1 - Kodomo

1. Построение выравнивания последовательностей пары протеинкиназ с
разметкой кластеров плюс-блоков.
Рассмотрим цепи В структур протеинокиназ 1AD5 и 1K9A.
Первый белок представляет собой тирозин-киназу Hck кроветворных
клеток, второй – карбоксил-терминальную Src киназу.
Длины выбранных цепочек – 531 и 450 а.о. соответственно, длина
выравниваемых цепей - 438 и 441 а.о. (причина лежит в отсутствии
некоторых координат).
Данные цепочки были поданы на вход программе гибкого выравнивания
FATCAT.
Некоторая информация о полученном выравнивании:
P-value = 1.11e-16,
RMSD = 2.72,
выравнивание содержит 2 изгиба, 416 эквивалентных позиций.
Оригинальное выравнивание находится в файле fatcat.txt в папке с
заданием, далее же будет представлено выравнивание в формате msf ,
конвертированное
с
помощью
скрипта
fatcat_to_fasta.py,
с
выделенными консервативными позициями и кластерами:
Всего было найдено 3 кластера плюс-блоков.
Длина
выравнивания
–
446,
суммарная
длина
обоснованного
выравнивания – 416, процент от длины меньшей последовательности в
выравнивании – 416/438 = 94,98%.
Суммарное
число
совпадающих
букв в
кластере
Identity %
Суммарное
число сходных
букв в
кластере
Similarity %
Мера сходства
конформаций
двух
фрагментов из
кластера
блоков
Block2
(С)
Суммарное
число позиций
обоснованного
выравнивания
в кластере
Block1
(B)
1-33,
36-44,
46-63
70-90,
93-117,
123-134,
136-175
183-215,
217-226,
228-260,
263-339,
342-446
Число плюсблоков
в кластере
Block0
(A)
Положение в
выравнивании
Идентификатор
кластера
Сравним полученные кластеры:
3
60
18
30
31
51,7
score
159.26
rmsd 1.38
4
98
32
32,65
41
41,8
score
254.39 rmsd
1.89
5
258
113
43,8
153
59,3
score
639.72 rmsd
1.30
СОВМЕЩЕНИЕ одной структуры с изогнутой второй в PDB формате с раскрашенными
кластерами плюс-блоков:
1. c сайта FATCAT был скачен файл 1AD5B.1K9AB.pdb
(где цепь А – структура 1ad5B, a цепь B – модифицированная структура 1k9aB)
и rasmol-скрипт 1AD5B.1K9AB.script
2. rasmol-скрипт для покраски кластеров преобразован в скрипт для PyMol:
load 1AD5B.1K9AB.pdb
bg_color white
hide all
show cartoon
color gray
color
color
color
color
color
color
palecyan, a/82-143/
cyan, b/10-71/
wheat, a/144-249/
yellow, b/78-175/
slate, a/254-526/
marine, b/183-450/
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
1. Хорошее совмещение кластеров плюс-блоков в пространстве (без
видимых крупных погрешностей), низкое значение RMSD (<2), а
также довольно высокий процент идентичности а.о. (>30)
позволяют говорить о высокой степени доверия данному
выравниванию.
Подозрения об ошибках программы в ходе выполнения работы не
возникли.
2. Рассмотрим доменную организацию совмещаемых цепей (согласно
pDomains):
Selected Protein: 1AD5 Chain: B
CATH 1AD5B1 1-63 1AD5B2 64-165 1AD5B3 176-261 1AD5B4 262-426
SCOP 1AD5B1 1-63 1AD5B2 64-166 1AD5B3 167-438
Selected Protein: 1K9A Chain: B
CATH 1K9AB1 6-67 1K9AB2 86-171 1K9AB3 187-272 1K9AB4 273-443
SCOP 1K9AB1 4-76 1K9AB2 77-177 1K9AB3 178-450
Границы доменов двух цепей незначительно отличаются от
координат кластеров плюс-блоков и друг от друга,
эти различия в совокупности с делением методом CATH
последнего домена на два указывают на некоторую степень
изменчивости конформации рассматриваемых белков, что скорее
всего говорит об их конформационной подвижности, также
небольшой
вклад
могут
вносить
ошибки
и
погрешности
кристаллизации, особенно на граничных участках кластеров.
Белок 1AD5 был получен из организма человека, а 1K9A выделен из организма крысы, так что роль эволюционной
изменчивости в изменчивости конформации невелика, против нее
также говорят высокие проценты идентичности и сходства а.о.
в цепях.
2 Построение гибкого выравнивания с помощью сервиса RAPIDO
для структур из упр.1.
Информация о полученном выравнивании
с размеченными кластерами):
(по ссылке можно посмотреть выравнивание
1st struct. 1AD5_B (438)
2nd struct. 1K9A_B (441)
#aligned 399
RMSD rigid 22.90
#rigid 351
RMSD flex 0.96
# rigid bodies 4
Идентификатор
кластера
Размер
1
191
1AD5_B: B267-B287, B289-B298, B316-B325, B335-B352, B357-B404, B407, B425B464, B470-B483, B486-B514
1K9A_B: B195-B225, B242-B251, B263-B280, B285-B332, B335, B349-B388, B394B407, B410-B438
0.86
2
83
1AD5_B: B146-B163, B170-B191, B197-B205, B210-B221, B224-B245
1K9A_B: B80-B97, B102-B132, B136-B147, B150-B171
0.84
3
55
1AD5_B: B84-B114, B116-B124, B126-B140
1K9A_B: B12-B42, B45-B68
1.04
4
22
1AD5_B: B262-B266, B306-B307, B310-B315, B326-B334
1K9A_B: B190-B194, B232-B233, B236-B241, B252-B257, B260-B262
1.68
Координаты
Прежде всего стоит отметить очень низкое значение RMSD; а также
наличие плюс-блока, состоящего всего из 1 а.о. (выделен жирным в
таблице), причина скорее всего заключается в том, что соседние
а.о. отсутствуют в структуре.
RMSD
Далее следует заметить, что по сравнению с FATCAT кластеры
содержат большее количество плюс-блоков (вплоть до восьми).
В отличии от FATCAT, RAPIDO обнаружил 4 кластера, для структуры
1K9A_B координаты первых двух кластеров сходны с FATCAT, третий
кластер поделен на 2, причем, что самое интересное, расположение
плюс-блоков этих двух кластеров чередуется.
Для структуры 1AD5_B координаты кластеров сильно различаются:
FATCAT RAPIDO
1-63
70-175 84-140
183-446 146-245
267-514
262-334
расположение кластеров, согласно RAPIDO, смещену в сторону N-конца
последовательности,
опять
же
присутствуют
два
кластера
с
чередующимися плюс-блоками.
3. Сравнение пары структур одного и того же белка с помощью
гибкого выравнивания
Рассматриваемый белок - гемофор HasA из бактерии S. marcescens
(записи 2cn4 и 1dk0, сравниваем цепи A), отвечающий за “кражу”
бактерией железа из эритроцитов.
Результаты работы сервиса FATCAT:
длина выравнивания – 173 позиции,
RMSD = 0.47,
Последовательности полностью идентичны.
Координаты кластеров – 2-48; 50-174.
Изображение гибкого выравнивания в PyMOL:
(зеленым цветом раскрашена цепь 2cn4_A, желтым - 1dk0_A)
Структуры в пространстве совмещаются почти полностью, попробуем
разобраться в причине их небольших отличий, она может заключаться
в конформационной подвижности белка либо в ошибках кристаллизации.
1. Обе последовательности идентичны, каждая структура состоит из
двух доменов, расположенных впритык друг к другу и занимающих
практически всю цепь, так что вариабельность конформаций невелика
(по версии БД SCOP и CATH домен и вовсе один).
2. Проверим вторую версию.
Для начала рассмотрим записи по-отдельности, запись 1dk0 содержит
идентичных полипептидных цепи, связанные с 2 молекулами гема.
2
2cn4 имеет такую же структуру, но его цепи располагаются более тесно,
переплетенно. Каждая молекула гема связана с обоими цепями.
Для проверки на предмет наличия ошибок кристаллизации поищем возможные
контакты димеров и молекул гема внутри одной ассиметричоской единицы с
белками и молекулами гема из других элементарных ячеек.
1dk0:
Каждая молекула гема связана с двумя цепями: из своей ассиметрической
единицы и из соседней.
2cn4:
Тут молекулы гема взаимодействуют с тремя цепями.
Скорее всего данное различие обуславливается ошибками кристаллизации.
Структура 2cn4 была получена на 7 лет позже (в 2006ом), так что стоит
предполагать, что более поздняя структура – более достоверная, к тому же
укладка белка,
взаимодействие между цепями димера и место связывания
молекул гема выглядят гораздо правдоподобней в 2cn4.
Подтверждение этой версии можно найти в литературе, в статье Mirjam
Czjzek и др. под названием “The Crystal Structure of the Secreted
Dimeric Form of the Hemophore HasA Reveals a Domain Swappingwith an
Exchanged Heme Ligand”, напечатанной в 2007 (т.е. через год после второй
расшифровки и публикации структуры гемафора HasA). В ней правильность
структуры 2cn4 доказывается методом ЯМР.