Горностаева ЕА

Горностаева Елена Анатольевна
ФГБОУ ВПО Вятская государственная сельскохозяйственная
академия, г. Киров, Россия
Научный руководитель: Домрачева Л.И., д.б.н., профессор ВГСХА,
ЦИАНОБАКТЕРИИ NOSTOC LINCKIA КАК БИОСОРБЕНТЫ И
БИОРЕМЕДИАТОРЫ
Тяжелые металлы (ТМ) – один из наиболее приоритетных
загрязнителей окружающей среды. Источником ТМ являются
промышленные предприятия, транспорт, сельское хозяйство и др. При
этом выброс ТМ может иметь протяженность до 30–40 км [2]. Высокие
концентрации ТМ наблюдаются не только в почве техногенных
территорий, но и в агросистемах, мигрируя в растения, в том числе и
товарную часть. Поэтому чрезвычайно актуальна проблема, связанная с
биоремедиацией почв, загрязненных ТМ, в частности, поиска
микроорганизмов, которые выполняли бы защитные функции.
Цианобактерии (ЦБ) – распространенная группа микроорганизмов,
которая встречается и в воде, и в почве, способная к фотосинтезу и
азотфиксации. Это древнейшие организмы, которые могут адаптироваться
к экстремальным условиям благодаря своим биохимическим и
физиологическим свойствам и возможности аккумулировать и
обезвреживать различные ксенобиотики. Не случайно в химически
загрязненных почвах наблюдается феномен цианофитизации альго-цианобактериальных комплексов [1, 3].
Цель: показать биосорбционные и биоремедиационные способности
ЦБ Nostoc linckia.
Задачи: 1. Показать физиологический отклик ЦБ N. linckia на
действие ТМ; 2. Указать на сорбционные возможности N. linckia;
3. Доказать эффективность цианобактериальной обработки семян при
фиторемедиации почв, загрязненных ТМ.
Для данных опытов был использован штамм ЦБ Nostoc linckia
(Roth.) Born and Flah. № 271 из музея фототрофных микроорганизмов
кафедры биологии растений, селекции и семеноводства, микробиологии
Вятской ГСХА.
Физиологический отклик исследуемой ЦБ N. linckia на действие
меди и никеля определяли интенсивностью биохемилюминесценции
(БХЛ). Измерения проводились на биохемилюминометре БХЛ-07 на базе
ФГБУН «Кировского НИИ гематологии переливания крови Федерального
медико-биологического агентства» [5].
Предварительно выращивали
культуру на среде Громова №6 без азота в течение 2-х месяцев в
люминостате при постоянной температуре (+25°С) и 12-ти часовом
освещении (3000 лк). Перед использованием культуру разбивали на
гомогенизаторе при 9000 об./мин в течение 5 минут. Определяли
оптимальный титр. Контакт с Cu (II) составлял 12 часов. Вели определение
хлорофилла а спектрометрическим методом по монохроматической
методике [6]. В следующем опыте выявляли действие Cu в области
концентраций близких к ПДК. Для этого в культуру ЦБ с титром,
определенным в предыдущем опыте, добавляли CuSO4•5Н2О так, чтобы
концентрация ТМ составляла 0,1, 0,2, 0,4, 0,8, 1,0 мг/л. В третьем опыте
расширяли область концентраций ТМ и экспериментировали с различным
времени экспозиции – 12 и 24 ч, а концентрации – 0,1, 1, 10 мг/л.
Для опыта был установлен оптимальный титр ЦБ, являющийся
наиболее чувствительным и, соответственно, показательным при
концентрации меди 2 мг/л. Определение хлорофилла а у ЦБ показало
зависимость концентрации хлорофилла а от титра клеток: с уменьшением
титра – уменьшается количество хлорофилла. Так, при максимальном
титре концентрация хлорофилла а равна 34 мг/мл, при 0,61⋅109 кл/мл –
20,2 мг/л, при 0,31⋅109 кл/мл – 12,5 мг/л, при 0,15⋅109 кл/мл - 5,24 мг/л, а
при самой малой концентрации ЦБ – 2,71 мг/л. В результате, по
интенсивности БХЛ (свечение минимальное – 486±8 мВ) и содержанию
хлорофилла а, был выбран оптимальный титр – 0,15⋅109 кл/мл. В
следующем опыте было выявлено действие меди на ЦБ в области
концентраций близких к ПДК (ПДК=0,1 мг/л). В ходе увеличения
концентраций от 0,1 до 1,0 мг/л в целом не прослеживается увеличение
БХЛ. К примеру, при концентрации меди в растворах, равной 0,1 и 1,0
мг/л, люминесценция составляет 1720±49 и 2021±36 мВ соответственно,
причем свечение культуры без токсиканта равно 1869±67 мВ.
Концентрация 0,2 мг/л оказалась наиболее токсичной даже более высоких
концентраций Сu, а концентрация 0,4 мг/л вызывает усиление БХЛ.
Поскольку в изученных интервалах низких концентраций ТМ не
обнаружено закономерностей в интенсивности БХЛ, то в третьем опыте
мы взяли более широкий диапазон концентраций. Так, при концентрации
0,1 мг/л наблюдалось увеличение БХЛ через 24ч, а при концентрации 1 и
10 мг/л увеличении времени экспозиции уменьшало максимальную
интенсивность БХЛ. В среднем, общий уровень свечения ЦБ через 12 ч
выше, чем в контроле. Проследить общее уменьшение БХЛ можно по
данным через 24 ч, где значение планомерно уменьшается с увеличением
концентраций ТМ.
В следующей серии модельных опытов изучали сорбционные
способности N. linckia к действию ионов Ni (II) (в виде соли NiSO4⋅7 H2O)
с концентрацией 2 и 20 мг/л. Уровень извлечения никеля из жидкой среды
определялся методом атомно-адсорбционной спектроскопии (ААС) на базе
экоаналитической лаборатории ВятГГУ [4]. Через 14 суток экспозиции ЦБ
в загрязненной среде наблюдалась определенная тенденция в поведении
ЦБ на поглощение Ni (II) из культуральной среды – чем выше
первоначальная концентрация поллютанта, тем полнее его извлечение из
среды биомассой ЦБ – 1,307±0,366 и 8,225±2,333 мг/л при 2 и 20 мг/л
соответственно. Таким образом, уровень биосорбции Ni может достигать
почти 60% (при концентрации в среде ТМ 20 мг/л). Следовательно, ЦБ
N. linckia обладает высокой сорбционной активностью.
Доказав высокий уровень сорбционных возможностей N. linckia по
отношению к Cu и Ni, в следующей серии опытов провели
предварительную цианобактериальную инокуляцию семян горчицы
(Sinapis alba L.) трехнедельной культурой ЦБ. Полевой опыт был заложен
на опытном поле ВГСХА в 2012 г. Фоновое содержание ТМ в почве в
контрольных вариантах составило 0,22±0,02 мг/кг. Почва на данной
территории дерново-подзолистая, среднесуглинистая: рН – 5,3, гумус – 1,
74%. Площадь учетной делянки – 0,24 м2. Повторность опыта 3-х кратная.
Инокулят
доводили
до
титра
8,3·108
кл/мл
разбавлением
дистиллированной водой. Перед посевом семена предварительно
замачивали в инокуляте в течение 12 ч. Уборку урожая проводили через 11
недель после посева. В качестве поллютанта использована медь в виде
соли (CuSO4·5Н2О) в различных концентрациях – 3; 150; 300 мг/кг, что
соответствует 1; 50; 100 ПДК для почвы. Водные растворы токсикантов
вносили в почву после посадки семян, проливая 10-15 см верхнего
горизонта. Были выделены контрольные варианты для каждой серии
опытов. Это варианты, в которых обработка семян ЦБ не проводилась или,
в соответствующих вариантах, проводилась. Во всех случаях воздействия
ТМ на данные участки не было. Содержание ТМ в почве, семенах и
вегетативной массе определяли методом ААС на базе экоаналитической
лаборатории ВятГГУ [4].
Содержание Cu в вегетативной массе не превышает значения ПДК
почти во всех вариантах, в отличие от семян. Необходимо заметить, что Cu
перераспределяется в наземной части растения неравномерно, особенно
концентрируясь в семенах. Данный факт подтверждается и литературными
данными. Значения в контроле говорят о протекторном действии ЦБ
N. linckia. К примеру, в семенах в вариантах без обработки ЦБ показатель
равен 3,6 мг/кг, тогда как с обработкой – 2,5 мг/кг. В вегетативной массе
обработка семян горчицы ЦБ привела к наибольшему запасанию ТМ. При
концентрации в почве на уровне 1 ПДК защитного эффекта не
проявляется. Наоборот, идет некое запасание Cu, что особенно
прослеживается в вегетативной массе: без обработки ЦБ – 2,3 мг/кг, с
обработкой – 2,9 мг/кг. При концентрации ТМ, равной 150 мг/кг,
отмечается защитный эффект ЦБ, как в семенах, так и в вегетативной
массе. К примеру, в семенах данные наиболее показательны - 4 мг/кг без
обработки ЦБ и 1,9 мг/кг с обработкой N. linckia. Не исключено, что это
наиболее «удобная» концентрация для биологических реакций в клетке
ЦБ, и в силу этого и происходит протекторное действие N. linckia по
отношению к ТМ.
Рис.1. Содержание меди в семенах и вегетативной массе горчицы, мг/кг
Извлечение меди из почвы горчицей наблюдается и при
концентрации 300 мг/кг. Похожая реакция была заметна и при 1 ПДК. Но в
данном случае четко обнаруживается реакция растения на обработку
N.linckia, а именно содержания ТМ в семенах: 3 мг/кг без обработки и 3,9
мг/кг с обработкой семян ЦБ. Возможно, такая высокая концентрация
поллютанта влияет на проницаемость корней для ТМ, где ЦБ, вероятно,
служат каналом для проведения меди в растение. Наиболее тесная
корреляция наблюдается в случае без обработки горчицы ЦБ, как в
вегетативной массе, так и семенах (r = 0,7). Что касается вариантов с
инокуляцией семян горчицы в цианобактериальной массе, то в обоих
вариантах коэффициент корреляции Пирсона равен 0,2. Это означает, что
N.linckia оказывает неоднозначное влияние на Sinapis alba, то обеспечивая
защитную функцию растению, то, наоборот, усиливая всасывание меди в
наземную часть растения.
Данная работа выполнялась в течение одного учебного года
аспирантуры. Принималось непосредственное участие в выполнении или
пробоподготовке во всех описанных методиках.
Выводы: 1. Не обнаружено закономерных различий в интенсивности
БХЛ при воздействии меди в интервалах низких концентраций. При более
широком диапазоне концентраций ТМ можно проследить общее
уменьшение БХЛ через 24 ч, где оно планомерно уменьшается с
увеличением концентраций ТМ. Следовательно, в дальнейшем
используемый штамм ЦБ возможно использовать для биотестирования и
биоиндикации техногенных территорий; 2. Благодаря высокому уровню
сорбции N. linckia по отношению к Ni ЦБ можно рассматривать как
перспективный объект для разработки методов цианобактериальной
очистки жидкостей от ТМ; 3. Полевой опыт показал, что содержание меди
в семенах во всех случаях больше, чем в вегетативной массе. При
концентрации 150 мг/кг, как и в контроле, наблюдается протекторное
действие со стороны N. linckia. На уровне 1 и 100 ПДК отмечено
увеличение извлечения Sinapis alba в комплексе с ЦБ ионов меди (II).
Данный факт говорит об усилении фиторемедиационных способностей
растения. Отсюда следует, что данные микроорганизмы являются
перспективными объектами для ремедиации почв, загрязненных ТМ.
Список использованных источников:
1.
Домрачева Л.И., Кондакова Л.В., Зыкова Ю.Н., Ефремова В.А.
Альго-циано-микологические комплексы городских почв // Особенности
урбоэкосистем подзоны южной тайги Европейского Северо-Востока / под.
ред. Ашихминой Т.Я., Домрачевой Л.И – Киров: Изд-во ВятГГУ.
2012. С. 282.
2.
Ильин В.Б., Сысо А.И. Микроэлементы и тяжелые металлы в почвах
и растениях Новосибирской области. Новосибирск: Изд-во СО РАН, 2001.
3.
Кабиров Р.Р., Гайсина Л.А., Сафиуллина Л.М. Использование
универсальных критериев при оценке эколгического состояния почвенных
альгоценозов // Экология. 2-10. №4. С.226-270.
4.
Методика выполнения измерений массовых долей токсичных
металлов
в
пробах
почв
атомно-абсорбционным
методом.
ФР.1.31.2007.04106. М.С.13.
5.
Руководство по эксплуатации биохемилюминометра БХЛ-07.
Нижний Новогород, 2007.С.35.
6.
Standard procedure for the determination of chlorophyll a by
spectroscopic methods. Institute of Marine Research. Norway. P.25.
Публикации по данной тематике:
1. Фокина А.И., Злобин С.С., Березин Г.И., Зыкова Ю.Н., Огородникова
С.Ю., Домрачева Л.И., Ковина А.Л., Горностаева Е.А. Состояние
цианобактерии Nostoc linckia в условиях загрязнения среды никелем и
нефтепродуктами и перспективы её использования в качестве биосорбента
// Теор. и прикл. экология. 2011. №1. С.69-75.
2. Горностаева Е.А., Фокина А.И., Лаптев Д.С., Огородникова С.Ю.,
Жаворонков В.И.Влияние ионов меди (II) на биохемилюминесценцию
почвенных цианобактерий // Адаптационные реакции живых систем на
стрессорные воздействия. Материалы Всероссийской молодежной
конференции с 23-26 апреля 2012. С.114-120.