Оценка пролиферативной активности лимфоцитов в реакции

Оценка пролиферативной активности лимфоцитов в реакции бласттрансформации на антигены и м
Сущность реакции бласттрансформации состоит в том, что лимфоциты периферической
крови способны вступать в цикл клеточной пролиферации в ответ на действие
антигенов и митогенов, и этот процесс отражает функциональную активность
иммунокомпетентных клеток. Последние могут пролиферировать и делиться в ответ на
действие специфического антигена, а также поликлональных стимуляторов-митогенов.
При этом для Т- и В-лимфоцитов существуют свои наиболее адекватные стимуляторы:
фитогемагглютинин (ФГА) и конканавалин-А (Кон-А) для Т-клеток и липополисахарид
(ЛПС) для В-клеток.
Иммунокомпетентные клетки смешиваются с антигеном и инкубируются при
определенных условиях. Затем проводится оценка реакции морфологическим способом
или с применением радиоактивного раствора Н3-тимидина. В первом случае из
клеточных культур делают мазки, в которых после их фиксации и окрашивания
определяют процент бластных клеток на определенное число лимфоцитов. Во втором
случае в клеточную культуру добавляют раствор Н3-тимидина и после окончания
куль-тивирования производят осаждение клеток на стекловолоконные фильтры при
помощи автоматического сборщика клеток. Затем с фильтра производится подсчет
включения изотопа на стинтилляционном счетчике.
Для определения показателя пролиферативной активности лимфоцитов вычисляется
средняя величина включения Н3-тимидина или средний процент бластных клеток в
контрольных культурах, не содержащих митоген (спонтанная пролиферация). Эти же
величины вычисляются для культур с митогеном (индуцированная пролиферация).
Одним из способов оценки пролиферативной активности клеток является индекс
стимуляции, который вычисляется по формуле:
ИС = ИП / СП, где СП – спонтанная пролиферация, ИП – индуцированная
пролиферация.
У здоровых людей ИС Т-лимфоцитов в периферичской крови в ответ на ФГА и Кон-А
колеблется от 14 до 25, а В-лимфоцитов в ответ на ЛПС – от 5 до 16.
Морфологический способ:
1/2
Оценка пролиферативной активности лимфоцитов в реакции бласттрансформации на антигены и м
1. У обследуемых больных берут 10 мл крови из локтевой вены в стерильную
пробирку с гепарином (4-5 ед. гепарина на 1 мл крови). Эритроциты осаждают в
термостате при температуре 37°С в течение 1-2 часов в положении пробирки под углом
в 45°. Надосадочную плазму с лейкоцитами объемом 0,5 мл на одну культуру вносят в
стерильные пенициллиновые флаконы, содер-жащие: 2 мл среды 199, 5 ЕД гепарина,
250 мкг канамицина, 2 мг L-глутамина и испытуемый антиген в объеме 0,1 мл.
2. Газовую среду во флаконах насыщают СО 2 , флаконы герметически закрывают
резиновыми пробками и ставят в термостат при 37°С. Культуры изучают через 72 часа.
По истечении срока культивирования надосадочную жидкость удаляют пастеровской
пипеткой, соединенной трубкой с вакуумным отсосом. Клетки, расположенные на дне
флакона в виде белой пленки, ресуспензируют в 5 мл гипотонического раствора
хлористого калия.
3. После инкубации в течение 5 минут клетки осаждают центрифугированием 5
минут при 1000 об./мин. Надосадочную жидкость отсасывают, а осажденные клетки
ресуспензируют в 0,2 мл оставшейся надосадочной жидкости и смешивают с 3 мл
фиксатора (ледяная уксусная кислота: этиловый спирт – 1:3).
4. Фиксацию проводят не менее 30 минут. При избыточном количестве кристаллов
гематина фиксатор меняют несколько раз до появления прозрачности надосадочной
жидкости. Клетки, ре-суспензированные в 0,5 мл фиксатора, наносят на покровное
стекло по 10 капель пастеровской пипеткой. Высохшие неокрашенные мазки хранят при
необходимости до 60 суток.
5. Окраску проводят 1% раствором орсеина в фиксаторе непосредственно перед
подсчетом препаратов. В мазках при увеличении в 900 раз подсчитывают лимфобласты
– лимфоидные клетки, достигающие размеров 20-22 мкн, с округлым ядром, имеющим
нежно-сетчатое строение и правильное равномерное распределение хроматиновых
нитей и содержащим от 1 до 3 крупных ядрышек. Количество обнаруженных
лимфобластов выражают в процентах. Сосчитывают от 500 до 1000 лимфоидных
клеток.
В норме РБТ Т-лимфоцитов в ответ на ФГА – 70-75%, на стафилококк – 10%,
стрептококк, кишечную палочку, синегнойную палочку – 8-9%, протей – 7%,
В-лимфоцитов (в ответ на лаконос американский) – 38-45%.
2/2