Тимашева Янина Римовна - Московский государственный

На правах рукописи
УДК 616.12-008.331.1-036.3-07-056.7:575.191
Тимашева Янина Римовна
РОЛЬ ПОЛИМОРФИЗМА И УРОВНЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ
ЦИТОКИНОВОЙ СЕТИ В ФОРМИРОВАНИИ МОЛЕКУЛЯРНОГЕНЕТИЧЕСКИХ ОСНОВ ПРЕДРАСПОЛОЖЕННОСТИ К
ЭССЕНЦИАЛЬНОЙ ГИПЕРТЕНЗИИ
14.00.06 - кардиология
03.00.15 - генетика
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Москва-2008
Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении
высшего профессионального образования «Башкирский государственный
медицинский университет Росздрава» и в Институте биохимии и генетики
Уфимского научного центра Российской академии наук
Научные руководители:
Доктор медицинских наук, профессор
Закирова Аляра Нурмухаметовна
Доктор биологических наук, профессор
Мустафина Ольга Евгеньевна
Официальные оппоненты:
Доктор медицинских наук, профессор
Терещенко Сергей Николаевич
Доктор медицинских наук
Зинченко Рена Абульфазовна
Ведущая организация:
Федеральное
Государственное
исследовательский
центр
Учреждение
Государственный
профилактической
медицины
научно-
Федерального
агентства по высокотехнологичной медицинской помощи
Защита состоится ___ апреля 2008 г. в ___ часов на заседании
диссертационного совета Д208.041.01 при Государственном образовательном
учреждении
высшего
государственный
профессионального
образования
медико-стоматологический
«Московский
университет
Росздрава»
(127473, г. Москва, ул. Делегатская, д.20/1).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО
«Московский
государственный
медико-стоматологический
университет
Росздрава» (127206, Москва, ул. Вучетича, д. 10а).
Автореферат разослан ____ марта 2008 года.
Ученый секретарь диссертационного совета,
доктор медицинских наук, профессор
Р. И. Стрюк
3
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Артериальная гипертензия является одним
из основных факторов риска развития тяжелых сердечно-сосудистых
осложнений, таких, как инсульт и инфаркт миокарда, – главных причин
смертности в современном мире [Оганов Р. Г., 2007].
Эссенциальная, или первичная, гипертензия (ЭГ), или гипертоническая
болезнь, представляет собой многофакторное заболевание, в возникновении
которого важную роль играет генетическая предрасположенность. Изучение
молекулярно-генетических основ ЭГ открывает перспективы для разработки
эффективных мер профилактики, адекватной терапии, а также способов
прогнозирования воздействия тех или иных факторов среды на развитие
заболевания. Общая концепция роли генетических факторов в этиопатогенезе
ЭГ достаточно хорошо обоснована, но остается много неясных вопросов
относительно вклада конкретных генов. Большая часть исследований
посвящена
ограниченному
набору
генов,
которые
кодируют
белки,
регулирующие тонус сосудов, функцию эндотелия, минеральный обмен,
метаболизм и транспорт липидов в сосудистом русле. Относительно недавно
стал изучаться вопрос об участии генов цитокинового каскада в развитии ЭГ.
Цитокины
являются
ключевыми
медиаторами
межклеточных
взаимодействий, в том числе в процессе воспаления. Воспаление – основной
патофизиологический субстрат сердечно-сосудистых заболеваний [Ross R.,
1999]. Повышенная экспрессия эндотелием медиаторов воспаления лежит в
основе атеросклеротического повреждения сосудистой стенки [Kofler S. et al.,
2005]. Дисфункция эндотелия, наряду с нарушением свертываемости крови и
гиперхолестеринемией, приводит к нарушению тонуса сосудов. В то же
время, известно, что цитокиновая сеть функционирует в тесной связи с
ренин-ангиотензиновой системой и эндотелиальными факторами релаксации,
в частности, оксидом азота. Особый интерес представляет исследование
профиля экспрессии генов цитокиновой сети в лейкоцитах периферической
4
крови больных ЭГ, результаты которого открывают новые возможности для
анализа роли транскриптома клеток крови в этиопатогенезе ЭГ.
Цель работы состояла в установлении роли полиморфизма и уровня
экспрессии
генов
цитокинов
в
детерминации
риска
эссенциальной
гипертензии и оценка их взаимосвязи с показателями внутрисердечной
гемодинамики и ремоделирования миокарда левого желудочка у больных
эссенциальной гипертензией.
Задачи исследования:
1.
Оценить состояние внутрисердечной гемодинамики и характер
ремоделирования миокарда левого желудочка у больных эссенциальной
гипертензией в зависимости от наличия осложнений.
2.
Провести
анализ
ассоциаций
с
эссенциальной
гипертензией
аллельных вариантов генов интерлейкина 1 бета (IL1B, -511T/C), фактора
некроза опухолей альфа (TNFA, -308A/G), лимфотоксина (LTA ,-252A/G),
интерлейкина 6 (IL6, -572G/C), интерлейкина 10 (IL10, -627C/A),
интерлейкина 12 (IL12B, 1159A/C), антагониста рецептора интерлейкина 1
(IL1RN,
VNTR
полиморфизм),
ангиотензиногена
(AGT,
-174Т/М),
эндотелиальной синтазы оксида азота (NOS3, VNTR полиморфизм в
интроне 4).
3.
Установить связь полиморфизма перечисленных генов с факторами
риска и сердечно-сосудистыми осложнениями эссенциальной гипертензии.
4.
Провести анализ ассоциаций аллельных вариантов генов-кандидатов
с гипертрофией левого желудочка у больных эссенциальной гипертензией.
5.
Оценить степень риска развития эссенциальной гипертензии и
сердечно-сосудистых осложненеий в связи с сочетаниями генотипов геновкандидатов.
6.
Провести
сравнительный
анализ
профилей
экспрессии
генов
цитокинов и цитокиновых рецепторов в клетках периферической крови
больных эссенциальной гипертензией и лиц контрольной группы.
5
Научная
новизна
исследования.
Впервые
проведён
анализ
ассоциаций полиморфизмов генов IL10, IL6, IL12B, IL1B, IL1RN, TNFA, LTA с
ЭГ и выявлены маркеры риска ЭГ. Впервые показана связь полиморфизма 511T/C гена IL1B и-627C/A гена IL10 с ЭГ. Впервые изучен профиль
экспрессии 84 генов цитокинов и цитокиновых рецепторов в клетках
периферической крови больных ЭГ и лиц контрольной группы и обнаружены
различия в уровне экспрессии 21 гена. Впервые у больных ЭГ обнаружено
повышение транскрипционной активности генов CCL16, CCL17, CCL18,
CCL19, CCL23, CCL8, CCR6, CCR8, CX3CR1, CXCL1, CXCL13, ICEBERG,
IL13, IL17C, IL1F10, IL1F6, ILF9, SPP1, CD40LG, XCR1 и понижение
транскрипционной активности гена CCL2 в клетках периферической крови.
Практическая
значимость
работы.
Результаты
работы
используются при разработке рекомендаций для медико-генетического
консультирования по ЭГ с целью первичной и вторичной профилактики
сердечно-сосудистой патологии. Материалы исследования могут быть
использованы
в
учебно-методическом
процессе
на
медицинских
и
биологических факультетах, а также на курсах последипломного образования
кардиологов, терапевтов и врачей общей практики.
Внедрение в практику. Результаты исследования и практические
рекомендации внедрены в работу Республиканского кардиологического
диспансера (г. Уфа) и используются в учебном процессе на кафедре
кардиологии и функциональной диагностики ГОУ ВПО «Башкирский
государственный медицинский университет Росздрава»..
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Развитие
эссенциальной
гипертензии
характеризуется
формированием концентрических вариантов ремоделирования миокарда
левого желудочка. У больных эссенциальной гипертензией, перенесших ИМ,
чаще наблюдаются эксцентрическая гипертрофия, в том числе, с дилатацией
левого желудочка.
6
2. Генетическими
маркерами
риска
эссенциальной
гипертензии
являются аллельные варианты генов IL1B, IL10, IL1RN, IL12B и AGT.
3. Риск развития сердечно-сосудистых осложнений эссенциальной
гипертензии (инсульта) ассоциирован с полиморфными вариантами генов
IL1B, IL-6, IL-10, IL-12B и TNFA.
4. VNTR-полиморфизм в 4-ом интроне гена эндотелиальной синтазы
оксида азота (NOS3) ассоциирован с гипертрофией левого желудочка у
больных эссенциальной гипертензией.
5. В
клетках
периферической
крови
больных
эссенциальной
гипертензией изменена транскрипционная активность ряда генов цитокинов,
в особенности хемокинов, по сравнению с контрольной группой.
Личное участие автора в получении результатов, изложенных в
диссертации. Все мероприятия по сбору материала для исследования (отбор
больных и лиц контрольной группы, анализ медицинской документации,
анкетирование, забор крови, выделение ДНК и РНК), генотипирование,
анализ экспрессии генов, статистический анализ результатов выполнены
автором лично.
Апробация работы. Результаты диссертационной работы были
представлены в виде устных и постерных докладов на 17-м Съезде
Европейского общества гипертензии (17th European Meeting on Hypertension,
Milan, 2007), Европейском конгрессе по генетике человека (European Human
Genetics Conference, Amsterdam, 2006; Nice, 2007), 7-м Балканском
симпозиуме по генетике человека (7th Balkan Meeting on Human Genetics,
Skopje, 2006), XIV Международном симпозиуме по атеросклерозу (XIV
International Symposium on Atherosclerosis, Rome, 2006), Российском
национальном конгрессе кардиологов (Москва, 2006), II-й Всероссийской
научно-практической конференции «Артериальная гипертония в практике
врача терапевта, невролога, эндокринолога и кардиолога» (Москва, 2006).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 18 печатных работ,
из них 3 статьи в журналах, рекомендуемых ВАК РФ.
7
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа включает в
себя следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы,
результаты
исследования
и
обсуждение,
выводы,
практические
рекомендации, библиографический список, приложения. Работа изложена на
150 страницах машинописного текста, содержит 46 таблиц и 10 рисунков.
Библиографический список включает 227 ссылок на 15 работ отечественных
и 212 работ зарубежных авторов.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Материалы исследования. Обследовано 355 больных ЭГ (298
мужчин, 57 женщин) с длительностью заболевания более года (средний
возраст больных на момент обследования составил 53.297.85 лет). Диагноз
ЭГ устанавливался с учетом Национальных рекомендаций по профилактике,
диагностике и лечению артериальной гипертонии второго пересмотра (2004).
Обследование
проводилось
на
базе
ГУЗ
«Республиканский
кардиологический диспансер» (главный врач И. М. Карамова, г. Уфа).
Клиническая группа состояла из трех подгрупп. Первая включала 219
больных неосложненной ЭГ (162 мужчины, 57 женщин), в возрасте от 30 до
65 лет (средний возраст 51.927.79 лет). Вторую подгруппу составили 95
мужчин, больных ЭГ, с постинфарктным кардиосклерозом (средний возраст
55.718.84
лет).
Заключение
о
перенесенном
ИМ
выносилось
ретроспективно, по данным амбулаторных карт и выписок, на основании
критериев Комитета экспертов ВОЗ (1978). В третью подгруппу входил 41
мужчина, страдающий ЭГ, перенесший ишемический инсульт (средний
возраст 53.987.45 лет). Заключение о перенесенном инсульте также
выносилось по данным амбулаторных карт и выписок, согласно критериям
ВОЗ, с учетом данных компьютерной и магнитно-резонансной томографии.
Контрольная группа составлена из 273 практически здоровых людей (182
мужчины, 91 женщина), без признаков сердечно-сосудистых и других
8
хронических заболеваний. Группы пациентов и контрольная были этнически
однородны.
Методы исследования.
Клиническое обследование. Все больные прошли обследование,
которое включало сбор жалоб и анамнеза, физикальное обследование, общий
и биохимический анализ крови и мочи, ЭКГ в 12 стандартных отведениях,
проведение эхокардиографического и доплеровского исследования, а также
велоэргометрии
и
холтеровского
мониторирования
по
показаниям,
антропометрическое обследование с определением индекса массы тела
(ИМТ) по формуле: ИМТ (кг/м2)=Вес(кг)/Рост(м)2 [Pyorala K., 1994].
Всем больным проводилось вычисление массы миокарда ЛЖ по
корригированной
КДР3)]+0.6,
формуле
индекса
ММЛЖ=0.8x1.04x[(КДР+МЖП+ТЗС)3-
ASE:
относительной
толщины
стенок
в
диастолу
(ИОТ=(МЖП+ТЗС)/КДР) [Васюк Ю.А., 2003] и индекса массы миокарда
(ИММ ЛЖ=ММЛЖ/ППТ, где ППТ (м2) – площадь поверхности тела,
определяемая по формуле: ППТ=0.007184хВес(кг)0.425хРост(см)0.725) [Dubois
D., 1976]. Также вычисляли конечный диастолический (КДО ЛЖ, мл) и
конечный систолический (КСО ЛЖ, мл) объем по формуле: V=7xD3/2.4+D,
где D-КДР ЛЖ или КСР ЛЖ, соответственно [Белов Ю.В., 2002]. Объем
миокарда левого желудочка (Vm) ЛЖ (см3) рассчитывали по формуле:
VmЛЖ= 1.047х(КДР ЛЖ+ТЗС ЛЖ во время диастолы)3-1,047хКДР ЛЖ3
[Белов Ю.В., 2002]; общий объем (ОО) ЛЖ (см3): ОО ЛЖ = КДО ЛЖ+Vm
ЛЖ [Белов Ю.В., 2002], конечно-диастолический индекс (КДИ): КДИ =
КДО/ППТ; индекс конечного диастолического размера (ИКДР): ИКДР=
КДР/ППТ [Мазур В.В., 2004].
За критерий гипертрофии левого желудочка принимался показатель
ИММ ЛЖ, превышающий 117 г/м2 у мужчин, 104 г/м2 у женщин [de Simone,
2007]. На основании значении ИММ и ИОТ выделяли следующие типы
ремоделирования миокарда: I тип – нормальная геометрия (ОТСМЖП≤ 0.45
и
ОТСЗСЛЖ≤0.45),
II
тип
–
концентрическое
ремоделирование
9
(ОТСМЖП>0.45 и ОТСЗСЛЖ>0.45), III тип – изолированная гипертрофия
МЖП (ОТСМЖП>0.45 и ОТСЗСЛЖ≤0.45), IV тип – изолированная
гипертрофия ЗС ЛЖ (ОТСМЖП≤0.45 и ОТСЗСЛЖ>0.45), V тип –
концентрическая гипертрофия (ИММ>117 г/см2 и ИОТ >0,45), VI тип –
эксцентрическая гипертрофия без дилатации полости ЛЖ (ИММ>117 г/см2,
ИОТ<0.45, ИКДР<3.1), VII тип – эксцентрическая гипертрофия с дилатацией
полости ЛЖ (ИММ>117 г/см2, ИОТ<0.45, ИКДР>3.1).
Молекулярно-генетический анализ. ДНК выделяли из цельной
венозной крови методом фенольно-хлороформной экстракции [Mathew M. et
al., 1984]. Суммарную РНК выделяли из периферической крови с
использованием набора AquaPure RNA Isolation Kit компании Bio-Rad в
соответствии с протоколом фирмы-производителя. Комплементарную ДНК
получали из 3-5 мкг суммарной РНК реакцией обратной транскрипции с
использованием oligo(dT)12-18 праймера (Синтол, Россия) и обратной
транскриптазы М-MuLV (MBI Fermentas, США). Количественную ПЦР в
реальном времени проводили в приборе iCycler iQTM Real-Time PCR
Detection
System (Bio-Rad, США). Для определения
уровня
мРНК
использовали микроматрицы, содержащие праймеры к 84 генам цитокинов и
их рецепторов (RT2ProfilerTM PCR Array, SuperArray Bioscience Corporation,
США), а также RT2 SYBR Green/Fluorescein qPCR Master Mix.
Анализ
генетического
полиморфизма
осуществляли
методом
полимеразной цепной реакции (ПЦР) на амплификаторе «Терцик» (ДНКТехнология, Россия). Анализ продуктов ПЦР проводили при помощи
электрофореза в агарозном или полиакриламидном геле с последующим
окрашиванием раствором бромистого этидия и визуализацией в УФ-свете.
Методы
Статистическая
статистического
обработка
анализа
полученных
результатов
данных
исследования.
проводилась
с
использованием пакета прикладных программ Statistica 6.0, программного
обеспечения MS Exel 98 (Мicrosoft) и компьютерной программы RxS (Rows x
Columns) [Roff P.A. et al., 1989]. Частоты генотипов и аллелей сравнивали с
10
использованием точного двустороннего критерия Фишера. Относительный
риск заболевания (OR, соотношение шансов, odds ratio) вычисляли по
формуле J. Bland (2000). Соответствие наблюдаемого распределения
значений количественных показателей нормальному закону распределения
оценивалось с использованием критерия Шапиро-Уилка. При сравнении
групп по количественному признаку в случае соответствия его нормальному
распределению использовался t-критерий Стьюдента для независимых групп,
равенство дисперсий распределений признаков проверялось при помощи
критерия Левена, в противном случае применялся U-критерий Манна-Уитни
[Гланц С., 1999; Реброва О. Ю., 2002].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Структура факторов риска сердечно-сосудистых заболеваний у
больных ЭГ
Больные, включенные в исследование, были подразделены на четыре
группы в зависимости от пола и наличия ассоциированных клинических
состояний (АКС), к которым были отнесены инфаркт миокарда и
ишемический инсульт.
Согласно результатам анализа клинических, антропометрических и
демографических данных, исследуемые группы однородны по таким
параметрам, как средний возраст манифестации заболевания, семейная
отягощенность по сердечно-сосудистым заболеваниям, наличию факторов
риска
(курение
и
употребление
алкоголя),
а
также
показателям
артериального давления и частоты сердечных сокращений (табл. 1).
При анализе липидного профиля сыворотки крови установлено, что у
женщин, больных ЭГ, в сравнении с мужчинами, выше уровень общего
холестерина (6.03±1.42 ммоль/л и 5.17±1.25 ммоль/л, Р<0.001). По остальным
показателям липидного спектра кровистатистически значимых различий не
выявлено.
11
Таблица 1
Клиническая характеристика больных ЭГ
Показатель
(M±SD)*
**
N
Средний возраст,
лет
Средний возраст
манифестации ЭГ,
лет
Отягощенность
анамнеза
по АГ
по ИБС
АГ+ИБС
Курение
Алкоголь
Курение + алкоголь
АД сис (мм.рт.ст)
АД диаст (мм.рт.ст)
АД ср (мм.рт.ст)
ЧСС (уд/мин)
ИМТ
До 25 кг/м2
От 25 кг/м2 до 30
кг/м2
От 30 кг/м2 и выше
Холестерин
(ммоль/л)
Мужчины
Женщины
ЭГ
162
ЭГ+ИМ
95
ЭГ+инсульт
41
ЭГ
57
52.92±6.74
50.00±6.30
54.83±7.05
57.22±9.11
43.16±8.32
45.67±10.12
42.19±8.89
41.62±9.98
31 (19.14%)
24 (14.81%)
9 (5.55%)
35 (21.60%)
37 (22.84%)
8 (4.94%)
147.30±17.62
91.56±10.10
110.14±11.71
79.07±11.13
18 (18.95%)
15 (15.79%)
7 (7.37%)
27 (28.42%)
25 (26.36%)
9 (9.47%)
148.03±21.91
91.98±11.26
110.20±14.00
78.23±11.39
9 (21.95%)
8 (19.51%)
2 (4.88%)
9 (21.95%)
6 (14.63%)
1 (2.44%)
148.33±9.83
92.50±6.12
111.11±6.55
76.13±10.03
12 (21.05%)
8 (14.04%)
4 (7.02%)
2 (3.51%)
2 (3.51%)
0 (-)
150.00±22.62
91.75±10.84
111.17±14.12
78.73±9.74
27.74±3.85
68 (41.98%)
59 (36.42)
35 (21.60%)
27.18±3.18
27 (28.42%)
52 (54.74%)
16 (16.84%)
27.79±4.79
14 (34.15%)
20 (48.78%)
7 (17.07%)
29.66±4.21
10 (17.54%)
25 (43.86%)
22 (38.60%)
5.17±1.25
5.14±1.18
5.18±1.05
6.03±1.42
Примечание:* M±SD – среднее значение±стандартное отклонение,
N –
**
численность групп
Состояние внутрисердечной гемодинамики и ремоделирование
миокарда у больных ЭГ, перенесших ИМ, и больных неосложненной ЭГ
Установлено, что у больных ЭГ, перенесших ИМ, имеются более
значимые изменения эхокардиографических показателей, чем у больных
неосложненной ЭГ.
12
В результате сравнения структурно-геометрических показателей у
больных двух групп (ЭГ и ЭГ+ИМ) выявлено преобладание процессов
дилатации левого желудочка у больных, перенесших ИМ. В данной группе
пациентов по сравнению с больными неосложненной ЭГ, не обнаружено
значимого увеличения ММЛЖ и ИММ ЛЖ, но наблюдается уменьшение
толщины задней стенки левого желудочка, а также снижение индекса
относительной толщины миокарда.
Таблица 2
Анализ изменений структурно-геометрических показателей сердца и
внутрисердечной гемодинамики у больных ЭГ
Показатель
КДР ЛЖ, см.
КСР ЛЖ, см.
ПЖ, см.
ЛП, см.
МЖП, см.
ТЗС, см.
ФВ, %
ФУ, %
УО, мл.
КДО ЛЖ, мл.
КСО ЛЖ, мл.
Масса ЛЖ, г.
ИММ ЛЖ, гр/м2.
Vm ЛЖ, см3.
ОО ЛЖ, см3.
КДИ
ИКДР
ИОТ
ЭГ
5.07±0.54
3.51±0.58
2.02±0.49
3.63±0.44
1.15±0.14
1.12±0.14
58.52±6.70
33.15±6.24
73.89±18.58
123.93±31.28
53.39±22.24
223.41±53.91
115.58±27.71
112.82±27.99
236.75±56.03
64.28±16.84
2.63±0.33
0.45±0.06
ЭГ+ИМ
5.54±0.82
4.10±1.02
2.22±0.55
4.15±0.69
1.13±0.22
1.06±0.14
48.83±13.61
26.74±8.50
73.17±17.29
154.19±54.98
81.26±49.99
247.19±74.43
130.76±40.15
126.07±43.92
280.26±95.93
81.63±29.47
2.93±0.48
0.40±0.08
P
<0.001
<0.001
0.02
<0.001
0.38
0.002
<0.001
<0.001
0.22
<0.001
<0.001
0.11
0.01
0.11
0.002
<0.001
<0.001
<0.001
В группе больных ЭГ, перенесших ИМ, выявлены также изменения
гемодинамических показателей: значительное снижение ФВ и ФУ. Тем не
13
менее, уменьшения УО в указанной группе по сравнению с больными
неосложненной ЭГ, не наблюдалось, возможно, за счет увеличения КДО ЛЖ.
Результаты
сравнительного
анализа
структурно-геометрических
параметров и показателей внутрисердечной гемодинамики с учетом типа
ремоделирования представлены в таблицах 3 и 4. Наименьшие значения как
линейных (КДР ЛЖ, КСР ЛЖ), так и объемных показателей (КДО ЛЖ, КСО
ЛЖ) отмечались в группе больных ЭГ с нормальной геометрией ЛЖ,
концентрическим
ремоделированием,
межжелудочковой
перегородки
и
изолированной
задней
стенки
гипертрофией
левого
желудочка.
Максимальные значения показателей КДР ЛЖ, КСР ЛЖ, КДО ЛЖ, КСО ЛЖ
наблюдались у больных с VII типом ремоделирования. Аналогично
происходило изменение массы миокарда ЛЖ. Показатели УО были
минимальны
в
группах
концентрической
межжелудочковой
с
концентрическим
гипертрофией,
перегородки
и
ремоделированием,
изолированной
задней
стенки
гипертрофией
левого
желудочка.
Максимальные значения УО отмечены в группах c VI и VII типами
ремоделирования, что, возможно, является проявлением закона ФранкаСтарлинга,
согласно
которому
УО
ЛЖ
зависит
от
его
конечно-
диастолического объема [Белов Ю.В., 2002].
У больных ЭГ, перенесших ИМ, наблюдались схожие тенденции,
носившие более выраженный характер, а также существенное снижение
толщины стенки левого желудочка. Функциональное состояние ЛЖ,
оцениваемое по показателю ФВ, также изменялось более значительно. Кроме
того, следует отметить, что у больных, перенесших ИМ на фоне
предсуществующей ЭГ, наблюдалось более выраженное увеличение ММЛЖ
в группе пациентов с концентрической гипертрофией ЛЖ
Таблица 3
Основные структурно-геометрические показатели и параметры внутрисердечной гемодинамики у больных ЭГ в зависимости от
типа ремоделирования левого желудочка
Показатель
КДР
КСР
ФВ
УО
КДО
КСО
ИММ
ИОТ
I
5.01±0.37
3.4±0.39
60.00±6.12
72.54±11.36
119.81±20.75
48.33±12.90
108.72±14.46
0.39±0.03
II
4.57±0.34
3.07±0.40
57.42±7.64
61.13±15.72
96.55±17.37
37.91±10.50
100.02±15.43
0.52±0.04
Типы ремоделирования
III
IV
V
4.73±0.39
4.64±0.16
5.11±0.35
3.18±0.36
3.26±0.11
3.72±0.57
57.25±9.57
58.71±1.89
57.96±4.51
67.25±9.50
71.86±12.68
71.05±11.59
104.39±19.72 99.62±8.08
125.28±19.21
40.81±11.78
42.83±3.62
60.86±25.25
91.98±15.27
108.73±10.17 132.96±11.65
0.46±0.02
0.46±0.03
0.49±0.05
VI
5.60±0.31
3.80±0.59
59.76±8.06
90.79±14.10
153.98±19.00
64.32±21.05
136.34±14.57
0.42±0.04
VII
6.08±0.48
4.43±0.53
55.50±9.12
93.42±32.21
187.07±32.61
90.84±25.53
177.37±30.70
0.38±0.04
Таблица 4
Основные структурно-геометрические показатели и параметры внутрисердечной гемодинамики у больных ЭГ,
перенесших ИМ, в зависимости от типа ремоделирования левого желудочка
Показатель
КДР
КСР
ФВ
УО
КДО
КСО
ИММ
ИОТ
I
5.14±0.39
3.59±0.56
52.53±11.33
71.50±12.27
127.25±21.62
55.96±21.40
93.82±13.91
0.37±0.04
II
4.56±0.23
3.05±0.34
59.88±9.34
57.00±9.72
95.79±10.97
37.10±9.76
105.43±16.63
0.53±0.05
Типы ремоделирования
III
IV
V
4.82±0.23
4.60±0.14
5.29±0.60
3.37±0.36
2.95±0.07
3.82±0.75
53.33±13.65
67.00±2.83
54.90±4.51
60.00±11.42
65.00±7.07
72.33±12.41
108.69±12.31
97.40±7.01
136.97±37.22
47.03±12.60
33.61±1.97
66.08±31.83
93.54±10.64
91.40±15.83
164.29±44.55
0.44±0.02
0.46±0.00
0.51±0.05
VI
5.58±0.32
4.14±0.58
49.00±11.05
77.85±14.44
153.20±20.12
78.10±24.73
132.10±13.46
0.40±0.03
VII
6.47±0.70
5.19±0.96
37.25±11.78
82.19±21.67
216.76±54.16
135.01±55.12
163.03±36.80
0.33±0.07
15
Анализ ассоциаций полиморфизма генов системы цитокинов с
эссенциальной гипертензией
Выявлены статистически значимые различия между группой больных и
контрольной в распределении частот аллелей и генотипов по полиморфизму
генов IL1B и IL10 (табл. 5).
В группе мужчин, больных ЭГ, отмечено значительное снижение
частоты гомозигот по аллелю IL1B-511*T и повышение частоты генотипа
IL1B-511*T/*С, что позволяет оценивать генотип IL1B-511*T/*T как маркер
пониженного
(OR=0.53,
CI:
0.29-0.96), а генотип
IL1B-511*T/*С –
повышенного риска ЭГ (OR=1.63, CI: 1.06-2.51). На основании наблюдаемых
различий по частотам генотипов полиморфизма -627C/A гена IL10 между
группами больных ЭГ и контрольной, можно отнести генотип IL10-627*C/*C
к маркерам пониженного (OR=0.56, CI: 0.35-0.88), а генотип IL10-627*C/*А –
к маркерам повышенного риска ЭГ у мужчин (OR=1.75, CI: 1.09-2.81).
Согласно результатам проведенного анализа, у женщин риск раннего
развития заболевания ассоциирован с полиморфизмом генов IL12B и IL1RN.
Было обнаружено, что частота генотипа IL1RN*1/IL1RN*1 и аллеля IL1RN*1
понижена в группе больных ЭГ с развитием заболевания в возрасте до 30 лет
(22.22% и 53.28%, P=0.04, OR=0,24, CI: 0.07-0.86). У мужчин риск раннего
развития заболевания связан с полиморфизмами генов IL1B и AGT. Генотип
IL1B -511*T/*T выявлен с меньшей частотой в группе больных с развитием
заболевания до 45 лет (10.68% и 21.13%, P=0.04, OR=0.45, CI: 0.21-0.95).
Частота генотипа AGT 174*T/*T значительно повышена в группе больных ЭГ
с дебютом заболевания до 45 лет (80.21% и 60.78%, P=0.018, OR=2.61 CI:
1.23-5.55), так же, как и аллеля AGT 174*T (90.1% и 79.41%, P=0.019,
OR=2.36, CI: 1.2-4.63). Генотип AGT174*T/*M в этой группе встречался реже
(19.79% и 37.25%, P=0.029, OR=0.42, CI: 0.2-0.9), как и аллель AGT 174*M
(9.9 и 20.59%, P=0.019, OR=0.42, CI: 0.21-0.82).
16
Таблица 5
Результаты анализа ассоциаций полиморфизма генов IL1B и IL10 с ЭГ
Аллель
Частота аллеля,
%
К
Р
Генотип
ЭГ
*T
43.92
41.29
*C
56.08
58.71
*C
68.99
76.71
*A
31.01
23.29
IL1B, -511 Т/С
0.53
*T/*T
*T/*C
0.53
*C/*C
IL10, –627 C/A
0.04
*C/*C
*C/*A
0.04
*A/*A
Частота
генотипа, %
Р
К
ЭГ
20.99
45.86
33.15
12.26
58.06
29.68
0.04
0.03
0.56
47.47
43.04
9.49
61.64
30.14
8.22
0.016
0.024
0.84
Анализ ассоциаций полиморфизма генов системы цитокинов с
сердечно-сосудистыми осложнениями эссенциальной гипертензии
Риск развития сердечно-сосудистых осложнений ЭГ ассоциирован с
аллельными вариантами генов IL1B, IL-6, IL-10, IL-12B и TNFA. Выявлены
маркеры повышенного риска развития инсульта: генотип IL1B -511*C/*C
(OR=2.14, CI: 1.05-4.35, P=0.039), IL-6 -572*G/*G (OR=2,52, CI: 1.05-6.08,
P=0.037), IL-12B 1159*C/*A (OR=2.47, CI: 1.21-5.04, P=0.016) и TNFA308*G/*A (OR=2.22, CI: 1.05-4.69, P=0.04). Также обнаружены маркеры
пониженного риска развития инсульта: генотип IL1B -511*T/*C (OR=0,45, CI:
0.21-0.95, P=0.037), IL-10−627*C/*C (OR=0.49, CI: 0.24-0.99, P=0.049) и IL12B 1159*A/*A (OR=0.42, CI: 0.2-0.86, P=0.019).
Анализ ассоциаций аллельных вариантов генов-кандидатов с
гипертрофией левого желудочка у больных ЭГ
В группах больных ЭГ с гипертрофией левого желудочка (ГЛЖ) и
пациентов без ГЛЖ выявлены статистически значимые различия частот
генотипов и аллелей VNTR-полиморфизма в интроне 4 гена NOS3. Генотип
NOS3*4A/*4B и аллель NOS3*4A являются маркерами повышенного риска
17
(OR=3.33,
CI:
1.38-7.91,
P=0.01
и
OR=2.47,
CI:
1.17-5.2,
P=0.02,
соответственно), а генотип NOS3*4B/*4B и аллель NOS3*4B ─ пониженного
риска развития ГЛЖ у больных ЭГ (OR=0.31, CI: 0.13-0.73, P=0.01 и
OR=0.41, CI: 0.19-0.86, P=0.01). Ассоциаций аллельных вариантов других
генов с ГЛЖ у больных ЭГ не найдено.
Анализ ассоциаций по сочетаниям генотипов полиморфизма генов
цитокинов с эссенциальной гипертензией
Обнаружено, что риск развития ЭГ понижен у мужчин при наличии
сочетания генотипов IL10-627*С/*С- IL12B 1159 *A/*A (OR=0.46, CI: 0.280.75, P=0.002) и IL1B-511*T/*T- IL6 -572*G/*G (OR=0.38, CI: 0.18-0.8,
P=0.013), и повышен – при наличии сочетания IL1B-511*T/*C- IL6 -572*G/*G
(OR=1.76, CI: 1.09-2.84, P=0.022). В то же время, у женщин повышение риска
развития ЭГ выявлено в случаях сочетания генотипов IL12B 1159 *A/*CIL6 572*G/*C C (OR=17.43, CI: 2.14-141.64, P=0.005) и IL12B 1159 *C/*CIL6 572*G/*G (OR=13.22, CI: 1.59-109.83, P=0.02).
Ряд сочетаний генотипов полиморфных вариантов генов цитокинов
ассоциирован с сердечно-сосудистыми осложнениями ЭГ. Сочетания
генотипов IL12B 1159 *A/*C – IL6 572*G/*G (OR= 3.97, CI: 1.88-8.39,
P<0.001) и IL1B-511*C/*C- IL6 -572*G/*G (OR=2.82, CI: 1.31-6.03, P=0.01)
являются маркерами повышенного риска развития инсульта. Сочетание
генотипов IL10-627*С/*A- IL12B 1159 *A/*A ассоциировано с инфарктом
миокарда (OR=2.26, CI: 1.16-4.39, P=0.017). Ассоциации каких-либо
сочетаний генотипов аллельных вариантов генов цитокинов, AGT и NOS3 с
ЭГ или ее сердечно-сосудистыми осложнениями не выявлено.
18
Сравнительный анализ профиля экспрессии в клетках периферической
крови генов цитокинов и их рецепторов у больных ЭГ и в контрольной
группе
Проведено изучение экспрессии 84 генов цитокинов и их рецепторов в
клетках периферической крови больных ЭГ и контрольной группы.
Благодаря количественному анализу выявлен 21 ген, чья экспрессия
изменяется в группе больных ЭГ по сравнению с контрольной группой.
Обнаружено повышение транскрипционной активности генов CCL16, CCL17,
CCL18, CCL19, CCL23, CCL8, CCR6, CCR8, CX3CR1, CXCL1, CXCL13,
ICEBERG, IL13, IL17C, IL1F10, IL1F6, ILF9, SPP1, CD40LG, XCR1 и
понижение транскрипционной активности гена CCL2. Результаты анализа
литературы, касающейся изучения профиля экспрессии генов цитокинов у
больных ЭГ, показали, что исследований в этой области чрезвычайно мало.
Тем не менее, полученные данные согласуются с результатами А. В.
Тимофеевой с соавт. (2007), которые также обнаружили изменение
транскрипции 80 генов у больных ЭГ, в том числе генов хемокиновых
рецепторов CXCR4 и CX3CR1. Данные хемокины участвуют в развитии
неспецифического воспаления сосудистой стенки, пролиферации и апоптозе
гладкомышечных клеток, развитии окислительного стресса в лейкоцитах и
клетках эндотелия [Shaw A., 2003], и, таким образом, могут влиять на
структурные изменения стенок сосудов при ЭГ.
ВЫВОДЫ
1. Развитие эссенциальной гипертензии характеризуется формированием
концентрических вариантов ремоделирования миокарда левого желудочка. У
больных эссенциальной гипертензией, перенесших ИМ, чаще наблюдаются
эксцентрическая гипертрофия, в том числе, с дилатацией левого желудочка.
У
больных
эссенциальной
гипертензией,
перенесших
инсульт,
не
19
обнаружено значимых отличий типов ремоделирования миокарда левого
желудочка по сравнению с больными неосложненной гипертензией.
2.
Аллельные
варианты
генов
IL1B
и
IL10
ассоциированы
с
эссенциальной гипертензией у мужчин. Риск развития эссенциальной
гипертензии повышен у носителей генотипов IL1B -511*T/*C и IL-10 627*C/*A, и понижен – у носителей генотипов IL1B -511*T/*T и IL-10 627*C/*C.
3.
Значимость аллельных вариантов генов-кандидатов для определения
риска развития ЭГ проявляется в зависимости от возраста и гендерной
принадлежности. Риск раннего развития ЭГ повышен у женщин с
генотипами IL1RN*1/IL1RN*1 и IL-12B 1159*C/*C, а также у мужчин с
генотипами IL1B -511*T/*T и AGT 174*T/*T. Генотип AGT174*T/*M и аллель
AGT 174*M маркируют пониженный риск раннего развития ЭГ у мужчин.
4.
Риск
развития
сердечно-сосудистых
осложнений
эссенциальной
гипертензии ассоциирован с полиморфными вариантами генов IL1B, IL-6, IL10, IL-12B и TNFA. Маркерами повышенного риска развития инсульта
являются генотипы IL1B -511*C/*C, IL-6 -572*G/*G, IL-12B 1159*C/*A и
TNFA-308*G/*A; маркерами пониженного риска – генотипы IL1B -511*T/*C,
IL-10−627*C/*C и IL-12B 1159*A/*A.
5.
VNTR-полиморфизм в интроне 4 гена эндотелиальной синтазы оксида
азота (NOS3) ассоциирован с гипертрофией левого желудочка у больных
эссенциальной гипертензией. Аллель NOS3*4A и генотип NOS3*4B/*4A
соотносятся с повышенным риском развития гипертрофии левого желудочка
у больных эссенциальной гипертензией. Генотип NOS3*4В/*4В и аллель
NOS3*4В являются протективными в отношении развития гипертрофии
левого желудочка у больных эссенциальной гипертензией.
6.
В формировании структуры наследственной предрасположенности к
эссенциальной
гипертензии
и
ее
сердечно-сосудистых
осложнений
участвуют сочетания генотипов полиморфных вариантов генов цитокинов. У
мужчин при сочетании генотипов IL10-627*С/*С – IL12B 1159 *A/*A и IL1B-
20
511*T/*T – IL6 -572*G/*G отмечается пониженный, а при сочетании
генотипов IL1B-511*T/*C – IL6 -572*G/*G – повышенный риск развития
эссенциальной гипертензии. Сочетание генотипов IL12B 1159 *A/*C –
IL6 572*G/*C C и IL12B 1159 *C/*C – IL6 572*G/*G является протективным в
отношении развития эссенциальной гипертензии у женщин. Сочетания
генотипов IL12B 1159 *A/*C – IL6 572*G/*G
и IL1B-511*C/*C – IL6 -
572*G/*G являются маркерами повышенного риска развития инсульта, а
генотипов IL10-627*С/*A – IL12B 1159 *A/*A – повышенного риска инфаркта
миокарда.
У больных эссенциальной гипертензией в клетках периферической
7.
крови повышен уровень экспрессии генов CCL16, CCL17, CCL18, CCL19,
CCL23, CCL8, CCR6, CCR8, CX3CR1, CXCL1, CXCL13, ICEBERG, IL13,
IL17C, IL1F10, IL1F6, ILF9, SPP1, CD40LG, XCR1 и понижен – гена CCL2.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
1.
Для оценки риска развития эссенциальной гипертензии у этнических
татар
целесообразно
проводить
генотипирование
по
полиморфным
вариантам -627С/А гена IL10 и -511Т/C гена IL1B.
2.
Для
оценки
риска
развития
сердечно-сосудистых
осложнений
эссенциальной гипертензии рекомендуется проводить генотипирование по
полиморфным вариантам генов IL1B, IL-6, IL-10, IL-12B и TNFA.
3.
При выявлении генетических маркеров повышенного риска заболевания
необходимо проводить раннюю первичную профилактику заболеваний у лиц,
относящихся к группе риска развития эссенциальной гипертензии, выбор
адекватных методов терапии – у лиц с диагностированной эссенциальной
гипертензией.
21
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1.
Timasheva Y. R. Association of interleukin-6, interleukin-12 and interleukin-
10 genes polymorphisms with essential hypertension in Tatars from Russia.
(Ассоциация полиморфизма генов интерлейкина-6, 10 и 12 с эссенциальной
гипертензией у татар в России). / Nasibullin T. R., Zakirova A. N., Mustafina O.
E. // Journal of Biochemical Genetics. – 2008. – Vol. 46, № 1-2. – P. 64-74.
2.
Мустафина О. Цитокины и атеросклероз: молекулярные механизмы
патогенеза. / Тимашева Я. Р. // Молекулярная медицина. – 2008. - №1. –
С.56-68.
3.
Timasheva Y. R. Interleukin-1 family genes polymorphisms are associated
with essential hypertension (Полиморфизмы генов семейства интерлейкина-1
ассоциированы с эссенциальной гипертензией) / Nasibullin T. R., Zakirova A.
N., Mustafina O. E. // 2nd International Symposium «Integrated biomarkers in
cardiovascular diseases». − Berlin, 2007. − P. 66.
4.
Тимашева Я. Р. Полиморфизм гена фактора некроза опухолей альфа
у больных эссенциальной гипертензией. / Насибуллин Т. Р., Закирова А.
Н., Мустафина О. Е. // Кардиоваскулярная терапия и профилактика. −
2007 −. №6. С. 5-9.
5.
Timasheva Y. R. Interleukin-10 gene polymorphism is associated with
essential hypertension in Tatars from Russia (Полиморфизм гена интерлейкина10 ассоциирован с эссенциальной гипертензией у татар, проживающих в
России / Nasibullin T. R., Zakirova A. N., Mustafina O. E. // Hypertension: 12 th
Annual Meeting of the European Council for Cardiovascular Research. − Nice,
2007. − V. 50, N. 4. − P. 817-818.
6.
Тимашева
Я.
Р.
Полиморфизм
генов
цитокиновой
сети
и
предрасположенность к эссенциальной гипертензии. / Матвеева В. А.,
Насибуллин Т. Р., Мустафина О. Е. // Биомика – наука XXI века. Материалы
школы-семинара молодых ученых УНЦ РАН и Волго-Уральского по физикохимической и биотехнологии, Уфа, 2007. – C. 123-124.
22
7.
Тимашева Я. Р. Анализ ассоциаций полиморфизма -627С/А гена
интерлейкина-10
с
сердечно-сосудистыми
заболеваниями
в
Башкортостане / Тулякова Г. Х., Насибуллин Т. Р., Закирова А. Н.,
Карамова И. М., Мустафина О. Е. // Уральский медицинский журнал. –
2007. − № 7(35). − С. 68-71.
8.
Timasheva Y. R. Polymorphisms of the IL1B and IL1RN genes are associated
with essential hypertension in Tatars from Russia (Полиморфизмы генов IL1B и
IL1RN ассоциированы с эссенциальной гипертензией у татар, проживающих
в России) / Nasibullin T. R., Zakirova A. N., Mustafina O. E. // European Journal
of Human Genetics: European Human Genetics Conference. − Nice, 2007. − V.
14, suppl. 1. − P. 245.
9.
Timasheva Y. R. Tumor necrosis factor alpha gene polymorphism is
associated with the risk of stroke in hypertensive patients (Полиморфизм гена
фактора некроза опухолей альфа ассоциирован с риском инсульта у больных
гипертензией) / Nasibullin T. R., Zakirova A. N., Mustafina O. E. // European
Meeting on Hypertension. − Milan, 2007. − P. 262.
10. Тимашева Я. Р. Анализ ассоциаций про- и противовоспалительных
цитокинов с эссенциальной гипертензией / Закирова А. Н., Карамова И. М.,
Мустафина О. Е. // Материалы Российского национального конгресса
кардиологов. − Москва, 2006. − С. 371.
11. Timasheva Y. R. Association of cytokine genes polymorphisms with essential
hypertension in Tatars from Russia (Ассоциация полиморфизмов генов
цитокинов с эссенциальной гипертензией у татар, проживающих в России) /
Nasibullin T. R., Zakirova A. N., Mustafina O. E. // Balkan Journal of Medical
Genetics: 7th Balkan Meeting on Human Genetics. − Skopje, 2006 − V. 9. − P. 95.
12. Timasheva Y. R. Association of interleukin-6 gene polymorphism with
essential hypertension in Tatars from Russia (Ассоциация полиморфизма гена
интерлейкина-6 с эссенциальной гипертензией у татар, проживающих в
России) / Nasibullin T. R., Zakirova A. N., Mustafina O. E. // Atherosclerosis. −
Rome, 2006. − V. 7, N. 3. − P.387-388.
23
13. Тимашева
Я.
Р.
Полиморфизм
генов
цитокиновой
сети
и
предрасположенность к эссенциальной гипертензии / Насибуллин Т. Р.,
Мустафина О. Е. // Материалы международной конференции «Генетика в
России и мире». − Москва, 2006. − С. 128.
14. Тимашева Я. Р. Полиморфизм генов интерлейкинов у больных
эссенциальной гипертензией / Насибуллин Т. Р., Мустафина О. Е., Закирова
А. Н., Хомякова Н. Г. // Медицинская иммунология. − 2006. − Т.8, № 2-3. − С.
408.
15. Timasheva Y. R. The interleukin-10 -627C/A promoter polymorphism is
associated with essential hypertension in Tatars from Russia (Полиморфизм 627C/A гена интерлейкина-6 ассоциирован с эссенциальной гипертензией у
татар, проживающих в России) / Nasibullin T. R., Zakirova A. N., Mustafina O.
E. // European Journal of Human Genetics: European Human Genetics Conference.
− Amsterdam, 2006. − V. 14, suppl. 1. − P. 134.
16. Тимашева
Я.
Р.
Полиморфизм
гена
интерлейкина-10
и
предрасположенность к эссенциальной гипертензии / Насибуллин Т. Р. //
Материалы Девятой Всероссийской медико-биологической конференции
молодых исследователей «Человек и его здоровье». − Санкт-Петербург, 2006.
− С. 328−329.
17. Тимашева
Я.
Р.
Роль
генов
цитокиновой
сети
в
патогенезе
эссенциальной гипертензии. // Материалы XIII международной конференции
студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2006». − Москва,
2006. − С. 221−222.
18. Тимашева Я. Р. Полиморфизм гена интерлейкина-10 у больных
эссенциальной гипертензией из Республики Башкортостан / Насибуллин Т.
Р., Хомякова Н. Г., Закирова А. Н., Мустафина О. Е. // Материалы II
Всероссийской
научно-практической
конференции
«Артериальная
гипертония в практике врача терапевта, невролога, эндокринолога и
кардиолога». – Москва, 2006. – С. 61.
24
Тимашева Янина Римовна
Роль полиморфизма и уровня экспрессии генов цитокиновой сети в
формировании молекулярно-генетических основ предрасположенности
к эссенциальной гипертензии
14.00.06 ─ кардиология
03.00.15 ─ генетика
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук