Таблица 3. Значение КГ кеторолака в зависимости от состава системы
растворителей и типа хроматографической пластинки
Исследование кеторолака проводят на спектрофотометре СФ-103 в
пределах длин волн 220 - 400 нм в кварцевых кюветах с толщиной измеряемого
слоя 10 мм.
УФ-спектры
поглощения
кеторолака
изучают
в
растворе
кислоты
хлористоводородной 0,Ш, в растворе натра едкого 0,Ш ив спирте этиловом
96%. Раствором сравнения служит соответствующий растворитель.
По 50 мкл стандартного раствора кеторолака с концентрацией 1 мг/мл
испаряют в токе воздуха. К сухим остаткам добавляют по 4 мл раствора
19
18
кислоты хлористоводородной 0,1 М, раствора натра едкого 0,1М и спирта
УФ-спектр кеторолака имеет два максимума поглощения, что
этилового 96%. Полученные растворы помещают в кварцевые кюветы и
существенно отличает его от УФ-спектров других изучаемых веществ, а также
проводят исследование. УФ-спектры кеторолака в различных растворителях
УФ-спектров наркотических анальгетиков и других НПВП.
представлены на рисунке 5.
Расчет значения удельного показателя поглощения производится по
результатам пяти опытов по формуле:
Таблица 5. Значение удельного показателя поглощения кеторолака в
растворе кислоты хлористоводородной 0,1 М при длине волны,
соответствующей максимумам абсорбции
Коэффициент поглощения характеристичен для конкретного вещества
Максимумы
абсорбции
кеторолака в
различных
растворителях
при четко сформулированном наборе условий (длина волны., растворитель,
температура).
представлены в таблице 4.
Однако фактически значение коэффициента экстинции частично зависит
Таблица 4. Спектральные характеристики кеторолака в
различных растворителях
и от характеристик прибора. По этим причинам количественный анализ
преимущественно проводится по калибровочному графику, построенному для
анализируемого вещества.
Количественное определение кеторолака спектрофотометрическим
методом проводят в растворе кислоты хлористоводородной 0,1 М.
20
21
Предварительно
с
помощью
стандартных
растворов
строят
3.3. Способ обнаружения и количественного определения
калибровочный график зависимое™ оптической плотности от концентрации
вещества в растворе, подчиняющиеся закону Бугера -Ламбсрта-Бера.
кеторолака методом ВЭЖХ
Жидкостной микроколоночный хроматограф «Милихром А-02»
Определение кеторолака производят при длине волны 317 нм в интервале
представляет собой аналитический комплекс функционально объединённых
концентраций 5-35 мкг/мл. В этих интервалах концентраций наблюдается
устройств, обеспечивающий разделение жидких смесей веществ методом
линейная зависимость. Предел обнаружения кеторолака - 0,5 мкг/мл.
ВЭЖХ, детектирование, идентификацию и количественный анализ
Калибровочный график УФ-спектрофотометрического определения кеторолака
компонентов.
представлен на рисунке 6.
Стандартный раствор кеторолака готовят в концентрации 1мг/мл путем
растворения в подвижной фазе.
Оптимальные условия анализа кеторолака:
• Хроматографическая колонка диаметром 2 мм. длиной 75 мм
• Неподвижная фаза «Силасорб 100-5С18»
• Подвижная фаза - ацетонитрил:фосфатный буферный раствор (40:60)
• Длина волны детектирования — 322 нм
• Время анализа 6-8 мин.
• Объем вводимой пробы - 5 мкл
• Скорость потока элюента --100 мкл/мин
• Режим элюирования - изократический
Рисунок 6. График зависимость оптической плотности от концентрации кеторолака в
растворе кислоты хлористоводородной 0,1М при длине волны 317 нм
Погрешность количественного определения кеторолака методом УФспектрометрии измеряется по результатам пяти параллельных определений.
« Температура колонки - 35°С
Время удерживания кеторолака в данных условиях составляет 4,14 мин.
Для количественного определения используется метод абсолютной калибровки.
Для построения калибровочного графика готовят стандартные растворы
кеторолака в подвижной фазе в диапазоне концентраций 2 -100 мкг/мл.
Растворы
хроматографируют
в
данных
условиях,
измеряют
хроматографических пиков и строят калибровочный график.
22
23
площади
Полученная линейная зависимость описывает уравнение первого порядка
У=Ьх+Ь, 8 пика прямопропорциональна концентрации вещества в пробе.
Следующее требование — наличие пика молекулярного иона М либо
таких осколочных ионов в масс-спектрах, которые однозначно устанавливают
Линейная зависимость между концентрацией растворов и площадью
молекулярную массу соединения. Отсутствие пика иона М + объясняют
хроматографическою пика наблюдается во всем интервале выбранных
процессом простого разрыва связи (без перегруппировки) в самом
молекулярном ионе.
концентраций.
Определение подлинности хроматографического вещества проводят
одновременно с количественным определением по времени удерживания
раствора стандартного и спектру поглощения в УФ-области. Спектр кеторолака.
имеющий максимум поглощения, характерный для этого вещества, снимают в
диапазоне от 190 до 360 им.
Система обработки
хроматографической информации хроматографа
включает функции автоматической разметки пиков, калибровки идентификации
пиков и расчетов концентрации с автоматической выдачей печатного отчета.
Погрешность дозирования (СКО): по временам удерживания - не более 1%,
по площадям пиков - не более 1%.
Таким образом, для выбора оптимальных условий анализа методом ГХМС, правильных выводов о структуре образца необходимо быть уверенным в
химической и термической стабильности изучаемого соединения при
применяемых условиях испарения и съемки масс-спектра.
Условия хроматомасс-спекрометрического анализа стандартного
раствора кеторолака на газовом хроматографе А§Пеп1 7890А с массселективным детектором А§!1еп1 5975С:
• Колонка НР-Згш;
• Температура испарителя 250°С;
• Температура хроматографической колонки:
3.4. Способ обнаружения кеторолака методом ГХ/МС
> до 70°С за 5 минут;
Подготовка образца для масс-спектрометрического анализа наиболее
> прогрев со скоростью 10°С в минуту до 310°С, выдержка 10 минут;
важная стадия всей аналитической процедуры. Для обеспечения эффективности
• Температура интерфейса 310°С;
к образцу предъявляется ряд требований. Основное из них — летучесть, которая
• Ионизация - электронным ударом (70 еУ), сканирование по полному
создает давление паров необходимое для получения достаточно интенсивного
ионного тока, позволяющего регистрацию в методе электронного удара.
ионному току в диапазоне 40 - 550 а.е.м;
• Объем пробы - 1 мкл в режиме деления потока 1:10.
Вещества, не отвечающие этому требованию, перед анализом должны быть
химически модифицированы (дериватизированы). Кроме того, аналит вплоть до
Па хроматограммах (п=5) присутствует один основной пик со временем
момента его ионизации должен сохранять первоначальный состав и строение.
удерживания 21, 28 минут. В масс-спектре этого пика наблюдаются
Масс-спектр вещества должен сниматься при самой возможной низкой
характеристические ионы: 211, 134, 77, 105, 51, 196, 182, 91 (рис. 7).
температуре также для снижения опасности превращения.
25
24
Полученные
масс-спектры
отличаются
от
масс-спектра
кеторолака,
На рисунке 8/1
представлена структурная фрагментация молекулы
кеторолака с соответсвующими отношениями масс к заряду(т/г).
опубликованного в литературе (библиотека масс-спектров N18198) прежде
всего по отсутствию молекулярного иона кеторолака с массой 255 (рис. 8).
На наш взгляд, это обусловлено отщеплением карбоксильной группы в
инжекторе хроматографа при 290°С. Зная структуру кеторолака и предполагая
термическое отщепление карбоксила, можно предположить, что пик на
хроматограмме
является
(±)-5-бензоил-2,3-дигидро-Ш-пирролизином
продуктом термического декарбоксилирования кеторолака.
26
27
Для
стандартного
раствора
кеторолака
установлены
следующие
характеристические ионы - 77, 105, 132, 210, 255. В таблице 6 представлены
параметры
идентификации
кеторолака
время
удерживания,
основные
характеристические ионы и их интенсивности.
Таблица 6. Параметры идентификации стандартного раствора кеторолака
(
Воспроизводимость полученных результатов, как при анализе
кеторолака, так и при анализе извлечений из биологических объектов,
обусловливает рекомендации по использованию данных методов для
идентификации и количественного определения в химико-токсикологическом
анализе.
ю
Подписано в печать 01.12.2011
Формат 60*84/16. Набор компьютерный. Бумага ВХИ.
Тираж 200 экз. Усл. печ. л 2,0 Заказ № 254/2011.
Отпечатано на ризографе в типографии ГБОУ ВПО ПГФА
614070, г. Пермь, ул. Крупской, 46,
тел./факс. 8-901-266-59-37, (342) 282-57-92
32