Кафедра химии - Белорусская государственная
реклама
МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА И ПРОДОВОЛЬСТВИЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ ДЕПАРТАМЕНТ ОБРАЗОВАНИЯ, НАУКИ И КАДРОВ БЕЛОРУССКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ Кафедра химии БЕЛКИ И ПЕПТИДЫ МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ДЛЯ ЛАБОРАТОРНЫХ РАБОТ ПО ОРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ Для студентов агроэкологического, агрономического и зооинженерного факультетов Горки 2003 Одобрено методической комиссией агроэкологического факультета 06.01.2003. Составили: А. Р. Ц Ы Г А Н О В, В. М. М И Н О В, В. И. К А Л Ь, М. Н. Ш А Г И Т О В А. УДК 547(072) Белки и пептиды: Методические указания / Белорусская государственная сельскохозяйственная академия; Сост. А. Р. Ц ы г а н о в, В. М. М и н о в, В. И. К а л ь, М. Н. Ш а г и т о в а. Горки, 2003. 28 с. Дана общая характеристика и классификация белков, методы установления строения белков (гидролиз, методы установления первичной структуры, методы изучения пространственной структуры). Приведено описание экспериментальных работ по приготовлению и изучению химических свойств белков, а также опыты цветных реакций белков. Для студентов агроэкологического, агрономического и зооинженерного факультетов. Рецензент Н. К. ЗАКРЕВСКАЯ. Составление. А. Р. Ц ы г а н о в, В. М. М и н о в, В. И. К а ль, М. Н. Ш а г и т о в а, 2003 Белорусская государственная сельскохозяйственная академия, 2003 2 1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА. КЛАССИФИКАЦИЯ Характерная особенность структуры белков и пептидов заключается в том, что они состоят из аминокислот, соединенных между собой пептидными связями. Пептиды классифицируются в соответствии с числом аминокислотных остатков в цепи и называются так, как производные аминокислоты, которой заканчивается цепь с карбоксильной стороны. Между белками и пептидами трудно провести четкую границу. Согласно одному из возможных способов классификации, белками называют только те соединения, молекулярная масса которых превышает 10000. Классификация может основываться и на различиях в физических свойствах при учете гидратации и конформационных отношений. Встречающиеся в природе пептиды имеют сравнительно короткие подвижные цепи, и хотя они гидратируются в водных растворах, этот процесс обратим. В то же время в белках содержатся очень длинные цепи, которые могут быть свернуты и изогнуты самыми различными способами. Молекулы воды заполняют промежутки между цепями. При нагревании или под действием органических растворителей, солей и т. д. молекулы белка претерпевают более или менее необратимые изменения, называемые денатурацией. При этом изменяются как конформационные отношения в цепях, так и степень гидратации. Результатом обычно оказывается понижение растворимости и потеря способности к кристаллизации. В этом плане сущность различий между белками и пептидами заключается в следующем: если воспроизвести последовательность аминокислот природного пептида, то природные и полученные синтетическим путем вещества будут идентичными в отношении их химических и физиологических свойств. В то же время синтез природного белка предполагает не только воспроизведение входящих в его состав пептидных цепей, но также воспроизведение конформационных особенностей и характера гидратации цепей. В сложной молекуле белка аминокислоты связаны между собой посредством амидных связей, образованных карбоксилом одной моле3 кулы аминокислоты и аминогруппой другой (поликонденсация типа «голова-хвост»). Например. О H2N–CH2–C ОН глицин О + CH3–CH–C H 2O NH2 OH аланин O О H2N–CH2–C–NH–CH–C . CH3 глицилаланин OH Амидные связи этого типа называются пептидными связями, а низкомолекулярные соединения, в которых аминокислоты соединены друг с другом пептидными связями, принято называть пептидами. В зависимости от числа аминокислотных остатков, входящих в молекулу полипептида, различают дипептиды, трипептиды, тетрапептиды О и т. д. Характерную для пептидов группировку –С–NH– называют пептидной. К настоящему времени разработано много методов превращения -аминокислот в пептиды и синтезированы простейшие природные белки: инсулин, рибонуклеаза, вазопрессин, окситоцин и др. В природе встречаются пептиды различных типов, однако, значительная часть пептидов, структуры которых были установлены, содержат одну или большее число аминокислот, не входящих в состав белков. Так, в некоторых случаях в состав пептидов входят даже Д-аминокислоты. Большинство наиболее хорошо исследованных пептидов содержит от трех до десяти аминокислотных остатков. Свойства пептидов и белков зависят не только от числа и типа входящих в их состав аминокислот, но также от последовательности, в которой аминокислоты соединены между собой. Особый характер белка связан не только с длиной и сложностью входящих в его состав пептидных цепей, но также и с тем способом, которым живые организмы синтезируют его в специфических, зачастую метастабильных конформациях и с различной степенью гидратации. Значительное влияние было уделено исследованию возможных способов расположения пептидных цепей, приводящих к устойчивым конформациям. Было показано, что наиболее выгодным расположением, которое осуществляется во многих пептидах и белках, является -спираль. Главная особенность -спирали заключается в том, что пептидные цепи свиты таким образом, что возможно образование водородных связей между амидными водородами и карбонильными группами, разделенными четырьмя пептидными связями. Водородные связи почти параллельны основной оси спирали, а боковые группы 4 аминокислот лежат на внешней стороне спирали. В структуре любого белка имеется три степени усложнения. Первичная структура представляет собой специфическую последовательность аминокислот полипептидной цепи. Вторичная структура определяется способом, которым скручена цепь. В частности, последняя может образовывать -спираль. Третичная структура – это способ, которым свернутая в спираль цепь (цепи) изогнута и гидратирована в природном (нативном) белке. Для молекул белков, состоящих из нескольких полипептидных цепей, рассматривают и так называемые четвертичные структуры, определяющие тип взаимодействия между отдельными цепями. Белки, дающие при гидролизе исключительно аминокислоты, называются простыми (протеинами). В зависимости от их свойств и биологических функций белки подразделяются на множество подгрупп. 1. Альбумины растворимы в воде, свертываются при нагревании, нейтральны, сравнительно трудно осаждаются растворами солей. Примерами их могут служить альбумин белка куриного яйца, альбумин кровяной сыворотки, молочный альбумин. 2. Глобулины нерастворимы в воде, но растворяются в очень слабых растворах солей. Более концентрированными растворами солей они вновь осаждаются. Осаждение происходит при меньшей концентрации, чем та, которая необходима для осаждения альбуминов. Эти белки являются очень слабыми кислотами. Примерами глобулинов могут служить фибриноген, глобулин кровяной сыворотки, глобулин мышечной ткани, глобулин белка куриного яйца. Таким образом, в белке куриного яйца, в крови, в мышечной ткани находятся и глобулины и альбумины. Из глобулинов состоят и многие растительные белки. 3. Гистоны – белки основного характера. Они содержатся в нуклеопротеидах лейкоцитов и красных кровяных шариках. 4. Протамины не содержат серы, обладают сравнительно сильными основными свойствами, дают кристаллические соки. Они содержатся (в составе нуклеопротеидов) в сперматозоидах рыб и считаются простейшими из белковых веществ. 5. Проламины содержатся в зернах различных хлебных злаков. Замечательной их особенностью является растворимость в 80%-ном спирте. Представителем этих белков может служить глиадин, составляющий главную часть клейковины. 6. Склеропротеины – это нерастворимые белки, из которых состоят наружные покровы тел животных, они содержатся также в ске5 лете и в соединительной ткани. К ним относятся кератин, коллагены, эластин, фиброин. Кератин является главной составной частью волос, рогов, копыт, ногтей, перьев, верхнего слоя кожи. Скорлупа куриного яйца состоит из извести и кератина. Если растворить известь скорлупы яйца в кислоте, то остается мягкая пленка, состоящая из кератина. Кератин богат серой. Коллагены содержатся в хрящах, т. е. из них состоит соединительная ткань. Кости позвоночных животных состоят из неорганических веществ (фосфата и карбоната кальция), жира и коллагенов. Эластин входит в состав сухожилий и других эластичных соединительных тканей. Нити сырого шелка состоят из белкового вещества – фиброина, покрытого серицином – белковым веществом, играющим роль шелкового клея. При кипячении с водой шелк освобождается от серицина, который при этом переходит в раствор. Сложные белки, или протеиды, являются соединениями белков с небелковой частью. В зависимости от природы небелковой части различают следующие подгруппы протеидов. 1. Фосфоропротеиды. В их состав входит фосфорная кислота. Они в противоположность протаминам, обладающим основными свойствами, имеют кислотный характер. Главным представителем фосфопротеидов является казеин молока. Он обладает настолько явно выраженным кислотным характером, что разлагает углекислые соки с выделением двуокиси углерода. Казеин растворяется в слабых растворах щелочей, образуя с ними соли. Так, в молоке казеин содержится в виде кальциевой соли. 2. Нуклеопротеиды содержатся в клеточных ядрах. При осторожном гидролизе они расщепляются на белки и нуклеиновые кислоты. 3. Хромопротеиды – сочетание белков с окрашенными веществами. Из хромопротеидов наиболее изучен гемоглобин – красящее вещество красных кровяных шариков. Значение гемоглобина в жизни человека и животных очень велико. Он играет роль переносчика кислорода от легких к тканям. Кроме того, гемоглобин вместе с плазмой крови осуществляет регуляцию рН крови и перенос углекислоты в организме. 4. Гликопротеиды встречаются в слизистых выделениях животных организмов и обусловливают свойство этих выделений вытягиваться в нити даже при сравнительно большом разбавлении. Эти белки образуются в подчелюстной железе, печени, железах желудка и кишечника. 6 Исследованные представители гликопротеидов являются сочетанием белков с олиго- и полисахаридами. 5. Липопротеиды – соединения белков с веществами, родственными жирам (фосфатидами, сфингомиелинами, а также полиеновыми пигментами типа каротина). К белкам этого типа относится, например, зрительный пурпур сетчатки глаза. При гидролизе липопротеиды распадаются на белок и растворимые в эфире жиры, лецитин и другие фосфатиды. 2. ПОНЯТИЕ О МЕТОДАХ УСТАНОВЛЕНИЯ СТРОЕНИЯ БЕЛКОВ 2.1. Гидролиз белков С целью изучения аминокислотного состава белка необходимо разрушить пептидные связи, которыми аминокислоты соединены друг с другом в пептидной цепи белка. Для расщепления пептидных связей в белках проводят кислотный или щелочной гидролиз, который протекает в довольно жестких условиях и сопровождается качественными изменениями в структуре некоторых аминокислот. При гидролизе происходит постоянное разрушение белка: белок пептоны полипептиды дипептиды смесь аминокислот. Для кислотного гидролиза применяют концентрированные минеральные кислоты, чаще всего 6н. соляную кислоту. Полный гидролиз происходит при кипячении белка с 20-200 кратным избытком соляной кислоты. С целью уменьшения разложения аминокислот нагревание ведут в запаянной ампуле, в которой имеется вакуум, при 105°С продолжительностью 12-48 ч. По окончании гидролиза соляную кислоту удаляют в вакууме, а аминокислоты выделяют в виде хлоридов. Иногда для гидролитического расщепления белка применяют и серную кислоту. При гидролизе соляной или серной кислотой полностью разрушается триптофан и частично серин, треонин, цистин. Чтобы уменьшить или предотвратить разложение этих аминокислот, можно использовать другие гидролизующие реактивы: йодистоводородную кислоту, жидкий сернистый ангидрид, щавелевую кислоту и др. Щелочной гидролиз белка обычно проводят при кипячении с 4-5н. NаОН в течение 6-24 ч. Удобно применять гидроксид бария, который затем может быть удален осаждением серной кислотой. 7 Щелочной гидролиз белков применяют редко из-за значительной деструкции аминокислот и образования побочных продуктов. Аминокислотный состав белков. Для установления аминокислотного состава белка необходимо аминокислоты, содержащиеся в белковом гидролизате, разделить и количественно определить каждую из них. Для этой цели применяют следующие методы: ионообменную хроматографию, бумажную хроматографию, электрофорез и газожидкостную хроматографию. Ионообменная хроматография. Лучшим методом анализа аминокислотного состава белковых гидролизатов является хроматографическое фракционирование на колонках с помощью сульфополистирольных катионитов. Процесс разделения и анализа смеси аминокислот осуществляется в приборе, называемом автоматическим анализатором аминокислот. В настоящее время этот прибор является непременной принадлежностью каждой химической лаборатории, изучающей белки. Сущность метода состоит в том, что белковый гидролизат, содержащий 2–3 мг смеси аминокислот, помещают в колонку с ионообменником, например с катионитом дауэкс 50х4. Колонка непрерывно промывается буфером с возрастающим рН. Элюент, вытекающий из колонки, встречается с капиллярным током нингидринового реактива и поступает затем в змеевик, где под влиянием повышенной температуры развивается голубое окрашивание. Затем элюент идет в кюветы, где измеряется его оптическая плотность. Результаты фотометрирования записываются в виде максимумов. Количественное определение аминокислот в гидролизате проводят, измеряя площадь пиков, отвечающих отдельным аминокислотам. Автоматический анализатор аминокислот позволяет точно и быстро определять аминокислотный состав белков. Полный анализ гидролизата продолжается около 24 ч. Для освоения техники работы на аминокислотном анализаторе необходимо изучить инструкции к прибору. Бумажная хроматография, электрофорез и газожидкостная хроматография обычно применяются для дополнения и уточнения результатов аминокислотного анализа, полученного при помощи автоматического анализатора. Газожидкостную хроматографию можно применять и как самостоятельный метод анализа белковых гидролизатов. Применение газожидкостной хроматографии перспективно, так как время, требуемое для проведения анализа, в этом случае сокращается и составляет не более 1 ч. С методами бумажной хроматографии, электрофореза и газожидкостной хроматографии можно познакомиться подробно в специальной литературе. 8 Результаты аминокислотного анализа белка проводят обычно в виде таблицы, где содержание аминокислот указывается в процентах или выражается числом остатков данной аминокислоты в молекуле. Например: Аминокислотный состав лизоцима из яичного белка Содержание, % Число остатков на молекулу Глицин 5,7 11,3 Аланин Валин Лейцин Изолейцин Серин Треонин Лизин 5,8 4,8 6,9 9,7 6,1 7,8 Глутаминовая кислота Цистин Метионин Фенилаланин 5,2 5,9 6,7 5,5 5,7 9,5 6,9 5,8 Аргинин 12,7 10,9 Аспарагиновая кислота 18,2 20,4 Аминокислота Содержание, % Число остатков на молекулу 4,3 4,4 6,8 2,1 3,1 5,0 2,1 2,8 Тирозин 3,6 2,9 Пролин Триптофан Гистидин Аммиак (амидный) 1,4 10,6 1,0 1,8 7,7 1,0 1,7 18,1 – – Аминокислота – 2.2. Методы установления первичной структуры белков Выяснение первичной структуры белков включает определение последовательности чередования аминокислотных остатков в полипептидной цепи белковой молекулы. 2.2.1. Определение концевых остатков аминокислот в молекулах белка Первой стадией при изучении последовательности аминокислотных остатков в молекуле белка является определение концевых остатков аминокислот в полипептидной цепи. Аминокислота со свободной -NН2-группой называется N-концевой, а аминокислота со свободной -карбоксильной группой – С-концевой. Для определения N-концевых аминокислот в молекуле белка применяют в основном три метода: фенилизотиоционатный метод Эдмана, дансильный метод Грея и Хартли и динитрофенильный метод Сенджера. 9 Фенилизотиоционатный метод Эдмана. На белок в воднодиоксановой или водно-пиридиновой среде (рН 8-9) действуют фенилизотиоционатом. Образуется производное тиомочевины, которое при действии хлористого водорода в нитрометане циклизуется с отщеплением N-концевой аминокислоты в виде фенилтиогидантоина O S O C6H5–N=C=S + NH2–CH–C–NH в цепь С6Р5–NH–C–NH–CH–C–NH в цепь R R O C–––CH–R C6H5––N NH + NH2 в цепь С S Фенилтиогидантоины выделяются из гидролизата белка и идентифицируются бумажной, тонкослойной хроматографией или по температуре плавления. Оставшуюся полипептидную цепь белка можно еще раз обработать фенилизотиоцианатом, отщепить и индентифицировать вторую аминокислоту, затем третью и т. д. В большинстве случаев удается определить последовательно до 13 остатков из N-конца и более. Сконструирован автоматический анализатор последовательности расположения аминокислот, который позволяет определить несколько десятков аминокислот с N-конца молекулы белка. Дансильный метод Грея и Хартли, а также динитрофенильный метод Сенджера, применяющиеся для определения N-концевых остатков аминокислот в белках, имеют меньшее значение. Подробно с этими методами можно познакомиться в специальной литературе. 2.2.2. Определение С-концевых аминокислотных остатков Карбоксидазный метод. Наиболее часто для определения С-концевых аминокислот применяют ферментативный метод, в котором образец подвергается действию фермента карбоксипептидазы и через определенные интервалы времени проводят хроматографирование реакционной смеси. Происходит последовательное отщепление аминокислот с С-конца полипептидной цепи белка, которые определяют хроматографически или на аминокислотном анализаторе. 10 2.2.3. Селективное расщепление молекулы белка на фрагменты На современном этапе развития методов химии белков непосредственное определение последовательности чередования аминокислот в длинных полипептидных цепях белковых молекул представляет собой трудноразрешимую задачу, поэтому белковую цепь предварительно разрушают на ряд фрагментов, которые затем определяют различными методами. Методы расщепления делятся на ферментативные и химические. Ферментативное расщепление. Протеолитические ферменты (трипсин, химотрипсин, пепсин и др.) разрушают белок по пептидным связям. Ферментативный гидролиз проходит при 37—40°С в течение нескольких часов при оптимальном для данного фермента рН. Белковая молекула гидролизуется на отдельные пептидные фрагменты. Химическое расщепление. Гидролиз белков кислотами в мягких условиях (37°С, несколько часов) дает расщепление только частично некоторых пептидных связей. Подбирая время гидролиза и концентрацию кислоты, можно регулировать процесс гидролиза и получать из белковой молекулы фрагменты различной сложности. 2.2.4. Выделение и исследование фрагментов Смесь пептидов, образовавшуюся после частичного гидролиза белка, подвергают препаративному разделению при помощи различных методов: двухмерной бумажной хроматографии, ионообменной хроматографии, бумажного электролиза и др. Каждый из выделенных пептидов изучают в отдельности. Для исследования аминокислотной последовательности удобны небольшие пептиды, содержащие от четырех до шести аминокислотных остатков. Для таких пептидов легко установить N- и С-концевые аминокислоты, применяя метод Эдмана, гидролиз карбоксипептидазой, а последовательность чередования аминокислотных остатков в этих пептидах можно установить, применяя масс-спектрометрический метод. Более крупные полипептиды обычно гидролизуют дополнительным гидролизом на более мелкие. 2.2.5. Установление всей последовательности аминокислот по фрагментам известной структуры После расшифровки строения отдельных пептидных фрагментов 11 приступают к воссозданию всей последовательности аминокислотных остатков в цепи белковой молекулы, мысленно складывая из них исходную полипептидную цепь. Например, ход установления полной последовательности аминокислотных остатков можно видеть на довольно простом примере установления первичной структуры белка -меланофорстимулирующего гормона гипофиза свиньи. Этот белок разрушается химотрипсином на четыре пептидных фрагмента. Трипсин гидролизует его с образованием трех пептидных фрагментов. После расшифровки аминокислотной последовательности этих пептидных фрагментов можно выявить перекрывающиеся пептиды из гидролизатов обоих этих ферментов и найти всю последовательность аминокислотных остатков в белке. Установление аминокислотной последовательности -меланофорстимулирующего гормона по фрагментам известной структуры. Структура ферментов Аспарагин – глицин – глутамин – пролин – тирозин (химотрипсин) Аспарагин – глицин – глутамин – пролин – лизин (трипсин) Лизин – метионин – глицин – гистидин – фенилаланин (химотрипсин) Аргинин – триптофан (химотрипсин) Триптофан – глицин – серин – пролин – пролин – лизин – глицин – серин – пролин – пролин – лизин – аспарагин (трипсин) Полная последовательность Аспарагин – глицин – глутамин – пролин – лизин – метионин – глицин– гистидин – фенилаланин – аргинин – триптофан – глицин – серин – пролин – пролин – лизин – аспарагин. В настоящее время расшифрована первичная структура многих десятков биологически важных белков, которые являются гормонами, ферментами, ядами. 2.3. Методы изучения пространственной структуры белка Биологические функции белков тесно связаны с их пространственной структурой. Несмотря на интенсивные исследования, проблема изучения пространственной структуры белка до сих пор не решена. Это прежде всего связано с тем, что методы исследования пространственной структуры полипептидов и белков до сих пор недостаточно разработаны. 12 В настоящее время существуют в основном три метода непосредственного изучения пространственной структуры белков: рентгеноструктурный анализ, дисперсия оптического вращения и циркулярный дихроизм, электронная микроскопия. Рентгеноструктурный анализ. Метод рентгеноструктурного анализа дает возможность получить картину пространственного строения многих белков. Для изучения пространственной структуры белков необходимы рентгеновская установка с высокой разрешающей способностью, автоматические дифрактометры и электронно-счетные машины для обработки получаемой информации. Метод рентгеноструктурного анализа является пока единственным надежным методом для установления пространственной структуры белков. Результаты, полученные с помощью этого метода, характеризуют пространственную структуру белка в кристаллическом состоянии. Это является одним из недостатков метода, так как белки в растворах могут существовать в других пространственных конформациях. Дисперсия оптического вращения и циркулярный дихроизм. Этот метод позволяет непосредственно изучать динамические изменения в пространственной структуре белковых молекул. По характеру кривой дисперсии оптического вращения можно оценить удельный вес участков цепи с упорядоченной структурой, проследить за изменениями пространственной структуры белковых молекул при изменении среды, в которой находится белок (рН, растворитель и т. д.). Электронная микроскопия. С помощью электронной микроскопии возможно непосредственное изучение структур белков, построенных из нескольких цепей (мультимеры). Электронная микроскопия в сочетании с рентгеноструктурным анализом применялась для изучения четвертичной структуры некоторых белков, в частности, фермента каталазы, молекула которого построена из четырех цепей (субъединиц). 3. ЛАБОРАТОРНЫЕ РАБОТЫ Материалы и реактивы: пшеничная мука, белок куриного яйца, молоко, конц. СH3COOH, 10%-ная CH3COOH, 1%-ная CH3COOH, разб. NaOH, насыщ. (NH4)2SO4, насыщ. NaCl, 10%-ный NaOH, конц. HCl, H2SO4, HNO3, 5%-ная CCl3COOH, 20%-ная сульфосалициловая кислота, спирт, ацетон, эфир, 10%-ный танин, реактив Бушарда (раствор йода в йодистом калии), 5%-ный K4[Fe(CN)6], K2[HgJ4] (раствор иодида ртути в йодистом калии), реактив Драгендорфа (раствор йоди13 стого висмута в иодистом калии), 30%-ный NaOH, 1%-ный CuSO4, 1%-ный нингидрин, 0,2%-ный -нафтол, 40%-ная мочевина, 5%-ная HCl, 2,5%-ный формальдегид, 0,5%-ный NaNO2, 10%-ный Na2CO3, реактив Милона, 5%-ный нитропруссид натрия. 3.1. Приготовление растворов белков Опыт 1. Яичный альбумин. Белок одного куриного яйца отделяют от желтка и встряхивают в закрытой колбе со 150–200 мл дистиллированной воды. Раствор фильтруют через марлю, сложенную в 3–4 слоя, или через чистое полотно. На фильтре остается яичный глобулин, а в растворе – альбумин. Опыт 2. Молочный альбумин. Раствор молочного альбумина получают, добавляя к 100 мл снятого молока равный объем насыщенного раствора сульфата аммония. Выпадает хлопьевидный осадок казеина и глобулина. Раствор перемешивают и оставляют на 10–15 мин, а затем фильтруют через складчатый бумажный фильтр. В растворе находится альбумин, а на фильтре остается казеин и глобулин. Казеин относится к сложным белкам – фосфоропротеидам. Опыт 3. Растительный альбумин. 25 г пшеничной муки заливают 100 мл дистиллированной воды и периодически встряхивают 30–40 мин. (или оставляют колбу на сутки в холодильнике), фильтруют сначала через вату, а затем через складчатый бумажный фильтр. В растворе содержится альбумин зерна пшеницы – лейкозин. С приготовленными растворами белков необходимо провести нижеследующие опыты. 3.2. Реакции осаждения белков Опыт 1. Отношение белков к кислотам и щелочам. Амфотерность белков. Изоэлектрическая точка. В три пробирки наливают по 3–4 мл каждого раствора белка и добавляют по каплям при встряхивании концентрированную СН3СООН. Наблюдается осаждение белка из растворов во всех пробирках. Кислоту продолжают медленно прибавлять до растворения осадков. Затем раствор белка разделяют на две части, перелив приблизительно половину раствора в другую пробирку. Одну из этих пробирок с раствором белка нагревают до кипения. Свертывание белка не наблюдается. Тогда добавляют 2–3 капли раствора (NН4)2SO4. В этом случае белок выпадает в осадок. В другую пробирку после разделения кислого раствора белка по каплям добавляют при перемешивании разбавленный раствор щелочи. По мере 14 нейтрализации кислоты белок выпадает в осадок. Щелочь продолжают по каплям приливать до растворения осадка белка. Затем добавляют щелочь 1–2 мл и нагревают раствор белка до кипения, белок в этом случае не свертывается. Попытайтесь самостоятельно объяснить наблюдаемые эффекты. Белки – это амфолиты, или амфотерные электролиты, которые обладают как кислотными свойствами (содержат карбоксильные группы), так и основными (содержат аминогруппы). Они диссоциируют в растворах. Белок – NН2+Н2О Белок – СООН Белок – NH3+ +OH- Белок – СОО- + Н+ В нейтральных растворах амино- и карбоксильные группы одновременно большей частью ионизированы. Белок – СОО-+Н+ Белок – СООН Белок – СООН. NH2 NH2 NH3+ Обычно константа диссоциации одного и того же белка как кислоты несколько больше, чем константа диссоциации как основания, поэтому в нейтральных водных растворах частицы такого белка заряжены отрицательно. При подкислении раствора степень кислотной диссоциации белка понижается (R–СОО- + Н+ R–СООН), а степень основной диссоциации повышается (R–NН2 + Н+ R–NН3+). При некоторой концентрации ионов водорода (рН) суммарный заряд частицы белка станет равным нулю, т. е. достигается равенство положительных и отрицательных зарядов. В таком состоянии молекулы белка не способны перемещаться в электрическом поле, белок оказывается наименее устойчивым и легко выпадает в осадок, что и наблюдалось в опыте, например, при подкислении белка концентрированной СН3СООН. То значение рН, при котором суммарный заряд белковой молекулы равен нулю, называется изоэлектрической точкой белка. При дальнейшем подкислении раствора белка (рН ниже изоэлектрической точки) сильно возрастает положительный заряд частиц и выпавший в осадок белок растворяется, повышается его устойчивость, он не свертывается даже при нагревании до кипения. Наоборот, при осторожном подщелачивании кислого раствора белка по мере нейтрализации кислоты уменьшается степень основной диссоциации (R–NН3+ + ОН- R–NН2 + Н2О) 15 и возрастает степень кислотной диссоциации (R–СООН+ОН- R—СОО- +Н2O) При некотором значении рН достигается равенство положительных и отрицательных зарядов на белковой молекуле, и белок выпадает в осадок, т. е. достигается изоэлектрическое состояние. В опыте наблюдалось выпадение осадка. При добавлении избытка щелочи резко возрастает отрицательный заряд частиц белка, осадок белка растворяется, и повышается его устойчивость в щелочном растворе, белок не свертывается в этом случае даже при нагревании до кипения. Таким образом, в зависимости от рН среды суммарный заряд молекулы белка принимает отрицательное, нулевое или положительное значение. Состояние белка в растворе при различной реакции среды можно выразить следующей схемой: белок – СОО- белок – СOO- белок – COOH. NH2 N+H3 N+H3 в щелочной среде в кислой среде белок – СООН NH2 в изоэлектрической точке Опыт 2. Высаливание белков из растворов. К 3–4 мл раствора белка постепенно при перемешивании добавляют равный объем насыщенного раствора (NН4)2SO4, чем достигается половинное насыщение белкового раствора по отношению к сульфату аммония. В таких условиях выпадает осадок глобулинов в виде хлопьев или мути. Большую часть мутного раствора белка фильтруют через складчатый фильтр, оставив в пробирке около 1 мл жидкости. В пробирку добавляют 2–3 мл воды и перемешивают, наблюдая растворение осадка белка. Прозрачный фильтрат во второй пробирке, помешивая, насыщают твердым сульфатом аммония (1–2 г) до прекращения его растворения, от чего над осадком соли (NH4)2SO4 высаливаются в виде хлопьев или мути альбумины. В пробирку добавляют двойной объем воды и наблюдают обратное растворение осадка альбуминов. Растворение белков после разбавления говорит об обратимом их осаждении (высаливании) сульфатом аммония. Белки осаждаются (высаливаются) солями щелочных металлов, магния, а также аммония при высокой их концентрации вследствие того, что происходит снятие электрического заряда коллоидных частиц белка в результате адсорбции противоположно заряженных ионов соли, а также снятием водных оболочек с гидрофильных групп ионами 16 соли. Эти два процесса облегчают слипание (агрегацию) частиц белка, и он выпадает в осадок. Высаливание – один из распространенных методов разделения (фракционирования) белков, когда осаждение фракций происходит путем постепенного увеличения концентрации сульфата аммония в растворе при оптимальном рН. В данном примере под действием возрастающих концентраций (NН4)2SO4 легко произошло разделение белков на две фракции – глобулины и альбумины. Опыт 3. Свертывание белков при нагревании (денатурация). В пять пробирок наливают по 1–2 мл раствора яичного или растительного белка. Нагревают содержимое первой пробирки. Осадок белка появляется еще до кипения жидкости. К раствору белка во второй пробирке добавляют 1–2 капли 1%-ного раствора СН3СООН и нагревают. Осадок белка выпадает быстро и полнее вследствие того, что в результате подкисления рН раствора приблизился к изоэлектрической точке белка. К раствору белка в третьей пробирке приливают около 0,5 мл 10%-ного раствора СН3СООН и нагревают до кипения. Осадок белка не образуется даже при кипячении. В четвертую пробирку добавляют около 0,5 мл 10%-ного раствора СН3СООН и несколько капель насыщенного раствора NаС1 и нагревают. В этом случае белок выпадает в осадок. В пятую пробирку добавляют 0,5 мл 10%-ного раствора NаОН и нагревают до кипения. Осадок белка не образуется даже при кипячении. Выпадение белков в осадок при нагревании – свертывание, или денатурация, начинается уже при температуре 50–60°. Денатурация белка обусловлена способностью белковых молекул изменять свою структуру. Нагревание вызывает разрушение третичной структуры белка (разрыв дисульфидных, солевых и др. связей между пептидными цепями), разрушение вторичной структуры (раскручивание и изменение конформации макромолекул белка). Первичная структура при денатурации обычно сохраняется. Осаждение белка в результате денатурации необратима, так как осадки белка не растворяются ни в воде, ни в растворах солей или растворителей. На процесс денатурации белка большое влияние оказывает рН раствора, добавление электролитов. В среде, близкой к изоэлектрической точке, молекулы белка имеют заряд, равный нулю, и поэтому белок легко денатурирует. При добав17 лении кислот молекулы белка заряжаются положительно, а в щелочных растворах они приобретают отрицательные заряды (см. опыт 1). Поэтому сдвиги рН в кислую или щелочную сторону от изоэлектрической точки белка препятствует его денатурации. Добавление к раствору белка нейтральных солей (хлорида натрия, сульфата аммония и др.) облегчает и ускоряет денатурацию при кипячении вследствие дегидратирования белковых молекул. Но есть вещества, защищающие белки от денатурации: сахара, полисахариды, многоатомные спирты, амины и др. Опыт 4. Осаждение белков концентрированными минеральными кислотами. В три пробирки наливают по 1 мл концентрированной азотной, серной и соляной кислот. В наклонном положении в каждую пробирку осторожно наливают около 0,5 мл раствора белка. На границе соприкосновения двух жидкостей образуется белый аморфный осадок белка. Пробирки встряхивают и наблюдают увеличение осадка, выпавшего под действием азотной кислоты, а осадки, выпавшие под действием соляной и серной кислот, растворяются в их избытке. Концентрированные минеральные кислоты вызывают как дегидратацию, так и денатурацию белка. В большинстве случаев эти осадки растворимы в избытке кислоты, кроме осадка белка, выпавшего при действии азотной кислоты. Опыт 5. Осаждение белков органическими кислотами. В две пробирки наливают по 1–2 мл раствора белка и добавляют в первую несколько капель 5%-ного раствора трихлоруксусной кислоты, а во вторую – столько же раствора 20%-ной сульфосалициловой кислоты. В двух пробирках белок выпадает в осадок. Трихлоруксусная и сульфосалициловая кислоты являются специфическими реактивами на белок. Трихлоруксусная кислота осаждает только белки и не осаждает продукты распада белка и аминокислоты, поэтому в химии белка ее часто используют для полного удаления белков из биологических жидкостей. Сульфосалициловая кислота наряду с белками осаждает и продукты их распада – пептоны и полипептиды. Опыт 6. Денатурация белков фенолом и формалином. В две пробирки наливают по 1–2 мл раствора белка и добавляют: в первую – равный объем насыщенного водного раствора фенола, а во вторую – равный объем формалина. В обеих пробирках выпадает осадок белка. От действия фенола осадок выпадает быстрее. Фенол и формалин вызывают денатурацию белка: образуются ма18 лорастворимые продукты конденсации, уплотняется его консистенция, резко снижается растворимость и т. д. На этом основано применение фенола и формалина для дезинфекции, так как эти вещества вызывают денатурацию белков живых клеток и, следовательно, их отмирание. Опыт 7. Осаждение белков органическими растворителями (спирт, эфир, ацетон и др.). В пробирки наливают 1–2 мл раствора белка, добавляют немного кристаллического хлористого натрия и приливают по каплям спирт, ацетон или эфир и др. растворители, сильно взбалтывают и через некоторое время наблюдают выпадение осадка белка. При разбавлении водой концентрация растворителя падает и белок снова переходит в раствор, т. е. наблюдается обратимое осаждение белка. Органические растворители (спирт, ацетон, эфир и др.) вызывают дегидратацию макромолекул белка, что понижает устойчивость белка, и он выпадает в осадок. Легче происходит осаждение белка в нейтральных и слабокислых растворах. В щелочных растворах белок более устойчив к осаждению органическими растворителями. Опыт 8. Осаждение белков реактивами на алкалоиды. Белки обнаруживают некоторые реакции, характерные для алкалоидов, потому что в белковых молекулах имеются такие же гетероциклы – имидозольные, индольные, пиролидиновые и другие, входящие в состав остатков отдельных аминокислот в полипептидной цепи, как и у молекул алкалоидов. В большинстве случаев общие реактивы на алкалоиды вызывают также осаждение белков. К таким реактивам относятся: танин, пикриновая кислота, раствор йода в йодистом калии (реактив Бушарда), раствор йодида ртути в иодиде калия К2[HgJ4], раствор гексациано (II) феррата калия К4[Fе(СN)6], раствор йодистого висмута в йодистом калии (реактив Драгендорфа) и др. В шесть пробирок наливают по 1–2 мл раствора белка и подкисляют 3 каплями 1%-ного раствора уксусной кислоты. В первую пробирку приливают 2–3 капли 10%-ного раствора танина, во вторую – 4–5 капель пикриновой кислоты, в третью – 2–3 капли реактива Бушарда, в четвертую – 2–3 капли реактива Дролендорфа, в пятую – несколько капель 5%-ной соляной кислоты и приливают по каплям 5%-ный раствор K4[Fе(СN)6], в шестую – несколько капель 5%-ной соляной кислоты и добавляют по каплям К2[НgJ4]. Во всех случаях наблюдают выпадение осадков. Опыт 9. Осаждение белков солями тяжелых металлов. В две пробирки наливают по 1–2 мл белка и осторожно по каплям при встряхивании в одну пробирку добавляют 5%-ный раствор сульфата 19 меди, в другую – 5%-ный раствор ацетата свинца. С солью меди выпадает осадок белка голубого цвета, а с солью свинца – белого цвета. При избытке реактива осадок снова растворяется. Соли тяжелых металлов (Нg, Аg, Сu, Рb и др.) вызывают необратимое осаждение белков, образуя с ними нерастворимые в воде соединения. Некоторые такие осадки (например, с солями меди, свинца, цинка) растворяются в избытке осадителя вследствие адсорбции ионов поверхности белковых частиц, которые приобретают заряд и вновь растворяются. 3.3. Цветные реакции белков Опыт 1. Биуретовая реакция белков. В пробирку наливают 1–2 мл раствора белка и такой же объем 30%-ного раствора гидроксида натрия, перемешивают и добавляют 1–2 капли 1%-ного раствора сульфата меди и снова перемешивают. В этом случае должно появиться красно-фиолетовое или сине-фиолетовое окрашивание. При недостаточно яркой окраске с целью повышения чувствительности реакции поступают следующим образом: берут и смешивают раствор белка и щелочи в тех же количествах и осторожно в наклонном положении приливают по стенкам пробирки около 1 мл 1%-ного раствора сульфата меди так, чтобы произошло наслаивание верхнего слоя реактива на раствор белка. При непродолжительном стоянии на границе раздела двух жидкостей появляется фиолетовое кольцо. Биуретовая реакция обусловлена наличием в молекулах белка пептидных групп –СО–NН–. Ионы Сu2+ меди образуют комплекс с енолизированными пептидными группами белка, Окраска растворов белка при образовании медного комплекса в случае биуретовой реакции может быть от синей до красной с преобладанием фиолетовой. R R CH––C === N––CH N O С––O––Cu C––OH OH ––C=N енольная форма пептидной группы N R–CH––N R––CH в цепь в цепь С––ОН Опыт 2. Нингидриновая реакция белков. В пробирку с 1–2 мл раствора белка приливают 3–4 капли 1%-ного раствора нингидрина в 95%-ном растворе ацетона. Раствор перемешивают и нагревают не20 сколько минут на водяной бане при 70°С. Реакция окрашивания нингидрина с белком в отличие от аминокислот протекает медленно и характеризуется сине-фиолетовым (или желтовато-фиолетовым) оттенком, свидетельствующим о присутствии аминокислот, содержащих альфа-аминогруппы. Нингидриновая реакция является одной из наиболее чувствительных для обнаружения альфа-аминогруппы. В результате взаимодействия альфа-аминогруппы аминокислоты или белка с нингидрином возникает Шиффово основание. Затем оно претерпевает перегруппировку, декарбоксилируется и расщепляется на альдегид и аминодикетогидриндамин. О О Н О + H2N–CH–COOH O H 2O N=C–COOH R O О СО2 R О Н Н HOH О +R–C . NH2 H N=CHR O O Аминодикетогидриндамин конденсируется еще с одной молекулой нингидрина, образовавшееся соединение енолизируется и переходит в окрашенную форму, имеющую название «сине-фиолетовый Рузмана», по имени исследователя, впервые изучившего эту реакцию в 1910 г. О О Н О H 2O + О NH2 О О О О Н N О О O + H+. N O- O В присутствии органических растворителей (ацетона, этанола и др.), на которых готовят раствор нингидрина, протекает реакция. Продукт этой реакции содержит в своем составе радикал исходной аминокислоты, который обусловливает различную окраску (голубую, красную и т. д.) соединений, возникающих при реакции аминокислот с нингидрином. 21 О О О Н N=CH–CH2–R+О О О + Н2О. N О О СН О СН R Опыт 3. Ксантопротеиновая реакция. В пробирку с 1 мл раствора белка добавляют 5-6 капель концентрированной азотной кислоты до появления белого осадка. Смесь в пробирке нагревают до кипения и кипятят около 2 мин. При нагревании раствор и осадок окрашиваются в ярко-желтый цвет, при этом осадок может полностью раствориться в результате гидролиза. Смесь охлаждают и осторожно (по стенке пробирки) приливают избыток концентрированного раствора аммиака или щелочи до щелочной реакции. Выпадающий вначале осадок кислотного альбумината растворяется, и жидкость окрашивается в яркооранжевый цвет. Ксантопротеиновая реакция происходит только при наличии в белках остатков ароматических аминокислот (фенилаланина, тирозина и триптофана). Желтоокрашенные нитросоединения образуются в результате нитрования ароматических радикалов этих аминокислот азотной кислотой. Изменение желтой окраски в оранжевую в щелочной среде обусловлено появлением хромофорной группы. В качестве примера рассмотрим механизм ксантопротеиновой реакции по радикалу тирозина: В цепь NH–CH–CO в цепь СH2 + HONO2 В цепь NH–CH–CO в цепь CH2 H 2O O– N OH OH В цепь NH–CH–CO в цепь СH2 В цепь NH–CH–CO в цепь CH2 + NH4OH O + NH4+ + H2O. O- O N OH N O OH 22 O- Опыт 4. Реакция Сакагучи. В пробирку с 1–2 мл белка добавляют 1 мл раствора NаОН, а затем несколько капель 0,2%-ного спиртового раствора альфа-нафтола. Перемешивают и приливают 0,5 мл раствора гипобромита натрия, вновь перемешивают и наблюдают появление оранжево-красного окрашивания. Для стабилизации окрашивания добавляют 1 мл 40%-ного раствора мочевины. Появление окраски обусловлено взаимодействием альфа-нафтола в присутствии окислителя с гуанидиновыми группировками радикалов аргинина, имеющихся в молекуле белка. Сначала альфа-нафтол в присутствии окислителя соединяется с гуанидиновой группировкой аргинина. В цепь NH–CH–CO в цепь В цепь NH–CH–CO в цепь (СH2)3 (CH2)3 NH + NaBrO NH + NaBr + H2O HN=C–NH OH HN=C–N O При более глубоком окислении остатка нафтиларгинина образуется соединение типа хинонимина. Цепь NH–CH–CO в цепь (СН2)3 NH + NH=C–NH2 В цепь NH–CH–CO в цепь OH (CH2)3 + NaBrO NH HN=C–NH +NaBr + H2O OH Опыт 5. Реакция Вуазене. В пробирку с 1–2 мл раствора белка добавляют одну каплю 2,5%-ного раствора формальдегида. Перемешивают, прибавляют 5–6 мл концентрированной соляной кислоты (пл. 1,18) и опять перемешивают. Через 10 мин прибавляют, перемешивая, 10 капель 0,5%-ного раствора нитрита натрия; Появляется интенсивное сине-фиолетовое окрашивание. Реакция Вуазене идет с белками, которые имеют в своём составе аминокислоту триптофан. Триптофан в этой реакции конденсируется с формальдегидом. 23 В цепь NH–CH–CO в цепь NH–CH–CO в цепь СH2 O CH2 С + H + H В цепь NH –CH–CO в цепь NH–СH–СО в цепь СH2 CH2 СН2 окисление В цепь NH–CH–CO в цепь NH–CH–CO в цепь CH2 CH2 СН . NH NH OH Опыт 6. Реакция Паули. В пробирку с 1 мл 1%-ного раствора сульфаниловой кислоты в 5%-ном растворе соляной кислоты приливают 2 мл 0,5%-ного раствора NaNO2, тщательно перемешивают, добавляют 2 мл раствора белка, опять перемешивают, а затем добавляют 6 мл 10%-ного раствора Na2СОз. Появляется вишнево-красное окрашивание. Реакцию Паули дают белки, содержащие в белковой молекуле остатки гистидина и тирозина. Реакция протекает по следующей схеме. SO3- SO3H + NaNO2 + HCl + 2H2O + HCl. N+N NH2 При взаимодействии кислого раствора сульфаниловой кислоты с нитритом натрия идет реакция диазотирования и образуется диазобензолсульфоновая кислота. Образовавшаяся диазобензолсульфоновая кислота, например, с остатком гистидина, образует соединение вишнево-красного цвета. В цепь NH–CH–CO в цепь SO3- SO3- CH2 + В цепь NH–CH–CO в цепь SO3H + SO3H . NH N+N CH2 NH N+N N=N N=N 24n-сульфобензолазогистидин Опыт 7. Реакция Миллона. В пробирку с 0,5 – 1 мл белка приливают двойной объем азотнортутного реактива Миллона. Появляется белый осадок. Пробирку нагревают, выпавший осадок белка окрашивается в кирпично-красный цвет. Эту реакцию дают белки, имеющие в составе молекул остатки аминокислоты тирозина. Реактив Миллона представляет собой смесь нитратов и нитритов одно- и двухвалентной ртути. Тирозин образует с реактивом Миллона ртутную соль нитрозотирозина красного цвета. В цепь NH–CH–CO в цепь СH2 В цепь NH–CH–CO в цепь CH2 2 + HgNO2 OH HNO3 Hg . NO OHg Опыт 8. Нитропруссидная реакция белков. В пробирку с 2–3 мл разбавленного раствора белка приливают равный объем насыщенного раствора сульфата аммония и 2–3 капли 5%-ного раствора нитропруссида натрия. Затем раствор подщелачивают, добавляя несколько капель концентрированного раствора аммиака. Если в состав белка входит аминокислота цистеин, то происходит реакция, в результате которой появляется красно-пурпурное окрашивание. Нитропруссид натрия с серусодержащими органическими соединениями в щелочной среде образуют комплексное соединение. В цепь NH–CH–CO в цепь В цепь NH–CH–CO в цепь СH2 + Na2[(Fe(CN)5NO]+OH- CH2 SH SHNa2[Fe(CN)5NO]. Следует отметить, что до сих пор отсутствует ясность в вопросе о строении нитропруссидных комплексов. Нитропруссид натрия применяется в биохимическом анализе для качественного и количественного определения сульгидрильных производных серусодержащих аминокислот, полипептидов и белков. Опыт 9. Реакция на серу в белках. В пробирку к 1–2 мл белка приливают двойной объем 30%-ного раствора едкого натра и 3–4 капли уксуснокислого свинца. Если в белке имеются остатки аминокислот, содержащие серу, выпадает желто-бурый и черный осадок сульфида свинца. Под действием щелочей белки подвергаются частичному гидролизу по пептидным связям. При этом наблюдается отщепление 25 аминогруппы в виде аммиака. При наличии в молекулах белка аминокислот, содержащих серу (цистеин, цистин, метионин), отщепляется сера в виде ионов S-2, которые образуют с солями свинца черный осадок. Реакции протекают по следующим уравнениям: В цепь NH–CH–CO в цепь В цепь NH–CH–CO в цепь СH2 + NaOH CH2 ; SH OH Pb(CH3COO)2 + 4NaOH Na2PbO2 + 2CH3COONa + 2H2O; Na2S + Na2PbO2 + 2H2O PbS + 4NaOH. 26 СОДЕРЖАНИЕ 1. Общая характеристика. Классификация . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2. Понятие о методах установления строения белков . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.1. Гидролиз белков . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.2. Методы установления первичной структуры белков . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.2.1. Определение концевых остатков аминокислот в молекулах белка . . . . . . . . 2.2.2. Определение С-концевых аминокислотных остатков . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.2.3. Селективное расщепление молекулы белка на фрагменты . . . . . . . . . . . . . . 2.2.4. Выделение и исследование фрагментов . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.2.5. Установление всей последовательности аминокислот по фрагментам известной структуры . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.3. Методы изучения пространственной структуры белка . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3. Лабораторные работы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.1. Приготовление растворов белков . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.2. Реакции осаждения белков . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.3. Цветные реакции белков . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27 3 7 7 9 9 10 10 11 11 12 13 14 14 20 Учебно-методическое издание Александр Риммович Цыганов Валерий Михайлович Минов Валентина Ивановна Каль Марина Николаевна Шагитова БЕЛКИ И ПЕПТИДЫ Методические указания для лабораторных работ по органической химии Редактор Т. П. Рябцева Техн. редактор Н. К. Шапрунова Корректор Л. А. Малеванкина Подписано в печать 20.02.2003. Формат 60х84 1/16. Бумага для множительных аппаратов. Печать ризографическая. Гарнитура «Таймс». Усл. печ. л. 1,63. Уч.-изд. л.1,54. Тираж 100 экз. Заказ Цена 2285 руб. ________________________________________________________ Редакционно-издательский отдел БГСХА 213410, г. Горки, Могилевской обл., ул. Студенческая, 2 28 Отпечатано на ризографе лаборатории множительных аппаратов БГСХА, г. Горки, ул. Мичурина, 5 29 30
