ВОЗРАСТНАЯ ДИНАМИКА ЧАСТОТЫ СТАБИЛЬНЫХ

ВОЗРАСТНАЯ ДИНАМИКА ЧАСТОТЫ СТАБИЛЬНЫХ
ХРОМОСОМНЫХ АБЕРРАЦИЙ У ЧЕЛОВЕКА И ЕЕ СВЯЗЬ С
ЕСТЕСТВЕННЫМ И ПАТОЛОГИЧЕСКИМ СТАРЕНИЕМ
И.Е.Воробцова,1 А.В.Семенов,1 А.Ю.Канаева,1 И.А.Петрова,1
Н.М.Плескач,2 И.М.Спивак,2 Г.А.Тимонина,2 В.В.Прокофьева,2
Н.М.Ярцева,2 В.М.Михельсон2
1
Центральный научно-исследовательский рентгенорадиологический
институт МЗ РФ и 2Институт цитологии РАН
Санкт-Петербург
электронный адрес: mikhels@mail.cytspb.rssi.ru
Частота стабильных хромосомных аберраций (СХА), т.е. аберраций, не
препятствующих прохождению митоза и сохраняющихся в ряду клеточных
поколений, рассматривается как объективный показатель биологического
возраста человека (Tucker, Preston, 1996; Воробцова и др., 1999, 2000).
Возможно, и само накопление СХА играет определенную роль в развитии
процессов старения. В настоящей работе исследовалась возрастная динамика
накопления СХА в лимфоцитах периферической крови человека в норме, у
лиц, подвергавшихся неконтролируемому воздействию небольших доз
ионизирующей радиации (ликвидаторы аварии на Чернобыльской АЭС,
участники испытаний ядерного оружия, и др.), а также при двух формах
наследственного преждевременного старения.
Материал и методики
В работе использованы краткосрочные культуры лимфоцитов
периферической крови 150 здоровых доноров в возрасте от 3 до 85 лет и 110
лиц от 8 до 85 лет, подвергавшихся в разные сроки до взятия крови
облучению относительно небольшими (неконтролируемыми) дозами
ионизирующей радиации при Чернобыльской аварии в 1986-88 гг., при
испытаниях ядерного оружия на Семипалатинском полигоне в 1960-е гг. и на
предприятии «Маяк» на Южном Урале в 1950-е гг. Исследовались также
лимфоциты
трех
больных
двумя
формами
наследственного
преждевременного старения – синдромом Вернера (2 больных в возрасте 26 и
30 лет, в т.ч. клетки иммортализованной лимфобластоидной линии) и
синдромом Хатчинсона-Гилфорда (1 больная в возрасте 12 лет).
Частоту СХА определяли методом флуоресцентной гибридизации in
situ – FISH-методом (Schmid et al, 1992; Bauchinger et al., 1993). Использовали
биотинилированные ДНК-зонды, специфичные к цельным хромосомам
человека 1, 4 и 12, а также меченные дигоксигенином ДНК-зонды к
центромерным участкам хромосом. Хромосомы-мишени окрашивали
конъюгатом стрептавидин-флуоресцеин-изотиоцианата (FITC), усиливая
окраску последовательными сменами FITC и биотинилированного
антистрептавидина. Для контрастирования использовали пропидиум иодид
2
(PI) в растворе, предотвращающем быстрое выцветание препарата при
микроскопировании в УФ лучах. Панцентромерные зонды выявляли с
помощью
последовательной
обработки
препаратов
мышиными
антидигоксигениновыми антителами, крысиным антимышиным IgG,
меченным метил-курамин-3-уксусной кислотой (AMCA), и мышиным
антикрысиным IgG, меченым АМСА. Анализ препаратов проводили на
флуоресцентном микроскопе Axioplan (Carl Zeiss, Германия) с набором
фильтров, позволяющим одновременно выявлять флуоресценцию FITC и PI,
а также FITC и АМСА, либо только PI-флуоресценцию. В результата
гибридизации гомологичные пары хромосом 1, 4 и 12 выглядели на
препаратах желтыми на фоне остальных красных хромосом, окрашенных PI.
Центромерные участки всех хромосом окрашивались в голубой цвет. Обмен
участками регистрировали по появлению двухцветных структур:
транслокаций, инсерций и дицентриков, различающихся по числу голубых
центромерных участков; ацентрические фрагменты не содержали голубой
окраски. Поскольку при FISH-анализе регистрируется лишь часть обменных
событий, для сопоставления зависимостей возраст – эффект для
транслокаций, выявляемых этим методом, производили перерасчет
наблюдаемой частоты обменных аберраций с участием хромосом-мишеней
на геномную частоту (Fg), для чего наблюдаемое количество транслокаций
относили к «клеточному эквиваленту», рассчитываемому по формуле Лукаса
(Lucas et al., 1992): N ·2fp(1-f p), где N – число проанализированных клеток, f p
– доля ДНК генома, которую покрывают хромосомы-мишени (Mendelsohn et
al., 1973). При этом исходили из того, что участие каждой хромосомы в
обменах случайно и пропорционально содержанию в ней ДНК.
Статистический анализ полученных данных проводили на компьютере с
помощью статистических пакетов с использованием дисперсионного и
регрессионного анализов.
Окраску хромосом на G-сегменты проводили модифицированным
методом Сиабрайта (Seabright, 1975). Препараты метафазных хромосом
периферических лимфоцитов крови, предварительно высушенные при 60°С в
течение 2-24 час, обрабатывали 1.5 мин 0.02%-ным раствором трипсина
(Difco) и окрашивали 3-5 мин 2%-ным раствором Гимза (Merc) на фосфатном
буфере (рН 6.8). Было просмотрено 80 метафазных пластинок из
лимфоцитов, полученных от больной синдромом Хатчинсона-Гилфорда и 50
– от ее матери. Для исследования кариотипа детально проанализированы 10
метафазных пластинок больной, окрашенных на G-сегменты, и столько же –
ее матери. (а что делали с остальными 70 и 40 метафазами, м.б. не стоит
обозначать, сколько всего просмотрено)
Результаты и обсуждение.
В клетках здоровых доноров частота СХА, выявляемых FISH-методом,
увеличивалась с возрастом (табл.1).
3
Таблица 1. Возрастная динамика СХА в лимфоцитах здоровых доноров.
Возраст, Количество
Количество
Количество
Геномная
лет
обследованных
клеток
СХА
частота СХА,%
0-19
18
7296
11
0.15±0.05
20-29
38
26780
115
0.43±0.04
30-39
29
19463
146
0.75±0.06
40-49
28
21959
196
0.89±0.06
50-59
24
16024
174
1.09±0.08
60-85
13
7695
118
1.53±0.14
Аналогичная возрастная динамика частоты СХА наблюдалась и в
лимфоцитах лиц, подвергавшихся в прошлом (от 15 до 40 лет назад)
неконтролируемому действию ионизирующей радиации (табл.2).
Таблица 2. Возрастная динамика СХА в лимфоцитах людей, подвергшихся
неконтролируемому облучению в малых дозах.
Возраст, Количество
Количество
Геномная
Отличие от
лет
обследованных
клеток
частота СХА, % контроля
0-19
6
1923
0.65±0.16
р<0.05
20-29
38
26780
0.80±0.08
р<0.05
30-39
29
19463
1.00±0.08
р<0.10
40-49
28
21959
1.44±0.12
р<0.05
50-59
24
16024
1.72±0.25
р<0.05
60-76
13
7695
2.85±0.31
р<0.05
Видно, что во всех возрастных группах облучавшихся в прошлом лиц
частота СХА достоверно выше, чем в соответствующих контрольных (не
облучавшихся) группах. Регрессионный анализ полученных данных методом
наименьших квадратов показал, что динамика возрастного накопления СХА
удовлетворительно описывается квадратичной функцией и имеет следующий
вид:
для контрольной выборки – y = (0.23±0.04)+(0.31±0.04)*10^-3х^2;
для облученной выборки – y = (0.42±0.11)+(0.51±0.06)*10^-3х^2,
где у – геномная частота СХА в процентах, х – возраст донора в годах.
Соответствующие кривые представлены на рис. 1. Видно, что кривая
возраст-эффект в облученной группе проходит выше и под бòльшим углом
наклона к оси абсцисс, чем в контрольной группе. Квадратичный характер
зависимости частоты СХА от возраста свидетельствует о том, что
хромосомные повреждения, в том числе и индуцируемые радиационным
воздействием, не просто накапливаются с возрастом, ибо в этом случае
зависимость должна была быть линейной. По-видимому, с возрастом
происходит прогрессирующее снижение стабильности хромосомного
аппарата, а предшествующее облучение ускоряет этот процесс. Медикобиологические данные, полученные на ликвидаторах последствий аварии на
4
ЧАЭС, свидетельствуют о том, что у них раньше, чем в среднем по
популяции возникают отклонения в состоянии здоровья, рассматриваемые
как старческие – атеросклероз, болезни опорно-двигательного аппарата,
аутоиммунные заболевания и др. (Заманова Л.В., 1999; Никифорова и соавт.,
2001). Если, как следует из представленных результатов по контрольной
выборке, частота СХА является показателем биологического возраста, то
можно также прийти к выводу о том, что облучённые люди одинакового с
необлучёнными календарного возраста, являются более пожилыми. В
литературе имеется лишь несколько публикаций по возрастной зависимости
частоты СХА, выявляемых FISH-анализом, в ходе естественного старения
(Tucker et al., 1994; Ramsey et al., 1995). Эти работы были выполнены на
меньших по величине выборках и в более узком возрастном диапазоне.
Аналогичные исследования облученных доноров выполняются лишь в одном
из наших коллективов (Воробцова, Богомазова, 1995).
Если частота СХА увеличивается с возрастом, логично было
предположить, что она будет повышена у людей с синдромами
наследственного преждевременного старения. Результаты, полученные на
лимфоцитах больных различными формами прогерий, оказались
неоднозначными. Частота СХА в лимфоцитах 28-летнего больного А.Г. с
синдромом Вернера, оцененная по контрольной калибровочной кривой
возраст-эффект (Vorobtsova et al., 2001), соответствует возрасту 56±4 года. В
клетках иммортализованной лимфобластоидной линии, полученной от 30летней больной Л.Ф. с тем же синдромом, но более легким течением, частота
СХА соответствует возрасту 48±4 года. В то же время, в клетках 12-летней
больной А.Р., страдающей другой формой прогерии – синдромом
Хатчинсона-Гилфорда, частота СХА не превышает возрастную норму для
здоровых лиц (табл.3).
Таблица 3. Частота СХА при различных синдромах наследственного
преждевременного старения.
Форма
Хромосомы- Количество Количество
прогерии
мишени
клеток
клеточных
СХА, %
эквивалентов
Синдром
1, 4, 12
2342
637
1.88±0.54
Вернера (А.Г.)
Синдром
1, 4, 12
2061
639
0.94±0.38
Вернера (Л.Ф.)
Синдром
1, 4, 8
4074
1344
0.07±0.07
ХатчинсонаГилфорда (А.Р.)
Цитогенетический анализ при окрашивании на G-сегменты хромосом
лимфоцитов больной синдромом Хатчинсона-Гилфорда А.Р., как и ее матери,
показал нормальный кариотип 46,ХХ (рис. 1). Можно отметить, что у
5
пробанда область центромерного гетерохроматина одного из гомологов
хромосомы 9 – локус q12 – существенно увеличена. Один из гомологов
хромосомы 9 в кариотипе матери также имеет увеличенный локус q12.
Впрочем, гетероморфизм центромерного гетерохроматина гомологов
хромосом 1, 9 и 16 вообще характерен для клеток человека в норме, имеет
достаточно широкие пределы вариабельности и наследуется (ПрокофьеваБельговская, 1986). Т.о., отсутствие возрастного повышения частоты СХО в
лимфоцитах больной синдромом Хатчинсона-Гилфорда нельзя объяснить
особенностями кариотипа.
Частота СХА, выявляемых FISH-методом в клетках больных
синдромами наследственного преждевременного старения – прогериями,
изучалась впервые. При синдроме Вернера – прогерии взрослых –
повышенная частота СХА четко показана как в настоящей, так и в одной из
наших предшествующих работ (Ковина и др., 2002). Однако, при синдроме
Хатчинсона-Гилфорда – прогерии детей – очевидное преждевременное
старение, по нашим данным, не сопровождалось повышением частоты СХА.
Возможно, это связано с тем обстоятельством, что в молодом возрасте, как в
норме (см. рис.), так, видимо, и при прогериях, накопление СХА происходит
относительно медленнее, чем в более зрелом возрасте. Необходим
мониторный цитогенетический анализ обследованного пробанда, а также
других больных прогериями для объяснения полученных в настоящей работе
результатов.
Литература
Заманова Л.В. Организационно-методические основы мониторинга за
состоянием здоровья участников ликвидации последствий аварии на
Чернобыльской атомной электростанции в условиях мегаполиса. // Автореф.
дис. канд. мед. наук. Санкт-Петербург. 1999. 22 с.
Никифорова И.Д., Шантырь И.И., Тютин Л.А. и др. Заболеваемость
костно-мышечной системы и минеральная плотность костной ткани у
ликвидаторов аварии на Чернобыльской АЭС. // Мед. радиол. и радиац.
безопас. 2000. Т.45. №6. С.14-20.