Диссертация Т.С
advertisement
Казахский национальный университет имени аль-Фараби УДК 602.3:633/635; 615.322 На правах рукописи КУСТОВА ТАТЬЯНА СЕРГЕЕВНА Создание новых комплексных фитопрепаратов для коррекции осложнений экспериментального сахарного диабета 6D070100 – Биотехнология Диссертация на соискание ученой степени доктора философии (PhD) Научные консультанты: доктор биологических наук, профессор Карпенюк Т.А, доктор философии (PhD), профессор Самир A. Росс Республика Казахстан Алматы, 2015 СОДЕРЖАНИЕ НОРМАТИВНЫЕ ССЫЛКИ.................................................................................. 4 ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ ................................................................... 5 ВВЕДЕНИЕ................................................................................................................. 6 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ....................................................................................... 10 1.1 Анализ состояния рынка препаратов из растительного сырья в Республике Казахстан ................................................................................................................. 10 1.2 Перспективные источники в разработке фитопрепаратов ........................... 12 1.3 Современное состояние проблемы сахарного диабета и его осложнений . 17 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ .......................................... 20 2.1 Объекты и материалы исследования .............................................................. 20 2.1.1 Объекты исследования............................................................................... 20 2.1.2 Препараты сравнения ................................................................................. 20 2.1.3 Описание тест-систем ................................................................................ 20 2.1.4 Материалы и реактивы исследования ...................................................... 22 2.2 Методы исследований...................................................................................... 22 2.2.1 Подготовка растительного сырья и экстракция биологически активных веществ растений ................................................................................................. 22 2.2.2 Микробиологические (бактериологические) методы исследования открытых инфицированных ран ........................................................................ 24 а) Микроскопия исследуемого материала ........................................................ 24 б) Посев исследуемого материала на питательные среды и идентификация культур .................................................................................................................. 24 2.2.3 Исследование антимикробной активности растительных экстрактов . 24 2.2.4 Определение антиоксидантного потенциала суммарных экстрактов .. 25 2.2.5 Изучение пролиферативной активности экстрактов in vitro ................. 26 2.2.6 Оценка миграционной активности экстрактов in vitro ........................... 26 2.2.7 Определение константы распределения соединений в системе 1октанол-вода......................................................................................................... 27 2.2.8 Изучение фармакологической активности фитопрепаратов in vivo ..... 27 а) Определение острой токсичности фитопрепаратов .................................... 28 б) Определение местно-раздражающего действия фитопрепаратов ............. 28 в) Методика моделирования сахарного диабета у крыс.................................. 30 г) Методика моделирования гнойной раны у крыс ......................................... 30 д) Гистологическое изучение срезов кожных ран ........................................... 31 2.2.9 Идентификация биологически активных веществ .................................. 31 а) Метод флэш- и тонкослойной хроматографии при разделении суммарных экстрактов............................................................................................................. 31 б) Высокоэффективная жидкостная хроматография для разделения фракций на индивидуальные вещества ............................................................................. 32 2 в) Хромато-масс-спектрометрия ........................................................................ 32 г) Спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР) ............................. 33 2.2.10 Статистическая обработка полученных данных ................................... 33 3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ........................ 34 3.1 Сбор и краткое ботаническое описание образцов растительного сырья ... 34 3.2 Получение экстрактов из растительного сырья ............................................ 41 3.3 Скрининг суммарных экстрактов ................................................................... 43 3.3.1 Изучение антимикробной активности экстрактов .................................. 43 3.3.2 Изучение антиоксидантной активности экстрактов ............................... 50 3.3.3 Изучение миграционной активности экстрактов .................................... 53 3.4 Исследования по разработке состава комплексных фитопрепаратов ........ 55 3.5 Фармакологическое изучение фитопрепаратов, полученных из растительного сырья Vexibia alopecuroides и Salvia deserta ............................. 57 3.5.1 Изучение острой токсичности фитопрепаратов ...................................... 57 3.5.2 Исследование местно раздражающего действия фитопрепаратов V1 и S1, полученных из растительного сырья Vexibia alopecuroides и Salvia deserta ................................................................................................................... 59 3.5.3 Изучение ранозаживляющей активности фитопрепаратов V1 и S1, разработанных на основе растительного сырья Vexibia alopecuroides и Salvia deserta ................................................................................................................... 61 3.6 Выделение и разделение биологически активных веществ из корней Vexibia alopecuroides и Salvia deserta ................................................................... 71 3.6.1 Разделение биологически активных веществ дихлорметанового экстракта Vexibia alopecuroides .......................................................................... 71 3.6.2 Разделение биологически активных веществ дихлорметанового экстракта Salvia deserta ....................................................................................... 79 3.7 Изучение антимикробных свойств фракций и отдельных веществ выделенных из корней Vexibia alopecuroides и Salvia deserta ........................... 87 ЗАКЛЮЧЕНИЕ ....................................................................................................... 91 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ ......................................... 95 ПРИЛОЖЕНИЯ …………………………………………………………………108 3 НОРМАТИВНЫЕ ССЫЛКИ В настоящей диссертации использованы ссылки на следующие стандарты: ГОСТ 7.1–2003. Библиографическая запись. Библиографическое описание. Общие требования и правила составления. ГОСТ 7.32–2001. Отчет о научно – исследовательской работе. Структура и правила оформления. ГОСТ 4517–87. Реактивы. Методы приготовления вспомогательных реактивов и растворов, применяемых при анализе. ГОСТ 23932–90 Е. Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. ГОСТ 1770–74. Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия. ГОСТ 2922–91. Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. ГОСТ 9147–80. Посуда и оборудование лабораторные фарфоровое. Технические условия. ГОСТ 20292–74. Колбы мерные вместимостью 100, 200, 500, 1000 мл. Технические условия. ГОСТ 6709–72. Вода дистиллированная. ГОСТ 24027.1-80 Сырье лекарственное растительное. Методы определения подлинности, зараженности амбарными вредителями, измельченности и содержания примесей. СТ РК 1613-2006 Надлежащая лабораторная практика. 4 ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ АО – Акционерное общество БАВ – Биологически активные вещества ВОЗ – Всемирная организация здравоохранения ВЭЖХ – Высокоэффективная жидкостная хроматография ГСД – Гестационный сахарный диабет ДМСО – Диметилсульфоксид ДХМ – Дихлорметан ПК – Производственный кооператив РК – Республика Казахстан СГС – Система классификации и маркировки химических веществ и смесей ТОО – Товарищество с ограниченной ответственностью ТСХ – Тонкослойная хроматография ЭДТА – Этилендиаминтетрауксусная кислота ad libitum – По желанию ABTS – 2,2'-азино-бис-(этилбензтиазолино-6-сульфонат ATCC – Американская коллекция типовых культур CD3COCD3 – Ацетон-d6 CD3SOCD3 – Диметилсульфоксид-d6 CD3OD – Метанол-d4 CDC13 – Хлороформ–d DMEM – Среда Игла, модифицированная по способу Дульбекко DPPH – 2,2-дифенил-1-пикрилгидразил ESI – Ионизация электрораспылением FID – Пламенно-ионизационный детектор HR-МS – Масс-спектрометрия высокого разрешения IC50 – Концентрация полумаксимального ингибирования LD50 – Средняя смертельная доза m/z – Отношение массы иона к его заряду MDCK – Культура клеток почек собаки MRSA – Метициллин-резистентный Staphylococcus aureus OECD – Организация экономического сотрудничества и развития per os – Пероральное введение v – Объем 5 ВВЕДЕНИЕ Общая характеристика работы. Работа посвящена разработке комплексных фитопрепаратов на основе биологически активных веществ растительного происхождения, обладающих ранозаживляющим, противомикробным и другими свойствами для профилактики и лечения трофических повреждений кожи, характерных для осложнений сахарного диабета. Актуальность исследования. В последние годы отмечается увеличение числа новых зарегистрированных лекарственных препаратов, однако поиск и разработка отечественных лекарственных средств остаются актуальными. При анализе ситуации на современном фармацевтическом рынке РК, отмечается перевес в пользу дорогостоящих импортных препаратов, тогда как потенциал лекарственных и эндемичных растений, распространенных на территории Республики, реализован не в полной мере. Растительные препараты имеют ряд преимуществ, в частности, из-за отсутствия побочных эффектов и низкой токсичности для организма, при этом они могут оказывать комплексное воздействие (антимикробное, противовоспалительное, спазмолитическое, болеутоляющее, антитоксическое и мембраностабилизирующее и др.). Фитопрепараты успешно используются в лечении целого ряда заболеваний, в том числе и при гормонально-метаболических (обменных) изменениях, вызванных сахарным диабетом. Согласно данным, число больных сахарным диабетом неуклонно растет, количество вновь диагностируемых случаев составляет от 6 до 10 % от общего числа диабетиков, среди которых подавляющее большинство страдают II типом сахарного диабета (инсулиннезависимым). Наиболее значимым осложнением сахарного диабета являются трофические язвы (диабетическая стопа), которые характеризуются длительной, вялотекущей и септической раной. Для лечения таких осложнений могут применяться комплексные растительные препараты с определенной направленностью действия. Поэтому разработка эффективных комплексов на основе биологически активных веществ растений, обладающих ранозаживляющим, противомикробным и другими свойствами для профилактики и лечения трофических повреждений кожи, характерных для осложнений сахарного диабета, является актуальной задачей современной науки. Цель исследований - создание новых комплексных фитопрепаратов из растений, произрастающих на территории Республики Казахстан, обладающих антимикробной, антиоксидантной и ранозаживляющей активностями. Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи: Провести экстрагирование биологически активных веществ из растительного сырья, собранного в полевых экспедициях по Алматинской области и Восточному Казахстану; 6 Изучить антиоксидантную, антимикробную и ранозаживляющую активность полученных экстрактов в экспериментах in vitro; Отобрать активные экстракты, не оказывающие цитотоксического действия в экспериментах in vitro и разработать на их основе комплексные фитопрепараты; Изучить влияние фитопрепаратов на морфометрическую и микробиологическую картину в динамике развития кожной раны при экспериментальном сахарном диабете у крыс; Провести идентификацию биологически активных веществ в экстрактах, взятых для создания фитопрепаратов. Объектами исследований являлись собранные в экспедиционных выездах по Алматинской области и Восточному Казахстану дикорастущие растения флоры Казахстана, принадлежащие к разным семействам: Epilobium hirsutum L. (Onagraceae), Rumex confertus Wiild. (Polygonaceae), Vexibia alopecuroides (L.) Jakovl. (Fabaceae), Polygonum undulatum Murr. (Polygonaceae), Rhodiola quadrifida (Pall.) Fisch. et Mey (Crassulaceae), Atraphaxis laetevirens (Ledeb.) Jaub. Et Spach (Polygonaceae), Salvia deserta Schang (Lamiaceae). Методы исследования - Микробиологические, биохимические, цитологические, культуральные, гистологические и морфометрические методы. Научная новизна Научная новизна данной диссертационной работы заключается в следующем: Впервые проведены исследования по поиску растительных экстрактов, обладающих высокой антимикробной, антиоксидантной и ранозаживляющей активностями, на основании которых отобраны два перспективных растения Salvia deserta и Vexibia alopecuroides. На основе комплексных экспериментальных исследований впервые показана фармакологическая эффективность и перспективность использования растений Salvia deserta и Vexibia alopecuroides для производства фитопрепаратов для лечения «диабетической стопы». Подобраны условия выделения биологически активных комплексов из корней Salvia deserta и Vexibia alopecuroides и их разделение на индивидуальные компоненты с использованием флэш-хроматографии. Из экстракта корней Vexibia alopecuroides выделены 9 индивидуальных веществ, относящихся к группе флавоноидов, из экстракта корней Salvia deserta выделены 4 вещества, относящиеся к группе дитерпеноидов. Впервые показана суммарная и индивидуальная антимикробная активность для 9-и веществ, выделенных из растения Vexibia alopecuroides (софорафлавон G, леахианон А , алопекурон А, алопекурон В, алопекурон С, алопекурон F, алопекурон D, софорафлавон I и глаброл) и для таксодиона, выделенного из корней Salvia deserta. На основе извлечений из корней Salvia desertа и Vexibia alopecuroides разработаны новые нетоксичные составы, которые в условиях 7 экспериментального сахарного диабета в 2 раза сокращают сроки заживления ран у животных. Связь работы с планом государственных программ. Диссертационная работа проводилась в рамках государственной программы фундаментальных исследований по проекту «Комплексное исследование экстрактов биологически активных веществ из растений и микроводорослей Казахстана для создания поликомпонентных препаратов по коррекции осложнений сахарного диабета», № госрегистрации: 0113РК00350. Личный вклад автора Автор самостоятельно провел анализ литературных данных по изучаемой проблеме, экспериментальные исследования, статистическую обработку и анализ результатов исследования, написание и оформление рукописи диссертации. Научная и практическая значимость диссертационной работы Научная и практическая значимость диссертационной работы заключается в экспериментальном обосновании возможности и перспективности использования экстрактов, выделенных из корней Vexibia alopecuroides и Salvia deserta, в качестве ранозаживляющих и антимикробных фитопрепаратов при наружном применении на фоне стрептозотоцин-индуцированного сахарного диабета. Результаты изучения ранозаживляющей активности комплексных фитопрепаратов на основе 2 % экстракта из корней Vexibia alopecuroides / Salvia deserta и 5 % Димексида, являются предпосылкой для создания отечественных фитопрепаратов по коррекции такого осложнения диабета, как «диабетическая стопа» и внесения Vexibia alopecuroides и Salvia deserta в Фармакопею Казахстана. Полученные результаты могут быть использованы в научноисследовательской практике, в учебном процессе, при обучении студентов по специальности «Биотехнология», «Химическая технологи органических веществ» и др. Положения, выносимые на защиту Итоги скрининговых исследований на наличие антимикробной, антиоксидантной и ранозаживляющей активностей экстрактов, подтверждающие выбор конечного растительного сырья для разработки фитопрепаратов. Подобранные условия выделения биологически активных комплексов и схемы их разделения с использованием флэш-хроматографии на индивидуальные вещества. Результаты разработки оригинальных фитопрепаратов, для лечения кожных ран больных с диабетической стопой, в состав которых входят извлечения из корней Vexibia alopecuroides и Salvia deserta. Результаты фармакологических исследований разработанных фитопрепаратов, их специфическая активность. Апробация диссертационной работы: Основные материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на 8-и международных 8 научных конференциях и 2-х конференция республиканского значения в их числе: International Conference on Personalized Medicine and Global Health (2013, Astana, Kazakhstan); IX Международный Междисциплинарный Конгресс «Нейронаука для медицины и психологии» (2013, Судак, Украина); 61st International Congress and Annual meeting of the Society for Medicinal Plant and Natural Product Research (2013, Muenster, Germany); European Biotechnology Congress 2014 (2014, Lecce, Italy); American Society of Pharmacognosy 2014 Annual Meeting (2014, Oxford, USA); 62nd International Congress and Annual Meeting of the Society for Medicinal Plant and Natural Product Research (2014, Guimaraes, Portugal); Международная научная конференция по биологии и биотехнологии растений (2014, Алматы, Казахстан); 40th Congress of Federation of the European Biochemical Societies «The Biochemical Basis of Life» (2015, Berlin, Germany); XXII Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых Ломоносов – 2015, секция «Биология» (2015, Москва, Россия); 63rd International Congress and Annual Meeting of the Society for Medicinal and Natural Product Research (2015, Budapest, Hungary); Публикации. По материалам диссертации опубликовано 16 печатных работ, из них 4 статьи в республиканских научных журналах, рекомендованных Комитетом по контролю в сфере образования и науки РК; пять тезисов в изданиях с ненулевым импакт-фактором; две статьи в журналах, входящих в базу данных Thomson Reuters. Подана заявка для получения патента на полезную модель «Лекарственное средство экстракт Вексибии лисохвостной, обладающее ранозаживляющим и противомикробным действием». Номер Государственной регистрации 2015/0289.2. Объем и структура диссертации: Диссертация изложена на 124 страницах машинописного текста и включает нормативные ссылки, обозначения и сокращения, введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, заключение, список использованных источников из 181 наименования, содержит 31 таблицу, 38 рисунков и 15 приложений. 9 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1 Анализ состояния рынка препаратов из растительного сырья в Республике Казахстан По рекомендациям Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), стратегическая безопасность каждого государства обеспечивается при 20 % доле отечественных препаратов на фармацевтическом рынке [1]. Однако в структуре фармацевтического рынка Республики Казахстана (РК), при населении в 17,6 млн. человек, отечественными производителями выпускается всего 11 % различных видов лекарственных средств, (рисунок 1), внесенных в Государственный реестр РК [2]. По сравнению с другими странами и уровнем рекомендованным ВОЗ, отечественная промышленность Казахстана в два раза ниже рекомендованного уровня, так например, в Испании с населением 39 млн. человек, доля производимых препаратов составляет 62%, во Франции (57 млн. человек) – 53%, в России (142 млн.) – 35% [1, c.23]. Рисунок 1 - Доля отечественной фармацевтической продукци на внутреннем рынке, (%) В связи с этим, фармацевтическая промышленность РК находится в сложной ситуации, хотя повышение доли отечественных лекарственных препаратов до 40-50 % к 2014 году было обозначено в качестве первоочередных приоритетов экономического развития страны (согласно Программе по развитию фармацевтической промышленности на 2010-2014 годы, утвержденной Постановлением Правительства Республики Казахстан от 4 августа 2010 года № 791) [3]. Успешное решение проблемы по развитию отечественного фармацевтического производства тесно связано с освоением природных растительных ресурсов страны, разработкой технологий и производством новых лекарственных растительных препаратов. 10 Хотя в настоящее время производством оригинальных отечественных лекарственных препаратов на основе лекарственного растительного сырья занято 25 предприятий, производство невелико и составляет всего 19 % от общего объема отечественных лекарственных средств (рисунок 2). Из них зарегистрированные в Государственном реестре РК как лекарственный препарат - 72 %, лекарственная субстанция - 11 % и в качестве сборов 16 % [2]. Рисунок 2 - Доля отечественных лекарственных средст из растительного сырья, (%) В ходе систематизации ассортимента по видам лекарственных форм показано, что большей частью препараты в Казахстане производят в виде лекарственного растительного сырья (20 %), а также в виде фиточая (18 %), на втором месте по производству стоят жидкие лекарственные формы: настойки (16 %), сиропы (9 %) и жидкости для наружного применения (4 %), в виде твердых лекарственных форм представлены таблетки (6 %), суппозитории (9 %) (рисунок 3). Лидирующие позиции по производству лекарственных средств из растительного сырья занимают такие предприятия Казахстана как, АО «Химфарм» (г. Шымкент), ТОО «Зерде-Фито» (г. Шымкент), ТОО «Карагандинский фармацевтический комплекс» (г. Караганда), ПК Фирма «Кызылмай» (г. Алматы). Данными предприятиями Казахстана разработаны и оптимизированы технологии производства таких оригинальных фитопрепаратов, как противоопухолевое средство "Арглабин" (из полыни гладкой) [4], гепатопротектор "Салсоколлин" (на основе флавоноидов солянки холмовой) [5], иммуномодулирующий препарат "Рувимин" [6], антипарадонтозный и противовоспалительный препарат "Тополин" (на основе флавоноидов почек тополя),) [7], полифитовое масло "Кызылмай" и противовоспалительное и противовирусное лекарственное средство "Лимонидин" (на основе Кермека Гмелина) [8, 9], противовоспалительное 11 средство для лечения заболеваний желудочно-кишечного тракта «Алхидин» (на основе конденсированных полифенолов верблюжьей колючки) и другие профилактические, витаминные средства, фитосборы и фиточаи [10]. Рисунок 3 - Структура ассортимента лекарственных средств по видам лекарственных форм, (%) Данными предприятиями используется только 2 % растений дикорастущей флоры Казахстана. Но несмотря на это, развитие фармацевтической промышленности в РК возможно за счет развития фитохимических производств, что обусловлено наличием богатого выбора растительного лекарственного сырья, выгодным территориально-географическим положением, а также за счет значительного научно-технического потенциала в области химии, медицины и фармации. Анализ фармацевтического рынка Казахстана показал перевес в пользу дорогостоящих импортных препаратов, а также необходимость развития производства препаратов из растительного сырья, поскольку Казахстан обладает достаточной сырьевой базой, которую необходимо использовать [11]. 1.2 Перспективные источники в разработке фитопрепаратов Обширный источник получения лекарственных средств – дикорастущая флора Казахстана, включает в себя около 6000 тысяч видов. Многие из них слабо изучены в фитохимическом аспекте и в отношении биологических активностей [12, 13]. Кроме этого в силу особенностей своего территориально-географического положения Республика Казахстан представляет собой перспективную базу для производства лекарственных препаратов из растительного сырья, в связи с 12 чередованием различных климатических зон, способствующих выработке растениями защитных средств в виде биологически активных веществ (БАВ). Биологически активные вещества растений представлены разнообразными классами органических соединений - алкалоидами, гликозидами, дубильными веществами, сапонинами, флавоноидами, кумаринами, органическими кислотами, витаминами, эфирными маслами, пектинами, лигнинами и другими веществами. Они поддерживают кислотно-щелочное равновесие в организме, предупреждают развитие атеросклероза, используются как бактерицидные, ветрогонные, мочегонные, желчегонные, болеутоляющие, успокаивающие и отхаркивающие средства, ускоряют заживление ран, регулируют секреторную функцию желудочно-кишечного тракта, стимулируют сердечную деятельность, обладают противовоспалительным, сосудорасширяющим, сосудоукрепляющим и другими видами фармакологического действия. При правильном применении растительные препараты обладают более мягким действием, менее токсичны, чем синтетические, и, в большинстве случаев, не вызывают привыкания и аллергии [14-22]. Благодаря этому применение фитотерапии в комплексном лечении многих заболеваний приводит к предупреждению их прогрессирования и развития осложнений. Одним из перспективных источников фитопрепаратов считаются лекарственные растения, содержащие алкалоиды. Фармакологическая активность алкалоидов изменяется в широких пределах в зависимости от структуры. Среди них имеются обезболивающие средства и наркотики (морфин, кодеин), мощные стимуляторы центральной нервной системы (стрихнин, бруцин), мидриатические (т.е. расширяющие зрачок) средства (атропин, гиосциамин) и миотические (т.е. суживающие зрачок) средства (физостигмин, пилокарпин). Некоторые алкалоиды обнаруживают адренергическую активность, возбуждают симпатическую нервную систему, стимулируют сердечную деятельность и повышают кровяное давление (эфедрин, эпинефрин). Другие – снижают кровяное давление (резерпин, протовератрин А). Благодаря своей физиологической активности многие алкалоиды, будучи сильными ядами, находят применение в медицине [23, 24]. Химия алкалоидов переживает период бурного развития. Среди природных соединений дитерпеновые, хиназолиновые, пирролидиновые и другие алкалоиды, источником которых служат растения родов Aconitum, Delphinium, Garrya, Spiriae, Inulae, Peganum,Capparis и др. Растения Казахстана и Средней Азии являются перспективными источниками алкалоидов широкого спектра фармакологического действия – с анальгетической, антибактериальной, спазмолитической и другими видами активности [25-29]. Также одним из перспективных источников фитопрепаратов считаются лекарственные растения, содержащие флавоноиды, которые в силу широкого распространения в растениях и большого структурного разнообразия в настоящее время находятся в центре внимания исследователей в области фармакогнозии, фармации и медицины. Флавоноиды – наиболее многочисленный класс природных фенольных соединений, для которых 13 характерно структурное многообразие, высокая и разносторонняя активность и малая токсичность. Широкая амплитуда биологической активности флавоноидов связана с многообразием их химических структур и вытекающих из них различных физико-химических свойств. Этот интерес связан с тем обстоятельством, что флавоноиды, будучи эволюционно адекватными организму человека, обуславливают антиоксидантные, ангиопротекторные, гепатопротекторные, желчегонные, диуретические, нейротропные и другие важнейшие фармакологические свойства. Причем именно вышеперечисленные фармакологические эффекты в наибольшей степени привлекают ученых в области создания новых растительных лекарственных препаратов. Диапазон терапевтического применения растительного сырья, богатого флавоноидами, очень широк. Флавоноиды не токсичны для человека при любом способе введения. Многие флавоноиды обладают Р-витаминной активностью, уменьшают хрупкость кровеносных капилляров (рутин), усиливают действие аскорбиновой кислоты, оказывают седативное действие (боярышник, пустырник). Используются как противовоспалительные, противоязвенные (корень солодки) средства. Некоторые обладают кровоостанавливающими свойствами (водяной перец, почечуйная трава); применяются при геморрое (стальник пашенный, конский каштан); служат хорошими желчегонными средствами (бессмертник, пижма). В последние годы появились сообщения о противоопухолевом действии флавоноидов. Однако препаратов, содержащих чистые флавоноиды, пока имеется немного. Чаще эти соединения находятся в растениях в комплексе с другими БАВ и используются суммарно. Дубильные вещества применяют как вяжущие, кровоостанавливающие, противовоспалительные, антимикробные средства. Они проявляют высокую Рвитаминную активность, обладают антигипоксическим и антисклеротическим действием. Конденсированные дубильные вещества являются антиоксидантами, проявляют противоопухолевый эффект. Дубильные вещества можно использовать как противоядие при отравлении гликозидами, алкалоидами, солями тяжелых металлов [30-34]. Антиоксиданты фенольного класса в значительном количестве содержатся в лекарственных травах, обуславливая, их антиоксидантное, противовоспалительное, антимикробное, спазмолитическое и нейропротекторное действия [35, 36]. Содержание флавоноидов в растительном сырье является важнейшим показателем его биологической ценности. Наличие сопряженных структур в молекулах флавоноидов позволяет им выступать в качестве улавливателей свободных электронов – гасителей цепных реакций свободно-радикального окисления. Перспективным представителем данного направления является дигидрокверцетин, включение которого в рацион крыс в дозе 130 мг/кг приводило к увеличению емкости плазмы крови и усилению резистентности микросом печени к индуцированному ex vivo перекисному окислению липидов [37]. Показано снижение продукции NO, простагландина Е2, активных форм кислорода в культуре хондроцитов человека, стимулированной IL_1β, катехинами и проантоци анидинами винограда вида 14 Vitis aestivaliscinereax и Vitis vinifera grapes [38, 39]. Хорошо известны растения с высокой антиоксидантной активностью, такие как розмарин лекарственный (Rosmarinus officinalis), шалфей лекарственный (Salvia officinalis), тимьян обыкновенный (Thymus vulgaris), душица обыкновенная (Origanum vulgare), базилик благородный (Ocimum basilicum) – все они из семейства Lamiaceae и относятся к растениям южных широтных групп [40]. Кроме практического интереса эти исследования могли бы дать ответ на вопрос о связи между условиями среды обитания растений и антиоксидантной активностью, обусловленной варьирующим в растениях содержанием полифенолов [41, 42]. Антиоксиданты фенольного класса обладают способностью прямо нейтрализовать свободные радикалы и хелатировать ионы металлов, включая железо [43, 44]. В то же время известно, что в определенных условиях полифенолы могут участвовать в генерации АФК и действовать как прооксиданты [45, 46]. Особый интерес в качестве источников соединений указанных классов представляют растения семейства Fabaceae (бобовые), в частности представители родов Trifolium L. и Vicia L., богатые флавоноидами и изофлавоноидами. Перспективным объектом исследования является иван-чай узколистный (Chamaenerion angustifolium (L.) Scop., сем. Onagraceae – Кипрейные), который применяется в традиционной и народной медицине как антиоксидантное, общеукрепляющее, противовоспалительное, ранозаживляющее, поливитаминное, противолихорадочное средство, а также применяется при бессоннице, головных болях, неврозах, анемии, нарушениях обмена веществ [47]. Анализ данных по изученности биологической активности у таннидоносных видов показал, что они характеризуются антибактериальной, антивирусной, противоопухолевой, антимикотической (виды рода Polygonum L., Rumex L.), тромбопластической, антиоксидантной, антипротозойной (виды рода Geranium L., Salix L.), иммуномодулирующей, противоопухолевой, цитотоксической (виды рода Thalictrum L.), ростингибирующей (виды рода Tamarix L.), противотуберкулезной, эстрогенной (виды рода Rhodiola L.) активностями [48-55]. В последнее время растет интерес к исследованию дикорастущих лекарственных растений, в том числе представителей рода Кипрейных Epilobium sр. (семейство Onagraceae), насчитывающего почти 200 видов по всему миру. Чай или спиртовые экстракты из свежих надземных частей растений этого рода используются в народной медицине для лечения расстройств предстательной железы, лихорадки, ревматических и головной боли [56]. Механизм действия растительных препаратов, полученных из кипрея до конца не изучен, но сообщалось, что они имеют антиандрогенную и антиэстрогенную активности [57, 58], ингибируют пролиферацию клеток [5961], оказывают противовоспалительное [62-64], антимикробное [65-68] и антиоксидантное действие [69]. 15 На основе фитохимического анализа экстрактов листьев, масла из семян представителей Epilobium sр. установлено наличие флавоноидов, дубильных веществ, стеринов, жирных кислот. Флавоноиды оказывают капилляроукрепляющее действие, что лежит в основе спазмолитического, противоопухолевого эффектов. Кумарины придают кипрею болеутоляющее, жаропонижающее, сосудорасширяющее, антимикробное действие [70]. Из соцветий кипрея узколистного был получен препарат «Ханерол», обладающий противоопухолевой активностью [71-73]. Вследствие высокого содержания витамина С кипрей узколистный входит в состав биологически активной добавки «Нейростабил» [74]. Знания о наличии биологически активных соединений в Epilobium sр. и их активности может быть особенно необходимо при проектировании новых безопасных и эффективных составов нутрицевтических и фитофармацевтических препаратов, содержащих лекарственные части этих растений. Род Sophora (Vexibia) также представляет большой научный и практический интерес для исследования. По всему миру насчитывается более 52 видов представителей этого рода, большинство из которых распространены в Азии. Около 15 видов данного рода широко используется в традиционной китайской медицине. В последние десятилетия использование представителей этого рода в традиционных китайских лекарственных средствах привело к быстрому росту информации по активным веществам и различным фармакологическим и лечебным свойствам, большинство алкалоидов софоры были признаны их главными активными химическими компонентами, включая матрин, оксиматрин, софорокарпин, и другие [75-77]. А также флавоноиды, изофлавоноиды, флавоны, флавонолы и их гликозиды, сапонины, тритерпеновые гликозиды, фосфолипиды, полисахариды и жирные кислоты [78, 79]. Значительное количество хинолиновых алкалоидов, прениловые флавоноиды и олигостильбены, были использованы как хемотаксономические маркеры [80]. Некоторые фитохимические исследования, in vitro и in vivo, а также эксперименты в клинической практике показали, что софора обладает различными фармакологическими свойствами, в том числе антиоксидантным [81, 82], противоопухолевым [83], антинеопластическим, противомикробным [84, 85], противовирусным [86], жаропонижающим, кардиотоническим [86], противовоспалительным [87], мочегонным а также широко используется в лечении кожных заболеваний, таких как экзема и псориаз [88]. Для создания фитопрепаратов активно используют род Salvia, который является основным родом семейства Lamiaceae; по всему миру распространено 900 видов этого рода [89]. Данный род широко распространен в различных регионах мира, в том числе в Средиземноморье, Южной Африке, Центральной и Южной Америке, Юго-Восточной Азии. Различные виды Salvia используются в качестве антимикробных [90, 91], антиоксидантных [92], противоопухолевых [93], инсектицидных [94] агентов. Корни различных видов Salvia используются 16 в качестве растительных лекарственных средств для лечения кашля и уретрита [95]. Одним из наиболее изученных видов является Salvia miltiorrhiza, кроме этого данный вид является хорошо известным лекарственным растительным сырьем, которое активно используется в традиционной китайской медицине для лечения многих заболеваний. Корни Salvia miltiorrhiza содержат дитерпены [96]. Другие вторичные метаболиты, продуцируемые Salvia, включают флавоноиды, сесквитерпены, дитерпеноиды, и тритерпены [97-100]. 1.3 Современное состояние проблемы сахарного диабета и его осложнений В соответствии с классификацией Международной Диабетической Федерации (IDF), есть три основных типа диабета: сахарный диабет типа I, сахарный диабет II типа и гестационный диабет. Сахарный диабет I типа входит в группу метаболических заболеваний, что в значительной степени, связано с абсолютным дефицитом секреции инсулина. Это обусловлено аутоиммунной реакцией, в результате которой β-клетки поджелудочной железы разрушаются собственными антителами организма. 510 % от всех случаев диабета занимает сахарный диабет I типа [101]. В данной категории инсулин не вырабатывается и единственным эффективным методом лечения является ежедневные инъекции инсулина. Сахарный диабет II типа иногда называют инсулиннезависимым сахарным диабетом. Около 90-95 % случаев диабета принадлежат к этому типу [101, c.11]. Заболевание обычно возникает вследствие устойчивости к действию инсулина, особенно в жировой ткани, мышцах, печени и дисфункции β-клеток. Болезнь может остаться незамеченной на ранних стадиях развития. Предполагается, что сахарный диабет II типа, в основном связан с образом жизни пациентов, который сам по себе может вызвать резистентность к инсулину, что приводит к повышению уровня глюкозы в плазме, и, таким образом, обуславливает тяжесть заболевания [102]. Гестационный сахарный диабет (ГСД) определяется как нарушение углеводного обмена во время беременности [103]. Современные исследования показали, что гестационный сахарный диабет связан с дефектом в функции βклеток и ожирением во время беременности [104]. Подсчитано, что 50 % женщин с ГСД находятся в группе риска по развитию диабета II типа в течение пятидесяти лет после родов [105]. Согласно данным ВОЗ на 2013 год в мире насчитывается 382 млн. человек, страдающих сахарным диабетом. В Казахстане более 200 000 человек страдают диабетом, из них 92 % - больны диабетом II типа [106]. Лечение сахарного диабета II типа с осложнениями обходится в десятки раз дороже, чем без осложнений и является острейшей медико-социальной проблемой. Затраты нашего государства на антидиабетические препараты растут с каждым годом, однако даже количество закупаемых препаратов в целом составляет не более 70-80 % от потребности. При этом растет экономический ущерб как от частых госпитализаций, использования дорогостоящих методов обследования, так и от 17 затрат на медикаментозное и оперативное лечение. Принцип непрерывного лечения, необходимый при данном заболевании предполагает чередование специфических и дополнительных методов, в частности использование лекарственных растений, богатых веществами, оказывающими положительное влияние на организм человека [107-112]. Синдром диабетической стопы встречается у 30-70 % пациентов с сахарным диабетом. У данной группы больных увеличен риск развития гангрены нижних конечностей в 20 раз. Риски при заживлении ран у пациентов с сахарным диабетом различны, это связано со степенью выраженности микроангиопатий и макроангиопатий, нейропатии, возрастом, наличием сопутствующих заболеваний, степенью заражения и различиями в раневой микрофлоре [113]. При различных типах сахарного диабета отмечаются некоторые отличия в течение раневого процесса. При диабете I типа раневой процесс характеризуется ранним ответом на появление клеточной инфильтрации и угнетением развития грануляционной ткани, при диабете II типа угнетение лейкоцитарной инфильтрации выражено сильнее [114]. Такое различие связано с особенностями иммунологической реакции у больных. Однако, несмотря на различия у больных, страдающих как первым, так и вторым типами диабета, в обоих случаях присутствует гипергликемия, которая вносит определенный вклад в ухудшение течения раневого процесса. Такой многофакторный патогенез раневого процесса, а также многообразие клинических вариантов поражений стопы при диабете объясняют огромнейшее количество применяемых лекарственных средств и методик лечения данной проблемы. Комплексное лечение диабетической стопы можно представить следующим образом: - Консервативное лечение: коррекция углеводного обмена, антиоксидантная терапия, антибактериальная терапия, лечение переферических невропатий, местное лечение гнойных ран. - Хирургическое лечение: вскрытие гнойников, кожно-пластические операции. Сейчас активно используются в лечении диабетической стопы принципиально новые препараты. Например, при развитии гнойного процесса, с выраженным отеком используют мази на полиэтиленгликолевой основе, такие как левосин, левомиколь, 5 % диоксидиновая мазь. Как показали исследования [115], антимикробная активность данных препаратов распространяется на все виды микроорганизмов, поражающих пациентов с диабетической стопой. Мази обладают высокой осмотической активностью, что позволяет хорошему извлечению гноя из раневой поверхности, а также хорошо борются с отеком мягких тканей, чем обеспечивают более благоприятные условия для микроциркуляции области раны. Также у больных местно применяются белковые и белковополисахаридные препараты, активизирующие репаративные процессы в ране, защищающие 18 грануляционную ткань от вторичной инфекции и улучшающие обменные процессы в тканях [116]. К таким препаратам относятся дигиспон (на основе коллагена сшитого поливиниловым спиртом и диоксидина 5 %), коллахит (на основе коллаген-хитозановых композиций с содержанием фурагина калия 5 %), гентоцикол (коллагеновая губка с добавлением гентамицина) [114, c. 25]. В связи с замедленным процессом регенерации гнойных ран у больных с диабетической стопой, во второй фазе раневого процесса, используются такие растительные препараты как облепиховое масло, масло шиповника и просяное масло, мазь прополиса, каланхоэ [117]. Для указанных фитопрепаратов характерно сочетание выраженного фармакологического действия с минимальными отрицательными воздействиями на организм больного. Однако, несмотря на наличие препаратов, применяемых в комплексном лечении диабета и его последствий, данное заболевание остается острейшей медико-социальной проблемой. В Казахстане для лечения больных сахарным диабетом используются в основном дорогостоящие импортные препараты, а потенциал практического использования местных растений для лечения осложненных форм диабета изучен не в полной мере. В связи с этим возникает необходимость в проведении исследований, направленных на подбор и разработку эффективных комплексов на основе биологически активных веществ растений Казахстана, обладающих ранозаживляющим, противомикробным и другими свойствами для профилактики и лечения трофических повреждений кожи, характерных для осложнений сахарного диабета. Применение фитотерапии в таком лечении является перспективным и может приводить к предупреждению прогрессирования заболевания и развития его осложнений. При правильном применении растительные препараты обладают более мягким действием, менее токсичны, чем синтетические, и не вызывают привыкания и аллергии. 19 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1 Объекты и материалы исследования 2.1.1 Объекты исследования Объекты исследования - дикорастущие растения флоры Казахстана, принадлежащие к разным семействам: Epilobium hirsutum L. (Onagraceae), Rumex confertus Wiild. (Polygonaceae), Vexibia alopecuroides (L.) Jakovl. (Fabaceae), Polygonum undulatum Murr. (Polygonaceae), Rhodiola quadrifida (Pall.) Fisch. et Mey (Crassulaceae), Atraphaxis laetevirens (Ledeb.) Jaub. Et Spach (Polygonaceae), Salvia deserta Schang (Lamiaceae), собранные в экспедиционных выездах по Алматинской области и Восточному Казахстану 2.1.2 Препараты сравнения Ципрофлоксацин - антибактериальное средство группы фторхинолонов II поколения. Бледный до слегка желтоватого цвета кристаллический порошок, растворим в 0,1 н. соляной кислоте, практически нерастворим в воде и этаноле (Sigma, США). Амфотерицин B полиеновый антибиотик, продуцируемый актиномицетом Streptomyces nodosus. Порошок желтого или желто-оранжевого цвета. Растворим в воде и 5 % растворе глюкозы с образованием коллоидной системы, практически нерастворим в эфире, хлороформе, 96 % спирте. Гигроскопичен, чувствителен к свету и высокой температуре. Легко инактивируется в кислой и щелочной средах (Sigma, США). Левомиколь - мазь для наружного применения белого или белого с желтоватым оттенком цвета. Комбинированный препарат для местного применения, оказывает противовоспалительное и противомикробное действие, активен в отношении грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов (стафилококков, синегнойной и кишечной палочек). Легко проникает вглубь тканей без повреждения биологических мембран, стимулирует процессы регенерации. В присутствии гноя и некротических масс антибактериальное действие сохраняется (Нижфарм, Россия). 2.1.3 Описание тест-систем Исследования in vivo проводились на лабораторных грызунах (мыши, крысы) и логоморфах (кролики). В in vitro исследованиях были задействованы тест-системы клеточного уровня, культура клеток почек собаки (MDCK), культуры микроорганизмов, полученные из Американской коллекции культуры клеток (АTCC): Staphylococcus aureus, Methicillin-resistant S. aureus, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans, Candida krusei, Candida glabrata, а также культуры микроорганизмов, выделенных из раневой поверхности больных с «диабетической стопой»: Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Candida krusei. 20 а) Экспериментальные животные При изучении острой токсичности исследуемых экстрактов использовались белые аутбредные самки мышей массой 20 - 24 г. В исследовании местно-раздражающего действия использовались кролики обоего пола породы «Шиншилла» массой 2 - 3 кг. В исследовании по изучению ранозаживляющей активности экстрактов использовались самцы белых аутбредных крыс массой 275 - 325 г. Все животные содержались в условиях вивария РГКП «Научнопрактический центр санитарно-эпидемиологической экспертизы и мониторинга» Министерства здравоохранения Республики Казахстан. Животные находились в клетках с подстилкой из древесной стружки, предварительно выдержанной под воздействием УФ лучей. Подстилка менялась 2 раза в неделю. Условия содержания животных соответствовали общепринятым нормам – температура окружающей среды составила 21 ± 2 оС, влажность 50 ± 10 %, искусственный световой режим 12:12. Для животных была подобрана смешанная диета, включающая преимущественно корма, содержащие натуральные ингредиенты (корнеплоды, зерно). Кормление животных проводилось 2 раза в день в одно и те же время суток. Вода была в распоряжении животных ad libitum. Маркировка животных проводилась отметкой маркером участка шерсти на конечностях, спине и голове. Наркоз проводили внутримышечно введением рометара в дозе 10,0 мг/кг и кетонала в дозе 25,0 мг/кг веса животного. Эвтаназию проводили с соблюдением правил гуманного обращения с лабораторными животными в СО2 камере, содержащей 70 % СО2 при скорости потока 30 л/мин. б) Для оценки цитотоксичности и миграции клеток использовали стандартно применяемую для этих целей культуру клеток почек собаки MDCK. Культура клеток была получена из коллекции ATCC. Клетки культивировали в среде Игла, модифицированной по способу Дульбекко (DMEM), содержащей 10 % фетальную сыворотку, 2 % L-глютамин и 1 % антимикробных и антигрибковых препаратов (10,000 Ед. пенициллина, 10,0 мг стрептомицина, 25,0 мкг/мл амфотерицина В). Клетки культивировали при 37 °С и 5 % СО2. Жизнеспособность после криоконсервации составила 98 % (окраска трипановым синим на нулевом пассаже). Клетки эффективно размножались в концентрации 2×105 клеток/мл, достигая 100 % монослоя через 2 дня культивирования. Пересев производили два раза в неделю. в) При изучении антимикробной активности использовали следующие штаммы микроорганизмов, которые были получены из Американской коллекции типовых культур: Staphylococcus aureus ATCC № 29213, Methicillinresistant S. aureus ATCC №43300, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Candida albicans ATTC № 90028, Candida krusei ATCC 6258, Candida glabrata ATTC 90030, а также микроорганизмы, выделенные из раневой поверхности больного с диабетической стопой: Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Candida krusei. 21 2.1.4 Материалы и реактивы исследования Парафин для гистологии (Sigma, США). Этиловый спирт (АО Талгарский спирт завод, Казахстан). Трипановый синий (Sigma, США). Фосфатный буфер (pH 6,8) (Sigma, США). Формалин нейтральный 10 %-ный раствор (Sigma, США). Гематоксилин-эозин (Sigma, США). o-Ксилол (Sigma, США). Физиологический 0,9% раствор хлорида натрия (ANP, Казахстан). Кетонал раствор для инъекций (Сандоз, Швейцария). Рометар 20 мг/мл раствор для инъекций (Bioveta, Чешская Республика). ТСХ пластины, покрытые сорбентом silicagel F254 (Analtech). SNAP Картридж KP-Sil 100 г. (Biotage). Раствор антимикробных и антигрибковых препаратов (Sigma, США). Среда DMEM (Sigma, США). Раствор Трипсин / ЭДТА (Sigma, США). Фетальная сыворотка (Sigma, США). Диметилсульфоксид (AppliChem, Германия). Дихлорметан (Sigma, США). Наборы:STAPHYtest16, NEFERMtest24 и CANDIDAtest21 (MIKROLATES, США). 2,2-дифенил-1-пикрилгидразил (DPPH) (Sigma, США). 2,2'-азино-бис-(этилбензтиазолино-6-сульфонат) ABTS (Sigma, США). 2.2 Методы исследований 2.2.1 Подготовка растительного сырья и экстракция биологически активных веществ растений В работе применялись стандартные методы заготовки, фиксации и подготовки к дальнейшим исследованиям образцов растений [118, 119]. Полученное сырье упаковывали и хранили в соотвествии с требованиями нормативной документации (ГОСТ 24027.1-80), при комнатной температуре, в сухом, хорошо проветриваемом помещении, без попадания солнечных лучей. По мере надобности сырье измельчали, взвешивали и помещали в стеклянные емкости для экстракции в соотношении сырье: растворитель не менее 1:10 (масса: объем) на 24 часа при периодическом помешивании, на встряхивателе KS 260, IKA (рисунок 4). Экстракция БАВ из растительного материала проводилась в два этапа растворителями с увеличивающейся ионной силой (рисунок 5): дихлорметан; 95 % этанол. Дихлорметановый экстракт сливали и растворитель отгоняли на роторном испарителе фирмы Cole-Parmer. Сырье подсушивали под тягой, заливали 95 % этанолом и повторяли процедуру экстракции. Сконцентрированные на роторном испарителе экстракты помещали в фарфоровые чашки для окончательного упаривания. После проведения последовательной экстракции и упаривания полученных экстрактов оценивали суммарных выход сухого вещества в каждой фракции. 22 Рисунок 4 - Процесс мацерации БАВ - растворитель дихлорметан Рисунок 5 - Схема проведения экстракции Все полученные экстракты биологической активности. использовались 23 для определения их 2.2.2 Микробиологические (бактериологические) методы исследования открытых инфицированных ран а) Микроскопия исследуемого материала Материал, взятый стерильным ватным тампоном c раневой поверхности, размазывали по стерильному предметному стеклу, окрашивали по Грамму и просматривали под микроскопом Leica DM1000. При обнаружении микроорганизмов отмечали их морфологическую характеристику (грамположительные и грамотрицательные палочки, кокки и др.) [120]. б) Посев исследуемого материала на питательные среды и идентификация культур Материал, взятый вторым стерильным ватным тампоном из того же участка раны, засевали на чашку с 5 % кровяным агаром, на "среду для контроля стерильности" и сахарный бульон. Посев на чашку с агаром производили методом "тампон-петля": тампоном проводилась "дорожка" по диаметру чашки, затем другой стороной тампона в обратном направлении засевали еще одну "дорожку", параллельную первой. После этого материал рассевали по чашке при помощи петли штрихами, перпендикулярными к "дорожкам". Такой посев позволяет выделить микроорганизмы в виде отдельных колониеобразующих единиц даже из ассоциации микроорганизмов. Засеянные жидкие и плотные питательные среды термостатировали при 37 °С в течение 18-24 часов. При обнаружении роста отдельных колоний, выделяли чистые культуры на чашках с кровяным агаром и с Сабуро-Глюкоза 2 % агаром. Идентификацию культур проводили с помощью трех наборов фирмы MIKROLATES: STAPHYtest16, NEFERMtest24 и CANDIDAtest21. Из чистой 24 часовой культуры готовили суспензию в физиологическом растворе и тщательно гомогенизировали ее. Мутность суспензии для STAPHYtest16 и NEFERMtest24 составила 2 единицы по шкале мутности McFarland, для CANDIDAtest21 составила 0,5 единицы по шкале мутности McFarland. Вносили в каждую лунку по 0,1 мл суспензии. Дальнейшие манипуляции проводили согласно инструкциям, прилагаемым к наборам. По завершении времени инкубации идентификацию микроорганизмов проводили с помощью компьютерной программы «Микроб-Авто» на бактериологическом анализаторе Multiskan Ascent, фирмы Thermo. 2.2.3 Исследование антимикробной активности растительных экстрактов Антимикробную активность суммарных экстрактов определяли методом серийных разведений в бульоне [121, 122]. Образцы растворяли в диметилсульфоксиде (ДМСО), серийно разводили в смеси с 20 % ДМСО / 0,9 % физиологическим раствором (1:1), вносили в двух повторах в пробирки. Для инокуляции использовали стандартную микробную взвесь (эквивалентную 0,5 по стандарту МакФарланда), разведенную в 100 раз питательным бульоном до конечной концентрации клеток микроорганизмов 24 106 КОЕ/мл. В пробирки, содержащие по 0,5 мл разведенного экстракта, вносили по 0,5 мл инокулюма (конечная концентрация микроорганизмов 5х105 КОЕ/мл.). В качестве препарата сравнения использовали «Ципрофлоксацин» для бактерий и «Амфотерицин B» для грибов. Отрицательным контролем были пробирки с 0,5 мл питательного бульона. Все исследуемые пробирки инкубировали при температуре 35 оС в течение 16-20 или 20-24 ч в зависимости от вида тестируемого микроорганизма. После завершения инкубации пробирки с образцами просматривали в проходящем свете при 630 нм на приборе Lambda 35 (фирмы PerkinElmer). Концентрацию полумаксимального ингибирования (IC50) рассчитывали с помощью пакета программ Excel. 2.2.4 Определение антиоксидантного потенциала суммарных экстрактов Определение антиоксидантного потенциала суммарных экстрактов проводили двумя методами: а) Фотометрически с использованием в качестве свободного радикала 2,2дифенил-1-пикрилгидразил (DPPH) [123] Дифенилпикрилгидразил в окисленной форме дает пурпурно-синюю окраску. В результате восстановления DPPH антиоксидантом окраска снижается вплоть до светло желтого цвета. Реакция контролируется по изменению оптической плотности (А) при 517 нм обычными методами спектрофотометрии. В работе использовали 0,002 % раствор DPPH, который смешивали с 1 мл спиртовых экстрактов, содержащих БАВ в различных концентрациях (от 50 до 750 мкг/мл). Смесь встряхивали и инкубировали в темноте 30 минут. Раствор DPPH без добавления экстрактов служил в качестве контроля. Исследование проводили в трех независимых повторах. В качестве положительного контроля использовали аскорбиновую кислоту. Оптическую плотность определяли на спектрофотометре BioMate 3S, фирмы Thermo Scientific. Антиоксидантный потенциал определяли по степени ингибирования свободных радикалов DPPH по формуле (1): Ингибирование (%) = [(Aк - Aо)/Aк] х 100, (1) где Ак - абсорбция контрольного образца; Ао - адсорбция опытного образца. б) Фотометрически с использованием радикал-катионов ABTS•+ Спектрофотометрические исследования антиоксидантной активности образцов проводили по методу Re [124]. Принцип метода заключается в совместном инкубировании ABTS (2,2'-азино-бис-(этилбензтиазолино-6сульфонат)) с персульфатом аммония, что приводит к образованию катионрадикала ABTS•+. Полученный раствор имеет относительно стабильный зеленоголубой цвет за счет катион-радикала ABTS•+, который обладает максимумом поглощения при длине волны 734 нм. Антиоксиданты, содержащиеся в 25 тестируемой пробе, уменьшают оптическую плотность пропорционально их концентрации в образце. В работе использовали маточный раствор ABTS (7 мМ) с аммоний персульфатом (2,45 мМ). Раствор хранили в темноте 12 часов для полного созревания. После маточный раствор разводили дистиллированной водой до величины оптической плотности, равной 0,7 ± 0,02 при 734 нм. Данный раствор служил в качестве контроля. Суммарные экстракты в объеме 1 мл добавляли к 1 мл раствора ABTS•+ и измеряли оптическую плотность при 734 нм используя спектрофотометр BioMate 3S, фирмы Thermo Scientific. Исследование проводили в трех независимых повторах. Антиоксидантный потенциал определяли в процентах изменения •+ поглощения исходного раствора ABTS . Процентное ингибирование ABTS•+ (доля, на которую снижается концентрация свободных радикалов в системе под действием экстракта, обладающего антиоксидантной активностью) вычисляли по формуле (1). Результаты выражали через значения параметров IС50 — концентрации анализируемых экстрактов, при которой происходит 50 %-ное ингибирование свободного радикала ABTS.+. 2.2.5 Изучение пролиферативной активности экстрактов in vitro Пролиферацию клеток после воздействия экстрактами определяли согласно тесту на захват нейтрального красного [125]. Для оценки пролиферативной активности использовали культуру клеток MDCK, в концентрации 3×103 клеток / лунка для 96-луночного планшета. Клетки рассаживали в культуральную среду (DMEM с 0,125 % фетальной сывороткой) добавляли серийные разведения исследуемого экстракта (150,0; 100,0; 50,0; 25,0; 12,5 мкг / мл). После инкубирования в течение 24 часов, монослой клеток прокрашивали витальным красителем - нейтральным красным, вносили в лунку лизирующий раствор. Количество красителя, включенного в монослой клеток, учитывали на микропланшетном ридере Tecan Sunrise RC.4 при длине волны 540 нм. В качестве контроля использовали лунки с клетками, без исследуемых растворов (данные лунки были взяты за 100 %). Пролиферацию клеток определяли по формуле (2): Пролиферация (%) = (Aо/ Aк) х 100, (2) где Ао - абсорбция клеток, обработанных экстрактом; Ак - абсорбция контрольных, необработанных клеток. 2.2.6 Оценка миграционной активности экстрактов in vitro В основе методики определения миграционной активности лежит принцип метода «раневой поверхности» [126]. 26 Для лучшей адгезии клеток на дно лунок, 24-луночных культуральных плашек, наносили поли-L-лизин в концентрации 50 мкг / мл. После культуру клеток MDCK в концентрации 3×106 клеток /мл, вносили в 24 луночные плашки и выращивали до образования конфлюэнтного монослоя, в течение 12 часов. Затем производили механическое разрушение монослоя клеток пластиковым наконечником на 200 мкл, точно посредине лунки, моделирую тем самым «рану». Разрушенные клетки отмывали фосфатно-солевым буфером, после производили замену среды с последующим фотографированием клеток на инвертированном микроскопе Leica DMI 3000B. В контрольные лунки вносили только культуральную среду и клетки, а в опытные лунки вносили культуру клеток, среду и исследуемые экстракты в разных концентрациях (150,0; 100,0; 50,0; 25,0; 12,5 мкг/мл). Инкубацию проводили 24 часа с последующим фотографированием клеток. Размеры площади, свободной от клеток, анализировали с помощью программы открытого доступа в интернете ImageJ. Результат выражали в процентном соотношении, принимая первоначальный размер площади повреждения монослоя клеток за 100 %. 2.2.7 Определение константы распределения соединений в системе 1октанол-вода Для оценки биодоступности субстанций лекарственных соединений, а также их лекарственных форм важно знать способность вещества проникать через клеточную мембрану (липидный бислой). Наиболее близким по строению к фосфолипидной мембране клетки является 1-октанол. Поэтому распределение вещества между октанолом и водой является численной характеристикой биодоступности препарата. В работе использовали метод спектрофотометрического определения [127]. В колбу объемом 50 мл вносили 0,005 г фитопрепарата, 10 мл воды, 10 мл октанола. Полученную двухфазную систему интенсивно перемешивали. Через 10 минут перелили в делительную воронку. После расслаивания смеси верхний октанольный слой переносили в сухую пробирку и центрифугировали при 3000 оборотов / мин в течение 5 минут. Водную часть раствора фильтровали и переносили в сухую пробирку. Измерение оптической плотности проводили при 239 и 284 нм. 1 мл октанольной фазы помещали в кювету (с длиной оптического пути 1 см) и замеряли оптическую плотность. В качестве раствора сравнения использовали чистый 1-октанол. Аналогично провели исследование с водной фазой. 2.2.8 Изучение фармакологической активности фитопрепаратов in vivo При проведении экспериментов учитывали рекомендации, изложенные в Руководстве по экспериментальному изучению новых фармакологических веществ под редакцией А.Н. Миронова [128], а также в соответствии с законодательством Республики Казахстан [129]. Работу с животными проводили с соблюдением принципов биоэтики, методических подходов к контролю качества экспериментов [130, 131], а также в соответствии с 27 положениями «Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей» [132]. а) Определение острой токсичности фитопрепаратов Острая токсичность была исследована в опытах на белых аутбредных мышах в соответствии с методическими рекомендациями Организации экономического сотрудничества и развития (OECD) No. 423 [133]. В качестве растворителя использовали 5 % диметилсульфоксид (ДМСО), также данный растворитель вводили контрольным животным. Исследуемое вещество вводили однократно per os с помощью зонда в объеме 0,5 мл. Согласно схеме эксперимента на предварительном этапе исследования трем животным вводили стартовую дозу вещества 2000,0 мг/кг. В случае гибели 2-3 животных доза должна быть уменьшена до 300,0 мг/кг. Снижение дозы должно продолжаться до тех пор, пока не будет найдена доза, при которой наблюдаются выраженные признаки токсичности у нескольких животных или гибель не более 1 животного в группе. Процедура должна быть остановлена в случае отсутствия токсических проявлений на максимально допустимой дозе в 2000,0 мг/кг. Наблюдения за животным осуществляли в течение 14 суток. В первый день каждые 2 часа, в последующие сутки каждые 12 часов. Массу тела животных измеряли еженедельно, начиная с первого дня исследования, и в день вывода из эксперимента. По завершению исследования проводили макроскопический анализ органов. О токсическом действии препарата судили по общему состоянию животных и их выживаемости, т.е. по средней смертельной дозе (LD50). Класс токсичности определяли в соответствии с международной системой классификации токсичности веществ по системе классификации и маркировки химических веществ и смесей (СГC) (таблица 1) Таблица 1 - Классы токсичности исследуемых веществ Класс токсичности LD50, мг/кг Класс 1 <5 Класс 2 Класс 3 > 5 < 50 > 50 < 300 Класс 4 Класс 5 > 300 < 2000 > 2000 < 5000 б) Определение местно-раздражающего действия фитопрепаратов В исследовании использовались белые кролики породы «Шиншилла» в количестве 3 штук [134]. Исследование начинали с использованием одного животного. За сутки до эксперимента шерсть животных на спине тщательно выстригалась на участке размером около 10×15 см. 0,5 мл исследуемого фитопрепарата, наносили на участок для аппликации размером 2,5×2,5 см. После нанесения соответствующий участок кожи накрывали повязкой и лейкопластырем без раздражающего действия. Контрольные участки обрабатывали только 5 % ДМСО (0,5 мл). 28 Период экспозиции составил 4 часа. В конце периода экспозиции остаточное количество исследуемого фитопрепарата удаляли небольшим количеством воды. День аппликации рассматривался как первый день исследования. Ежедневно проводили клиническое наблюдение. Визуальное состояние каждого аппликационного участка оценивали через 60 минут после воздействия исследуемой субстанции и далее, через 24, 48 и 72 часа после экспозиции. Кожную реакцию в виде эритемы и отека оценивали согласно критериям, представленным в таблице 2. Таблица 2 - Система классификации кожной реакции [134] Реакция Эритема и формирование струпа Отсутствие эритемы Очень незначительная эритема (едва заметная) Четко выраженная эритема Эритема от умеренной до сильной Тяжелая форма эритемы (свекольнокрасная по цвету) до формирования струпа Появление отека Отсутствие отека Очень незначительный отек (едва заметный) Четко выраженный отек: края области хорошо определены благодаря четкому возвышению Умеренный отек (возвышение примерно на 1 мм) Тяжелая форма отека (возвышение более чем на 1 мм, распространение за пределы участка экспозиции) Цифровые оценки 0 1 2 3 4 0 1 2 3 4 Если никаких признаков раздражения не наблюдалось в течение 72 часов, то два оставшихся кролика обрабатывали тем же способом. В работе использовались только животные со здоровой неповрежденной кожей. Индекс первичного раздражения вычисляли путем суммирования оценок реакции на эритемы и отек, через 24 и 72 часа для трех животных и делением на 6 [135]. Индекс первичного раздражения сравнивали с категориями реакции на раздражение, приведенными в нижеследующей таблице 3. 29 Таблица 3 - Категории реакции на раздражение у кролика Категория реакции Пренебрежимо малая Незначительная Умеренная Тяжелая Индекс первичного раздражения 0-0,4 0,5-1,9 2,0-4,9 5,0-8,0 в) Методика моделирования сахарного диабета у крыс Модель диабета была создана путем внутрибрюшинного введения стрептозотоцина в дозе 65,0 мг/кг крысам с предварительным внутрибрюшинным введением никотинамидадениндинуклеотида (НАД) в дозе 230,0 мг/кг [136]. На 8 сутки забирали каплю крови из хвостовой вены и замеряли уровень глюкозы с помощью глюкометра Accu-Chek Active. Крысы с уровнем глюкозы больше 19,0 ммоль/дл в крови рассматривались как животные с развитым экспериментальным диабетом. г) Методика моделирования гнойной раны у крыс Для изучения влияния экстрактов на морфометрическую и микробиологическую картину кожной раны крыс была смоделирована гнойная рана в условиях экспериментального сахарного диабета [137]. Для этого, через 8 суток после воспроизведения модели стрептозотоцинового диабета крысам в асептических условиях было произведено удаление волосяного покрова и обработка кожи настойкой йода с последующим моделированием раны путем иссечения кожного лоскута 1x1 см в области холки, с дальнейшим внесением в раневой дефект суспензии S. aureus, содержащей в 1 мл 2х107 микробных тел (концентрация определялась по стандарту мутности). Наличие местного гнойного процесса оценивали на 4 сутки. В работе использовался клинический штамм S. aureus, выделенный с раневой поверхности диабетической стопы больного. После получения экспериментальной модели гнойно-воспалительного очага, лабораторные животные - крысы были разделены на четыре группы по 6 животных в каждой группе. Первая группа контрольная – животные, получавшие 5 % раствор Димексида, вторая группа получала референтное вещество – мазь «Левомиколь», третья группа животных получала фитопрепарат V1, на основе 2 % экстракта Vexibia alopecuroides. Четвертая группа – животные, получавшие фитопрепарат S1, на основе 2 % экстракта Salvia deserta. Препараты наносились в виде аппликации на раневую поверность в течение 9 дней. Для подтверждения гипергликемии у крыс один раз в 7 дней замерялся уровень глюкозы в крови, в связи с тем что, в отличие от больных сахарным диабетом, гипергликемия у экспериментальных животных носит волнообразный характер из-за регенерации части островков в поджелудочной железе. 30 Оценку ранозаживляющего действия проводили по наличию нагноения, времени и динамике полной эпителизации раны. д) Гистологическое изучение срезов кожных ран Образцы кожи отбирали так, чтобы в поле зрения попадали участки здоровой и поврежденной кожи. Гистологические препараты готовили по общепринятой методике [138]. Для этого иссеченные части фиксировали в 10 % растворе нейтрального формалина, дегидратировали в растворах этанола с восходящей концентрацией и заливали в парафиновые блоки. Из парафиновых блоков делали срезы толщиной 5-7 микрон на полуавтоматическом микротоме ERM3000, срезы окрашивали гематоксилин-эозином [139] и по Массону с анилиновым синим, согласно инструкции к набору фирмы BioVitrum. Полученные препараты исследовали при помощи микроскопа прямого света DM1000 (Leica, Германия). 2.2.9 Идентификация биологически активных веществ а) Метод флэш- и тонкослойной хроматографии при разделении суммарных экстрактов Хроматография относится к способам разделения, при которых компоненты распределяются между неподвижной и подвижной фазами. Разделение происходит, в связи с тем, что компоненты образца имеют различное сродство к неподвижной и подвижной фазе и, следовательно, движение осуществляется с различной скоростью вдоль пластин тонкослойной хроматографии (ТСХ) и колонок. Флэш-хроматография является препаративной колоночной хроматографией, основанной на оптимизации расфасованной колонки и давления воздуха при высокой скорости потока растворителя. Это метод очень прост и быстр, широко используется для разделения различных органических соединений. Суммарные экстракты были разделены на приборе Biotage Isolera, с использованием 100 г SNAP картриджа (40-63 мкм, 60 Å, 39 х 157 мм) при потоке элюентов 40 мл/мин, используя для дихлорметанового экстракта S. deserta, гексан и диэтиловый эфир, при ступенчатом градиенте (первая ступень в соотношении 0:100 (v/v), - 2300 мл, вторая ступень 100, 1000 мл, и завершающая ступень промывка метанолом 300 мл; для дихлометанового экстракта, выделенного из корней V. alopecuroides, использовали гексан и изопропанол, при ступенчатом градиенте (первая ступень 0-100 (v/v) , - 2400 мл, вторая ступень промывка метанолом 385 мл). Фракции в объеме от 22 до 25 мл собирали в пробирки 16х150 мм и 18х150 мм. Выход разделяемых компонентов во фракциях контролировали при длине волны 254 нм, 280 нм и 220 нм. Полученные фракции анализировали методом тонкослойной хроматографии на пластине Anal Tech Silica Gel GF 250 м, используя гексан/ацетон в качестве растворителя для суммарного экстракта S. 31 deserta, и гексан/изопропанол - для суммарного экстракта V. alopecuroides. Хроматографически одинаковые фракции объединяли, концентрировали досуха и подвергали повторному хроматографированию. Объединенные фракции после разделении на колонке наносили с помощью капилляра на нижний край пластины Anal Tech Silica Gel GF 250 м на расстоянии 1,5 см от нижнего края пластины. Подготовленную пластину с образцами помещали в камеру для хроматографии. В процессе хроматографии растворитель под действием капиллярных сил поднимался вверх по пластине, достигая места нанесения анализируемых веществ и перемещая их. По мере передвижения растворителя происходило разделение анализируемой смеси веществ в зависимости от их сродства к сорбенту. После окончания хроматографического процесса пластину с сорбентом вынимали из камеры и отмечали линию фронта. После высыхания пластину облучали УФ-излучением при длине волны 254 нм и 302 нм. Для обнаружения пятен опрыскивали сернокислым раствором ванилина. Реактив готовили согласно [140]. б) Высокоэффективная жидкостная хроматография для разделения фракций на индивидуальные вещества Фракции и подфракции суммарных экстрактов были разделены на приборе Agilent 1200. В работе использовали полупрепаративную колонку: Zorbax RXSIL (Agilent) 5 мкм 9,4 × 250 нм. Количество впрыскиваемого образца составило от 50 до 100 мкл, в зависимости от подобранного метода. Для подфракций C и D дихлорметанового экстракта Salvia deserta пики фиксировались на диодном детекторе при длинах волн 254 и 280 нм, а для фракции H дихлорметанового экстракта Vexibia alopecuroides при длинах волн 210 и 360 нм. Каждый пик собирался в отдельный флакон с последующим выпариванием растворителя. в) Хромато-масс-спектрометрия Вещества выделенные из Salvia deserta анализировали с помощью прибора Agilent 7890 А GC используя газохроматографическое определение с массспектрометрическим детектированием. Газовый хроматограф был оснащен колонкой DB-5 (30 м × 0,25 мм × 0,25 мкм). Анализ проводили в условиях: температура инжектора 240 °С; температура печи 60-240 °С с интенсивностью 3 °С/мин. Конечная температура 240 ° С в течение 5 мин; объем пробы составил 1 мкл. Диапазон масс был от 40 до 650 m/z, задержка накаливания 3 мин, предварительное сканирующая ионизация 100 мкс, при температуре ионнойловушки 150 °C. Все соединения из Vexibia alopecuroides анализировали на приборе Agilent 1100 совмещенного с масс-спектрометром JEOL AccuTOF (JMS-T100LC) методом высоко эффективной жидкостной хроматографии с массспектрометрическим детектированием. Отдельно разделенные вещества растворяли в метаноле (0,1 мг / мл) и вводили напрямую в поток скоростью 0,4 32 мл / мин, 20 % Н2О / 80 % МеОН, содержащего раствор 1 мкг / мл Lтриптофана. Массовый дрейф компенсаций был выполнен по отношению к Lтриптофану [М + Н]+ и / или [2М + Н]+. г) Спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР) Образцы индивидуальных веществ растворяли в 150 мкл дейтерированных растворителей (ацетон-d6 (CD3COCD3), хлороформ–d (CDC13), метанол-d4 (CD3OD), диметилсульфоксид-d6 (CD3SOCD3)). Выбор растворителя определялся растворимостью анализируемого вещества. Образец переносили в ампулу для ЯМР, которую помещали в прибор между полюсами сильного магнита. 1H и 13С ЯМР-спектры регистрировали на ЯМР-спектрометре Brucker AMX 500 со стандартными импульсными последовательностями, с рабочей частотой 500 МГц для 1H и 125 МГц для 13С. Полученные спектры обрабатывали с помощью программы MestReNova. 2.2.10 Статистическая обработка полученных данных Статистическая обработка проведена по стандартным методикам [141]. Достоверность численных данных оценивали, используя критерий Стьюдента и критерий Фишера. Различия между группами считались статистически значимыми при p ≤ 0,05. 33 3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 3.1 Сбор и краткое ботаническое описание образцов растительного сырья Для составления списка растений использовали литературные данные о свойствах и химическом составе, этноботаническую информацию и сведения из Интернета [49-55, 142-146]. В результате анализа литературных данных были отобраны 7 видов растений: Epilobium hirsutum L. (Onagraceae), Rumex confertus Wiild. (Polygonaceae), Vexibia alopecuroides (L.) Jakovl. (Fabaceae), Polygonum undulatum Murr. (Polygonaceae), Rhodiola quadrifida (Pall.) Fisch. et Mey (Crassulaceae), Atraphaxis laetevirens (Ledeb.) Jaub. Et Spach (Polygonaceae), Salvia deserta Schang (Lamiaceae). Исследуемые виды растений были собраны в полевых условиях в Алматинской области и в Восточном Казахстане (таблица 4). Идентификация видов растений проводилась сравнением их с коллекционным материалом Гербария Института ботаники и фитоинтродукции МОН РК и по определителям [142, 143]. В связи с тем, что полезные свойства растений зависят от содержания в них действующих веществ, содержание которых в свою очередь зависят от фазы развития растения, было принято решение собирать растения в период цветения [12, с. 42]. Таблица 4 - Перечень образцов растительного сырья Семейство, вид Место и дата сбора Epilobium hirsutum L. (Onagraceae) Кипрей мохнатый [142, 143] Rumex confertus Wiild. (Polygonaceae) Щавель конский [142, 143] Vexibia alopecuroides (L.) Jakovl. (Fabaceae) [142, 143] Софора лисохвостная Polygonum undulatum Murr. (Polygonaceae) Горец волнистый [142, 143] Rhodiola quadrifida (Pall.) Fisch. et Mey. (Crassulaceae) Родиола четырехчленная [142, 143] Алматинская область, 5-9 км от поселка Узын-Агаш, у реки 14 Июля 2009 и 20 Июля 2013 Алматинская область, Илийский район, 2-5 км от Первомайских озер. 3 Июля 2013 Алматинская область, 5-9 км от поселка Узын-Агаш, 14 Июля 2013 На хребте Алтайский Тарбагатай, (Восточно-Казахстанской области), 9 Августа 2012 На высокогорных склонах Алтайский Тарбагатай (ВосточноКазахстанской области), 7 Августа 2010 и 3 Августа 2013 34 Заготовлен ная часть Все растение Все растение Корни Надземная часть Все растение Продолжение таблицы 4 Семейство, вид Место и дата сбора Заготовленная часть Salvia deserta Schang. В Алматинской области, Все растение (Lamiaceae) Карасайском районе, на 41 км Шалфей пустынный трассы Алматы-Чемолган, на [142, 143] склонах предгорий Заилийского Алатау на высоте 914 м над уровнем моря, 22 Июня 2011 и 20 Июня 2013 Atraphaxis laetevirens (Ledeb.) По склонам Сюгатинских гор Надземная Jaub. Et Spach на каменисто-щебнистой часть (Polygonaceae) почве. 153 км трассы АлматыКурчавка яркозеленая Кегень. 19 мая 2012 [142, 143] Род кипрей Epilobium L. представлен во флоре Казахстана 15 видами [146, с. 121]. Виды рода содержат флавоноиды, фитостерины, фенольные соединения и высшие жирные кислоты установленной структуры. Выделены дубильные вещества, обнаружены алкалоиды, сапонины, витамин С [144]. Epilobium hirsutum L. кипрей мохнатый (сем. Onagraceae Juss.) – многолетнее травянистое растение, 60–150 см высотой, c толстым корневищем (рисунок 6). Рисунок 6 - Epilobium hirsutum L. [147] Стебель прямостоящий, опушенный, как и все растение. Листья супротивные, сидячие, стеблеобъемлющие, продолговато–ланцетные. Цветки одиночные, венчик пурпурово–фиолетовый, крупный, до 2,5 см в диаметре. Цветет в июне–августе. Растет на заливных лугах по берегам рек, озер, по склонам низкогорий всего Казахстана [142, 143]. Надземная часть обладает вяжущим, гемостатическим, мягчительным, противовоспалительным действиями. В эксперименте показано, что водный 35 настой оказывает противоязвенное и противоопухолевое действие. Используется как кормовое, медоносное, декоративное растение [144-145]. Род щавель Rumex L. во флоре Казахстана представлен 23 (27) видами – многолетними или однолетними травами с олиственными стеблями [142, 146, с. 140]. Rumex confertus Wiild. Щавель конский (сем. Polygonaceae Lindl.) – многолетнее травянистое растение 60—120 см высотой (рисунок 7). Рисунок 7 - Rumex confertus Wiild. [147] Стебель прямой, бороздчатый, олиственный. Нижние листья продолговато- или яйцевидно-треугольные, тупые, у основания сердцевидные, по краю волнистые, с нижней стороны по жилкам жестко волосистые, пластинка 15—20 см длиной и 6—12 см шириной, черешки желобчатые, равные или превышающие длину пластинки. Соцветие узкое, цилиндрическое, густое, состоит из сближенных мутовок, почти безлистое. Цветоножки сочленены в середине или немного ниже. Внутренние доли околоцветника при плодах округло-сердцевидные, с тупой или островатой верхушкой, сетчатые, с зазубренным краем, чаще ширина превышает длину, 6—7 мм шириной, обыкновенно одна доля околоцветника с более или менее развитым желвачком. Цветет в мае-июне. Растет на лугах, по склонам, лесным полянам и как сорняк на пастбищах. Корни растения содержат дубильные вещества, обладают вяжущим, гемостатическим, гипотензивным, антигельминтным действиями, слабительным (в больших дозах), противовоспалительным, капилляроукрепляющим действиями. Используется как кормовое, дубильное средство [144]. Семейство: Fabaceae Lindl. Видов в роде два [146, с. 101]. Vexibia alopecuroides (L.) Jakovl. Софора лисохвостная - многолетнее растение 40-100 см высотой. Стебель прямостоячий, в верхней части ветвистый 36 и сильно олиственный, шелковисто-беловато-пушистый, как и все растение (рисунок 8). Рисунок 8 - Vexibia alopecuroides (L.) Jakovl. [147] Прилистники опадающие, малозаметные. Листья непарно перистые, 10-20 см длиной с 5-12 парами продолговато-яйцевидных, яйцевидных или продолговатых, цельнокрайних листочков; 14-40 мм длиной и 5-15 мм шириной; беловато-шелковистые от короткого прижатого опушения. Цветки собраны на верхушке стебля в удлиненную густую многоцветковую кисть, 5-15 см длиной. Чашечка широко-колокольчатая, венчик беловатый или желтоватый. Бобы 5-12 см длиной, не раскрывающиеся, зачастую изогнутые, ясно четковидные, с расставленными длинными суженными бесплодными участками (перетяжками); мелко прижато пушистые, в зрелом состоянии поникающие. Семена шаровидно-яйцевидные, 4-5 мм длиной и 3-4 мм шириной, желтоватые, реже светло-коричневые, гладкие, слегка блестящие с округлым рубчиком. Цветет в мае-июне, плодоносит в июне-августе. Растет в речных долинах, на солонцеватых лугах, по берегам рек и арыков, по сорным местам, в посевах, на залежных землях, часто зарослями. Встречается на всем равнинном Казахстане, кроме крайнего севера [142, 143]. Надземная часть (трава) софоры содержит до 2 % алкалоидов, семена до 3 %. Подземные органы до 1 % алкалоидов (матрин, пахикарпин, софокарпин), флавоноиды. Главный алкалоид травы пахикарпин снижает возбудимость вегетативных ганглиев нервной системы и тормозит проведение через них нервных импульсов. Кроме того, пахикарпин повышает тонус и усиливает сокращение 37 гладкой мускулатуры матки, улучшает функциональную активность мышечной системы при миопатии. Пахикарпин в качестве ганглиоблокатора применяют при гипертонической болезни для купирования кризов, при облитерирующем эндартериите, т.е. при заболеваниях, сопровождающихся спазмами периферических сосудов [144]. В акушерско-гинекологической практике препарат применяют для ускорения родовой деятельности при слабости родовых схваток или при раннем отхождении околоплодных вод, а также при слабых потугах. Вследствие тонизирующего действия пахикарпина на матку препарат назначают для уменьшения кровопотери в послеродовом периоде. Род Atraphaxis L. представлен 14 видами [146, с. 138]. Сведения о химическом составе и полезных свойствах известны для 5 видов - они богаты флавоноидами, фенольными кислотами. Atraphaxis laetevirens (Ledeb.) Jaub. Et Spach Курчавка яркозеленая (рисунок 9). Рисунок 9 - Atraphaxis laetevirens (Ledeb.) [147] Некрупный; растопыренно-ветвистый кустарник, 30—70 см высотой, с деревянистыми, неколючими, на концах с листьями или цветками, ветвями, покрытыми серой корой; годичные веточки второго порядка неколючие, оканчивающиеся листьями или цветками и на всем протяжении коротко опушенные; раструбы коротко цилиндрические, 2—3 мм дл, пленчатые, к основанию буреющие, по верхнему краю, слегка зубчатые, с 2 удлиненными зубцами; листья ярко-зеленые, кожистые, 7—15 мм длиной и 4—8 мм шириной яйцевидно-эллиптические, в основании быстро клиновидно суженные, на верхушке коротко заостренные, по краям цельные или слегка волнистозазубренные, по верхней стороне голые, почти гладкие, снизу с ясно заметной сеткой жилок и обычно по средней жилке, ближе к основанию, коротко железистоопушенные; цветки в малоцветковых, головчатых, преимущественно боковых безлистых кистях, сидят на концах годичных веточек; цветоножки, выходящие из прицветных раструбов, длинные, с сочленением ниже середины 38 или в нижней трети; околоцветник 5-членный, розовый, с белыми краями или белый, позже буреющий, внутренние доли его почковидные или округлосердцевидные, 5—6 мм длиной и 6—7 мм шириной, наружные доли мелкие, округло-яйцевидные, вниз отогнутые; орешек трехгранный, яйцевиднозаостренный, темно-бурый, голый, гладкий. Цветет с мая по июнь. Растет на каменистых горных склонах [142]. Род Polygonum L. представлен во флоре Казахстана 45(48) видами [146, с. 139]. Горец волнистый Polygonum undulatum Murr. (Polygonaceae Lindl.) многолетнее травянистое растение с прямостоящими стеблями до 1 м высоты и стержневыми корнями (рисунок 10). Листья ланцетные, цветки белые, собранные в коротко ветвистую безлистную метелку. Плод – трехгранный орешек. Цветет в мае-августе. Растет в предгорьях, по луговым склонам, кустарникам и лесным опушкам всего горного Казахстана [142]. Рисунок 10 - Polygonum undulatum Murr. [147] Род Rhodiola L. представлен во флоре Казахстане 11 видами [142, с. 350]. Родиола четырехчленная Rhodiola quadrifida (Pall.) Fisch. et Mey. (сем. Crassulaceae DC.) – многолетник с. длинным, красноватым, толстым корнем и многоглавым корневищем, толщиной 1—3 см, черно-бурым, покрытым чешуевидными, треугольными, бурыми листьями 4 мм длиной, 4 мм шириной (рисунок 11). Стебли тонкие, 3—10 (15) см высотой, 0,5—1 мм толщиной, многочисленные, прямостоящие, вверх торчащие, густо олиственные. Листья очередные, сидячие, 5—8 (12) мм длиной, 1 мм шириной, линейные, почти цилиндрические, острые, мясистые, цельнокрайние, большей частью вверх направленные. Соцветие немногоцветковое, щитковидное. Цветки двудомные, мелкие, цветоножки равны или короче их. Лепестки около 4 мм длиной, продолговато-обратно-яйцевидные, тупые, желтые, иногда на верхушке 39 краснеющие, сухие часто зеленеющие. Листовки около 5 мм длиной, ланцетные, прямые, зрелые темно-красные, со слабо отогнутым наружу или прямым, коротким носиком. Семена 2 мм длиной, продолговатые, крылатые, бурые. Рисунок 11 - Rhodiola quadrifida (Pall.) [147] Цветет в мае-июне. Растет в альпийском поясе, щебнистой и моховолишайниковой тундре, на скалах, каменистых склонах и осыпях около ледников. Корни обладают тонизирующим, вяжущим действием, также обладают антиаллергическими свойствами. Используется как кормовое растение [144]. Род шалфей Salvia L. (сем. Lamiaceae) - насчитывает около 1000 видов, распространенных в обоих полушариях. В Казахстане 8(11) видов. [146, с.112]. Виды рода содержат моно- и сесквитерпеноиды, ди- и тритерпеноиды, хиноны, флавоноиды, стероиды, кумарины, углеводы, фенолы, фенольные кислоты, высшие жирные кислоты и алифатические углеводороды установленной структуры, характеризуются антибактериальной, антимикотической, антипротозойной, антивирусной, ростингибирующей, репеллентной, противоопухолевой активностью Шалфей пустынный Salvia deserta Schang. – травянистый многолетник высотой 35-90 см (рисунок 12). Стебли по нескольку, реже одиночные, длиннее соцветия, в верхней части разветвленные, опушенные от самого основания. Листья прикорневые мелкие, рано засыхают. Листья стеблевые от продолговато-яйцевидных до продолговатых, сердцевидные, острые, двоякогородчатые, морщинистые, сверху негусто, коротко опушенные, снизу сизые от густого ворсинчатого опушения, на черешках, равных по длине пластинке листа. Соцветия простые, с 1-2(3) парами боковых ветвей, реже соцветие одиночное. Цветки на коротких бело-опушенных цветоножках с двумя линейными опушенными прицветниками, собраны в 4-6-цветковые ложные мутовки, которые в количестве 20-25 расставлены по стеблю на расстоянии 1,5 см. 40 Рисунок 12 - Salvia deserta Schang [147] Чашечка по жилкам опушенная, на 1/3 надрезанная на губы; верхняя губа округлая, с короткими, сближенными на верхушке зубчиками, нижняя - с двумя более глубоко надрезанными, яйцевидными, на верхушке заостренными долями. Венчик темно-фиолетовый, снаружи коротко опушенный, верхняя губа прямая или несильно согнутая, нижняя трехлопастная с округлой или широко обратнояйцевидной средней лопастью и двумя боковыми продолговатыми лопастями. Плод - темно-бурые, трехгранно-шаровидные орешки. Цветет в июне-августе; плодоносит в августе-сентябре. Растет по степям, опушкам леса, берегам рек, сорняк, около жилья и в посевах по всему Казахстану. Содержит органические кислоты, алкалоиды, витамин С, дубильные вещества, флавоноиды. В корнях – хиноны. Листья и соцветия шалфея пустынного содержат небольшое количество эфирного масла - 0,02 %, которое оказывает антимикотическое действие. В сухих семенах содержится до 23 % жирного масла, пригодного для изготовления олифы. Отвар, настойка корней проявляют антибактериальную активность. В народной медицине надземную часть используют при кишечных инфекциях, лихорадке; листья и цветки – при неврозе сердца и неврастении; плоды толченые с маслом – ранозаживляющее; жареные и измельченные в порошок – при тахикардии и дизентерии. Медонос [148, с. 73-74]. 3.2 Получение экстрактов из растительного сырья При экстракции биологически активных веществ растений выбор экстрагента является важной задачей для достижения максимального результата. Наиболее успешной считается экстракция, проведенная поэтапно с применением разнополярных растворителей. Выбор органических 41 растворителей, таких как дихлорметан и этанол, обусловлен их способностью растворять большинство органических соединений, находящихся в растительном сырье. Наибольший интерес представляет экстракция БАВ, проявляющих антимикробную и антиоксидантную активности, таких как флавоноиды, танины, антоцианы, алкалоиды и их совместные комплексы, стандартные методы экстракции которых основаны на использовании органических растворителей, в том числе дихлорметана и этанола [149]. В связи с вышесказанным суммарные экстракты получали последовательной двухступенчатой экстракцией, используя в качестве растворителя дихлорметан и спирт. Количество сухого материала варьировало от 100 г до 300 г. Объем и масса полученных суммарных экстрактов зависели от применяемого растворителя, максимальное количество экстракта было получено при экстракции спиртом (таблица 5). Таблица 5 - Масса экстрактов, полученных из сухого сырья растений Семейство, вид Часть растения, взятая для экстракци и Epilobium hirsutum Кипрей мохнатый Надземная часть Rumex confertus Щавель конский Корни Vexibia alopecuroides Софора лисохвостная Количество Растворите Количество сухого ль полученного материала экстракта для (сухой вес, г.) экстракции, г. 100 Дихлормет 2,9 ан Спирт 4,4 150 Корни 100 Atraphaxis laetevirens Надземная Курчавка часть яркозеленая Rhodiola quadrifida Родиола четырехчленная 300 Целое растение 150 42 Дихлормет ан Спирт 1,1 Дихлормет ан Спирт 2,2 Дихлормет ан Спирт 6,1 Дихлормет ан Спирт 1,8 13 8,7 9,8 4,6 Продолжение таблицы 5 Семейство, вид Часть растения, взятая для экстракци и Polygonum undulatum Надземная Горец волнистый часть Salvia deserta Шалфей пустынный Количество Растворите Количество сухого ль полученного материала экстракта для (сухой вес, г.) экстракции, г. 150 Дихлормет 3,2 ан Спирт 6,8 корни 150 Дихлормет ан Спирт 2,5 3,6 3.3 Скрининг суммарных экстрактов 3.3.1 Изучение антимикробной активности экстрактов Литературные данные о наиболее часто выделяемых микроорганизмах у больных с гнойно-некротическими формами диабетической стопы сильно разнятся в зависимости от источника [150]. В связи с этим, для точного установления микроорганизмов, поражающих стопы больных диабетом (рисунок 13), был проведен бактериальный посев из раневой поверхности больных на базе НИИ Кардиологии и Внутренних Болезней, г. Алматы. Все манипуляции с пациентами проводили в соответствии с принципами, изложенными в Хельсинкской декларации 2013 года, а также сопровождали получением информированного согласия от пациента, составленного в соответствии с рекомендациями руководства ICHGCPE6 (R1) (Надлежащая клиническая практика). Одобрения локальной этической комиссии на данный вид исследования не требовалось в связи с неинтервенционным характером исследования, а также согласно локальным регулирующим требованиям в Республики Казахстан на 2013 год. Кожу вокруг раны обрабатывали антисептиком, удаляли с помощью стерильной салфетки некротические массы, детрит и гной. Материал брали с помощью стерильного тампона. Тампон помещали в транспортную среду и в течение 3 часов доставляли в лабораторию. Идентификацию микроорганизмов проводили, выделив чистые культуры согласно стандартным процедурам и методикам, описанным в разделе «Материалы и методы». 43 Рисунок 13 - Пациент с диабетической стопой (НИИ Кардиологии и Внутренних Болезней, г. Алматы) Бактериальный посев из раневой поверхности выявил наличие трех доминирующих микроорганизмов: Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Candida krusei (таблица 6, 7), что свидетельствует о смешанной флоре раневой поверхности, которая плохо поддается лечению антибактериальными препаратами [151]. Таблица 6 - Морфофункциональные признаки культур Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Candida krusei выделенных из раневой поверхности Параметры S. aureus Ps. aeruginosa Микроскопия исследуемого материала C. krusei морфология грамположитель грамотрицательн грамположите ные кокки в ые палочки льно скоплениях окрашенные (грозди) клетки Культуральные свойства микроорганизмов (рост на твердой среде) форма колоний: круглая круглая круглая размер: 2,3 мм 2,3мм 3-4мм поверхность: гладкая гладкая гладкая профиль: выпуклый выпуклый плоская оптические свойства: непрозрачны прозрачный непрозрачный 44 Продолжение таблицы 6 Параметры S. aureus Ps. aeruginosa C. krusei Культуральные свойства микроорганизмов (рост на твердой среде) цвет: желтый зеленый серый край колонии: ровный ровный - структура колонии: однородная однородная неоднородная с мелкой зернистостью в центре консистенция: мягкая мягкая плотная Таблица 7 - Идентификация культур микроорганизмов, выделенных из раневой поверхности Название теста Анализируемый параметр Название теста Код Реакция STAPHYtest 16 Уреаза Аргинин Орнитин β - Глюкуронидаза Эскулин Нитраты Фосфатаза Галактоза Сахароза Трегалоза Маннитол Ксилоза Мальтоза Манноза Лактоза Ацетоин Цитохромоксидаза Индол Аргинин Уреаза URE ARG ORN GLR ESL NIT PHS GAL SUC TRE MAN XYL MLT MNS LAC VPT OXI IND ARG URE + + _ _ _ + + _ + + + _ + + + + + _ + + 45 Идентифика ция S. aureus Продолжение таблицы 7 Название Анализируемый параметр теста Название теста NEFERMtest 24 CANDIDAte st21 Лизин Глюкоза Фруктоза Инозитол Сахароза Фосфатаза N-Ацетил β – Dглюкозаминидаза Маннитол Ксилоза Целлобиоза Галактоза Нитраты Нитриты Эскулин γ - Глютамилтрансфераза Лактоза Мальтоза Трегалоза Цитрат Симмонса Цитохромоксидаза N-Ацетил β – Dглюкозаминидаза Глюкоза Галактоза Мальтоза α Галактозидаза L-фенилаланинаминопептидаза Уреаза Рамноза Инозитол Трегалоза Лактоза L-пролинаминопептидаза Мелобиоза Ксилоза Целлобиоза 46 Код Реакция LYS GLU FRU INO SUC PHS NAG _ + + _ _ + _ MAN XYL CEL GAL NO3 NO2 ESL GGT LAC MLT TRE SCI OXI NAG + + _ + + + + + _ _ _ + + _ GLU GAL MAL A αGAL PHE + _ _ URE RHA INO TRE LAC PRO MEL XYL CEL _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ Идентифика ция Ps. aeruginosa Candida krusei Продолжение таблицы 7 Название Анализируемый параметр теста Название теста CANDIDAte st21 Сахароза Раффиноза Ростовые трубки Псевдогифы Атроспоры Код Реакция SUC RAF GET PSH ATS _ _ _ + _ Идентифика ция Candida krusei В связи с полученными результатами бактериального посева, для скрининга суммарных экстрактов, обладающих антибактериальной активностью были выбраны следующие сертифицированные штаммы микроорганизмов из Американской коллекции культур: бактерии Staphylococcus aureus ATCC № 29213, Methicillin-resistant S. aureus ATCC №43300, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, дрожжеподобные грибки Candida albicans ATTC № 90028, Candida krusei ATCC 6258, Candida glabrata ATTC 90030. Первичный скрининг проводили для каждого суммарного экстракта в двух повторностях. Если исследуемый образец демонстрировал зону ингибирования роста тест-объектов, превышающую 50 %, то данный экстракт повторно исследовался для установления концентрации полумаксимального ингибирования (IC50). Полученные данные показали, что экстракты обладают избирательной антимикробной активностью. Три дихлорметановых экстракта Rhodiola quadrifida (все растение), Epilobium hirsutum (надземная часть), Polygonum undulatum Murr. (надземная часть) показали 50 % ингибирование по отношению к представителям рода Candida. И три дихлорметановых экстракта Rumex confertus (корни), Vexibia alopecuroides (корни) и Salvia deserta (корни) показали 50 % ингибирование по отношению к бактериям рода Staphylococcus (таблица 8). И только одно выбранное растение Atraphaxis laetevirens (надземная часть) не обладало антимикробным действием в отношении изучаемых штаммов. Но, не смотря на это, Atraphaxis laetevirens, может быть отличным кандидатом при разработке сельскохозяйственных препаратов пестицидов, в связи с тем, что выделенные вещества из данного растения: хризофанол, эмодин, неподин и физцион проявляют высокую антимикробную активность в отношении таких бактерий, как Flavobacterium columnare, Edwardsiella ictaluri и Streptococcus iniae, вызывающих болезни у рыбы «Сома» Так например хризофанол обладает высокой антимикробной активностью в отношении Flavobacterium columnare, эти данные базируются на результатах минимальной ингибирующей концентрации, которая составляет 1,4 мг/л [152]. 47 Таблица 8 - Первичный скрининг растительных экстрактов на антимикробную активность Исследуемый экстракт Ингибирование роста, % (исследуемая концентрация образца 50,0 мкг / мл) S. aureus MRSA P. C. C. C. aeruginos glabrata albicans krusei a Rhodiola quadrifida (все растение) этанол 17 11 0 8 37 25 Rhodiola quadrifida (все растение) дихлорметан 21 13 0 55 94 94 Epilobium hirsutum (надземная часть) этанол 14 0 6 13 24 0 Epilobium hirsutum (надземная часть) дихлорметан 21 4 42 16 96 48 Rumex confertus (корни) дихлорметан 77 69 0 40 38 57 Rumex confertus (корни) этанол 0 0 32 11 9 0 Vexibia alopecuroides (корни) этанол 45 38 2 0 0 28 Vexibia alopecuroides (корни) дихлорметан 99 100 3 0 0 6 Atraphaxis laetevirens (надземная часть) этанол 18 38 39 6 48 11 Atraphaxis laetevirens (надземная часть) дихлорметан 36 38 22 17 8 7 Salvia deserta (корни) этанол 12 35 3 11 0 6 Salvia deserta (корни) дихлорметан 76 69 9 15 0 0 Polygonum undulatum (надземная часть) этанол 13 0 7 30 7 20 Polygonum undulatum (надземная часть) дихлорметан 17 21 3 64 1 16 Примечание - образцы с ингибированием <50 % рассматривались как не активные Для подтверждения полученных данных, провели повторное исследование антимикробной активности экстрактов для установления концентрации 48 полумаксимального ингибирования (IC50). Если IC50 составляет ≤ 1 мкг / мл, то экстракт является очень активным, при IC50 от 1 до 10 мкг / мл активным, а при IC50 от 10 до 20 мкг / мл умеренно активным, выше 20 мкг / мл экстракт считается не активным. Результаты вторичного скрининга показали, что антибактериальная и противогрибковая активность суммарных экстрактов варьирует в зависимости от вида растений. Как видно из представленных данных (таблица 9), суммарный экстракт Epilobium hirsutum, выделенный из надземной части дихлорметановым растворителем, показал активность по отношению к Candida albicans (IC50 составила 2,0 мкг / мл) [153], суммарный экстракт Rhodiola quadrifida, выделенный из всего растения дихлорметановым растворителем, показал активность против всех трех представителей рода Candida, C. glabrata (IC50 2,9 мкг / мл) и C. krusei (IC50 9,2 мкг / мл) и C. albicans (IC50 15,6 мкг / мл), дихлорметановый суммарный экстракт Rumex confertus (корни) показал активность против C. glabrata (IC50 2,9 мкг / мл). Дихлорметановый экстракт, выделенный из надземной части Polygonum undulatum Murr. непроявил активность по отношению C. glabrata, так как IC50 составила 36,9 мкг / мл. Таблица 9 - Вторичный скрининг растительных экстрактов на антимикробную активность Исследуемый экстракт S. aureus MRSA P. C. C. aerugi glabrata krusei nosa IC50 * (мкг / мл)** C. albicans 2,9±2,33 9,2±1,40 15,6±2,3 Rhodiola quadrifida 0 (все растение) дихлорметан 2,0±0,80 Epilobium hirsutum (надземная часть) дихлорметан 36,9±4,93 Polygonum undulatum (надземная часть) дихлорметан 10,8±0,4 16,2±1,0 2,9±0,37 Rumex confertus 4 2 (корни) дихлорметан Vexibia alopecuroides 3,05±1,7 2,9±0,20 (корни) дихлорметан 4 5,7±0,80 7,6±1,06 Salvia deserta (корни) дихлорметан 0,1±0,02 0,1±0,01 0,1±0,0 Ципрофлоксацин 1 (контроль) 0,14±0,03 0,55±0,0 0,28±0,0 Амфотерицин B 5 7 (контроль) Примечание -* IC 50 , 50 % ингибирующая концентрация ** в таблице представлено среднее значение ± стандартное отклонение (n=3) 49 Антибактериальную активность в отношении рода Staphylococcus проявили три дихлорметановых экстракта, выделенных из корней растений Rumex confertus, Salvia deserta и Vexibia alopecuroides. Rumex confertus показал умеренную активность против Staphylococcus aureus (IC50 составила 10,8 мкг / мл) и Methicillin-resistant S. aureus (IC50 16,2 мкг / мл). Также антимикробную активность проявил экстракт Salvia deserta против Staphylococcus aureus, IC50 составила 5,7 мкг / мл, а для Methicillin-resistant S. aureus IC50 составила 7,6 мкг / мл. Самая высокая антибактериальная активность среди растительных экстрактов была характерна для экстракта Vexibia alopecuroides в отношении Staphylococcus aureus (IC50 составила 3,05 мкг / мл) и Methicillin-resistant S. aureus (IC50 составила 2,9 мкг / мл). Таким образом, на основании полученных результатов были отобраны следующие экстракты: Rhodiola quadrifida (все растение, растворитель дихлорметан), Epilobium hirsutum (надземная часть, растворитель дихлорметан), Rumex confertus (корни, растворитель дихлорметан), Vexibia alopecuroides (корни, растворитель дихлорметан), Salvia deserta (корни, растворитель дихлорметан). 3.3.2 Изучение антиоксидантной активности экстрактов Одним из важных факторов развития диабета и его сосудистых осложнений является окислительный стресс. Это состояние характеризуется повышенным образованием свободных радикалов, которые повреждают сосудистую стенку с последующим развитием микроангиопатий и макроангиопатий [154]. Поэтому необходимо изучить антиоксидантные свойства исследуемых экстрактов. На данный момент не существует единой методики по определению антирадикальной активности соединений. Поэтому для получения более полной информации об антирадикальных свойствах исследуемых соединений используют различные методики, каждая из которых предоставляет свою уникальную информацию [155]. Благодаря методу определения антиоксидантной активности, основанному на способности восстанавливать ABTS+ радикал, можно оценить широкий спектр антиоксидантов, включая антиоксиданты с низким окислительновосстановительным потенциалом. Первоначальным этапом исследования антиоксидантной активности было определение наличия антиоксидантного потенциала у растительных экстрактов, отобранных при изучении антимикробного действия. Для этого были проанализированы дихлорметановые экстракты растений Rhodiola quadrifida, Epilobium hirsutum, Rumex confertus, Vexibia alopecuroides, Salvia deserta в концентрации 100,0 мкг/мл (рисунок 14). 50 Рисунок 14 - Антиоксидантная активность растительных экстрактов при ингибировании ABTS+ радикала. Согласно представленным данным три экстракта обладали высокой антиоксидантной активностью, больше 50 % ингибирования. Это Rhodiola quadrifida (все растение, растворитель дихлорметан), Rumex confertus (корни, растворитель дихлорметан) и Epilobium hirsutum (надземная часть, растворитель дихлорметан). Все остальные экстракты обладали средней антиоксидантной активностью. На основании полученных данных был рассчитан коэффициент эффективного ингибирования IC50 для экстрактов с высоким антиоксидантным потенциалом. Данный показатель указывает на минимальное количество антиоксиданта необходимого для ингибирования 50 % радикала в реакционной среде. Данные по определению IC50 продемонстрированы в таблице 10. Наименьшее значение данного параметра указывает на более высокую антиоксидантную активность. Таблица 10 - Эффективный коэффициент ингибирования (IC50) растительными экстрактами ABTS+катион-радикала Исследуемый экстракт Rhodiola quadrifida (все растение) дихлорметан Epilobium hirsutum (надземная часть) дихлорметан Rumex confertus (корни) дихлорметан Vexibia alopecuroides (корни) дихлорметан Sanguisorba officinalis L. (корни) этанол Sanguisorba officinalis L. (корни) дихлорметан 51 ABTS+катион-радикала IC 50 (мкг / мл) 5.6 4.0 3.8 NA NA NA Продолжение таблицы 10 Исследуемый экстракт ABTS+катион-радикала IC 50 (мкг / мл) NA 1.83 Salvia deserta (корни) дихлорметан Аскорбиновая кислота (контроль) Примечание - NA- не активен Наибольшей антиоксидантной активностью среди проверенных растительных экстрактов обладал дихлорметановый экстракт Rumex confertus, выделенный из корней, и дихлорметановый экстракт Epilobium hirsutum, IC50 которых составила 3,8 мкг / мл и 4,0 мкг/ мл соответственно [156]. Аналогичные исследования по изучению антиоксидантного потенциала были проведены с участием DPPH-радикала. Полученные данные согласуются с данными, показанными при использовании фотометрической методики определения антиоксидантной активности с помощью катион-радикала ABTS. В данном исследовании также три экстракта (Rhodiola quadrifida (все растение, дихлорметан),, Epilobium hirsutum (надземная часть, дихлорметан и спирт) и Rumex confertus (корни, дихлорметан, спирт), показали достоверное DPPH ингибирование выше 83 % в концентрации 100,0 мкг / мл. В связи с тем, что процент ингибирования DPPH у аскорбиновой кислоты составил 96 %, а процент ингибирования следующих экстрактов (Rhodiola quadrifida (все растение, дихлорметан),, Epilobium hirsutum (надземная часть, дихлорметан и спирт) , Rumex confertus (корни, дихлорметан, спирт), составил более 70 % их можно отнести к группе с высокой антиоксидантной активностью, что делает их перспективными для дальнейших исследований (рисунок 15). Рисунок 15 - Антиоксидантная активность растительных экстрактов при ингибировании DPPH-радикала. 52 В ходе исследований антиоксидантной активности, проведенных in vitro, выявлены экстракты, обладающие высокой антиоксидантной активностью: Rhodiola quadrifida (все растение, растворитель дихлорметан), Epilobium hirsutum (надземная часть, растворитель дихлорметан и спирт), Rumex confertus (корни, растворитель дихлорметан), Несмотря на то, что экстракты корней Vexibia alopecuroides, и Salvia deserta полученные дихлорметановым растворителем, не проявили высокую антиоксидантную активность, они остаются перспективным для исследования, так как обладают высокой антимикробной активностью. Таким образом, на основании полученных данных по антимикробной и антиоксидантной активности были отбраны следущие растительные экстракты для дальнейших исследований: Rhodiola quadrifida (все растение, растворитель дихлорметан), Epilobium hirsutum (надземная часть, растворитель дихлорметан), Rumex confertus (корни, растворитель дихлорметан), Vexibia alopecuroides (корни, растворитель дихлорметан), Salvia deserta (корни, растворитель дихлорметан). 3.3.3 Изучение миграционной активности экстрактов Заживление ран является очень организованным и очень управляемым процессом, характеризующимся четырьмя различными, но перекрывающимися фазами: кровотечение, воспаление, пролиферация и полное заживление [157]. На заключительном этапе заживления ран, пролиферация фибробластов включает восстановление структуры и функции пораженного места [158]. Однако многие исследователи показали, что высокие концентрации глюкозы подавляют процесс заживления раны, продлевая воспалительную фазу [159], нарушая процесс ангиогенеза [160] и снижая пролиферацию фибробластов [161]. В связи с этим, была предпринята попытка поиска экстрактов, обладающих пролиферативной активностью и способностью к миграции клеток, так как миграция клеток участвует во многих физиологических процессах, включая эмбриональное развитие, иммунные реакции и заживление ран. В результате проведенного исследования после 24 часового воздействия исследуемыми экстрактами на культуру клеток МDСК было показано, что экстракты Rhodiola quadrifida (все растение, растворитель дихлорметан), Epilobium hirsutum (надземная часть, растворитель дихлорметан) и Rumex confertus (корни, растворитель дихлорметан) обладали цитотоксическими свойствами в исследуемых дозах (12,5; 25,0; 50,0; 100,0 и 150,0 мг/кг). И только экстракты, выделенные из корней Salvia deserta и Vexibia alopecuroides не проявляли цитотоксических свойств в исследуемых концентрациях. Экстракт Salvia deserta (корни, растворитель дихлорметан) не влиял на пролиферацию клеток (рисунок 16). Экстракт Vexibia alopecuroides (корни, растворитель дихлорметан) обладал достоверно отличающейся 53 пролиферативной активностью в двух концентрациях 50,0 мкг/мл и 25,0 мкг/мл. * * * –p ≤0,05 по отношению к контрольной группе Рисунок 16 - Влияние экстрактов на пролиферацию клеток MDCK В присутствии экстракта Vexibia alopecuroides в концентрации 25,0 мкг/ мл просходило существенное повышение миграционной активности клеток MDCK, что выражалось в повышении интенсивности заполнения клетками площади экспериментальной «раны» клеточного монослоя (рисунок 17). Так, если в контрольных лунках через 24 часа после повреждения монослоя, свободная от клеток площадь составила 40 %, то в присутствии экстракта Vexibia alopecuroides в концентрации 25,0 мкг/мл этот показатель составил 69 % , что на 29 % больше чем в котроле (рисунок 18). * * p ≤0,05 по отношению к контрольной группе Рисунок 17 - Миграционная активность экстрактов на клетках MDCK 54 б) а) в) г) а) Исходное положение (сразу после нанесения раны); б) при внесении экстракта Vexibia alopecuroides в дозе 25,0 мкг/мл, через 24 часа, после нанесения раны; в) контрольнаяы группа, через 24 часа, после нанесения раны; г) при вненсении экстракта Salvia deserta в дозе 100,0 мкг/мл, через 24 часа после нанесения раны Рисунок 18 - Сравнительная микроскопическая картина, отражающая интенсивность миграции клеток MDCK Таким образом, на основании полученных данных для дальнейших исследований были отобраны растительные экстракты Vexibia alopecuroides (корни, растворитель дихлорметан) и Salvia deserta (корни, растворитель дихлорметан). 3.4 Исследования по разработке состава комплексных фитопрепаратов Базируясь на литературных источниках, были разработаны составы фитопрепаратов. В качестве растворителя, солюбилизатора и консерванта использовали Димексид. По химическому строению Димексид – диметилсульфоксид (ДМСО), цвитерион. Температура плавления ДМСО 18,4 оС, температура кипения – 189 оС, плотность 1,11 г/см3, молекулярная масса – 78,13 [162]. 55 Диметилсульфоксид обладает уникальными химическими свойствами, прежде всего, такими как стабильность, высокая полярность, исключительная растворяющая способность, низкая токсичность. Является поверхностноактивным веществом. Способствует пенетрации лекарственных веществ через клеточные мембраны. Растворяя медикаменты, не снижает фармакологические эффекты лекарственных препаратов. Диметилсульфоксид - фармакологически активный компонент с противовоспалительным, бактерицидным, болеутоляющим действием [162, с. 128]. В соответствии с выбором растворителя, для изготовления растворов требуемой концентрации, расчет велся в % содержании компонентов (таблица 11). Таблица 11 - Состав растворов для наружного применения, содержащих извлечения из корней V. alopecuroides и S. deserta Код состава V1 Извлечение из корней V. alopecuroides, полученное с использованием дихлорметана, % 2,0 Извлечение из Димексид, Очищенная корней S. % вода, % deserta, полученное с использованием дихлорметана, % 5,0 93,0 V2 1,0 - 1,0 98,0 V3 3,0 - 10,0 87,0 S1 - 2,0 5,0 93,0 S2 - 1,0 1,0 98,0 S3 - 3,0 10,0 87,0 Биофармацевтическую оценку разработанных составов – растворов, для наружного применения, оценивали согласно распределению БАВ в системе октанол-вода и по антимикробной активности. Полученные данные показали, что состав под кодовым названием V1 обладал максимальной способностью к проникновению через биологические мембраны, о чем свидетельствуют данные по распределению веществ в системе 1-октанол-вода (таблица 12). Данный состав также обладал максимальным ингибирование роста S. aureus при концентрации образца 50,0 мкг/мг (100 % ингибирование). Состав под кодовым названием S1, также обладал схожими свойствами. 56 Таблица 12 - Результаты оценки биодоступности и антимикробных свойств разработанных фитопрепаратов Код состава Содержание БАВ, % Октанол Вода V1 95 5 Ингибирование роста S. aureus, % (исследуемая концентрация образца 50 мкг / мл) 100,0 V2 25 75 57,0±4,5 V3 40 60 68,0±5,8 S1 87 13 91,0±3,0 S2 11 89 49,0±3,7 S3 48 52 62,0±3,9 Руководствуясь полученными данными, для дальнейшей работы были выбраны два оптимальных состава V1 и S1, характеризующиеся наивысшей антимикробной активностью и способностью к проникновению веществ через клеточные мембраны. 3.5 Фармакологическое изучение фитопрепаратов, полученных из растительного сырья Vexibia alopecuroides и Salvia deserta 3.5.1 Изучение острой токсичности фитопрепаратов При разработке новых препаратов одним из обязательных требований является проведение неклинических исследований по безопасности. Изучение токсичности полученных комплексных фитопрепаратов исследовали на «Острую токсичность» на аутбредных мышах. Стартовая доза фитопрепаратов V1 и S1, полученных из корней растений V. alopecuroides и S. deserta составляла 2000,0 мг/кг. Наблюдения за животным осуществлялось в течение 15 суток. В первый день - каждые 2 часа, в последующие сутки каждые 12 часов. После внутрижелудочного введения фитопрепаратов V1 и S1 в дозе 2000,0 мг/кг гибель животных не наблюдалась в течение срока наблюдения. В связи с отсутствием гибели и согласно руководству OECD No. 423, исследование было остановлено на максимальной дозе в 2000,0 мг/кг. Токсические симптомы в первые часы эксперимента проявлялись в виде сбивания животных в группы и резко повышенной реакции их на внешние раздражения (шум). Все симптомы полностью исчезали через 2 часа. Динамика 57 изменения массы тела животных в ходе эксперимента представлена в таблице 13. Таблица 13 – Изменение массы тыла мышей после однократного внутрижелудочного введения фитопрепаратов в дозе 2000,0 мг/кг, M ± m Исследуемый экстракт Фитопрепарат V1, на основе 2 % экстракта V. alopecuroides Фитопрепарат S1, на основе 2 % экстракта S. deserta 1 сутки Средняя масса животных, г 8 сутки 15 сутки 22,4 ± 1,1 23,9 ± 1,9 24,6 ± 1,2 21,7 ± 0,9 22,4 ± 2,5 23,5 ± 1,6 Исследование динамики массы тела мышей, получавших исследуемые фитопрепараты, не выявило снижения массы тела, что также свидетельствует об отсутствии токсических проявлений исследуемых веществ при однократном внутрижелудочном введении. По истечению 15 суток животные выводились из эксперимента в СО2 камере. Макроскопия внутренних органов опытных животных не выявила каких-либо отклонений. Расположение внутренних органов было типичным, не отмечалось ни их спаянности, ни резкого увеличения или уменьшения размеров. Ткань легких была воздушная, розовая, без признаков отека, кровоизлияний или некроза на разрезе. Мышцы сердца темно-красного цвета, однородные, без повреждений. Кровоизлияний не обнаружено. Печень темнокрасного цвета, с гладкой капсулой, на разрезе однородная, обычной консистенции. Кровоизлияний или отложений жиров в паренхиме печени не выявлено. Селезенка темно-вишневого цвета, на разрезе четко дифференцируется красная и белая пульпа, не изъязвленная, без признаков кровоизлияний. Капсула почек снималась тяжело. Стенки кишечника и мочевого пузыря не были повреждены. По результатам исследования острой токсичности фитопрепаратов V1 и S1, полученных из V. alopecuroides и S. deserta, можно сделать следующий вывод: при однократном внутрижелудочном введении исследуемых веществ значение их LD50 находится в пределах 2000,0-5000,0 мг/кг. Таким образом, данные фитопрепараты можно отнести к 5 классу токсичности (т.е. малотоксичных веществ). 58 3.5.2 Исследование местно раздражающего действия фитопрепаратов V1 и S1, полученных из растительного сырья Vexibia alopecuroides и Salvia deserta С целью оценки раздражающего действия фитопрепаратов V1 и S1 на интактную кожу, проведены опыты на трех кроликах породы «Шиншилла». Фитопрепараты V1 и S1, на основе 2 % экстрактов V. alopecuroides и S. deserta в объеме 0,5 мл, наносили на участок для аппликации размером 2,5×2,5 см. Контрольные участки обрабатывали только 5 % раствором ДМСО (0,5 мл) размер аппликации также составил 2,5×2,5 см (рисунок 19). а б а) контрольный участок; б) опытный участок Рисунок 19 – Участок спины кролика после аппликации исследуемым фитопрепаратом V1 Период экспозиции составил 4 часа. В конце периода экспозиции остаточное количество исследуемых фитопрепаратов удаляли небольшим количеством воды. Визуальное состояние каждого аппликационного участка оценивали через 60 минут после воздействия исследуемой субстанции и далее, через 24, 48 и 72 часа после экспозиции. Ежедневное клиническое наблюдение за общим состоянием здоровья всех испытуемых животных не обнаружило никаких патологических отклонений эритем, отеков, изъявлений. Индивидуальные показатели реакции раздражения представлены в таблицах 14-15. Как видно из таблицы 15, фитопрепараты V1 и S1, при однократной аппликации не оказывают местно-раздражающего действия на кожу кроликов. Индекс первичного раздражения равен 0, в связи с этим их можно отнести к 1 категории, которая классифицируется как пренебрежимо малая. При ежедневном наблюдении за общим состоянием кроликов никаких патологических нарушений не было выявлено. 59 Изучение кожно-раздражающего действия показало, что эритем, отеков, изъявлений, изменений в массе теле не отмечалось. Таблица 14 – Индивидуальные показатели реакции первичного раздражения контрольного участка (5 % ДМСО) Реакция Время экспозиции Индивидуальные значения Общее Кролик Кролик Кролик значение №1 №2 №3 Эритема 1 час 0 0 0 0 формирование 24 часа 0 0 0 0 струпа 48 часов 0 0 0 0 72 часа 0 0 0 0 Появление 1 час 0 0 0 0 отека 24 часа 0 0 0 0 48 часов 0 0 0 0 72 часа 0 0 0 0 Сумма реакций за 24 часа и 72 часов 0 (S) Индекс первичного раздражения 0/6=0.0 (S/6) Категория реакции Пренебрежимо малая Таблица 15 - Индивидуальные показатели реакции первичного раздражения опытных участков после нанесения фитопрепаратов V1 и S1 Реакция Время экспозиции Индивидуальные значения Общее Кролик Кролик Кролик значение №1 №2 №3 Эритема 1 час 0 0 0 0 формирование 24 часа 0 0 0 0 струпа 48 часов 0 0 0 0 72 часа 0 0 0 0 Появление 1 час 0 0 0 0 отека 24 часа 0 0 0 0 48 часов 0 0 0 0 72 часа 0 0 0 0 Сумма реакций за 24 часа и 72 часов 0 (S) Индекс первичного раздражения 0/6=0.0 (S/6) Категория реакции Пренебрежимо малая 60 Результаты проведенных исследований позволяют заключить, что фитопрепараты V1 и S1, на основе 2 % экстракта корней Vexibia alopecuroides и Salvia deserta не вызывают изменений поверхностных структур кожного покрова кроликов и не обладают местно-раздражающим действием. 3.5.3 Изучение ранозаживляющей активности фитопрепаратов V1 и S1, разработанных на основе растительного сырья Vexibia alopecuroides и Salvia deserta Для изучения ранозаживляющей активности у крыс, путем ввдения стрептозотоцина был смоделирован экспериментальный сахарный диабет. Лабораторные животные были разделены на четыре группы по 6 животных в каждой группе: Первая группа контрольная – животные, получавшие 5 % раствор Димексида; Вторая группа получала референтное вещество – мазь «Левомиколь»; Третья группа животных получала фитопрепарат V1, на основе 2 % экстракта Vexibia alopecuroides; Четвертая группа – животные, получавшие фитопрепарат S1, на основе 2 % экстракта Salvia deserta. Путем введения стрептозотоцина удалось получить выраженные нарушения углеводного обмена, что подтверждается развитием гипергликемии и потерей массы тела животными. Гипергликемия сохранялась до конца эксперимента (таблица 16). Таблица 16 - Уровень глюкозы в крови крыс в исследуемых группах Группа животных Уровень глюкозы в крови до введения стрептозотоцина ммоль/л Контрольная 7,1±0,4 группа (5 % раствор Димексида) Референтное 7,4±0,7 вещество мазь «Левомиколь», Фитопрепарат 7,3±0,2 V1, на основе 2 % экстракта V. alopecuroides Уровень глюкозы в крови животных на 7 сутки после введения стрептозотоцина ммоль/л 27,2±1,4* Уровень глюкозы в крови животных на 20 сутки после введения стрептозотоцина ммоль/л 23,4±1,2* 30,5±0,6* 27,6±0,9* 31,9±0,5* 29,0±1,5* 61 Продолжение таблицы 16 Группа животных Уровень глюкозы в крови до введения стрептозотоцина ммоль/л Уровень глюкозы в крови животных на 7 сутки после введения стрептозотоцина ммоль/л 29,7±1,5* Уровень глюкозы в крови животных на 20 сутки после введения стрептозотоцина ммоль/л 25,0±1,3* Фитопрепарат 6,9±0,6 S1, на основе 2 % экстракта S. deserta Примечание - * p ≤0,05 по отношению к уровню глюкозы до ведения стрептозотоцина На протяжении всего исследования наблюдалось достоверное снижение массы тела крыс (таблица 17), что соотвествует высокому уровню глюкозы в крови. Таблица 17 - Масса тела крыс в исследуемых группах Группа животных Вес животного до введения стрептозотоцина, г Вес животного на 7 день после ввдения стрептозотоцина, г 279±9,6 Вес животного на 20 день после ввдения стрептозотоцина, г 265±5,9* Контрольная группа 313±5,3 (5 % раствор Димексида) Референтное 292±6,6 286±2,7 270±3,6* вещество мазь «Левомиколь» Фитопрепарат V1, на 290±3,7 265±4,3 260±4,7* основе 2 % экстракта V. alopecuroides Фитопрепарат S1, на 295,0±6,3 268,3±4,9 265,1±4,7* основер 2 % экстракта S. deserta Примечание -* – p ≤0,05 по отношению весу до ведения стрептозотоцина Кроме повышенной концентрации глюкозы в крови и снижения массы тела, были отмечены и другие симптомы диабета, такие как вялость, значительное увеличение потребления воды и полиурия. 62 Важно отметить, что различия по таким показателям, как концентрация глюкозы в крови, масса тела в исследуемых группах были сходными. Это говорит о том, что данная модель сахарного диабета воспроизводима. Таким образом путем введения стрептозотоцина удалось смоделировать выраженные нарушения углеводного обмена и развить сахарный диабет у лабораторных животных. На 9 сутки после воспроизведения модели сахарного диабета в асептических условиях и при анестезии (рометар в дозе 10,0 мг/кг веса животного и кетонала в дозе 25,0 мг/кг веса животного) было произведено удаление волосяного покрова и обработка кожи настойкой йода с последующим моделированием раны путем иссечения кожного лоскута 1x1 см в области холки (рисунок 20), с дальнейшим внесением в раневой дефект Staphylococcus aureus, содержащего в 1 мл 2х107 микробных тел. место после удаления волосяного покрова место иссечения кожного лоскута Рисунок 20 - Процесс моделирования раны путем иссечения кожного лоскута Наличие местного гнойного процесса оценивали на 4 сутки от начала нанесения раны (рисунок 21). В работе использовался клинический штамм S. aureus, выделенный с раневой поверхности пациента больного диабетической стопой. Рисунок 21 - Гнойный очаг, на 4 сутки после внесения S. aureus в рану 63 Таким образом, была получена экспериментальная модель гнойновоспалительного очага на лабораторных крысах. Исследуемые фитопрепараты наносились в ввиде аппликаций, в объеме 250 мкл на раневую поверность в течение 9 дней. Микробиологическую картину раневого процесса оценивали на 4, 7, 9 и 12 сутки от начала нанесения раны. Проводили посев с раны на селективные среды с последующей идентификацией, для подтверждения инфицирования раны. На четвертые сутки от начала лечения (седьмые сутки от начала нанесения раны) фитопрепаратами V1 и S1 высев штамма S. aureus с раневой поверхности составил 1 КОЕ/мазок для фитопрепарата V1, что в 5 раз меньше данных по сравнению с контрольной группой, и 2 КОЕ/мазок для фитопрепарата S1, что в 2,5 раза меньше данных в сравнении с контрольной группой. На девятые сутки от начала нанесения раны высев данного штамма наблюдался только в контрольной группе животных получавших в виде апплекаций 5 % раствор Димексида (рисунок 22). Эти данные подтверждают антимикробные свойства данных фитопрепаратов. Рисунок 22 - Обсемененность раны в исследуемых группах На протяжении всего периода лечения проводили ежедневный замер раны до окончания эксперимента. На четвертый день после заражения ран S. аureus, размеры ран увеличились и составили более 120 % от первоначальных размеров. После санации раневой поверхности размер ран стал уменьшаться во всех исследуемых группах. Однако полученные нами данные свидетельствуют 64 о том, что на 9 день происходило значительное уменьшение площади раны именно в группе, пролеченой комплексным фитопрепаратом V1, на основе 2 % экстракта Vexibia alopecuroides и фитопрепаратом S1, на основе 2 % экстракта Salvia deserta (рисунок 23) [162]. Уже на 12 день в данных группах животных наблюдалось полное закрытие раневого дефекта. В области раны сформировался рубец, тогда как в контрольной группе к 12 суткам только началось уменьшение площади раны. Полученные результаты представлены в таблице 18. День Контрольная группа (5 % раствор Димексида) Мазь – «Левомиколь» Фитопрепарат V1, на основе 2 % экстракта Vexibia alopecuroides Фитопрепарат S1, на основе 2 % экстракта Salvia deserta 4 день от нанесения раны 7 день от нанесения раны 9 день от нанесения раны 12 день от нанесения раны Рисунок 23 - Процесс заживления раны в исследуемых группах 65 Таблица 18 - Динамика изменения площади ран в исследуемых группах в период от начала нанесения и заражения раны. Группа животных Контрольная группа (5 % раствор Димексида) Референтное вещество мазь «Левомиколь», Фитопрепарат V1, на основе 2 % экстракта Vexibia alopecuroides Фитопрепарат S1, на основе 2 % экстракта Экстракт Salvia deserta Размер раны (% от первоначального размера) 1 сутки 4 сутки 7 сутки 9 сутки 12 сутки 100 119±2,5 67±2,1 24±1,2 9±1,8 100 121±3,0 72±1,9 29±2,1 20±1,5 100 120±1,9 42±1,5 4±2,2 0 100 121±2,7 51±2,3 9±1,6 0 Таким образом фитопрепараты V1 и S1, разработанные на основе экстрактов корней Vexibia alopecuroides и Salvia deserta показали высокую ранозаживляющую активность и в условиях стрептозотоцин-индуцированного экспериментального сахарного диабета сократили сроки заживления раны по сравнению с контрольной группой в 1,5 раза. По окончании лечения, животных выводили из эксперимента путем ингаляции воздухом, содержащим 70 % СО2. Производился забор кожи в области раны для проведения гистологических исследований. Образцы кожи забирали так, чтобы в поле зрения попадал участок поврежденной кожи. Также проводился отбор неповрежденного участка, который в последующем сравнивали с поврежденными участками. Диабетические раны относятся к категории хронических вялотекущих повреждений целостности кожного покрова, трудно поддающихся проводимой терапии и при заживлении приводящие к нарушению анатомо-функциональной целостности ткани [164]. Известно, что с момента нанесения раны запускаются сложные молекулярно-клеточные механизмы, включающие взаимообусловленные процессы клеточной миграции, пролиферации в направлении ее полного заживления. При этом микроскопическая картина проявляется в виде сменяющих друг друга клеточно-тканевых реакций: фаза воспаления, пролиферации и ремоделирования с последующим формированием плотной соединительной ткани, состоящей преимущественно из коллагена [165]. Микроскопические исследования кожи, выделенной из области раны животных контрольной группы (получавшей 5 % раствор Димексида), показало, что на 12 день от момента ее нанесения отмечались явления клеточно-воспалительной реакции: картина лимфогистиоцитарного инфильтрата, преобладание клеточных элементов, отсутствие волосяных фолликул, сальные железы и эпидермис не дифференцируются (рисунок 24). 66 а) Увеличение × 40 б) Увеличение × 20 Окраска гематоксилин-эозин. Рисунок 24 - Микроструктура кожи, выделенная из области раны животных контрольной группы Наряду с этим, у этой группы животных в ткани кожи отмечались явления пролиферативной активности коллагеновых волокон (прослеживалась их незрелость) и кровеносных капилляров, явление неполной эпителизации (рисунок 25). Окраска по Массону. Увеличение × 10 Рисунок 25 - Микроструктура кожи, выделенная из области раны животных контрольной группы У группы крыс, получавших мазь – «Левомиколь» в течение 9 дней, выявлена микроскопическая картина кожи с признаками неравномерного заживления: количество коллагена было уменьшено и отмечались явления неполной эпителизации (рисунки 26-27). 67 Окраска гематоксилин-эозин. Увеличение × 10 Рисунок 26 - Микроструктура кожи, выделенная из области раны животных, получавших мазь –«Левомиколь» Окраска по Массону. Увеличение × 10 Рисунок 27 - Микроструктура кожи, выделенная из области раны животных, получавших мазь –«Левомиколь» Наиболее выраженные процессы фиброзирования отмечались в группе животных, получавших в виде аппликаций фитопрепарат V1, на основе 2% экстракта Vexibia alopecuroides и фитопрепарат S1, на основе 2% экстракта Salvia deserta к окончанию срока эксперимента (12 сутки), что выражалось зрелостью коллагеновых волокон, равномерным распределением эпителиального слоя (рисунки 28-31). 68 Окраска гематоксилин-эозин. Увеличение × 40 Рисунок 28 - Микроструктура кожи, выделенная из области раны животных, получавших фитопрепарат V1, на основе 2 % экстракта Vexibia alopecuroides Окраска по Массону. Увеличение × 10 Рисунок 29 - Микроструктура кожи, выделенная из области раны животных, получавших фитопрепарат V1, на основе 2 % экстракта Vexibia alopecuroides 69 а) Увеличение × 20 б) Увеличение × 10 Окраска гематоксилин-эозин. Рисунок 30 - Микроструктура кожи, выделенная из области раны животных, получавших фитопрепарат S1, на основе 2 % экстракта Salvia deserta б) Увеличение × 10 а) Увеличение × 10 Окраска по Массону. Увеличение × 10 Рисунок 31 - Микроструктура кожи, выделенная из области раны животных, получавших фитопрепарат S1, на основе 2 % экстракта Salvia deserta Итак, у животных контрольной группы, получавших 5 % раствор Димексида, отмечалось неполное закрытие раневой поверхности и в ткани наблюдалось большое количество кровеносных сосудов, клеточная инфильтрация и коллагеновые волокна с признаками незрелости. Напротив ежедневная обработка раны фитопрепаратами V1 и S1 сопровождалась к окончанию срока исследования (12 сутки) полным закрытием раны, за счет выработки высокоорганизованных коллагеновых волокон. 70 3.6 Выделение и разделение биологически активных веществ из корней Vexibia alopecuroides и Salvia deserta Перспективные экcтракты выделенные из корней Vexibia alopecuroides и Salvia deserta содержат биологически активные вещества различной химической природы, которые обуславливают совокупный эффект и фармакологическое действие, поэтому следующим этапом работы было изучение химического состава для возможной дальнейшей разработки методов стандартизации данного растительного сырья. 3.6.1 Разделение биологически активных веществ дихлорметанового экстракта Vexibia alopecuroides Для фракционного разделения основных групп БАВ, суммарные экстракты разделили с помощью флэш-хроматографии на приборе Biotage Isolera. Для разделения дихлорметанового экстракта Vexibia alopecuroides (рисунок 32) в работе было использовано 1,5 г образца. Перед нанесением на колонку взвешенный экстракт растворяли в дихлорметане. В работе использовали 100 г SNAP картридж (40-63 м, 60 Å, 39 х 157 мм) при потоке элюентов 40 мл/мин. При хроматографическом разделении дихлометанового экстракта, выделенного из корней Vexibia alopecuroides, использовали гексан и изопропанол, при ступенчатом гарадиенте (первая ступень 0-100 (v/v), 2400 мл, вторая ступень промывка метанолом 385 мл). Сбор фракций контролировали при длине волны 254 нм и 220 нм. Каждый пик на графике говорит о том, что соединения, входящие в состав данного экстракта, обладают спектром поглощения при исследуемых длинах волн. В результате разделения было полученно 113 фракций по 22 мл. Для дальнейшего объединения фракций провели тонкослойную хроматографию (на пластине Anal Tech Silica Gel GF 250 м) всех полученных фракций. Данные ТСХ согласовывались с полученными данными при разделении экстракта на приборе Biotage. В связи с этим, были объединены следующие фракции: с 1 по 35 – фракция А; с 36 по 42 – фракция В; с 43 по 50 – фракция С; с 51 по 63 – фракция D; с 64 по 74 – фракция Е; с 75 по 85 – фракция F; с 86 по 96 – фракция G; с 97 по 107 – фракция H; с 108 по 113 – фракция I. 71 Рисунок 32 - Флэш-хроматография на приборе Biotage дихлорметанового экстракта, выделенного из корней Vexibia alopecuroides. Полученные на предыдущем этапе фракции, концентрировали досуха и подвергали повторному хроматографированию (рисунок 33). старт S A B C D E F G H I J - фракции Рисунок 33 – Тонкослойная хроматография фракций после объединения (экстракт Vexibia alopecuroides), обработка спрей Година. 72 В результате суммарный экстракт Vexibia alopecuroides был разделен на 10 фракций, характеристика которых представлена в таблице 19. При загрузке на SNAP картридж использовалось 1,5 г сухого экстракта. Суммарный выход фракций после расчета составил 820,4 мг, что соответствует 55 %, следовательно, потери равнялись 679,6 мг, что соответствует 45 %. Таблица 19 - Характеристика и выход фракций суммарного экстракта Vexibia alopecuroides Код фракции Характеристика фракции Фракция A Белый порошок, легко растворимый в дихлорметане, без запаха Фракция B Светло-коричневый с зеленоватым оттенком вязкое, легко растворимый в дихлорметане, с специфическим запахом Фракция C Темно-желтый порошок со специфическим запахом, легко растворимый в дихлорметане Фракция D Светло-желтый порошок с запахом, легко растворим в дихлорметане Фракция E Светло-желтый порошок с запахом, легко растворим в дихлорметане Фракция F Желтый порошок с запахом, легко растворим в дихлорметане Фракция G Бледно-желтый порошок с запахом, легко растворим в дихлорметане Фракция H Светло- коричневый порошок с запахом, легко растворим в метаноле Фракция I Бледно-желтый порошок с запахом, легко растворим в метаноле Фракция J Желтый порошок с запахом, легко растворим в метаноле Сумма выделенных фракций Потери на колонке Выход, мг (%) 24,6 (2,9) 245,6 (29,1) 29,6 (3,5) 97,2 (11,5) 85,5 (10,1) 53,8 (6,4) 19,6 (2,3) 88,5 (10,5) 106,6 (12,6) 69,4 (8,2) 820,4 (55) 679,6 (45) После разделения суммарного экстракта фракции были проверены на наличие антимикробной активности, полученные результаты представлены в следующем разделе. На основании полученных данных, провели дальнейшее выделение только тех фракций, которые обладали антимикробными свойствами - это фракции D, E, F и Н. На пластинах ТСХ фракция F показала единичное пятно, что свидетельствует о чистоте соединении. На основании физико–химических 73 данных, данных спектрального анализа и их сравнения с описанными в литературе, вещество было идентифицировано, как софорафлавон I, структура представлена в таблице 20. Таблица 20 - Характеристика выделенного вещества из фракции F растения Vexibia alopecuroides Название Структура Используемые методы для определения чистого вещества HR-ESI-МS: 431,1849 m/z + ([M+Na] , C25H28Na1O5+: вычислино 431,1834). Данные ЯМР 13С согласуются со значениями, опубликованными Iinuma и другими [166]. ЯМР спектры к данному соединению представлены в Приложении А. софорафлавон I (фракция F) Фракцию D разделяли с помощью флэш-хроматографии на приборе Biotage, исследуемое количество составило 97,2 мг, образец растворяли в дихлорметане, разделение производили с использованием градиента гексан / диэтиловый эфир, начиная с градиента от 100 % гексан до 0 % диэтиловый эфир, вторая ступень от 0 % гексан до 100 % диэтиловый эфир, 400 мл, и заканчивали промыванием метаномом в объеме 400 мл. Порции фракций в объеме 22 мл были собраны и объединены на основании полученных данных с ТСХ, после объединения получены 6 фракций (D1-D6). Из них было выделено два чистых соединения, на основании физико–химических данных, данных спектрального анализа и их сравнения с описанными в литературе, вещества были идентифицированы как леахианон А (43,0 мг) и глаброл (16,1 мг) (таблица 21). Фракцию E также разделяли методом флэш-хроматографии на приборе Biotage, исследуемое количество составило 85,5 мг, образец растворяли в дихлорметане, разделение производили с использованием ступенчатого градиента гексан / этилацетат, первой ступенью было 0-20 (v/v), 400 мл, вторая ступень 20-50 (v/v), 2000 мл, третья ступень 50-100 (v/v), 400 мл и промывка метанолом 300 мл). Сбор фракций контролировали при длине волны 260 нм и 280 нм. Фракция Е3 и Е4 были идентифицированы как софорафлавон G (33,5 мг) (таблица 22). 74 Таблица 21 - Характеристика выделенных веществ из фракции D растения Vexibia alopecuroides Название Структура Используемые методы для определения чистого вещества HR-ESI-МS: 461,1985 m/z + ([M+Na] , C26H30Na1O6+: вычислено 461,1940). Данные ЯМР 13С согласуются со значениями, опубликованными Iinuma и другими [167]. ЯМР спектры к данному соединению представлены в Приложении Б. леахианон А (фракция D2) глаброл (Фракция D3) OH HO O HR-ESI-МS: 415,1935 m/z + ([M+Na] , C25H28Na1O4+: вычислено 415,1885). Данные ЯМР 13С согласуются со значениями, опубликованными Tezuka и другими [168]. ЯМР спектры к данному соединению представлены в Приложении В. O Таблица 22 - Характеристика выделенного вещества из фракции E растения Vexibia alopecuroides Название Структура софорафлавон G (фракция Е3 и Е4) HO HO OH O OH O 75 Используемые методы для определения чистого вещества HR-ESI-МS: 425,2007 m/z + + ([M+H] , C25H29O6 : вычислено 425,1964). Данные ЯМР 13С согласуются со значениями, опубликованными Iinuma и другими [167]. ЯМР спектры к данному соединению представлены в Приложении Г. Фракцию H в количестве 64,7 мг очищали методом полупрепаративной ВЭЖХ. Количество впрыскиваемого образца в среднем составило 100 мкл. В подобранном обратно фазовом методе по разделению использовали 50 % ацетонитрил: 50 % очищенную воду в течение 22 мин. Для каждого нового впрыска образца фракции H в систему ВЭЖХ, колонка промывалась ацетонитрилом и повторно проводилась калибровка. Пики обнаружились при длине волны 210 нм и 360 нм на диодном детекторе. Было получено 6 фракций (H1-H6). Из которых было выделено пять чистых соединения, на основании физико–химических данных, данных спектрального анализа и их сравнения с описанными в литературе, вещества были идентифицированы как алопекурон А (15,8 мг), алопекурон В (4,4 мг), алопекурон С (5,7 мг), алопекурон D (4,7 мг), алопекурон F (5,1 мг) (таблица 23) [169]. Таблица 23 - Характеристика выделенных веществ из фракции H растения Vexibia alopecuroides Название Структура Используемые методы для определения чистого вещества HR-ESI-МS: 673,2491 m/z + ([M+Na] , C39H38Na1O9+: вычислено 673,2467). Данные ЯМР 13С согласуются со значениями, опубликованными Iinuma и другими [166]. ЯМР спектры к данному соединению представлены в Приложении Д. алопекурон А (фракция H3) HO HO O OH O HO OH O OH алопекурон В (фракция H4) OH OH O OH O OH OH O OH 76 HR-ESI-МS: 673,2468 m/z + ([M+Na] , C39H38Na1O9+: вычислено 673,2405). Данные ЯМР 13С согласуются со значениями, опубликованными Iinuma и другими [166]. ЯМР спектры к данному соединению представлены в Приложении Е. Продолжение таблицы 23 Название алопекурон С (фракция H2) Структура OH H O OH O OH OH O OH алопекурон D (фракция H5) OH HR-ESI-МS: 687,2635 m/z + ([M+Na] , C40H40Na1O9+: вычислено 687,2602). Данные ЯМР 13С согласуются со значениями, опубликованными Iinuma и другими [166]. ЯМР спектры к данному соединению представлены в Приложении И. OH HR-ESI-МS: 605,1804 m/z + ([M+Na] , C34H30Na1O9+: вычислено 605,1787). Данные ЯМР 13С согласуются со значениями, опубликованными Iinuma и другими [166] ЯМР спектры к данному соединению представлены в Приложении К HO H3CO O OH O HO OH алопекурон F (фракция H1) Используемые методы для определения чистого вещества HR-ESI-МS: 589,1916 m/z + ([M+Na] , C34H30Na1O8+: вычислено 589,1838). Данные ЯМР 13С согласуются со значениями, опубликованными Iinuma и другими [166]. ЯМР спектры к данному соединению представлены в Приложении Ж. O HO HO O OH O HO OH O Из девяти выделенных веществ, два вещества также были найдены в других видах данного рода Sophora. Леахианон А - был найден в корнях Sophora davidii [170], а глаброл - найден в корнях Sophora prostrata [168]. Однако согласно С.А. Абдулиной данные виды не произрастают на территории Казахстана [146]. Полная схема по разделению веществ экстракта, выделенных из корней Vexibia alopecuroides представлена на рисунке 34. 77 H3CO HO OH O HO HO OH OH O O O Рисунок 34 - Схема выделения и разделения БАВ из растения вида Vexibia alopecuroides 78 3.6.2 Разделение биологически активных веществ дихлорметанового экстракта Salvia deserta Для разделения дихлорметанового экстракта корней Salvia deserta 1,23 грамма экстракта растворили в дихлорметане и также загрузили на колонку. В работе использовали 100 г SNAP картридж (40-63 м, 60 Å, 39 х 157 мм) при потоке элюентов 40 мл/мин. При хроматографическом разделении дихлорметанового экстракта из корней Salvia deserta использовали гексан и ацетон, при ступенчатом градиенте (первая ступень в соотношении 80:20 (v/v), 1600 мл, вторая ступень 20:50 (v/v), 800 мл, третья ступень 50:100 (v/v), 400 мл, четвертая ступень100:0 (v/v), 700 мл и завершающая ступень промывка метанолом 350 мл). Сбор фракций контролировали при длине волны 254 нм и 280 нм (рисунок 35). В результате разделения было полученно 67 фракций по 27 мл каждая. Для дальнейшего объедиенния фракций провели тонкослойную хроматографию всех полученных фракций. Данные ТСХ не согласовывались с полученными данными при разделении экстракта на приборе Biotage, так как многие соединения, входящие в состав данного экстракта, не имели спектра поглощения при УФ излучении. В связи с этим фракции были объединены только согласно данным ТСХ, так как в данном случае результаты более информативны: с 1 по 28 – фракция А; с 29 по 36– фракция В; с 37 по 38 – фракция С; с 39 по 40 – фракция D; с 41 по 43 – фракция Е; с 44 по 48 – фракция F; с 49 по 51 – фракция G; с 52 по 55 – фракция H; с 56 по 59 – фракция I; с 60 по 66 – фракция J; с 67 по 73 – фракция L. . Рисунок 35 - Флэш-хроматография на приборе Biotage, дихлорметанового экстракта выделенного из корней Salvia deserta. 79 Полученные на предыдущем этапе фракции, концентрировали досуха и подвергали повторному хроматографированию (рисунок 36). старт A B C D E F G H I J L S - фракции Рисунок 36 – Тонкослойная хроматография фракций полученных после объединения (экстракт S. deserta), обработка спрей Година. Суммарный экстракт Salvia deserta, был разделен хроматографированием на 11 фракций (таблица 24). В работе было использовано 1,23 грамма исследуемого экстракта. Суммарный выход после разделения на приборе Biotage составил 843,5 мг, следовательно потери составили 17,5 %. Таблица 24 - Характеристика и выход фракций суммарного экстракта Salvia deserta Код фракции Фракция A Фракция B Фракция C Фракция D Фракция E Характеристика фракции Белый порошок, легко растворимый в дихлорметане, без запаха Светло-коричневый порошок, легко растворимый в дихлорметане, со специфическим запахом Светло-коричневый порошок, легко растворимый в дихлорметане, со специфическим запахом Коричневый порошок со специфическим запахом умеренно растворим в дихлорметане Коричнево-зеленого цвета без запаха, растворим в дихлорметане 80 Выход, мг (%) 21,3 (2,5) 351 (41,6) 49,9 (5,9) 3,3 (3,9) 46,3 (5,5) Продолжение таблицы 24 Код фракции Характеристика фракции Фракция F Выход, мг (%) 85,9 (10,2) Коричневый порошок без запаха, растворим в дихлорметане Фракция G Коричневый порошок со 40 специфическим запахом, растворим в (4,7) дихлорметане Фракция H Коричневый порошок со 45,9 специфическим запахом, растворим в (5,4) дихлорметане Фракция I Коричневый порошок со 24,4 специфическим запахом, растворим в (2,9) дихлорметане Фракция J Желтый порошок с запахом, легко 47,2 растворим в метаноле (5,6) Фракция L Желтый порошок с запахом, легко 98,6 растворим в метаноле (11,7) Сумма выделенных фракций 843,5 (82,4) Потери на колонке 179,5 (17,5) Фракцию В также разделяли с помощью флэш-хроматографии на приборе Biotage, исследуемое количество составило 322, 9 мг разделение производили с использованием градиента гексан / диэтиловый эфир, начиная с линейного градиента от 0 % гексан до 100 % диэтиловый эфир, 2300 мл и заканчивали промыванием метанолом в объеме 350 мл. Порции фракций в объеме 27 мл были собраны и объединены на основании полученных данных с ТСХ, после объединения получены 10 фракций (A-J). После фракцию D в количестве 61 мг очищали методом полупрепаративной ВЭЖХ. Количество впрыскиваемого образца составило 50 мкл каждый раз. В подобранном методе по разделению использовали 98 % гексан: этилацетат 2 % в течение 20 мин сопровождаемый10 минутным градиентом 92 % гексана: 8 % этилацетат и 70 % гексана: 30 % этилацетата в течение 10 мин. Для каждого нового впрыска образца фракции D в систему ВЭЖХ, колонка промывалась гексаном и повторного проводилась калибровка. Пики обнаружились при длине волны 254 нм и 280 нм на диодном детекторе. Было получено 7 фракций (A-G), из которых было выделено два чистых соединения. На основании физико–химических данных, данных спектрального анализа и их сравнения с описанными в литературе, вещества были идентифицированы как таксодион (10,8 мг) и ферругинол (9,8 мг) (таблица 25) [171]. 81 Таблица 25 - Характеристика выделенных веществ из фракции D растения Salvia deserta Название Структура Используемые методы для определения чистого вещества согласно проценту площади GCFID был определена чистота соединения, которая составила 99,5 %; [α]D26 +35,3 (CHCl3, c=0,26), химическая формула C20H26O3 и молекулярный вес 314,42. Данные ЯМР 13С согласуются со значениями, опубликованными Tezuka и другими [100] ЯМР спектры к данному соединению представлены в Приложении Л согласно проценту площади GCFID был определена чистота соединения, которая составила 98,8 %; [α]D26 +25,2 (CHCl3, c=0,33), химическая формула C20H30O и молекулярный вес 286,45. Данные ЯМР 13С согласуются со значениями, опубликованными Tezuka и другими [100] ЯМР спектры к данному соединению представлены в Приложении М таксодион (фракция А) ферругинол (Фракция В) При вторичном разделении дихлорметанового экстракта Salvia deserta 0,9583 грамм экстракта растворили в дихлорметане и также загрузили на колонку. В этом случае использовали гексан и диэтиловый эфир, при ступенчатом градиенте (первая ступень в соотношении 0:100 (v/v), 2300 мл, вторая ступень 100 (v/v), 1000 мл, и завершающая ступень промывка метанолом 300 мл). Сбор фракций контролировали при длине волны 254 нм и 280 нм. В результате разделения было полученно 66 фракций по 27 мл каждая. Для дальнейшего объедиенния фракций провели тонкослойную хроматографию всех полученных фракций. Данные ТСХ не согласовывались с полученными данными при разделении экстракта на приборе Biotage, так как многие соединения, входящие в состав данного экстракта, не имели спектра поглощения при УФ излучении. В связи с этим фракции были объединены 82 только согласно данным ТСХ, так как в данном случае результаты более информативны: с 1 по 18 – фракция А; с 19 по 22– фракция В; с 23 по 29 – фракция С; с 30 по 41 – фракция D; с 42 по 46 – фракция Е; с 47 по 51 – фракция F; с 52 по 60 – фракция G; с 61 по 65 – фракция H; с 66 по 81 – фракция I (рисунок 37). старт S S2 A B C D E F G H I - фракции Рисунок 37 – Тонкослойная хроматография фракций полученных после объединения (экстракт S. deserta), обработка спрей Година. Суммарный экстракт Salvia deserta, был разделен хроматографированием на 9 фракций (таблица 26). В работе было использовано 0,9583 грамма исследуемого экстракта. Суммарный выход после разделения на приборе Biotage составил 543,2 мг, следовательно потери составили 43 %. Таблица 26 - Характеристика и выход фракций суммарного экстракта Salvia deserta Код фракции Фракция A Фракция B Фракция C Характеристика фракции Желтый аморфный порошок, легко растворимый в дихлорметане, без запаха Светло-коричневый порошок, легко растворимый в дихлорметане, со специфическим запахом Светло-коричневый порошок, легко растворимый в дихлорметане, со специфическим запахом 83 Выход, мг (%) 34,3 (6,3) 36,7 (6,8) 172,1 (31,7) Продолжение таблицы 26 Код фракции Характеристика фракции Фракция D Фракция E Коричневый порошок со специфическим запахом умеренно растворим в дихлорметане Коричневый порошок цвета без запаха, растворим в дихлорметане Выход, мг (%) 65,6 (12,1) 36,0 (6,6) Фракция F Коричневый порошок без запаха, 37,0 растворим в дихлорметане (6,8) Фракция G Коричневый порошок со 79,3 специфическим запахом, растворим в (14,6) дихлорметане Фракция H Коричневый порошок со 19,8 специфическим запахом, растворим в (3,6) дихлорметане Фракция I Коричневый порошок со 62,4 специфическим запахом, растворим в (11,5) метаноле Сумма выделенных фракций 543,2 (56,6) Потери на колонке 415,1 (43,3) Фракцию С подвергли дальнейшему разделению используя полупрепаративный метод ВЭЖХ, в количестве 41,8 мг. Количество впрыскиваемого образца составило 50 мкл каждый раз. В подобранном методе по разделению использовали градиент 50 % гексана: 50 % (97 % гексан: этилацетат 3 %) в течение 30 мин с последующим 30-минутным градиентом 50 % гексан: 50 % (97 % гексан: этилацетат 3 %). Для каждого нового впрыска образца фракции С в систему ВЭЖХ, колонка промывалась гексаном и повторного проводилась калибровка. Пики обнаружились при длине волны 254 нм и 280 нм на диодном детекторе. Фракция С была разделена на два чистых соединения, на основании физико–химических данных, данных спектрального анализа и их сравнения с описанными в литературе, вещества были идентифицированы как 7-Oацетилгорминон (8,8 мг) и горминон (11,2 мг) (таблица 27). 84 Таблица 27 Характеристика выделенных веществ из фракции С растения Salvia deserta Название Структура Используемые методы для определения чистого вещества 1 Н-ЯМР определил процент чистоты, который составил 84,4%; HR-ESI-МS: 375,2220 ([М + Н]+, C22H30O5+; вычислено 375,2171). Данные ЯМР 13С согласуются со значениями, опубликованными Tezuka и другими [100]. ЯМР спектры к данному соединению представлены в Приложении Н. 1 Н-ЯМР определил процент чистоты, который составил 95,2%; HR-ESI-МS: 355,1896 ([М +Na]+, C20H28Na1O4+; вычислено 355,1885). Данные ЯМР 13С согласуются со значениями, опубликованными Tezuka и другими [100]. ЯМР спектры к данному соединению представлены в Приложении П. 7-Oацетилгорминон горминон Все выделенные вещества, также распространены в других видах данного рода Salvia. Дитерпеноид – таксодион, также представлен в Salvia chorassanica [92], S. hypargeia [172], S. broussonetii [173]. Дитерпеноиды: 7-Oацетилгорминон и горминон распространены в S. amplexicaulis [174], S. eriophora [175], S. blepharochlaena [90], S. officinalis [176]. Однако данные виды не произрастают на территории Казахcтана согласно данным С.А. Абдулиной [146]. Полная схема по разделению веществ экстракта, выделенного из корней Salvia deserta представлена на рисунке 38. 85 Рисунок 38 - Схема выделения и разделения БАВ из растения вида S. deserta 86 3.7 Изучение антимикробных свойств фракций и отдельных веществ выделенных из корней Vexibia alopecuroides и Salvia deserta Были проведены эксперименты по определению антимикробной активности суммарных экстрактов Vexibia alopecuroides и Salvia deserta после разделения их на фракции и индивидуальные вещества. Суммарный экстракт Vexibia alopecuroides был разделен на 10 фракций, каждая из которых была проверена на антимикробную активность. Из выделенных фракций суммарного экстракта Vexibia alopecuroides, три фракции D, F, I обладали избирательной антибактериальной активностью (таблица 28) по отношению к Staphylococcus aureus (< 0,8 мкг / мл) и Methicillin-resistant S. aureus (< 0,8 мкг / мл). Согласно данным по антимикробной активности Vexibia alopecuroides наблюдалось антагонистическое действие биологически активных веществ в составе данного экстракта, так как у суммарного экстракта не наблюдалось активности по отношению к роду Candida, а после разделения фракции E и H обладали как антибактериальной активностью по отношению к Staphylococcus aureus (< 0,8 мкг / мл) и Methicillin-resistant S. aureus (< 0,8 мкг / мл), так и антигрибковой активностью по отношению к исследуемым штаммам Candida, однако фракция E обладала антигрибковой активностью только в отношении C. glabrata [177]. Таблица 28 – alopecuroides Исследуемый экстракт Антимикробные S. aureus свойства Methicillin -resistant S. aureus фракций P. C. aeruginos glabrata a экстракта Vexibia C. krusei C. lbicans >200 >200 >200 >20 >20 >20 >20 15,08 >20 >20 3,82 >20 >20 >20 >20 >20 >20 >20 17,73 >20 >20 >20 >20 >20 >20 >20 4,45 IC 50 (мкг/мл) Суммарный экстракт Vexibia alpoecuroides (корни) дихлорметан Фракция A Фракция B Фракция C Фракция D Фракция E Фракция F Фракция G Фракция H 3,05±1,74 2,9±0,20 >20 >20 >20 <0,8 <0,8 1,29 4,68 <0,8 Фракции экстракта >20 >20 >20 >20 >20 >20 <0,8 >20 <0,8 >20 1,7 >20 5,31 >20 <0,8 >20 >200 87 Продолжение таблицы 28 Исследуемый экстракт S. aureus Methicillin -resistant S. aureus P. C. C. aeruginos glabrata krusei a IC 50 (мкг/мл) Фракция I 1,72 <0,8 >20 >20 Фракция J 11,10 6,46 >20 >20 Ципрофлоксацин 0,1±0,02 0,1±0,01 0,1±0,01 (контроль) Амфотерицин B 0,14±0, (контроль) 03 Примечание - >20 – означает, что образец не активен C. albicans >20 >20 - >20 >20 - 0,55±0 ,05 0,28±0, 07 После разделения все индивидуальные вещества сохранили антимикробную активность. Так антибактериальной активностью в отношении Staphylococcus aureus и Methicillin-resistant S. aureus обладали все выделенные вещества. А антигрибковая активность была показана только у четырех индивидуальных веществ: софорафлавон G, алопекурон А, алопекурон В, алопекурон С (таблица 29). Данные по антимикробной активности выделенных индивидуальных веществ представлены впервые. Таблица 29 – Антимикробные свойства отдельных веществ экстракта Vexibia alopecuroides Исследуемый экстракт S. aureus Methicillin -resistant S. aureus P. C. aeruginosa glabrata C. krusei C. albicans >20 >20 >20 >20 >20 >20 >20 >20 8,15 9,04 >20 >20 >20 - 5,21 5,54 14,88 >20 >20 - IC 50 (мкг/мл) леахианон А <0,8 <0,8 >20 >20 глаброл 1,06 1,0 >20 >20 софорафлавон 1,03 0,93 >20 10,45 G софорафлавон 1,29 1,7 >20 >20 I алопекурон А <0,8 <0,8 12,52 13,38 алопекурон В <0,8 <0,8 11,58 7,69 алопекурон С <0,8 0,89 15,2 >20 алопекурон D 0,81 <0,8 >20 >20 алопекурон F 4,68 5,62 >20 >20 Ципрофлоксац 0,1±0,02 0,1±0,01 0,1±0,01 ин (контроль) Амфотерицин 0,14±0,03 B (контроль) Примечание - >20 – означает, что образец не активен 88 0,55±0,0 0,28±0, 5 07 Суммарный экстракт корней Salvia deserta был разделен на 11 фракций, которые были исследованы на антибактериальную и противогрибковую активности. Среди данных фракций суммарного экстракта Salvia deserta (таблица 30), только фракции B, C и D обладали антимикробными свойствами по отношению к Staphylococcus aureus и Methicillin-resistant S. aureus. Из данных таблицы 23 видно, что наибольшей антибактериальной активностью обладала фракция B в отношении Staphylococcus aureus (IC50 2,95 мкг / мл) и Methicillin-resistant S. aureus (IC50 2,6 мкг / мл). Таблица 30 – Антимикробные свойства фракций экстракта Salvia deserta Исследуемый экстракт S. aureus Methicillin -resistant S. aureus P. aeruginosa C. C. glabrata krusei C. albicans IC 50 (мкг/мл) Суммарный экстракт Salvia deserta (надземная часть) дихлорметан 5,7±0,80 7,6±1,06 >200 >200 Фракции суммарного экстракта >20 >20 >20 >20 2,95 2,6 >20 >20 6,66 4,57 >20 >20 18,51 13,24 >20 >20 >20 >20 >20 >20 >20 >20 >20 >20 >20 >20 >20 >20 >20 >20 >20 >20 >20 >20 >20 >20 >20 >20 >20 >20 >20 >20 >20 >20 0,8 <0,8 >20 >20 0,1±0,02 0,1±0,01 0,1±0,01 - Фракция A Фракция B Фракция C Фракция D Фракция E Фракция F Фракция G Фракция H Фракция I Фракция J Фракция L Фракция С’ Ципрофлоксацин (контроль) Амфотерицин B 0,14±0, (контроль) 03 Примечание - >20 – означает, что образец не активен >200 >200 >20 >20 >20 >20 >20 >20 >20 >20 >20 >20 >20 >20 - >20 >20 >20 >20 >20 >20 >20 >20 >20 >20 >20 >20 - 0,55±0 ,05 0,28±0, 07 Таксодион, ферругинол и горминон показали хорошую антимикробную активность против S. aureus и Methicillin-resistant S. aureus - показатель IC50 варьировал между 2,75 и 2,83 мкг/мл и 1,95 и 2,63 мкг/мл соответственно. Таксодион также проявил хорошую антигрибковую активность в отношении C. glabrata показатель IC 50 составил 2,67 мкг/мл [178]. 89 Вещество 7-O-ацетилгорминон показало слабую антимикробную активность в отношении S. aureus и Methicillin-resistant S. aureus показатель IC 50 был 14,48 мкг/мл и 11,11 мкг/мл соответственно (таблица 31). Полученные нами результаты по антимикробной активности веществ, выделенных из S. deserta согласуются с данными полученными Юлубеленом и другими [92, 94], которые опубликовали данные по антимикробной активности горминона, 7-Oацетилгорминона и ферругинола. Автор показал высокую антимикробную активность в отношении S. aureus горминона и 7-O-ацетилгорминон (МИК состав ил 6,5 и 10,0 мкг/мл соответственно), однако им не была найдена антимикробная активность для ферругинола. Таблица 31 – Антимикробные свойства отдельных веществ экстракта Salvia deserta Исследуемый экстракт S. aureus Methicillin -resistant S. aureus P. C. C. aeruginos glabrata krusei a C. albican s IC 50 (мкг/мл) таксодион 2,78 2,63 >20 2,67 5,39 11,69 (фракция А) ферругинол 2,75 1,95 >20 >20 >20 >20 (Фракция В) 7-O14,48 11,11 >20 >20 >20 >20 ацетилгорминон горминон 2,83 1,96 >20 >20 >20 >20 Ципрофлоксацин 0,3±0,02 0,4±0,01 0,3±0,01 (контроль) Амфотерицин B 0,1±0,0 0,3±0,05 0,1±0,0 (контроль) 3 7 Примечание - в таблице представлено среднее значение ± стандартное отклонение (n=3) >20 – означает, что образец не активен Таким образом, полученных данные по антимикробной активности позволяют сделать предположение, что при разработке фитопрепаратов можно создавать композиции используя, как индивидуальные вещества, фракции, так и сам суммарный экстракт. 90 ЗАКЛЮЧЕНИЕ БАВ растений представлены разнообразными классами органических соединений, которые обладают противовоспалительным, сосудорасширяющим, сосудоукрепляющим и другими видами фармакологического действия. Поэтому они являются перспективным сырьем для создания лечебнопрофилактических средств. В ходе выполнения работы получены следующие результаты: Произведен сбор дикорастущих растений флоры Казахстана, принадлежащих к разным семействам: Epilobium hirsutum L. (Onagraceae), Rumex confertus Wiild. (Polygonaceae), Vexibia alopecuroides (L.) Jakovl. (Fabaceae), Polygonum undulatum Murr. (Polygonaceae), Rhodiola quadrifida (Pall.) Fisch. et Mey. (Crassulaceae), Atraphaxis laetevirens (Ledeb.) Jaub. Et Spach (Polygonaceae) и Salvia deserta Schang (Lamiaceae). Из собранных растений получены дихлорметановые и спиртовые экстракты. Проведены исследования по скринингу растительных экстрактов, обладающих высокой антимикробной, антиоксидантной и ранозаживляющей активностью, на основании которых отобраны два перспективных растения (Salvia deserta и Vexibia alopecuroides), которые могут быть использованы для создания на их основе лекарственных препаратов для лечения такого осложнения сахарного диабета, как «диабетическая стопа». Отработаны составы фитопрепаратов на основе экстрактов корней растений Salvia deserta и Vexibia alopecuroides. Проведено изучение ранозаживляющей активности разработанных фитопрепаратов на модели in vivo. Произведено фракционирование суммарных экстрактов Salvia deserta и Vexibia alopecuroides, обладающих биологической активностью. Изучена антимикробная активность индивидуальных веществ, выделенных из экстрактов корней Salvia deserta и Vexibia alopecuroides. Полученные результаты позволили сделать следующие выводы: Дихлорметановые экстракты, выделенные из корней Salvia deserta и Vexibia alopecuroides, обладают высокой антимикробной активностью в отношении Staphylococcus aureus (IC50 3,05 мкг / мл для Vexibia alopecuroides и 5,7 мкг / мл для Salvia deserta) и Methicillin-resistant S. aureus (IC50 2,9 мкг / мл и 7,6 мкг / мл соответственно). Антиоксидантная активность экстракта из корней Salvia deserta составляет 49 % ингибирования DPPH, экстракта из корней Vexibia alopecuroides - 29 % ингибирования DPPH. Экстракты, выделенные из корней Salvia deserta и Vexibia alopecuroides, не обладают цитотоксическим действием в отношении клеток MDCK в дозах от 12,5 до 150,0 мкг/мл. 91 В экспериментах in vitro экстракт, выделенный из корней Vexibia alopecuroides, в концентрации 50,0 мкг/мл и 25,0 мкг/мл проявляет пролиферативную активность в 1,2 раза превышающую пролиферацию в контрольной группе. В эксперименте in vitro экстракт, выделенный из корней Vexibia alopecuroide, в дозе 25,0 мкг/мл обладает ранозаживляющей активностью, которая на 29 % выше чем в контрольной группе. Разработаны оптимальные составы комплексных фитопрепаратов, содержащих 5 % раствор Димексида и 2 % извлечение из корней Salvia desertа (S1) и Vexibia alopecuroides (V1). Комплексные фитопрепараты V1 и S1 не проявляют кожнораздражающего действия, не вызывают признаков острой токсичности у животных (LD50, 2000,0 мг/кг). Комплексные фитопрепараты V1 и S1 в условиях стрептозотоцининдуцированного экспериментального сахарного диабета в 2 раза сокращают сроки заживления раны по сравнению с нелеченными животными. В суммарном экстракте из корней Vexibia alopecuroides идентифицированы 9 индивидуальных веществ, относящихся к группе флавоноидов, (софорафлавон G, леахианон А, алопекурон А, алопекурон В, алопекурон С, алопекурон F, алопекурон D, софорафлавон I и глаброл), в суммарном экстракте корней Salvia deserta идентифицированы вещества, относящиеся к группе дитерпеноидов (таксодион, 7-O-ацетилгорминон, горминон и ферругинол). Индивидуальные вещества из корней Salvia desertа и Vexibia alopecuroides проявляют антимикробную активность в отношении штаммов S. aureus, Methicillin-resistant S. aureus, P. aeruginosa, C. glabrata, C. krusei, C. albicans с показателями IC50 в диапазоне от < 0,8 до13,38 мкг / мл., что в свою очередь позволит рассматривать эти вещества, как потенциальные кандидаты при разработке неогаленовых фитопрепаратов. Рекомендации по использованию результатов Выявлены и предложены новые источники биологически активных веществ с сочетанным антимикробным и ранозаживляющим действием – корни растений Salvia desertа и Vexibia alopecuroides. Созданные комплексные фитопрепараты на основе экстрактов корней данных растений могут быть рекомендованы для дальнейшего углубленного доклинического исследования. Полученные данные могут использоваться в учебном процессе, при обучении студентов по специальности «Биотехнология», «Химическая технологи органических веществ» и др. Оценка полноты решений поставленных задач. Все задачи, поставленные в диссертационной работе, выполнены полностью, в частности: согласно данным скрининга отобраны два растения Salvia deserta и Vexibia alopecuroides, дихлорметановые экстракты корней которых обладают антимикробным, антиоксидантным и ранозаживляющим действием. На их основе созданы комплексные фитопрепараты, не 92 проявляющие кожно-раздражающего действия, не вызывающие признаков острой токсичности и сокращающие в 2 раза сроки заживления гнойной раны в условиях стрептозотоцин-индуцированного экспериментального сахарного диабета. Проведена идентификация индивидуальных веществ экстрактов из корней Salvia desertа и Vexibia alopecuroides, проявляющих антимикробную активность. Оценка научного уровня выполненной работы в сравнении с лучшими достижениями в данной области. Высокий научный и практический уровень диссертации обеспечивается следующим: 1. В экспериментах in vivo показано, что разработанные комплексные фитопрепараты при использовании в форме растворов для наружного применения, обладают высоким ранозаживляющим, противомикробным, антиоксидантным потенциалом и не вызывают аллергических реакций по сравнению с известными российскими фитопрепаратами, применяемыми при лечении ран, ожогов и трофических язв: Сбором лекарственных трав, включающих чертополох курчавый, зверобой продырявленный, траву татарника колючего, обладающий противовоспалительным, ранозаживляющим и противомикробным действиями [179], недостатком которого является его невысокая эффективность, возможность развития аллергических реакций. Лекарственным средством жидкий спиртовый экстракт хвоща полевого (Extractum Equiseti arvensis fluidum), обладающий противовоспалительным, антиоксидантным, ранозаживляющим, диуретическим, дезинтоксикационным действиями [180]. Недостатками данного препарата является наличие большого количества противопоказаний, так как, препарат не применяется при гипертиреозе, туберкулезе легких, язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки, нефрозе, нефрите, беременности, повышенной чувствительности к йоду. Кроме того, принимать препараты из хвоща полевого необходимо под наблюдением врача, строго соблюдая назначенный режим лечения. Лекарственным средством растительного происхождения "Биосед", представляющим собой водный экстракт свежей травы очитка большого. Препарат усиливает процессы обмена и регенерации, оказывает противовоспалительное и ранозаживляющее действия [181]. Однако "Биосед" обладает побочным эффектом, так как при его применении могут отмечаться гиперемия и уртикальная сыпь, а также он имеет противопоказания (ахилия и злокачественные новообразования), не обладает противомикробным действием, что ограничивает сферу его применения. 2. Наряду с описанными в литературе свойствами исследуемых растений Salvia desertа и Vexibia alopecuroides выявлены новые, ранее не описанные биологические активности: ранозаживляющая активность. антимикробная активность по отношению к микроорганизмам Staphylococcus aureus и Methicillin-resistant S. aureus. 93 Высокий научный уровень полученных результатов подтверждается научными публикациями в авторитетных реферируемых научных журналах, а также трудах международных конференций и симпозиумов. Настоящая диссертационная работа соответствует научно-техническим требованиям, предъявляемым к исследованиям в области современной биотехнологии. 94 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ 1 Гуськов В., Марзилович О. Состояние и прогноз развития фармацевтического рынка Казахстана. – Алматы: БТА Аналитика, - 2008. – с.43. 2 Государственный реестр лекарственных средств [Электронный ресурс]: http://www.dari.kz/category/gos_reestr_excel (дата обращения:15.09.2015 г.) 3 Программа по развитию фармацевтической промышленности Республики Казахстан на 2010 - 2014 годы Постановление Правительства Республики Казахстан от 4 августа 2010 года № 791 "Казахстанская правда" от 21.08.2010 г., № 222 (26283): САПП Республики Казахстан, 2010 , № 46, 422 с. 4 Адекенов С.М. Арглабин – противоопухолевое средство из полыни гладкой // Российский биотерапевтический журнал. - 2002. - Т. 1, No 2. -С. 5–7. 5 Чиркин А.А., Селевич М.И., Лелевич В.В., Виницкая А.Г., Шейбак В.М., Данченко Е.О., Козловский А.В., Цыдик В.Ф. Влияние салсоколлина на метаболические показатели печени крыс после введения этанола и его отмены // Патологическая физиология и экспериментальная терапия.- 2001, N 3.-С.26-28. 6 Байманова A. M. Использование растителього препарата Рувимин при хронических бронхитах и гепатитах у рабочих нефтехимической промышленности // Бюллетень Восточно-Сибирского научного центра СО РАМН. – 2005, № 8 (46). - С. 103-108. 7 Поляков В.В., Адекенов С.М. Биологически активные соединения растений Populus L. и препараты на их основе. – Алматы: Гылым, 1999. – 160 с. 8 Жусупова Г.Е. Лекарственные средства, полученные на основе растений вида Limonium gmelinii // Вестник медицинского университета. Алматы. - 2009. - №1. - С. 105-112. 9 Korulkina L.M., Shul’ts E.E., Zhusupova G.E., Abilov Zh.A., Erzhanov K.B., Chaudri M.I.. Biologically active compounds from Limonium gmelinii and L. popovii // Chemystry of natural compounds. - 2004. - Vol. 40, №5. - P. 465-471. 10 Тарлыков П.В., Бердин А.Г., Кусаинова Д.Д., Хабаров И.А., Тулеуов Б.И. Растения Казахстана-перспективные источники новых адаптогенных препаратов // Матер. Х междунар. съезда «Фитофарм 2006». - СПб: НИИХ СПбГУ, 2006. - С.321. 11 Лосева И.В. Сырьевая база лекарственных растений Казахстана и ее рациональное использование. Учебно-методическое пособие. – Караганда. – 2008. – 110 с. 12 Введение в фитохмические исследования и выявление биологической активности веществ растений. / под. ред. Мамонова Л.К., Музычкиной Р.А. – Алматы: Школа XXI века, 2008. - 216 с. 13 Дикорастущие полезные растения Казахстана (каталог) / cоставители: Грудзинская Л.М., Есимбекова М.А., Гемеджиева Н.Г., Мукин Б. – Алматы, 2008. – 100 с. 95 14 Ажунова Т.А., Лемза С.В., Линхоева Е.Г. Фармакотерапевтическая эффективность комплексного растительного средства при экспериментальном диабете // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. – 2011, №1. – С. 104 – 108. 15 Abo-Elmatty D.M., Essawy S.S., Badr J.M., Sterner O. Antioxidant and anti-inflammatory effects of Urtica pilulifera extracts in type2 diabetic rats // Journal Ethnopharmacology. -2012, № 142(1). -Р. 65-71. 16 Pandikumar P., Babu N.P., Ignacimuthu S. Hypoglycemic and antihyperglycemic effect of Begonia malabarica Lam.in normal and streptozotocin induced diabetic rats // Journal Ethnopharmacology. -2009. - Vol.124. - Р. 111–115. 17 Grover J.K., Vats V., Rathi S.S. Medicinal plants of India with antidiabetic potential // Journal Ethnopharmacology. – 2000. –Vol.73. - Р. 461–470. 18 Genta S.B., Cabrera W.M., Mercado M.I., Grau A., Catalan C.A., Sanchez S.S. Hypoglycemic activity of leaf organic extracts from Smallanthus sonchifolius: Constituents of the most active fractions // Chemico- Biological Interactions. – 2010. - Vol.185. -Р. 143–152. 19 Baskaran K., Ahamath K.B., Shanmugasundaram R.K., Shanmugasundaram E.R. Antidiabetic effect of a leaf extract from Gymnema sylvestre in non-insulin-dependent diabetesmellitus patients // Journal Ethnopharmacology. – 1990. - Vol.30. - Р.2 95–300. 20 Blevins S.M., Leyva M.J., Brown J., Wright J., Scofield R.H., Aston C.E. Effect of cinnamon on glucose and lipid levels in non insulin-dependent type 2 diabetes // Diabetes Care.- 2007. – Vol.30. - Р. 2236–2237. 21 Dugoua J.J., Seely D., Perri D., Cooley K., Forelli T., Mills E., Koren G. From type 2 diabetes to antioxidant activity: A systematic review of the safety and efficacy of common and cassia cinnamon bark // Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. - 2007. - Vol.85. - Р. 837–847. 22 Grover J.K., Yadav S.P. Pharmacological actions and potential uses of Momordica charantia: A review // Journal Ethnopharmacology. - 2004. – Vol.93. -Р. 123–132. 23 Aniszewski T. Alkaloids Secrets of life. — Amsterdam, 2007. —110 p. 24 Brossi A. The Alkaloids: Chemistry and Pharmacology.— AcademicPress, 1989.-Vol.35.- 261 p. 25 Положительное решение на выдачу предпатента РК. “2,4Динитрофенилгидразон вазицинона, обладающий антибактериальной активностью” / Агедилова М.Т., Турмухамбе-тов А.Ж., Казанцев А.В., Ахметова С.Б., Аксартов Р.М., Адекенов С.М. от 21.05.06, №17262/02. 26 Положительное решение на заявку “Пеганин, обла-дающий антибактериальной активностью” / Агедилова М.Т., Турмухамбетов А.Ж., Кайрала-пова К.К., Казанцев А.В., Ахметова С.Б., Аксартов Р.М., Адекенов С.М. от 08.11.05. № 2005 / 1251.01. 27 Агедилова М.Т., Турмухамбетов А.Ж., Казанцев А.В., Шульц Э.Э., Шакиров М.М., Адекенов С.М. Компонентный состав Peganum harmala L. // Химия природных соединений.-2006, .№2.-С.186-187. 96 28 Нурмаганбетов Ж.С., Турмухамбетов А.Ж., Казанцев А.В., Адекенов С.М. Галоге-нирование стахидрина: Азотсодержащие гетероциклы / под ред. Карцева В.Г., М: МБФНП, 2006.-Т.2.- С.194. 29 Бурдельная Е.В., Турмухамбетов А.Ж., Казанцев А.В., Адекенов С.М. О синтезе 8,9-О,О -липпаконитилфосфорной кислоты // В сб: Новые достижения в создании лекарствен-ных средств растительного происхождения. -Томск, 2006.-С. 337-338. 30 Корулькин Д.Ю., Абилов Ж.А., Музычкина Р.А., Толстиков Г.А. Природные флавоноиды. – Новосибирск: Академическое издательство «Гео», 2007.– 232 с. 31 Куркина А.В. Флавоноиды фармакопейных растений. – Самара:ООО «Офорт», 2012.– 290 с. 32 Harborne J.B., Mabry T.J. The Flavonoids: Advances in Research. – London; New York: Chapman and Hall., 1982.– 744 p 33 Музычкина Р.А., Корулькин Д.Ю. Биологически активные вещества растений. Выделение, разделение, анализ. - Алматы: Атамұра, 2006. - 438 с. 34 Andersen M., Markham K.R. Flavonoids: Chemistry, Biochemistry, and Applications, 2005.-P.397-441 35 Карповa E.A., Храмова Е.П., Фершалова Т.Д.. Флавоноиды и аскорбиновая кислота у некоторых представителей рода Begonia L. // Химия растительного сырья. -2009, № 2.- С. 105–110. 36 Rice-Evans C.A., Miller N.J., Paganga G. Antioxidant properties of phenolic compounds // Trends in plant science. -1997.- Vol. 2.-P. 152–159. 37 Кравченко Л.В., Морозов С.В., Авреньева Л.И. Оценка антиоксидантной и антитоксической эффективности природного флавоноида дигидрокверцетина // Токсикологический вестник. – 2005, № 1. – С. 14-20. 38 Panico A.M., Cardile V., Avondo S. The in vitro effect of a lyophilized extract of wine obtained from Jacquez grapes on human chondrocytes // Phytomedicine . – 2006. – Vol.13 (7). –P. 522–526. 39 Лимфляндский В.Г. Витамины и минералы. – М.-: ОлмаМедиаГрупп, 2010. – 640 с. 40 Matkowski A., Piotrowska M. Antioxidant and free radical scavenging activities of some medicinal plants from the Lamiaceae // Fitoterapia.- 2006, №77.-Р. 346–353. 41 Bettaieb I., Hamrouni-Sellami I., Bourgou S. Et al.Drought effects on polyphenol composition and antioxidant activities in aerial parts of Salvia officinalis L. // ActaPhysiol Plant.- 2011, №33. -Р.1103–1111. 42 Pietta P.G. Flavonoids in medicinal plants. In: Flavonoids in Health and Disease. N.Y.: Dekker, 1998. -P. 61–110. 43 Rice-Evans C.A., Miller N.J., Bolwell P.G. et al.The relative antioxidant activities of plantderived polyphenolic flavonoids // Free Radical Research.- 1995.Vol. 22, № 4.- P. 375–383. 44 Sestili P., Diamantini G., Bedini A. et al.Plant derived phenolic compounds prevent the DNA single-strand breakage and cytotoxicity induced by tert97 butyl-hydroperoxide via an iron-chelating mechanism // Biochemistry Journal.-2002.Vol.-364.-P.121–128. 45 Smith A.H., Imlay J.A., Mackie R.I. Increasing the oxidative stress response allows Escherichia coli to overcome inhibitory effects of condensed tannins // Applied and Environmental Microbiology.-2003.-Vol.69.-P. 3406–3411. 46 Smirnova G.V., Samoylova Z.Y., Muzyka N.G., Oktyabrsky O.N. Influence of polyphenols on Escherichia coli resistance to oxidative stress // Free Radical Biology and Medicine.-2009.- Vol. 46, № 6.-P. 759–768. 47 Мамонов Л.К., Сарсенбаев Б.А., Карпенюк Т.А., Ахметова Д.Ш., Кустова Т.С., Мурсалиева В.К., Есенбаева Г.Л. Некоторые фитохимические и фитофармакологические свойства Chamaenerion angustifolium (L.) Scop. и их практическое использование // Матер. междунар. науч. конф. и школы молодых ученых «Физиология растений – теоретическая основа инновационных агро- и фитобиотехологий» .- Калининград: 2014. - С. 285-287. 48 Vasas A, Orbán-Gyapai O, Hohmann J. The Genus Rumex: Review of traditional uses, phytochemistry and pharmacology // Journal of Ethnopharmacology – 2015. - Vol. 175. - P. 198–228. 49 Kiss А.К., Bazylko А., Filipek А., Granica S., Jaszewska E., Kiarszys U., Kosmider A., Piwowarski J. Oenothein B's contribution to the anti-inflammatory and antioxidant activity of Epilobium sp. // Phytomedicine. -2011, № 18(7). - P. 557560. 50 Kunduhoglu B., Pilatin S., Caliskan F. Antimicrobial screening of some medicinal plants collected from eskisehir, Turkey // Fresenius Environmental Bulletin. – 2011, № 20(4). - P. 945-952. 51 Wojdylo A., Oszmianski J., Czemerys R. Antioxidant activity and phenolic compounds in 32 selected herbs // Food Chemistry. – 2007, № 105(3). - P. 940-949. 52 Ye F., Zhang P., Tian J.,Yang Y., Zhang X., Feng Z., Chen L. Traditional chinese medicine composition for preventing and treating insulin resistance and related metabolism syndrome // Faming Zhuanli Shenqing. - 2012. – P.12-39. 53 Skopnska-Rozewska E., Wojcik R., Siwicki A. K., Sommer E., Wasiutynski A., Furmanowa M., Malinowski M., Mazurkiewicz M. The effect of Rhodiola quadrifida extracts on cellular immunity in mice and rats // Polish journal of veterinary sciences. – 2008, № 11(2). – P. 105-11. 54 Wegiera M., Kosikowska U., Malm A., Smolarz H.D. Antimicrobial activity of the extracts from fruits of Rumex L. species // Central European Journal of Biology. – 2011, № 6(6). – P. 1036-1043. 55 Wegiera M., Grabarczyk P., Baraniak B., Danuta H.S. Antiradical properties of extracts from roots, leaves and fruits of six Rumex L. species // Acta Biologiga cracoviensia Series Botanica. - 2011. – Vol. 53, № 1. - P. 125–131. 56 PDR (Physicians Desk Reference) for Herbal Medicines, 4th Edition, 2007. - 1244 p. 57 Lesuisse D, Berjonneau J, Ciot C, Devaux P, Doucet B, Gourvest JF, Khemis B, Lang C, Legrand R, Lowinski M, Maquin P, Parent A, Schoot B, Teutsch 98 G. Determination of Oenothein B as the Active 5-α-Reductase-Inhibiting Principle of the Folk Medicine Epilobium parviflorum // Journal Natural Products. – 1996. – Vol. 59. - P. 490-492. 58 Ducrey B, Marston A, Gohring S, Hartmann RW, Hostettmann K. Inhibition of 5α-Reductase and Aromatase by the Ellagitannins Oenothein A and Oenothein B from Epilobium Species // Planta Medica. – 1997. – Vol. 63. - P. 111114. 59 Vitalone A, Bordi F, Baldazzi C, Mazzanti G, Saso L, Tita B. Antiproliferative effect on a prostatic epithelial cell line (PZ-HPV-7) by Epilobium angutifolium L Il // Farmaco. – 2001. – Vol. 56. - P. 483-489. 60 Vitalone A, Guizzetti M, Costa LG, Tita B. Extracts of various species of Epilobium inhibit proliferation of human prostate cells // J Pharm Pharmacol. – 2003. – Vol. 55. - P. 683-690. 61 Kiss A, Kowalski J, Melzig MF. Effect of Epilobium angustifolium L extracts and polyphenols on cell proliferation and neutral endopeptidase activity in selected cell lines // Pharmazie. – 2006. – Vol. 61. - P. 66-69. 62 Hiermann A, Juan H, Sametz W. Influence of Epilobium extracts on prostaglandin biosynthesis and carrageenin induced oedema of the rat paw // J Ethnopharmacol. – 1986. – Vol. 17. - P. 161-169. 63 Schepetkin IA, Kirpotina LN, jakiw L, Khlebnikov AI, Blaskovich CL, Jutila MA, Quinn MT. Immunomodulatory Activity of Oenothein B Isolated from Epilobium angustifolium // J immunology. - 2009. – Vol. 183. - P. 6754-66. 64 Kiss A, Bazylko A, Filipek A, Granica S, Jaszewska E, Kiarszys U, Kośmider A, Piwowarski J. Oenothein B’s contribution to the anti-inflammatory and antioxidant activity of Epilobium sp // Phytomedicine. – 2010. – Vol. 18. - P. 557560. 65 Ivancheva S, Manolova N, Serkedjieva J, Dimov V, Ivanovska N. Polyphenols from Bulgarian medicinal plants with anti-infectious activity // Basic Life Sci. – 1992. – Vol. 59. - P. 717-728. 66 Battinelli L, Tita B, Evandri MG, Mazzantu G. Antimicriobial activity of Epilobium spp Extracts // Farmacology. – 2001. – Vol. 56. - P. 345-348. 67 Steenkamp V, Gouws MC, Gulumian M, Elgorashi EE, van Staden J. Studies on antibacterial, anti-inflammatory and antioxidant activity of herbal remedies used in the treatment of benign prostatic hyperplasia and prostatitis // J Ethnopharmacology. – 2006. – Vol. 103. - P. 71-75. 68 Kustova T.S., Karpenyuk T.A., Mamonov L.K., Goncharova A.V. Antimicrobial activity of crude extracts from wild plants growing in Kazakhstan // Матер. «Международной научной конференциии по биологии и биотехнологии растений», Алматы: – 2014. - C. 169. 69 Hevesi B.T., Houghton P.J., Habtemariam S., Kery A. Antioxidant and anti-inflammatory effect of Epilobium parviflorum. Schreb // Phytother Res. – 2009. – Vol. 23. - P. 719-724. 70 Махов А.А. Зеленая аптека: Лекарственные растения Красноярского края. Красноярск, 1986. - 352 с. 99 71 Сыркин А.Б., Коняева О.И. Фармацевтические исследования некоторых новых противоопухолевых средств // Химико-фармацевтический журнал. -1984, №10. - С. 1172–1180. 72 Киселева Т. Л., Ермакова В. А. К вопросу стандартизации сырья соцветия кипрея узколистного // Фармацея. -1984, №5. - С. 12–13. 73 Рабинович А. М. Фитотерапия против рака // Экология и жизнь. – 2001, №5. - С. 78–81. 74 Пищевые добавки Арт лайф (БАД). [Офиц. сайт]. URL: http://artlifemsk.ru/ (дата обращения: 22.03.2014). 75 Liu M., Liu X.Y., Cheng J.F. Advance in the pharmacological research on matrine // Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. - 2003. – Vol. 28. – P. 801-804. 76 Zhang Y.F., Wang S.Z., Li Y.Y., Xiao Z.Y., Hu Z.L., Zhang J.P. Sophocarpine and matrine inhibit the production of TNF and IL-6 in murine macrophages and prevent cachexia-related symptoms induced by colon 26 adenocarcinoma in mice // International Immunopharmacology - 2008. - Vol. 8. – P. 1767-1772. 77 Lin W., Zhang J.P., Hu Z.L., Qian D.H. Inhibitory effect of matrine on lipopolysacchride induced tumor necrosis factor and interleukin-6 production from rat Kupffer cells // Yao Xue Xue Bao. - 1997. – Vol. 32. - P. 93-96. 78 Xing N.L., Sha N., Yan H.X., Pang X.Y., Guan S.H., Yang M., Hua H.M., Wu L.J., Guo D.A. Isoprenylated flavonoids from the roots of Sophora tonkinensis // Phytochem Letters - 2008. – Vol. 1. - P. 163-167. 79 Bach M.K., Brashler J.R. Inhibition of IgE and compound 48/80-induced histamine release by lectins // Immunology. - 1975. – Vol. 29. - P. 371-386. 80 Izaddoost M. Alkaloid chemotaxonomy of the genus Sophora // Phytochemistry. - 1975. - Vol. 14. – P. 203-204. 81 Ding PL, Liao ZX, Huang H, Zhou P, Chena DF (+)-12aHydroxysophocarpine, a new quinolizidine alkaloid and related anti-HBV alkaloids from Sophora flavescens // Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters. - 2006. – Vol. 16. – P. 1231-1235. 82 Piao XL, Piao XS, Kim SW, Park JH Cai SQ Identification and characterization of antioxidants from Sophora flavescens // Biological and Pharmaceutical Bulletin. - 2006. – Vol. 29. –P. 1911-1915. 83 Xingming Ma, Luo Y, Yu H, Cui Y Ethanolic extracts of Sophora moorcroftiana seeds induce apoptosis of human stomach cancer cell line SGC-7901 in vitro. // African Journal of Biotechnology. - 2009. – Vol. 5. – P. 1669-1674. 84 Yamaki M, Kashihara M, Takagi S Activity of Kushen compounds against Staphylococcus aureus and Streptococcus mutans // Phytotherapy Research. 1990. –Vol. 4. –P. 235-236. 85 Sohn HY, Son KH, Kwon CS, Kwon GS, Kang SS Antimicrobial and cytotoxic activity of 18 prenylated flavonoids isolated from medicinal plants: Morus alba L., Morus mongolica Schneider, Broussnetia papyrifera (L.) Vent Sophora flavescens Ait and Echinosophora koreensis Nakai // Phytomedicine -2004. – Vol. 11. –P. 666-672. 100 86 Kinghorn AD, Balandrin MF, Pelletier SW (Eds.) Alkaloids // Chemical and Biological Perspectives. -1984. - Vol. 2. P. 105. 87 Wen M, Mao XJ 2006. Research progress on chemical composition, antiinflammatory and antiallergic activity of Sophora viciifolia // Yunnan Journal of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica. – 2006.-Vol. 27. – P. 63-64. 88 Saito K, Arai N, Sekine T, Ohmiya S, Kubo H, Otomasu H, Murakoshi I Phytoconstituents of S. tonkinensis. // Planta Medica. -1990.- Vol. 56. – P. 487-490. 89 Mabberley D.J. The plant book, 3rd edition. Cambridge: Cambridge University Press; 2008. 1040 p. 90 Ulubelen A., Okusuz S., Topcu G., Goren A., Voelter W. Antibacterial diterpenes from the roots of Salvia blepharochlaena // Journal of Natural Products. – 2001. -Vol. 64.- P. 549-551. 91 Ulubelen A. Cardioactive and antibacterial terpenoids from Salvia species // Phytochemistry. – 2003. - Vol.64. - P. 395-399. 92 Najaran Z., Mousavi S., Taifard F., Asili J., Soltani S., Hatamipour M., Emami S. Cytotoxic and apoptogenic properties of three isolated diterpenoids from Salvia chorassanica through bioassay-guided fractionation // Food and Chemical Toxicology. – 2013. -Vol. 57. -P. 346-351 93 Zhang Y., Jiang P., Ye M., Kim S.H., Jiang C., Lü J. Tanshinones: sources, pharmacokinetics and anti-cancer activities // International Journal of Molecular Sciences. – 2012. – Vol. 13. – P. 13621– 13666. 94 Fraga B.M., Díaz C.E., Guadaño A., González-Coloma A. Diterpenes from Salvia broussonetii transformed roots and their insecticidal activity // Journal of Agricultural and Food Chemistry. – 2005. – Vol. 13. – P. 5200–5206. 95 Li M., Li Q., Zhang C., Zhang N., Cui Z., Huang L., Xiao P. An ethnopharmacological investigation of medicinal Salvia plants (Lamiaceae) in China // Acta Pharmaceutica Sinica B. – 2013. – Vol. 4. – P. 273–280. 96 Wang B.Q. Salvia miltiorrhiza: chemical and pharmacological review of a medicinal plant // Journal of Medicinal Plants Research. – 2010. - Vol. 4. – P. 2813– 2820. 97 Topçu G. Bioactive triterpenoids from Salvia species // Journal of Natural Products. – 2006. – Vol. 69. –P. 482–487. 98 Lu Y., Foo L.Y. Polyphenolics of Salvia: a review // Phytochemistry. 2002. – Vol. 59. – P. 117–140. 99 Wu Y., Ni Z., Shi Q., Dong M., Kiyota H., Gu Y., Cong B. Constituents from Salvia species and their biological activities // Chemical Reviews. – 2012. –Vol. 112. – P. 5967–6026. 100 TezukаY., Kasimu R., Li J.X., Basnet P., Tanaka K., Namba T., Kadota S. Constituents of roots of Salvia deserta Schang. (Xinjiang-Danshen) // Chemical and Pharmaceutical Bulletin. – 1998. -Vol.46. - P. 107-12. 101 Уоткинс П.Дж. Сахарный диабет / 2-е изд. – Пер. с англ. М.: Издательство БИНОМ, 2006. – 134 с. 102 Luley C., Blaik A., Reschke K., Klose S. and Westphal S. Weight loss in obese patients with type 2 diabetes: Effects of telemonitoring plus a diet combination 101 - The Active Body Control (ABC) Program // Diabetes Research and Clinical Practice. – 2011. - Vol. 91. – P. 286-292. 103 Carolan M., Steele C. and Margetts H. Knowledge of gestational diabetes among a multi-ethnic cohort in Australia // Midwifery. – 2010. – Vol. 26. – P. 579588. 104 Hak C., Yim C.H., Han K. O., Yoon H.K., Han I.K., Kim M.Y., Yang J.H., Cho N.H.. Gestational diabetes mellitus in Korea: prevalence and prediction of glucose intolerance at early postpartum // Diabetes Research and Clinical Practice. – 2003. – Vol. 61. – P. 117-124. 105 United Nations. General Assembly, Resolution 61/225. World Diabetes Day. – 2007. - 225 p. 106 Туткушбаева З.М., Нурбекова С.Т., Ха Д.В., Крячкова А.П. Эпидемиология и актуальные вопросы сахарного диабета / Матер. междунар. конф. молодых ученых «Мир науки и молодожь: достижения и перспективы»: Караганда - 2015. -С. 196-197. 107 Балаболкин М.И., Клебанова Е.М., Креминская В.М. Лечение сахарного диабета и его осложнений (руководство для врачей). – М.: Медицина, 2005. – 511 с. 108 Bloomgarden Z. Т. Developments in diabetes and insulin resistance // Diabetes Care. – 2006. – Vol. 29. – P. 161–167. 109 Chan C.H., Ngoh G.C., Yusoff R. A brief review on anti diabetic plants: Global distribution, active ingredients, extraction techniques and acting mechanisms // Pharmacological Reviews. – 2012, № 6(11). - Р. 22–28. 110 Cefalu W.T, Ribnicky D.M. Modulation of insulin action by botanical therapeutics // Obesity and Weight Management. – 2009, №5. -Р. 277–81. 111 Dey L., Attele A.S., Yuan C.S. Alternative therapies for type 2 diabetes // Alternative Medicine Review. – 2002, №7. - Р.45–58. 112 Jung M., Park M., Lee H.C., Kang Y.H., Kang E.S., Kim S.K. Antidiabetic agents from medicinal plants // Current Medicinal Chemistry. – 2006. – Vol.13. -Р. 1203–1218. 113 Mendes J.J., Neves J. Diabetic Foot Infections: Current Diagnosis and Treatment // The Journal of Diabetic Foot Complications. – 2012. – Vol. 4, N1, - P. 26-45. 114 Синельщиков Е.А. Экспериментально-морфологическое обоснование применения препарата окситоцина в лечении гнойных ран при сахарном диабете: дис. … канд. мед. наук: 03.03.04. – Оренбург: ОГМА, 2011. – 147 с. 115 Блатун Л.А. Возможности современных мазей в лечении гнойных ран, пролежней, трофических язв // Фармацевтической вестник. – 2002. - № 3. – С. 18-19. 116 Funderburgh J.L. Keratan Sulfate Biosynthesis // IUBMB Life. -. 2002. Vol. 54(4). – P. 187–194. 117 Алиханова Р.И., Ушбаева К.У., Дутова В.А. Препараты облепихи в клинике // Здравоохранение Казахстана. 1973. - I 7. - С.73. 102 118 Satyajit D. Sarker, Zahid Latif, Alexander I. Gray Natural Products Isolation. - Human Press, - 2005, - 515 p. 119 Дзюба В.Ф., Николаевский В.А., Щербаков В.М., Коренская И.М. Лекарственные растения в фитотерапии / Практическое пособие. - Воронеж: ВГУ, 2004. - 83 с. 120 Приказ Министерства Здравоохранения от 22 апреля 1985 г. Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагноститечких лабораториях лечебнопрофилактических учреждений 121 National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) (Wayne, Pa.): Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeasts; Approved Standard – Second Edition. Document M27-A2, 2002. - 22 p. 122 NCCLS: Methods for dilution antimicrobial susceptibility test for bacteria that grow aerobically, approved Standard – Seventh edition; Document M7-A7, 2006. – 26 p. 123 Brand-Williams W., Cuvelier M.E., Berset C. Use of a free radical method to evaluate antioxidant activity. // In Lebensmittel-Wissenschaft und Technologie. – 1995. - Vol. 28, № 1. - P. 25-30. 124 Re R., Pellegrini N., Proteggente A. et al. Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation depolarization assay // Free Radical Biology and Medicine. – 1999. – Vol. 26, № 9/10. – P. 1231–1237. 125 Repetto G., del Peso A., Zurita J. Neutral red uptake assay for the estimation of cell viability/cytotoxicity // Nature Protocols. – 2008. - Vol. 3. - P. 1125 – 1131. 126 Liang Сh., Park A, Guan J. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro // Nature Protocols. – 2007. - Vol. 2. - P. 329 – 333. 127 Rothwell J.A., Day A.J., Morgan M.R. Experimental determination of octanol-water partition coefficients of quercetin and related flavonoids. // Journal of Agriultural and Food Chemistry, - 2005. - Vol. 53 (11). – P. 4355–4360. 128 Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. / под ред. Миронова А.Н. – М.: Гриф и К, 2012. – Ч. 1. – 944 с. 129 Приказ Министра здравоохранения Республики Казахстан от 12 ноября 2009 года № 697. Об утверждении Правил проведения медикобиологических экспериментов, доклинических (неклинических) и клинических исследований. 130 Каркищенко Н. Н. Основы биомоделирования / Н. Н. Каркищенко. – М.: Межакадемическое изд-во ВПК, 2004. – 607 с. 131 Руководство по лабораторным животным и альтернативным моделям в биомедицинских исследованиях: учеб. пособие для системы медицинского и фармацевтического послевузовского образования / под ред. Каркищенко Н.Н., Грачева С.В. – М.: Профиль, 2010. – 358 с. 132 Европейская Конвенция о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях Страсбург, 103 18 марта 1986 г. [Электронный ресурс] — Режим доступа. — URL: http://ecologysite.ru/norms/item/569 (дата обращения:14.04.2014 г.) 133 Acute Oral Toxicity – Acute Toxic Class Method. OECD guidelines for the testing of chemicals. – OECD. – 2001. – 14p. 134 Acute Dermal Irritation Corrosion: OECD guidelines for the testing of chemicals. – OECD № 404. - 2002. – 13p. 135 Test for irritation and skin sensitization ISO 10993-10. - 2010. - 74 p. 136 Masiello P., Broca Ch., Gross R., Roye M., Manteghetti M., Hillaire-Buys D., Novelli M., Ribes G. Experimental NIDDM: Development of a New Model in Adult Rats Administered Streptozotocin and Nicotinamide // Diabetes . – 1998. -Vol. 47. - P. 224-229. 137 Mendes J.J., Leandro C.I., Bonaparte D.P., Pinto A.L. A rat model of diabetic wound infection for the evaluation of topical antimicrobial therapies // Comparative Medicine. - 2012. – Vol. 62(1). -P. 37-48. 138 Wayt R., Maclarson T., Newman W. Histology. Modern principles and methods. // Elsevier. - 1996. – 323 p. 139 Меркулов Г. А. Курс патогистологической техники. - Л.: Медицина, 1969. – 424 с. 140 Wagner H., Bladt S., Rickl V. Plant drug analysis: a thin layer chromatography atlas / Springer: Second edition, 2001. – 385 p. 141 Углов Б.А., Кательников Г.П. Основы статистического анализа и математического моделирования в медико-биологических исследованиях – Самара: Наука, 1994. – 170 с. 142 Павлов, Н.В. Флора Казахстана: в 9 т. / Алма-Ата. : Академия наук Казахской ССР, 1956 - 1966. – 9 т. 143 Иллюстрированный определитель растений Казахстана / под ред. Голоскокова В.Р. - Алма-Ата: Наука, 1969. -Т.1. – 243 с. 144 Дикорастущие полезные растения России. – СПб. – 2001. - 663 с. 145 Головкин Б., Руденская Р., Трофимова И., Шретер А. Биологические активные вещества растительного происхождения: в 3 т. – М.: Наука, - 20012002. – 3 т. 146 Абдулина С.А. Список сосудистых растений Казахстана. - Алматы, 1999. – 187 с. 147 Фотографии [Электронный ресурс] — Режим доступа. — URL: http://www.plantarium.ru (дата обращения:14.08.2013 г.) 148 Растительные ресурсы СССР / под. ред. Соколова П. Наука: Ленинградское отделение, 1991. Т. 6 С. 200. 149 Stalikas C. D. Extraction, separation, and detection methods for phenolic acids and flavonoids // Department of Chemistry, University of Ioannina.- 2007.Vol.30.- P. 3268 – 3295. 150 Bowler P.G., Duerden B.I., Armstrong D.G., Wound microbiology and associated approaches to wound management // Clinical Microbiology Reviews. – 2001. -Vol. 14. -P. 244-269 104 151 Кустова Т.С., Карпенюк Т.А., Гончарова А.В., Соломко В.П., Искакбаева Ж.А. Идентификация микроорганизмов раневой поверхности больных с гнойно-некротическими формами диабетической стопы для разработки корригирующих фитопрепаратов // Вестник КазНУ, Серия биологическая -2014, №1/1(60). - С.126-130. 152 Nakano H., Schrader K.K., Mamonov L.K., Kustova T. S., Mursaliyeva V.K., and Cantrell Ch. L. Isolation and Identification of Flavobacterium columnare and Streptococcus iniae Antibacterial Compounds from the Terrestrial Plant Atraphaxis laetevirens // Journal of Agriultural and Food Chemistry - 2012. - Vol. 60. - P. 10415−10419. 153 Кустова Т.С., Карпенюк Т.А., Гончарова А.В., Мамонов Л.К. Противомикробные свойства суммарных экстрактов Epilobium hirsutum // Вестник КазНУ, Серия биологическая -2014, №1/1(60).- С.122-125. 154 Балаболкин М.И., Клебанова Е.М. Профилактика сосудистных осложнений сахарного диабета // Клиническая Эндокринология. – 2008, № 2. С. 6. 155 Selvakumar K., Madhan R., Srinivasan G., Baskar V. Antioxidant assays in pharmacological research. // Asian J. Pharm. Tech. – 2011. -Vol. 1. - P. 99-103. 156 Кустова Т.С., Карпенюк Т.А., Гончарова А.В., Мамонов Л.К. Антимикробная и антиоксидантная активность экстрактов, выделенных из растений Казахстана // Вестник КазНУ, серия биологическая, -2013, № 3 (59). – С. 125-129. 157 Diegelmann, R.F., Evans, M.C., Wound healing: an overview of acute, fibrotic and delayed healing // Frontiers in Bioscience - 2004. - Vol. 9. – P. 283–289. 158 Clark, R.A., Fibrin and wound healing // Annals of NewYork Academy of Sciences. - 2001. – Vol. 936. –P. 355–367. 159 Naguib, G., Al-Mashat, H., Desta, T., Graves, D.T., Diabetes prolongs the inflammatory response to a bacterial stimulus through cytokine dysregulation // Journal of Investigative Dermatology. - 2004. – Vol. 123. –P. 87–92. 160 Goren, I., Muller, E., Pfeilschifter, J., Frank, S., Severely impaired insulin signaling in chronic wounds of diabetic ob/ob mice: a potential role of tumor necrosis factor-alpha // The American Journal of Pathology. - 2006. – Vol. 168. – P. 765–777. 161 Hehenberger, K., Hansson, A., High glucose-induced growth factor resistance in human fibroblasts can be reversed by antioxidants and protein kinase Cinhibitors // Cell Biochemistry and Function. - 1997. – Vol. 15. –P. 197–201. 162 Краснюк И.И., Михайлова Г.В., Чижова Е.Т. Фармацевтическая технология: Технология лекарственных форм. – М.: Издательскитй центр Академия, 2004. – 464 c. 163 Kustova T.S., Karpenyuk T.A., Ibragimova N.A., Cantrell Ch.L., Ross S.A. The in vivo and in vitro diabetic wound healing effects of two wild plants growing in Kazakhstan and its mechanisms of action // Abstract Book of 63rd International Congress and Annual Meeting of the Society for Medicinal and Natural Product Research. Budapest, 23-17 August 2015. – P. 444. 105 164 Nancy Broderick R.N. Understanding chronic wound healing // Journal for Nurse Practitioners.- 2009. - 34(10). –Р.16–22 165 Iba Y., Shibata A., Kato M,. Masukawa T. Possible involvement of mast cells in collagen remodeling in the late phase of cutaneous wound healing in mice // International Immunopharmacology. – 2004. – Vol. 4(14).- Р.1873–1880. 166 Iinuma M., Ohyama M., Tanaka T. Six flavonostilbenes and a flavanone in roots of Sophora alopecuroides. // Phytochemistry. – 1995. -Vol.38. -P. 519-525. 167 Iinuma M., Tanaka T., Muzuno M., Shirataki Y., YokoeI., Komatsu M., Lang F. Two flavanones in Sophora Leachino and some related structures // Phytochemistry. – 1990. -Vol.29. -P. 2667-2669. 168 Iinuma, M.; Ohyama, M.; Tanaka, T.Flavonoids in roots of Sophora prostrata // Phytochemistry. – 1995. -Vol. 38. -P. 539-543 169 Kustova T.S., Karpenyuk T.A., Goncharova A.V., Ross S.A. Flavonostilbens from Vexibia alopecuroides (L.) Jakovl with antimicrobial and proliferative properties // FEBS Journal. - 2015. - V. 282, S. 1. - P. 146-147. 170 Tanaka T., Ito T., Iinuma M., Ohyama M., Ichise M., Tateishi Y. Stilbene oligomers in roots of Sophora davidii // Phytochem. – 2000. -Vol. 53. -P. 1009-1014. 171 Búfalo J., Cantrell C.L., Schrader K.K., Kustova T.S. Diterpenoids from Salvia deserta Schang with antibacterial activity // Planta Medica – 2014. – V. 80. – N 10. – P. 798. 172 Ulubelen A., Topcu G., Chai H., Pezzuto J. Cytotoxic activity of diterpenoids isolated from Salvia hypargeia // Pharmaceutical Biology. – 1999. -Vol. 37. -P. 148-151 173 Fraga M., Díaz C., Guadaño A., González-Coloma A. Diterpenes from Salvia broussonetii Transformed Roots and Their Insecticidal Activity //. Journal of Agriculture and Food Chemistry.- 2005. -Vol.53. -P. 5200–5206. 174 Kolak U.S., Birman H., Hasancebi S., Ulubelen A. Cardioactive diterpenoids from the roots of S. amplexicaulis // Planta Medica. – 1999. -Vol. 67. -P. 761-763. 175 Ulubelen A., Birman H., Okusuz S., Topcu G., Kolak U., Barla A., Voelter W. Cardioactive diterpenes from the roots of Salvia eriophora // Planta Medica. – 2002.- Vol. 68. - P. 818-821. 176 Slameňová D., Mašterová I., Lábaj J., Horváthová E., Kubala P., Jakubíková J., Wsólová L. Cytotoxic and DNA-Damaging Effects of Diterpenoid Quinones from the Roots of Salvia officinalis L. on Colonic and Hepatic Human Cells Cultured in vitro // Basic and Clinical Pharmacology and Toxicology. – 2004. Vol. 94. - P. 282-290. 177 Kustova T.S., Karpenyuk T.A., Jacob M.R., Cantrell Сh.L, Ross S.A. Antibacterial effect of crude dichloromethane extract and fractions obtained from Vexibia alopecuroides (L.) Jakovl // Planta Medica – 2014. – V. 80, N 16. – P. 1468. 178 Búfalo J., Cantrell Ch.L., Jacob M.R., Schrader K.K., Tekwani B.L., Kustova T.S., Ali A., Boaro C. F. Antimicrobial and antileishmanial activities of 106 diterpenoids isolated from roots of Salvia deserta // Planta medica.- 2015. - DOI: 10.1055/s-0035-1557875. 179 Бендер К.И., Гоменюк Г.А., Фрейдман С.Л. Указатель по применению лекарственных растений в научной и народной медицине. / Саратовский ун-т.- С:- 1988.- С. 84-92. 180 Пастушенков В.Н. «Растительные ресурсы».- 1990.-С.25. 181 Машковский М.Д. Лекарственные средства. -М.: Медицина, 1993.-Ч. 2.-С. 175. 107 ПРИЛОЖЕНИЕ А ЯМР – спектры софорафлавона I Рисунок А1 - 1H ЯМР-спектр софорафлавона I в CD3OD Рисунок А2 – 13С ЯМР-спектр софорафлавона I в CD3OD 108 ПРИЛОЖЕНИЕ Б ЯМР – спектры леахианон А Рисунок Б1 - 1H ЯМР-спектр леахианон А в CDCL3 Рисунок Б2 – 13С ЯМР-спектр леахианон А в CDCL3 109 ПРИЛОЖЕНИЕ В ЯМР – спектры глаброл Рисунок В1 - 1H ЯМР-спектр глаброл в CD3OD Рисунок В2 – 13С ЯМР-спектр глаброл в CD3OD 110 ПРИЛОЖЕНИЕ Г ЯМР – спектры софорафлавон G Рисунок Г1 - 1H ЯМР-спектр софорафлавон G в CD3OD Рисунок Г2 – 13С ЯМР-спектр софорафлавон G в CD3OD 111 ПРИЛОЖЕНИЕ Д ЯМР – спектры алопекурон А Рисунок Д1 - 1H ЯМР-спектр алопекурон А в CD3COCD3 Рисунок Д2 – 13С ЯМР-спектр алопекурон А в CD3COCD3 112 ПРИЛОЖЕНИЕ Е ЯМР – спектры алопекурон В Рисунок Е1 - 1H ЯМР-спектр алопекурон В в CD3COCD3 Рисунок Е2 – 13С ЯМР-спектр алопекурон В в CD3COCD3 113 ПРИЛОЖЕНИЕ Ж ЯМР – спектры алопекурон С Рисунок Ж1 - 1H ЯМР-спектр алопекурон С в CD3OD Рисунок Ж2 – 13С ЯМР-спектр алопекурон С в CD3OD 114 ПРИЛОЖЕНИЕ И ЯМР – спектры алопекурон D Рисунок И1 - 1H ЯМР-спектр алопекурон D в CD3OD Рисунок И2 – 13С ЯМР-спектр алопекурон D в CD3OD 115 ПРИЛОЖЕНИЕ К ЯМР – спектры алопекурон F Рисунок К1 - 1H ЯМР-спектр алопекурон F в CD3OD Рисунок К2 – 13С ЯМР-спектр алопекурон F в CD3OD 116 ПРИЛОЖЕНИЕ Л ЯМР – спектры таксодион Рисунок Л1 - 1H ЯМР-спектр таксодион в CDCL3 Рисунок Л2 – 13С ЯМР-спектр таксодион в CDCL3 117 ПРИЛОЖЕНИЕ М ЯМР – спектры ферругинол Рисунок М1 - 1H ЯМР-спектр ферругинол в CDCL3 Рисунок М2 – 13С ЯМР-спектр ферругинол в CDCL3 118 ПРИЛОЖЕНИЕ Н ЯМР – спектры 7-O-ацетилгорминон Рисунок Н1 - 1H ЯМР-спектр 7-O-ацетилгорминон в CDCL3 Рисунок Н2 – 13С ЯМР-спектр 7-O-ацетилгорминон в CDCL3 119 ПРИЛОЖЕНИЕ П ЯМР – спектры горминон Рисунок П1 - 1H ЯМР-спектр горминон в CDCL3 Рисунок П2 – 13С ЯМР-спектр горминон в CDCL3 120 ПРИЛОЖЕНИЕ Р Заявка на выдачу патента Республики Казахстан на полезную модель 121 122 ПРИЛОЖЕНИЕ С Акт о внедрении результатов 123 124
