На правах рукописи Куликов Вячеслав Валерьевич ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЛОКАЛИЗАЦИИ БЕЛКОВ БЕРЕМЕННОСТИ В ТКАНЯХ ЧЕЛОВЕКА
реклама
На правах рукописи Куликов Вячеслав Валерьевич ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЛОКАЛИЗАЦИИ БЕЛКОВ БЕРЕМЕННОСТИ В ТКАНЯХ ЧЕЛОВЕКА 03.00.04 - биохимия 03.00.25 - гистология, эмбриология и клеточная биология Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук Москва 2008 Работа выполнена в государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Астраханская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор кандидат медицинских наук, профессор АГМА Сентюрова Людмила Георгиевна Никулина Дина Максимовна Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор ГОУ ВПО РГМУ Ивков Николай Николаевич доктор медицинских наук, профессор Федорова Надежда Николаевна ГОУ ВПО АГТУ Ведущая организация: ФГУ «Научно-Исследовательский Институт Физико-Химической Медицины Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию». Защита состоится «12» мая 2008 г. в 14.00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.072.01 при Российском государственном медицинском университете (117997, г. Москва, ул. Островитянова, д.1) С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского государственного медицинского университета по адресу: 117997, Москва, ул. Островитянова, д.1 Автореферат разослан «20» февраля 2008 года Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор П.Х.Джанашия СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ АГ - антиген АТ - антитело АФП - альфа-фетопротеин АХ - аффинная хроматография БОФ - белки острой фазы Hb - гаптоглобин ИХ - ионообменная хроматография ИФА - иммуноферментный анализ ИФО - иммуноферментное определение ИЭФ - иммуноэлектрофорез МГ - альфа2-макроглобулин ПААГ - полиакриламидный гель ПИЭФ - перекрестный иммуноэлектрофорез ПЛ - плацентарный лактоген РИД - радиальная иммунодиффузия РИФ - реакция иммунофлюоресценции СБАГ - связанный с беременностью альфа2-гликопротеин ТБГ - трофобластический бета-глобулин ТФ - трансферрин ХГ - хорионический гонадотропин ЦП - церулоплазмин ЭФ - электрофорез 2 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ДИССЕРТАЦИИ Актуальность исследования Одной из главных целей реализации приоритетного национального проекта Российской Федерации в сфере здравоохранения является формирование предпосылок демографического роста в стране. Министерством здравоохранения РФ для реализации поставленной цели определены следующие основные задачи: улучшение репродуктивного здоровья населения и охрана здоровья матери и ребенка. Среди важнейших методов диагностики, как самой беременности, так и ряда патологических процессов, возникающих в период беременности, следует отметить количественный и качественный анализ маркеров беременности. К таким исследованиям относится определение гормонов и специфических белков беременности, а именно таких белков-маркеров как альфа-фетопротеин (АФП), связанный с беременностью альфа2-гликопротеин (СБАГ), трофобластический бета-глобулин (ТБГ). Эти белки беременности продолжают оставаться пристальным объектом научных исследований. Несмотря на их внедрение в практику как диагностикумов, что связано, прежде всего, с появлением новых методических подходов, позволяющих проводить тонкие исследования поведения и функции белковых молекул в организме (Татаринов Ю.С., 1970; Никулина Д.М., 1998; Терентьев А.А., 2003; Denro C.W., 1981; Horne C.H.W., 1986). Следует отметить, что в лабораторной диагностике используются также и постоянные белковые компоненты сыворотки крови, уровень которых повышается при беременности: альфа2-макроглобулин (МГ), трансферрин (ТФ), церулоплазмин (ЦП), гаптоглобин (ГГ) и другие. Все перечисленные белки крови относятся к белкам острой фазы. Концентрация практически всех названных белков в биологических жидкостях характерно изменяется не только при физиологически протекающей беременности, но и при многих патологических состояниях, сопровождающих беременность, таких как ранние и поздние гестозы (Никулина Д.М., 1977; Зорин Н.А., 1987; Воробьева Т.Б., 1991), нефротический синдром (Valnichkova L., 1996), сахарный диабет (Веремеенко К.Н., 1979; Smith N.M., et al., 1988; Straube W., 1983), резус-несовместимость (Straube W., 1983), эклампсия, спон- 3 танные и индуцированные аборты и внутриутробная гибель плода (Васильева З.Ф., 1987; Wagner V., 1977; Straube W., 1983). Уровень этих белков может служить косвенным ориентиром состояния плода (Воробьева Т.Б., 1991). Изменение сывороточных концентраций белков-маркеров беременности может служить диагностическим подспорьем при многоплодии (Васильева З.Ф., 1987; Воробьева Т.Б., 1991) и переношенной беременности (Воробьева Т.Б., 1991; Dunn J.T., 1967). Следует отметить, что белки первой группы (АФП, СБАГ и ТБГ) являются маркерами не только беременности (Азявчик А.В., 1969; Bundschuh G., 1967; Bersinger N.A., 1990), но и ряда онкологических заболеваний (Татаринов Ю.С., 1970; Никулина Д.М., 1977; Васильев М.Ю., 1985; Зорин Н.А., 1991). Кроме того, большинство вышеуказанных белков характерно изменяют свой уровень при многих воспалительных заболеваниях (Никулина Д.М., 1977; Мощич П.С., 1980; Зорин Н.А., 2006). Доказана иммуносупрессивная и иммуномодулирующая активность АФП, СБАГ и ТБГ (Трубников Г.А., 1975; Bohn H., 1972; Lupu F., 1994). Все вышеизложенное доказывает огромную физиологическую и патогенетическую роль белков, ассоциированных с беременностью. Вместе с тем, многие вопросы их места синтеза и локализации в нормальных и малигнизированных тканях остаются не до конца изученными, несмотря на пристальное внимание исследователей к белкам беременности (Татаринов Ю.С., 1988). Поэтому приобретает важное не только теоретическое, но и клиническое значение знание места локализации и синтеза наиболее значимых белков беременности для последующего использования их в диагностике и оценке эффективности лечения. Иными словами, для обоснованной корректировки гомеостаза организма. В настоящее время ведущими методами в исследовании белков являются иммунохимические. Среди них известны иммуногистохимические методы, позволяющие выявить места локализации исследуемого белка в конкретной структуре органа или ткани. С помощью иммуногистохимии можно проводить скрининг-исследования в условиях поликлинической лаборатории для оценки состояния организма: в случае определения белков беременности - плода и матери. Наиболее полно и достоверно определено место синтеза, локализации и накопления в субклеточных структурах при физиологиче- 4 ском и патологическом течении беременности ТБГ (Bohn H., 1971; Chard T., 1979). Установлено, что этот белок продуцируется и секретируется в кровь матери для выполнения своей основной функции – иммуносупрессивной. Сведения же по гистотопографии СБАГ отличаются большой разноречивостью, как при беременности, так и при развитии заболеваний, сопровождающихся усилением синтеза этого белка. Таким образом, совершенно закономерным и актуальным представляется более детальное изучение белков беременности, в частности, СБАГ в органах и тканях в условиях нормы и патологии. Цель работы: Уточнение представлений о молекулярных механизмах в условиях нормы и при канцерогенезе, а также улучшение диагностики опухолей путем определения локализации и места синтеза белков беременности в тканях человека. Задачи исследования: 1. Определить гистотопографию и количество общего (суммарного) белка в экзокриноцитах исследуемых тканей в норме. 2. Сравнить гистотопографию и количество общего (суммарного) белка в малигнизированных экзокриноцитах толстого кишечника и эндометрия. 3. Изучить гистотопографию белков беременности в тканях (печень, толстый кишечник, эндометрий) человека (мужчин и небеременных женщин) в норме, и в тканях рожениц (плацента). 4. Изучить гистотопографию белков беременности в тканях человека при канцерогенезе. 5. Сравнить гистотопографию белков беременности в нормальных и малигнизировованных тканях. 6. Разработать принципы практического использования полученных результатов в лечении заболеваний женской половой сферы. Научная новизна В ходе исследования впервые были получены новые данные о топографии суммарного белка с одновременным определением локализации белков беременности (СБАГ) в тех же тканях человека в физиологических условиях нормы и при онкопатологии. Также впервые были получены количественные характеристики суммарного белка и СБАГ в норме и при канцерогенезе в некоторых тканях с помощью программно–аппаратного комплекса «Морфолог». 5 Полученные новые данные о динамике содержания и распределения как суммарного белка в тканях, так и иммуногистохимического исследования СБАГ в аналогичных участках организма позволят сделать рекомендации для практического здравоохранения с целью наиболее ранней диагностики предболезни. Практическая значимость результатов исследования На основе результатов исследования сформированы рекомендации для практического здравоохранения по иммунофлюоресцентному анализу опухолевых тканей эндометрия и толстого кишечника по выявлению определенного антигена. Полученные результаты позволяют рекомендовать этот метод как лабораторный тест для ранней диагностики опухолей. Внедрение результатов исследования Результаты диссертации используются в лекционном курсе кафедр биологической химии с курсом клинической лабораторной диагностики и медицинской биологии лечебного факультета Астраханской государственной медицинской академии для курсантов ФПО и студентов. Выявление СБАГ в гистологических препаратах может быть использовано для диагностики в гинекологической практике для оценки состояния эндометрия и проктологии в качестве дополнительного критерия степени малигнизации исследуемых тканей. Апробация работы Материалы работы были доложены на научных региональных и международных форумах. Материалы диссертации доложены на заседаниях кафедры биологической химии с курсом клинической лабораторной диагностики и конференциях ГОУ ВПО АГМА, на международных научных конференциях молодых ученых «Белки - маркеры патологических состояний» (Астрахань - Москва, 1999, 2003гг.), на научно-практической конференции молодых учёных с международным участием «Современные достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины» (Астрахань-Москва, 2004г.), были представлены на XXVIII Meeting of the international society for oncodevelopmental biology and medicine (ISOBM) (Мюнхен, Германия, 2000 и Хельсинки). По теме диссертации опубликовано 7 научных статей, 2 из них в изданиях рекомендованных ВАК изданиях. 6 Структура и объем работы Диссертация изложена на 114 страницах, состоит из введения, обзора литературы, глав «Материалы и методы исследования», «Собственные исследования», «Обсуждение полученных результатов», выводов, практических рекомендаций, списка литературы. Библиография включает в себя 65 отечественных и 190 зарубежных авторов. Иллюстративный материал представлен 18 таблицами и 24 рисунками. Работа выполнена по плану НИР ГОУ ВПО «Астраханская государственная медицинская академия» на базе кафедр биологической химии с курсом клинической лабораторной диагностики, медицинской биологии и генетики ГОУ ВПО АГМА и Центральной научно– исследовательской лаборатории Российского государственного медицинского университета г. Москвы при поддержке грантов ФЦП «Интеграция науки высшего образования России», 2000 – 2004 гг. Положения выносимые на защиту Содержание общего белка в неизмененных тканях эндометрия, толстого кишечника, плаценты, аппендикса и печени по данным углубленных цитофотометрических исследований существенно различается. В малигнизированных тканях эндометрия и толстого кишечника количество общего белка существенно возрастает соответственно с 231,23 в норме до 314,02 усл.ед при аденокарциноме эндометрия; для толстого кишечника с 174,07 в норме до 347,05 усл.ед при аденокарциноме. Наибольшие концентрации СБАГ в различных тканях по степени убывания выявляются в малигнизированных тканях толстого кишечника, эндометрия и в нормальной плаценте рожениц. Выявленное увеличение содержания СБАГ в плаценте рожениц и малигнизированных тканях, вероятно, связано с разной степенью дерепрессии структурного гена СБАГ, реализующего иммуносупрессивную активность в большей степени при беременности и опухолях. 7 СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы Объектом исследования являлся аутопсийный материал, полученный от людей, погибших в результате случайных причин, а также операционный материал, полученный в патологоанатомическом бюро областного онкологического диспансера города Астрахани, ГНЦ колопроктологии РФ, МНИОИ им. Герцена города Москвы с 2001 года по 2007 год. Кроме того, для исследований брались плаценты рожениц в Астраханском родильном доме №2, родильном отделении Астраханской областной Александро – Мариинской больницы. Всего было изучено 132 пробы (табл. 1). Таблица 1 Характеристика исследуемого материала № Исследуемый материал Кол-во проб Возрастная группа Пол 20-29 30-39 40-49 50 и > М Ж 1 Эндометрий 20 3 5 10 2 – 20 2 Плацента 10 6 3 1 – – 10 3 Толстый кишечник 20 7 6 2 5 13 7 4 Аппендикс 10 5 4 1 - 8 2 5 Печень 12 4 6 1 1 4 8 6 Рак эндометрия 30 – – 6 24 – 30 7 Рак толстого кишечника 30 – – 3 27 18 12 Полученный материал обрабатывался на кафедрах медицинской биологии и биологической химии Астраханской государственной медицинской академии и Центральной научно–исследовательской лаборатории Российского государственного медицинского университета г. Москвы. Пробы тканей эндометрия, плаценты, толстого кишечника, аппендикса, печени в норме и при малигнизации размерами не более 0,5-1см помещали в фиксатор – абсолютный спирт для дальнейшего получения парафиновых блоков, либо замораживались при минус 15-20ºС и изготавливали криостатные срезы. 8 Кровь для приготовления сыворотки брали пункцией кубитальной вены в количестве 10,0 мл или из пальца у взрослых людей натощак; у новорожденных – из пуповины сразу после ее рассечения. Ретроплацентарную кровь получали при родах в последовом периоде. Сыворотку отделяли от форменных элементов крови методом центрифугирования, консервировали 1% раствором азида натрия и хранили при температуре -180 С. Гистологические методы В работе использованы как парафиновые срезы, так и срезы, полученные на криостате. Приготовление парафиновых срезов осуществлялось на микротоме санного типа по стандартной методике. Толщина парафиновых срезов составляла 4-5 мкм, и 5-7 мкм для криостатных срезов. Всего для гистологических и иммуногистохимических исследований образцов тканей было использовано 6 методов окраски: гематоксилин-эозином, по Ван-Гизону, альциановым синим, прочным зеленым на общий белок, на гликоген по Бесту, иммунофлюоресцентное окрашивание (табл. 2). Ведущим методом в исследовании белков являлся иммуногистохимический. Именно он позволяет выявить места локализации белка в конкретной структуре органа или ткани. Помимо локализации этот метод позволяет определить, какие именно структуры являются продуцентами этого белка. Для непрямого иммунофлюоресцентного анализа срез вначале обрабатывали антителами, не связанными с флюорохромом. Затем последние, выступающие уже в роли антигена, соединялись с мечеными антителами специфической антисыворотки. Для проведения реакции иммунофлюоресценции использовали антикроличьи диагностические иммуноглобулины, меченные флуоресцин-5-изотиоцианатом (ФИТЦ) из НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалея. Специфические антисыворотки были получены самостоятельно. Таблица 2 Использованные гистологические и иммуногистохимические методы при исследовании различных тканей № Исследуемый материал Общие гистологические Метод исследования Окраска Окраска Выявлеальциана гликоние общеновым ген по Бе- го белка синим сту Метод иммунофлюоресценции 9 1 Эндометрий + + - + + 2 Плацента + + + + + 3 + + - + + 4 Толстый кишечник Аппендикс + + + + + 5 Печень + + + + + 6 Рак эндометрия Рак толстого кишечника + + + + + + + + + + 7 Биохимические и иммунохимические методы Процесс получения антисывороток к СБАГ и ТБГ состоял из следующих этапов: приготовление иммунизирующего Аг (иммуногена); иммунизации животного; оценки полученной Ас; обработки Ас, включая при необходимости адсорбцию лиофилизированной плазмой доноров. Приготовление АГ и получение антисывороток составило первую часть собственных исследований. Исходным биоматериалом для выделения и очистки исследуемых белков-антигенов служила сыворотка крови женщин с поздними сроками беременности. В работе использовали сочетание методов высаливания, ионообменной, гель-проникающей хроматографии и препаративного иммуноэлектрофореза. Идентификацию Аг в препаратах с каждого этапа очистки проводили классическими иммунохимическими методами: иммунодиффузионным титрованием и аналитическим иммуноэлектрофорезом. При иммунизации использовали в качестве лабораторных животных кроликов, которым в течение месяца вводили антиген дробными дозами. 10 Результаты исследований и их обсуждение В работе проведено сравнительное исследование общего (суммарного) белка (ОБ), выявляемого в экзокриноцитах печени, плаценты, эндометрия и толстого кишечника в норме и при канцерогенезе. Именно его количество характеризует степень напряженности метаболических процессов. Большинство же имеющихся работ описывают изменения белка либо в гомогенатах печени, либо в периферической крови по результатам исследований с помощью биохимических реакций. При этом можно только косвенно судить о функциональном состоянии органа. Сведения о содержании и распределении общего (суммарного) белка, выявляемого гистохимически в плаценте, эндометрии и толстом кишечнике в литературе практически отсутствуют. ОБ выступает в качестве количественного критерия, характеризующего степень напряженности метаболических процессов в норме и при патологии в этих органах. С другой стороны, иммуногистохимические исследования позволяют определить место синтеза того или иного белка. Одним из наиболее значимых в диагностическом плане является связанный с беременностью альфа2-гликопротеин (СБАГ). Известно, что его количество увеличивается во много раз при беременности, а в крови небеременных женщин и мужчин присутствует в низкой концентрации. Кроме того, значительным повышением в крови концентрации этого белка также сопровождается воспаление, заболевания крови, опухоли. Однако сведения о содержании и распределении этого функционально важного белка в структурах органов неоднозначны и недостаточны. Поскольку большинство белков плазмы крови синтезируется в печени, то на какой – то период они присутствуют в гепатоцитах. Естественным было предположить, что печень является одним из основных мест синтеза и СБАГ. Но, учитывая, что он впервые был выявлен при беременности, то вероятным местом синтеза может являться и плацента. Также вероятен синтез СБАГ и другими экзокриноцитами, например, эндометрия (эстрогензависимыми) или толстого кишечника. Есть данные о синтезе СБАГ в плазматических клетках. Впервые было проведено параллельное исследование гистохимическими методами общего (ОБ) и специфического белка (СБАГ) в клетках и тканях отдельных органов человека, а именно печени, тол- 11 стого кишечника, эндометрия, плаценты. Кроме того, было проведено исследование общего белка (ОБ) и СБАГ в эндометрии и толстом кишечнике при аденокарциноме. Были использованы как взаимодополняющие методы выявления ОБ в эндокриноцитах и иммуногистохимическое определение с помощью специфической тест-системы мест предполагаемого синтеза СБАГ. Было установлено, что ОБ во всех изученных органах имеет сходную локализацию и распределен в цитоплазме экзокриноцитов чаще диффузно (рис 1). а) б) Рис 1 – Окраска прочным зеленым: эндометрий норма (а) и малигнизированная ткань (б) Исключением является печень, где общий белок представлен множественными глыбками, сливающимися в гепатоцитах друг с другом. Поэтому даже при визуальном наблюдении можно отметить его увеличенное содержание. Далее, в ряду по степени концентрации ОБ, располагаются столбчатые экзокриноциты аппендикса, затем симпластотрофобласт плаценты, экзокриноциты желез эндометрия и столбчатые экзокриноциты толстого кишечника (рис 2). а) б) Рис.2 – Окраска прочным зеленым: толстый кишечник норма (а) и малигнизированная ткань (б) 12 Концентрация ОБ в разных органах колеблется от 174,07 до 752,28 усл.ед., то есть изученные органы характеризуются высокой гетерогенностью функциональной активности. По-видимому, это способствует оптимальной адаптации к выполняемым функциям. Было проведено количественное определение общего белка в клетках печени, аппендикса, плаценты, эндометрия и толстого кишечника. Данные цитофотометрического исследования приведены на гистограмме (Рис. 3). Рис. 3 Цитофотметрическое исследование общего белка в органах человека 800 700 600 500 усл.ед. 400 300 200 100 0 1 2 3 4 5 1 - печень; 2 - аппендикс; 3 - плацента; 4 - эндометрий; 5 - толстый кишечник Наличие большого количества белка в гепатоцитах согласуется с выполнением печенью большого объема метаболических реакций, здесь идут наиболее напряженные метаболические процессы. Учитывая, что аппендикс является элементом защитной системы организма, выработка достаточно большого количества белка столбчатыми экзокриноцитами вполне оправдана. Часть этих белков вырабатывается иммунокомпетентными клетками общей иммунной системы слизистых оболочек желудочно–кишечного тракта и поступает в столбчатые экзокриноциты для борьбы с вредоносным агентом. Наличие высоких значений показателя также может объясняться тем, что здесь идут интенсивные иммунные процессы, где задействованы иммуноглобулины А. В плаценте уменьшение данного показателя может быть обусловлено тем, что синтезируемый здесь секрет очень быстро поступает в кровь, не успевая накапливаться в самой ткани. Изучение общего белка в малигнизированных тканях позволило констатировать, что локализация общего белка сохраняется, но существенно ме- 13 няется количественное содержание (Рис 4.). Так, при аденокарциноме толстого кишечника количество общего белка в клетках эпителия увеличивается в 2 раза, при аденокарциноме в эндометрии в полтора раза. Рис. 4 Цитофотометрическое исследование общего белка в нормальных и малигнизированных тканях усл.ед. 400 350 300 250 200 150 100 50 0 1 2 3 4 1- эндометрий (норма); 2 - эндометрий (аденокарцинома); 3 - толстый кишечник (норма); 4 - толстый кишечник (аденокарцинома) Исследование площади этих же клеток показывает сходные результаты, но площадь малигнизированных клеток эндометрия больше в 1,4 раза. В то же время площадь столбчатых эпителиоцитов толстого кишечника, напротив, уменьшается при малигнизации тканей, что возможно связано с усилением выделения секрета в просвет кишечника (Рис. 5). Рис. 5 Площадь эпителиальных клеток эндометрия и толстого кишечника усл.ед. 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0 1 2 3 4 1 - эндометрий (норма); 2 - эндометрий (аденокарцинома); 3 - толстый кишечник (норма); 4 толстый кишечник (аденокарцинома) 14 Ещё одним показателем функционального состояния органа может быть полусумма максимального и минимального диаметров ядра клетки (рис. 6). Рис. 6 Формализованная характеристика ядер толстого кишечника и эндометрия 30 25 20 усл.ед. 15 10 5 0 1 2 3 4 1 - толстый кишечник (норма); 2 - толстый кишечник (рак); 3 эндометрий (норма); 4 - эндометрий (рак) Полученные в работе данные позволяют предположить по формализованному показателю увеличения размеров ядер железистых эпителиоцитов эндометрия с 21,48 ± 1,8 до 25,86 ± 1,9 условных единиц, при несущественном снижении размеров ядер толстого кишечника с 23,3 ± 1,8 до 22,51 ± 2,0 условных единиц о влиянии на орган гормональной составляющей. Таким образом, полученные данные свидетельствуют об особенностях обмена белка, как в нормальных, так и малигнизированных клетках и тканях (рис 1, 2). Вместе с тем, представляется важным знать динамические характеристики отдельных биологически важных компонентов клетки, а именно специфических белков, таких как СБАГ. Поскольку обычными гистохимическими методами этот белок в клетках не выявляется, был применен метод иммунофлюоресцентного анализа со специфической антисывороткой или реакция иммунофлюоресценции (РИФ), позволяющий визуально идентифицировать исследуемый белок в качестве индивидуального антигена. Ранее было установлено, что СБАГ в норме синтезируется в печени, моноцитах и плазматических клетках. Кроме того, этот белок могут синтезировать лейкоциты и моноциты матери. Присутствие его в других органах не описано. 15 Анализ полученных результатов РИФ позволяет констатировать, что СБАГ выявляется во всех исследованных органах: толстом кишечнике, аппендиксе, эндометрии, печени и плаценте. С целью объективизации данных РИФ на СБАГ были использованы формализованные показатели. На первом этапе проводилось фотографирование РИФ каждого исследуемого органа: печени, аппендикса, толстого кишечника, эндометрия и плаценты. На втором этапе микрофотографии оценивали с помощью программноаппаратного комплекса «Морфолог» и по оптической плотности РИФ определяли концентрацию СБАГ в тканях в условных единицах. Таким образом, при анализе изображения были получены инвертированные данные. То есть, чем ниже оптическая плотность исследуемого образца, тем выше содержание белка в тканях. Впервые установлено, что в тканях толстого кишечника и эндометрия концентрация СБАГ существенно возрастает при малигнизации (рис 7, 8, 9). а) б) Рис 7. Иммунофлюоресцентное исследование на СБАГ в нормальном (а) и малигнизированном эндометрии (б) В эндометрии местом локализации СБАГ определены столбчатые эпителиоциты. В толстом кишечнике и аппендиксе это были экзокриноциты желез эндометрия. В печени, предположительно, - фибробласты соединительной ткани, что согласуется с данными литературы. Сами гепатоциты не дали положительной реакции на СБАГ. Проведенными исследованиями установлено, что аденокарциноматоз существенно влияет на содержание СБАГ в органе и соответственно на его синтез, но влияние проявляет в зависимости от органа в различной степени малигнизации. 16 а) б) Рис.8. Результаты иммунофлюоресцентного анализа на СБАГ в нормальном (а) и малигнизированном (б) толстом кишечнике Так, максимальное увеличение концентрации СБАГ (иммунофлюоресценции) более чем в 4 раза наблюдается в малигнизированном кишечнике (Рис. 8). Менее значительное увеличение содержания СБАГ было отмечено в малигнизированном эндометрии (Рис. 9). Рис. 9. Цитофотометрия реакции иммунофлюоресценции на СБАГ 2500 2000 1500 усл.ед. 1000 500 0 1 2 3 4 5 6 1 - эндометрий (норма); 2 - эндометрий (аденокарцинома); 3 - толстый кишечник (норма); 4 толстый кишечник (аденокарционома); 5 - печень; 6 аппендикс Ранее на основании исследований крови априори этот белок относили к группе неспецифических маркеров рака в сыворотке, так как его уровень достоверно увеличивается при злокачественных опухолях. Результаты данного исследования подтверждают это положение. С другой стороны, полученные данные подтверждают, что в печени синтезируется СБАГ в небольшом количестве в нормальной 17 ткани, но больше в соединительнотканной строме органа, предположительно, фибробластами. Таким образом, полученные данные позволяют утверждать, что местом усиленного синтеза СБАГ является малигнизированная ткань, в наибольшей степени эпителиальная ткань толстого кишечника. Это может объясняться тем, что именно кишечник синтезирует большое количество иммуноглобулина А, по литературным данным функционально тесно связанного со СБАГ. С учетом литературных данных об иммуносупрессивных свойствах СБАГ, полученные данные свидетельствуют о дерепрессии гена, регулирующего синтез данного белка при злокачественных новообразованиях, что ведет к увеличению содержания СБАГ в ткани. Вероятно, при канцерогенезе в клетке увеличивается содержание факторов, выполняющих роль индукторов дерепрессии структурного гена СБАГ. ВЫВОДЫ 1. Гистохимическое исследование нормальных тканей печени, толстого кишечника, аппендикса, эндометрия, плаценты позволило выявить содержание и топографию общего белка. Так, для печени среднее значение интегральной оптической плотности составило 752,28, аппендикса 400,48, плаценты 329,77, эндометрия 231,23, толстого кишечника 174,07 усл.ед. 2. Выявлено, что в нормальных тканях печени, толстого кишечника, аппендикса, эндометрия, плаценты СБАГ определяется практически везде, но интенсивность свечения тканей различна. Наибольшая концентрация СБАГ по среднему значению интегральной плотности определяется в плаценте рожениц 1369,7 усл.ед. 3. Аденокарцинома толстого кишечника характеризуется увеличением среднего значения интегральной плотности белка по сравнению с нормальной тканью соответственно 347,05 и 174,07 усл.ед. 4. Среднее значение интегральной плотности аденокарциномы эндометрия превышает таковое нормальной ткани – 314,02 и 231,23 усл.ед. соответственно. 18 5. Сравнительный анализ гистотопографии СБАГ в различных тканях показал, что наибольшие концентрации данного белка в ряду по степени убывания выявляются в малигнизированных тканях толстого кишечника, эндометрия и в нормальной плаценте рожениц. 6. Неидентичное увеличение содержания СБАГ в плаценте и малигнизированных тканях, вероятно, связано с разной степенью дерепрессии структурного гена СБАГ, реализующего иммуносупрессивную активность в большей степени при беременности и опухолях. Практические рекомендации Полученные показатели суммарного белка в нормальных и малигнизированных тканях позволят расширить спектр ранних диагностических тестов состояния предболезни, так как характеризуются простотой постановки, доступностью, экономичностью и необходимой информативностью. 2. Результаты иммуногистохимических исследований могут быть использованы в практике научно – исследовательских учреждений 3. Материалы работы рекомендуется использовать в учебном процессе на кафедрах биохимии, биологии, гистологии. 1. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. D.M.Nikulina - M.A.Volodin, T.B. Vorobyeva, Yu.Kostina, S.Kulikov. - Alpha2-pregnancy associated glycoprotein localization in placental and endometrial tissues //Tumor Biology, 21(suppl 1) 2000. - P.153. 2. Воробьева Ю.А.., Куликов В.В., Костина Ю. Иммунофлюоресцентное изучение локализации белков беременности в тканях эндометрия и плаценты // Материалы 81-й итоговой научной конференции «Биология и медицина на рубеже веков» Астрахань 2001.- С.212-216 19 3. П.А.Иванов, М.Ю.Темчук, В.В.Куликов. – Показатели гомеостаза у больных с хронической алкогольной и наркотической интоксикацией // Материалы III съезда биохимического общества РАН. С-Пб. – 26 июня 1 июля 2002. С.161-162. 4. П.А.Иванов, Д.М.Никулина, И.О.Островерхова, В.В.Куликов. – Изучение корреляции между уровнем белков острой фазы воспаления и показателями иммунограммы // Материалы международной научно-практической школы-конференции "Цитокины. Воспаление. Иммунитет". - С-Пб. - 23-26 июня 2002. - С.160. 5. Сентюрова Л.Г., Куликов В.В., Кривенцев Ю.А., Островерхова И.О. Иммуногистохимическое определение локализации белков беременности в нормальных тканях человека // Материалы 3 научной конференции и школы-семинара для молодых ученых "Белки-маркеры патологических состояний". - АстраханьМосква. - 2003. - С.145-148. 6. Сентюрова Л.Г., Куликов В.В., Никулина Д.М., Кривенцев Ю.А. Иммуногистохимическое определение локализации белка беременности в структурах нормального эндометрия и при опухолях. // Материалы научно-практической конференции и школы-семинара для молодых ученых с международным участием "Современные достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины". - Астрахань-Москва. - 2004. С.229-233 7. Сентюрова Л.Г., Куликов В.В., Никулина Д.М. Сравнительное иммуногистохимическое исследование содержания общего белка и белка беременности в организме человека. // Естественные науки - 2007 – №1 (18) –С.78-83.
