Иммунитет к дистрофину при мышечной дистрофии Дюшенна.

Иммунитет к дистрофину при мышечной дистрофии Дюшенна.
Мышечная дистрофия Дюшенна является Х-хромосомной, наследственной болезнью, возникающей у 1 в 3500
новорожденных мальчиков. Заболевание проявляется прогрессирующей слабостью мышц, что обусловлено
мутациями в гене, кодирующем дистрофин. Дистрофин большой (427 кДа) белок цитоскелета. Ген
дистрофина имеет 79 экзонов и слишком велик, чтобы поместиться внутри рекомбинантного аденоассоциированного вируса(РААВ). Поэтому мы использовали функциональный миниатюрный трансген
дистрофина, что частично восстанавливает мышечную силу в мышиных моделях мышечной дистрофии
Дюшенна, и предлагает один подход к лечению заболевания у человека. Наличие клеточного иммунитета к
терапевтическому дистрофину является препятствием для успешной генной терапии с РААВ, особенно у
пациентов со смещением рамки считывания при делеции в гене МДД. Мы исследовали вызывает ли
дистрофин, терапевтической трансгена, Т-клеточный иммунитет у больных с мышечной дистрофией
Дюшенна.
Методы
Мы отобрали шесть мальчиков со смещением рамки считывания при делецях в гене дистрофина в этом
исследовании, которое было одобрено Экспертным советом Национальной детской больницы. Письменное
информированное согласие было получено от родителей всех пациентов. Пациенты 9 лет и старше
принимались также при условии согласия в письменной форме. Это исследование было начато 15 марта 2006
года, и завершится 3 апреля 2009 года Asklepios были изготовлены вектор РААВ, используемые в
исследовании. При регистрации, четыре пациента получали стандартную терапию глюкокортикоидами для
замедления наступления слабости мышц. Лечение было продолжено на протяжении всего исследования
(Рисунок 1А). Все пациенты получали внутривенно метилпреднизолон за 4 часа до введения вектора, чтобы
уменьшить возможное местное воспаление. Чтобы свести к минимуму боль во время процедуры, пациент
получил седацию во время инъекции вектора и в время биопсии мышц. Один бицепс обрабатывали РААВ,
который включил модифицированный капсид серотипа 2 и функциональной трансген мини-дистрофина, что
составляет приблизительно 40% от последовательности гена дистрофина человека 11-Кб (подробнее см
дополнительном приложении, доступны с полным текстом данной статьи на NEJM.org). Пациенты 1, 2, и 3
получили низкую дозу вектора (2,0 × 1010 векторных геномов на килограмм массы тела), и пациенты 4, 5, и 6
получили дозу, которая была выше (1,0 × 1011 вектора геномы на килограмм) (1А). Неблагоприятные
события показаны в таблице1. Мононуклеары периферической крови (МНПК) были исследованы при
иммуноферментном анализе (ELISPOT), также проведен анализ интерферона-γ на реактивность к минидистрофину. Три бассейна из 40 перекрывающихся синтетических пептидов (назначенных MDP1, MDP2 и
MDP3), охвативших всю последовательность мини-дистрофина были использованы, чтобы стимулировать
МНПК в анализе ELISPOT (см дополнительном приложении для детального описания методов). Как и
ожидалось, бассейны пептидов дистрофина не стимулировали реакцию интерферона-γ у 12 необработанными
лиц, которые не имеют мышечной дистрофии Дюшенна (данные не показаны).
Результаты
Мы оценивали эффективность переноса генов путем анализа биоптатов двуглавой мышцы, в которую
вводился вектор, и необработанной двуглавой мышцы на 42-й день (у больных 1, 3, 4, и 6) или 90-й день (у
больных 2 и 5). У всех пациентов, ДНК-вектор был обнаружен в количествах в диапазоне от 0,01 до 2,56
геномных копий на диплоидный геном в обработанных мышцах, но не был обнаружен в необработанном
контралатеральном бицепсе. Мышечных волокон, экспрессирующие мини-дистрофин, не были обнаружены в
двух образцах биопсии, которые были рассмотрены на 90-й день, но они были обнаружены в двух из четырех
образцов (взятые у пациентов, 3 и 6), которые были определены на день 42 с использованием антител
(MANDYS3), которые обнаруживают N-терминальный конец последовательности
дистрофина. Мы
обнаружили, что пациент 3 имел три или четыре дистрофин-положительных волокна, и пациент 6 имел одно
положительное волокно (данные не показаны). Эти волокна были отрицательными на наличие дистрофина
при иммуногистохимическом окрашивании с антителоми, которые обнаруживают С-конец, который
удаляется при приготовлении мини-дистрофина комплементарной ДНК для размещения в РААВ.
Неспособность установить долгосрочную экспрессию трансгена побудило нас измерить клеточные иммунные
ответы на мини-дистрофин у всех шести пациентов. Мини-дистрофин-специфические Т-клетки не были
обнаружены у пациентов 1 и 3 (которые получили низкие дозы вектора), по оценке с интерфероном-γ путем
ELISPOT анализа (Рисунок 1В и 1D). Пациент 2, который также получил низкую дозу вектора, имел
свидетельство деятельности Т-клеток против пептида MDP2 на 15-й день после лечения (Рисунок 1C).
Реакция достигла максимума на 30 день, медленно снизилась в течение следующих 3 месяцев, и была
периодически положительной после 120 дня (Рисунок 1C). Т-клеточные ответы проявлялись с задержкой у
пациентов 5 и 6 (рис 1F и 1G, соответственно), получавших высокие дозы вектора, и превысили порог
обнаружения 50 клеток на 1 млн РВМС только на 60-й день. T -клеточный ответ на MDP3 неожиданно
обнаружен до введения вектора у больной 4 и был периодически позитивным в течение 2 лет наблюдения
(Рисунок 1E). Доставка высокой дозы вектора при генной терапии в двуглавой мышце пациента 4 не вызывает
быстрое увеличение удельной активности Т-клеток, что наблюдалось у больного 2.
Клеточный иммунитет дополнительно проанализирован у пациента 2 и пациента 5, чтобы лучше понять
различия в сроках и продолжительности реакции на мини-дистрофин. Переходные характеристики Т-клеток
обнаружены у пациента 5 на 60-й день. Один эпитоп экзона-7 был признан HLA-B * 1801-ограниченными
CD8 + Т-клетками (рис 2А и 2BFigure 2 Характеристика дистрофин-специфического клеточного иммунного
ответа у пациента 5). CD4 + Т-клетки признали два эпитопа, локализованные в составе экзона 8 (рисунок 2в) и
экзона 6 (Рисунок 2D). Поскольку экзоны 3 - 17 были удалены из гена дистрофина у этого пациента, мы
пришли к выводу, что клетки CD4 + и CD8 + T были активированы мини-дистрофином. Эпитоп экзона 6,
представленный HLA-DQA1 * 0505 и HLA-DQB1 * 0301 (Рисунок 2E) был сопоставлен с сегментом
дистрофина, состоящим из 10 аминокислот (рис 2F, с аминокислотами, обозначенные одним буквенных
символом ) - 163-WSDGLALNAL-172 - что отличается от β-спектрина только в двух позициях (Рисунок 2G).
Т-клетки пациента 5 признали эпитоп дистрофина, но не гомолог β-спектрина, содержащий замену S164R и
L169F, которая предполагает, что гомология между этими высоко связанными клеточными белками
ограничивается, но не устраняет пул эпитопов, доступных для иммунного распознавания. Быстрый MDP2специфический ответ наблюдается у пациента 2 был достигнут при посредничестве CD4 + Т-клеток (Рисунок
3AFigure 3 Мини-Дистрофин клеточных иммунных реакций у пациента 2). Эпитоп был локализован в 2809 2829 положениях аминокислот экзона 57 (Рисунок 3В). Экзон 57 должн иметь сдвиг рамки считывания, так
как осуществлялась делеция экзон 50 у этого пациента. Альтернативный сплайсинг или вторая мутация в гене
МДД может восстановить экспрессию функционального дистрофина в редких ревертантные мышечных
волокнах. Ревертантные волокна были визуализированы в образце от пациента 2 с использованием антител,
направленных против экзонов 55-56 и 59 гена дистрофина(фиг.3С). Экзон 57 была экспрессирован таким
образом Т-клеточным эпитопом в правильной рамке считывания, несмотря на удаление экзона 50. Мы
предположили, что Т-клетки спонтанно примированные по ревертантным волоконам присутствовали до
обработки вектором и ускорили темпы клеточного иммунного ответа к терапевтическому мини-дистрофину.
Действительно, эффективный интерферон-γ был обнаружен, когда криоконсервированные МНПК собранные
до и после лечения вектором стимулировали пептидный эпитоп, охватывающий аминокислоты 2809 - 2829
экзона 57 (Рисунок 3D). Дистрофин-специфические антитела не были обнаружены в сыворотке исследуемых
пациентов, в том числе 2 пациента (данные не показаны).
Существовавший ранее клеточный иммунитет к дистрофину у больной 4, который имел делейию экзонов 49 54 (Рисунок 1А и 1Е), также был связан с выражением ревертантных мышечных волокон. Реакция при
посредничестве CD8 + Т-клеток (рисунок 1 в дополнительном приложении) была направлена против MDP3
который содержит пептиды из R24, H4 и цистеина повторных регионов закодированных экзонами 59 -70
(фиг.1Е). Ревертантные волокона, экспрессирующие экзон 59-70 были обнаружены в двуглавой мышце с
использованием экзон-специфических антител; экспрессированая последовательность дистрофина,
содержащая этот эпитоп в скелетных мышцах пациента 4 (рисунок 1А, и рисунке 2 в дополнительном
приложении). Экспрессия белков HLA 1 класса была больше в обработанной двуглавой мышце, чем в
необработанной мышце у пациента 4, что указывает на возможность признания CD8 + Т-клетками миоцитов
(рис 3 в дополнительном приложении). Аналогичное повышение экспрессии HLA класса I на миоцитов
наблюдалось у больной 5, у которой CD8 + Т-клетки были направлены против эпитопов кодируемого
трансгена (рисунок 3 в дополнительном приложении).
Обсуждение
Влияние клеточного иммунитета на итоги генной терапии человека РААВ вектором еще не определены. Тклеточый иммунитет против AAV капсида был временно связан с потерей трансгенной экспрессии
человеческого фактора свертываемости крови IX из печени одного пациента с гемофилией B, которые
обрабатывали AAV . Конкретных Т-клеточные ответы на капчид также иногда вызванны поставкой РААВ, но
не обязательно приводят к потере трансгенной экспрессии. В других исследованиях на людях трансгенная
экспрессия не была связана с клеточным иммунным ответом против терапевтической передачи белка. Генная
терапия глаз у больных с врожденным амаврозом Лебера может быть успешна
отчасти потому, что целевая ткань считается защищенной от иммунной системы. В других исследованиях,
риск Т-клеточного иммунитета, возможно, был сведен к минимуму с помощью ограниченного числа различий
между последовательностью дефектного гена и терапевтического трансгена, либо потому, что фенотип
заболевания был вызван малым количеством миссенс-мутаций. Обнаружение спонтанно активированных Тклеток в крови больных 2 и 4, прежде чем они получили вектор, было неожиданным. Быстрый Т-клеточный
ответ, что мы наблюдали после передачи терапевтического гена у пациента 2, согласуется с на минидистрофина. Почему ответ не был повышен у пациента 4, неизвестно, но экспрессия мини-дистрофина,
возможно, была недостаточна, чтобы спровоцировать реакцию повторной активации. Мышечное воспаление
необъяснимое осложнение мышечной дистрофии Дюшенна. Глюкокортикоидная терапия продлевает
способность передвигаться от 1 до 2 лет у пациентов с расстройством,
возможно, из-за
противовоспалительного эффекта. Популяция олигоклональных Т-клеток является одной из основных
компонентов воспалительного инфильтрата, который предполагает, что иммунопатогенез может присходить
под действием по крайней мере частично одного или нескольких неопознанных антигенов. Инициируют ли
ревертантные волокна или поддерживающееся воспаление мышц наличие спонтанно активированных Тклеток у больных 2 и 4 показывает, что эти мутантные белки не обязательно вызывает толерантность. Почему
дистрофин-специфические Т-клетки не были обнаружены у остальных четырех исследуемых пациентов перед
лечением вектором требует дальнейшего изучения.
Если дистрофина-специфические Т-клетки локализованы в месте воспаления, анализ мышечных образцов
полностью определит сферу ответа у пациентов с мышечной дистрофией Дюшенна. Условия определения
антигена Т-клетками может также варьироваться среди пациентов с этим заболеванием. Т-клетки, которые
распознают аутоантигены при рассеянном склерозе могут быть активированы с помощью перекрестнореактивных микробных или вирусных антигенов. Этот механизм активации Т-клеток также может быть
активными при мышечной дистрофии Дюшенна, но вряд ли, потому что, по крайней мере два различных
антигена окружающей среды будут активировать
клеточный иммунитет против различных эпитопов
дистрофина у пациентов 2 и 4. Если дистрофин является антигеном, так как это исследование показывает, что
активация Т-клеток может также зависеть от сроков спонтанного сплайсинга генов или мутаций, которые
генерируют ревертантные волокна. Кроме того, это может зависеть от того, как выбор времени событий
согласовывается с созреванием иммунной системы и индукцией толерантности. Наконец, на изменение в
активации или силе спонтанного иммунитета Т-клеток против дистрофина может влиять иммуногенетика
(например, HLA класса I или II) или тяжесть воспаления мышц у пациентов с мышечной дистрофией
Дюшенна. В мышцах после лечения вектором и необработанных бицепсах содержатся воспалительные клетки
CD4 + и CD8 + Т, которые были типичны для мышечной дистрофии Дюшенна. Невозможность определить
мини-дистрофин в биоптатах бицепсов, за исключением образцов двух пациентов, которые были
рассмотрены в начале (на 42 день), согласуется с временной экспрессией трансгенов в связи с иммунной
ликвидацией путем охвата Т-клетками. Циркуляционные антиген-специфические CD8 + Т-клетки у
пациентов 4 и 5 четко имели потенциал, чтобы повреждать миоциты, потому выражение HLA класса I
антигенов было увеличено в скелетных мышцах. Миоциты, визуализированые в двуглавой мышце пациента 2,
не выразили класс HLA II белки (данные не представлены). Поэтому прямое признание этих клеток
дистрофин-специфическими CD4 + Т-лимфоцитами кажется маловероятным. Тем не менее, конкретная
продукция интерферона-γ предполагает, что эти CD4 + Т-клетки типа 1 Т-хелперы, которые могут вызывать
мышечное воспаление. Дистрофин-специфические антитела не были обнаружены в сыворотке крови любых
исследуемых пациентов, в том числе пациента 2, роль гуморального иммунитета против трансгенного
продукта в исходе генной терапии маловероятна. Пропуск экзона 23 и пресечение остановки кодона 24 также
рассматриваются как способы увеличения экспрессии дистрофина у больных с мышечной дистрофией
Дюшенна. Действительно, мы недавно обнаружили дистрофин-специфичные Т-клетки в крови и скелетных
мышцах одного пациента сразу после лечения гентамицином (неопубликованные данные). Неожиданное
выявление аутореактивных дистрофин-специфических Т-клеток показывает, что мониторинг клеточных
иммунных реакций должен быть приоритетом для любой экспериментальной терапии, призванной увеличить
количество дистрофин-положительных мышечных волокон у пациентов с мышечной дистрофией Дюшенна.
Оригинал стать: http://www.nejm.org/doi/full/10.1056/NEJMoa1000228#t=articleи
Переведено проектом МОЙМИО: http://mymio.org/