Национальный исследовательский центр «Курчатовский
реклама
Национальный исследовательский центр «Курчатовский институт» Федеральное государственное бюджетное учреждение «Петербургский институт ядерной физики им. Б.П. Константинова» На правах рукописи Демина Екатерина Петровна Экспрессия генов транскрипционных факторов LXRalpha, LXRbeta, PPARgamma и транспортера ABCA1 при атеросклерозе Специальность 03.02.07 – генетика Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: д.б.н., Шварцман А.Л. Санкт-Петербург 2014 2 ОГЛАВЛЕНИЕ СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ......................................................................................... 5 ВВЕДЕНИЕ ..................................................................................................................... 7 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ........................................................................... 14 1.1 Патогенез атеросклероза. Роль липопротеинов.............................................. 14 1.1.1 Факторы риска развития атеросклероза ......................................................... 14 1.1.2 Роль липопротеинов.......................................................................................... 15 1.1.2.1 Липопротеины низкой плотности ............................................................. 16 1.1.2.2 Липопротеины высокой плотности ........................................................... 17 1.1.3 Обратный транспорт холестерина ................................................................... 19 1.2 ABCA1 транспортер .............................................................................................. 22 1.2.1 Болезнь острова Танжер ................................................................................... 24 1.2.2 Варианты гена АВСА1 ...................................................................................... 25 1.2.3 Функции ABCA1 транспортера ....................................................................... 27 1.2.4 Роль ABCA1 транспортера в макрофагах....................................................... 28 1.2.5 ABCG1 транспортер ......................................................................................... 30 1.2.6 Индукция транскрипции гена АВСА1 ............................................................. 30 1.2.7 Деградация белка АВСА1 ................................................................................ 33 1.3 Роль колониестимулирующего фактора макрофагов М-CSF ..................... 35 1.4 Матричная металлопротеиназа-9 ...................................................................... 36 1.5 Ядерные рецепторы .............................................................................................. 39 1.5.1 Семейство PPAR ............................................................................................... 39 1.5.1.1 Формы PPAR ............................................................................................... 40 1.5.1.2 PPARγ ........................................................................................................... 41 1.5.1.3 Роль PPARγ в макрофагах .......................................................................... 42 3 1.5.2 Семейство LXR ................................................................................................. 43 1.5.2.1 Формы LXR ................................................................................................. 43 1.5.2.2 Регуляция экспрессии LXR ........................................................................ 44 1.5.2.3 Роль LXR в макрофагах.............................................................................. 45 1.5.2.4 Антиатерогенные и противоспалительные эффекты LXR ..................... 46 ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ .................................................................. 48 2.1 Характеристика обследованных групп. ................................................................ 48 2.2 Выделение ДНК из периферической крови человека ......................................... 51 2.3 Полимеразная цепная реакция и рестрикционный анализ ................................. 52 2.3.1 Идентификация варианта R219K гена ABCA1 ............................................... 53 2.3.2 Идентификация варианта G(-17)>C гена АВСА1 .......................................... 54 2.3.3 Идентификация варианта 319ins<G гена ABCA1 .......................................... 55 2.3 Выделение фракции моноцитов периферической крови. ................................... 57 2.4 Оценка уровня мРНК генов ABCA1, LXRα, LXRß, PPARγ и MMP-9. ............. 57 2.5 Измерение уровня белка ABCA1........................................................................... 62 2.6 Статистическая обработка данных. ....................................................................... 63 ГЛАВА 3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ ........................................................ 65 3.2 Анализ вклада вариантов гена АВСА1 (R219K, 319ins<G, G(-17)>C) в развитие атеросклероза ................................................................................................................. 69 3.2 Уровень мРНК гена ABCА1 в макрофагах, активированных М-CSF исследуемых групп........................................................................................................ 72 3.3 Измерение уровня белка ABCА1 в макрофагах, активированных М-CSF ....... 75 4 3.4 Уровень мРНК гена MMP-9 в макрофагах, активированных М-CSF в исследуемых группах. ................................................................................................... 78 3.5 Уровень мРНК генов ядерных рецепторов PPARγ, LXRα, LXRβ в макрофагах, активированных М-CSF................................................................................................ 82 3.6 Корреляция между содержанием липидов в плазме крови и уровнем мРНК PPARγ, LXRα, LXRβ, MMP-9, ABCА1 и уровнем белка ABCA1 ............................ 88 ВЫВОДЫ ...................................................................................................................... 92 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ......................................................................................... 93 5 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ апо АI – аполипопротеин АI апо Е - аполипопротеин Е апо В - аполипопротеин В ИБС – ишемическая болезнь сердца к ДНК – комплементарная дезоксирибонуклеиновая кислота ЛПВП – липопротеины высокой плотности ЛПНП – липопротеины низкой плотности ЛПОНП – липопротеины очень низкой плотности мРНК – матричная рибонуклеиновая кислота о.е. – относительные единицы ОТХ – обратный транспорт холестерина п.н. – пар нуклеотидов ПЦР – полимеразная цепная реакция ССЗ – сердечно-сосудистые заболевания Х-ЛПВП – холестерин липопротеинов высокой плотности ХС – холестерин ЭХ – эфиры холестерина АВСА1 – АТФ-связывающий кассетный транспортер А1 ABCG1 – АТФ-связывающий кассетный транспортер G1 6 LXR – печеночный Х рецептор М-CSF – колониестимулирующий фактор макрофагов MMP – матричная металлопротеиназа PPAR – рецептор активации пролиферации пероксисом RXR – ретиноидный Х-рецептор SD – стандартное отклонение 7 ВВЕДЕНИЕ Актуальность проблемы Атеросклероз и его осложнения, такие как ишемическая болезнь сердца (ИБС), ишемический инсульт и другие, являются ведущей причиной смертности взрослого населения во многих странах мира. В настоящее время продолжается рост числа заболеваний, обусловленных атеросклерозом (ВОЗ. Ситуация в области неинфекционных болезней в странах на 2011 г. Глобальный доклад ВОЗ). В связи с этим, одной из важнейших проблем, стоящих перед медициной, является выявление групп повышенного риска сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ) и создание на этой основе эффективной системы их профилактики и лечения. В свою очередь, решение этих задач невозможно без глубокого понимания причин и механизмов развития атеросклероза. В настоящее время атеросклероз рассматривают как многофакторное заболевание, представляющее собой сложный многоэтапный патологический процесс, этиопатогенетические механизмы которого остаются не до конца выясненными. Болезнь развивается на основе тесного взаимодействия внешних повреждающих и генетических факторов. Одной из актуальных проблем современной медицины является выяснение молекулярно-генетических основ наследственной предрасположенности к атеросклерозу. На молекулярно-клеточном уровне ключевым компонентом в атерогенезе является накопление нагруженных холестерином макрофагов, внутриклеточных липидов, внеклеточного матрикса и снижение уровня антиатерогенных липопротеинов высокой плотности (ЛПВП) (Feig et al., 2008). Предполагается, что обратный транспорт холестерина (ОТХ) из клеток периферических тканей к печени, в которой ЛПВП играют важную роль, является одним из основных механизмов, обусловливающих антиатерогенные свойства ЛПВП. Нагруженные холестерином макрофаги (так называемые «пенистые клетки») являются клеточными маркерами атеросклеротических повреждений. 8 Транспорт холестерина из макрофагов интимы может защищать сердечнососудистую систему от дальнейшего развития атеросклероза. Таким образом, активация ОТХ может быть эффективной терапевтической стратегией уменьшения риска развития атеросклероза (Ono, 2012). Одним из ключевых белков ОТХ является АТФ-связывающий кассетный транспортер A1 (ABCA1), который осуществляет перенос холестерина на аполипопротеин АI (апо АI). Нарушения функционирования белка АВСА1, или снижение экспрессии гена АВСА1 приводят к ускоренному темпу атерогенеза и раннему развитию атеросклероза (Oram, Heineckel, 2005). Дефицит ABCA1 в макрофагах сопровождается повышенным уровнем холестерина в мембране, увеличением его отложения на артериальной стенке и усилением образования липидных пятен (Choi et al., 2009; Francone et al., 2005; Yvan-Charvet et al., 2008). Это свидетельствует о том, что ABCA1 может принимать активное участие в удалении холестерина из атеросклеротических бляшек, а уровень экспрессии его гена может влиять как на начало атеросклеротического процесса, так и на стабильность уже существующих атероматозных бляшек. Таким образом, корреляция между содержанием мРНК ABCA1 в макрофагах и уровнем холестерина в составе ЛПВП также может отражать развитие атеросклероза. В понимании механизмов развития атеросклероза важное значение имеет семейство ядерных рецепторов, которые регулируют липидный гомеостаз и ОТХ, усиливают экспрессию генов аполипопротеина Е (апо Е) и генов транспортеров ABCA1 и АТФ-связывающего кассетного транспортера G1 (ABCG1) (Bensinger et al., 2008; Oosterveer et al., 2010). К данному семейству относятся печеночные Х рецепторы (LXR), LXRα и LXRβ и рецептор активации пролиферации пероксисом (PPAR) γ, которые играют ключевую роль в регуляции энергообмена и липидного обмена (Wahli et al., 2012). Было показано, что данные ядерные рецепторы экспрессируются в макрофагах и в пенистых клетках в местах атеросклеротических поражений (Apostoli et al., 2012, Kiss et al., 2013) и их экспрессия может критически влиять на функции макрофагов, включая их 9 активацию, продукции цитокинов и их преобразование в пенистые клетки, что, в свою очередь, влияет на развитие атеросклероза. Вместе с тем стабильность атеросклеротической бляшки также играет ключевую роль в прогрессировании развития атеросклероза и его осложнений. В ряде исследований был отмечен повышенный уровень экспрессии гена матричной металлопротеиназы (ММР)-9 в атеросклеротических бляшках (Chen et al., 2005) и получены данные, что аккумуляция MMP-9 макрофагами приводит к фрагментации атеросклеротического кора и формированию осложненной атеромы (Morishige et al., 2003). В этой связи, особый интерес уделяется роли экспрессии гена MMP-9 в макрофагах, что может пролить свет на его влияние в патогенезе атеросклероза На основе анализа литературных данных было сделано предположение, что варианты гена АВСА1 и уровень экспрессии гена ABCА1, а также уровень экспрессии генов ядерных рецепторов PPARγ, LXRα, LXRβ и гена MMP-9 в макрофагах могут быть ассоциированы с развитием атеросклероза. Эта гипотеза послужила основой для проведения настоящего исследования. Цель исследования Цель работы заключалась в оценке вклада вариантов гена АВСА1 и уровня мРНК генов PPARγ, LXRα, LXRβ, MMP-9 и ABCА1 и уровня белка ABCА1 в развитие атеросклероза. Задачи исследования 1. Определить частоту вариантов гена АВСА1 (R219K, 319ins<G, G(- 17)>C) в группе пациентов с атеросклерозом и контрольной группе. 2. Определить уровень мРНК генов PPARγ, LXRα, LXRβ, MMP-9 и ABCА1 в макрофагах, активированных М-CSF, у пациентов с атеросклерозом и у лиц без сердечно-сосудистой патологии. 10 3. Провести сравнительный анализ уровня белка ABCA1 в макрофагах, активированных М-CSF, у пациентов с атеросклерозом и у лиц без сердечнососудистой патологии. 4. Провести анализ корреляции между исследованными уровнями мРНК генов PPARγ, LXRα, LXRβ, гена MMP-9, ABCА, уровнем белка ABCA1. 5. Провести анализ ассоциации уровня мРНК генов PPARγ, LXRα, LXRβ, гена MMP-9, ABCА и уровня белка ABCA1с содержанием липидов в плазме крови у пациентов с атеросклерозом и у лиц без сердечно-сосудистой патологии. Научная новизна полученных результатов Дана оценка частоты вариантов гена АВСА1 (R219K, 319ins<G, G(-17)>C) у жителей Санкт-Петербурга и впервые показано, что вариант G319 гена АВСА1 снижает относительный риск развития атеросклероза. Впервые проведен анализ экспрессии генов PPARγ, LXRα, LXRβ, MMP-9, ABCА1 и уровня белка ABCА1 в макрофагах, стимулированных М-CSF, у пациентов с атеросклерозом и у лиц без сердечно-сосудистой патологии. Выявлено повышение уровня мРНК ABCА1 и MMP-9 в макрофагах больных атеросклерозом по сравнению с контрольной группой. Впервые показано снижение уровня мРНК LXRβ и PPARγ в макрофагах группы пациентов с атеросклерозом по сравнению с контрольной группой. Впервые установлено, что содержание белка ABCA1 в макрофагах у пациентов с атеросклерозом выше по сравнению с контрольной группой. Впервые продемонстрирована корреляция между уровнем мРНК гена MMP-9 и уровнем белка ABCA1 в макрофагах у пациентов с атеросклерозом. Практическая значимость работы: Полученные экспериментальные данные вносят вклад в понимание молекулярно-генетических основ наследственной предрасположенности к атеросклерозу. Типирование варианта 319ins<G гена АВСА1 может быть использовано для оценки прогноза развития атеросклероза. Выявленные изменения в уровне экспрессии генов PPARγ, LXRβ, MMP-9 и ABCА1 позволяют 11 приблизиться к пониманию роли уровня экспрессии данных генов в патогенезе атеросклероза. Гены, для которых были обнаружены изменения в уровне экспрессии, могут рассматриваться в качестве значимых факторов в развитии атеросклероза. Оценка уровня их экспрессии может представлять интерес для формирования групп риска в профилактике атеросклероза. Гены, для которых были обнаружены изменения в уровне экспрессии, могут рассматриваться в качестве значимых факторов в развитии атеросклероза. Основные положения, выносимые на защиту: 1. Вариант G319 гена АВСА1 снижает риск развития атеросклероза у жителей Санкт-Петербурга. 2. Уровень мРНК генов ABCА1 и MMP-9 в макрофагах, активированных М-CSF, пациентов с атеросклерозом повышен по сравнению с контрольной группой. 3. Уровень мРНК генов LXRβ и PPARγ снижен в макрофагах, активированных М-CSF, пациентов с атеросклерозом по сравнению с контрольной группой. 4. Содержание белка ABCA1 в макрофагах, активированных М-CSF у пациентов с атеросклерозом ниже по сравнению с контрольной группой. 5. Существует прямая корреляция между уровнем мРНК гена ABCA1 в макрофагах, активированных М-CSF, и уровнем холестерина в составе ЛПВП плазмы крови контрольной группы. 6. Существует обратная корреляция между уровнем мРНК гена MMP-9 и уровнем белка ABCA1 в макрофагах, активированных М-CSF, пациентов с атеросклерозом. 12 Личное участие автора в получении результатов, изложенных в диссертации: Осмотр и ангиографическая диагностика атеросклероза у пациентов, забор у них периферической крови, измерения концентрации липидов плазмы крови осуществлялись сотрудниками СПбГМУ им ак. И.П. Павлова Майоровым Н.В. и Давыденко В.В., Культивирование что нашло макрофагов, отражение в активированных совместных публикациях. М-CSF, пациентов у с артериальным стенозом и у лиц без сердечно-сосудистой патологии проведены совместно с сотрудником ФГБУ «ПИЯФ» Мирошниковой В.В., что нашло отражение в совместных публикациях. Измерение уровня мРНК PPARγ, LXRα, LXRβ, MMP-9, ABCА1 и уровня белка ABCA1 в макрофагах, активированных МCSF, в исследованных группах проведены автором лично. Описание собственных исследований, анализ и обсуждение результатов выполнены автором самостоятельно. Материалы, вошедшие в представленную работу, обсуждались и публиковались совместно с соавторами и научным руководителем. Степень достоверности и апробация результатов. Результаты работы имеют высокую степень достоверности, подтвержденную методами статистического анализа, публикацией в 4 статьях в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК, и 16 тезисных сообщениях. Материалы диссертации были представлены на Европейском конгрессе общества атеросклероза (EAS) – Гамбург, Германия, 2010 г., Милан, Италия, 2012 г., Мадрид, Испания, 2014 г., Российском национальном конгрессе кардиологов, Санкт-Петербург, 2013 г., 4-ом Международной конференции молодых ученых ИМБ «Молекулярная биология: проблемы и перспективы», Киев, Украина, 2011 г., V Съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров, Москва, 2009 г., 3-ем конгрессе FEBS «ABC Proteins», Инсбрук, Австрия, 2010 г., Международной конференции «Биология: от молекулы до биосферы», Харьков, Украина, 2008 г., Европейской конференции по генетике человека, Барселона, Испания, 2008 г.. 13 Структура и объем диссертации: Диссертационная работа состоит из следующих разделов: введения, глав «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и Обсуждение», «Выводы» и списка литературы (192 наименований). Работа изложена на 115 страницах машинописного фотографиями. текста, иллюстрирована 5 таблицами, 21 рисунком и 14 Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1 Патогенез атеросклероза. Роль липопротеинов 1.1.1 Факторы риска развития атеросклероза ССЗ, обусловленные атеросклерозом, по данным эпидемиологических исследований, являются основной причиной смерти во всем мире, в том числе и в России (Roger et al., 2012; ВОЗ. Ситуация в области неинфекционных болезней в странах на 2011 г. Глобальный доклад ВОЗ, 2011). Атеросклероз (от греч. ἀθέρος athere, «мякина, кашица» и σκληρός sklerosis, «уплотнение, затвердение») согласно определению Всемирной Организации Здравоохранения, – это вариабельная комбинация изменений интимы артерий, включающая накопление липидов, сложных углеводов, фиброзной ткани, компонентов крови, отложение кальция и сопутствующие изменения средней оболочки артериальной стенки. Отложения формируются в виде атероматозных бляшек. Последующее разрастание в них соединительной ткани (склероз), и обызвествления стенки сосуда приводят к деформации и сужению просвета вплоть до облитерации артерии. Частота встречаемости многоочагового атеросклероза варьирует от 18 до 54% (Чернявский и др., 2006). Патогенез атеросклероза представляет собой многофакторный процесс, этиопатогенетические механизмы которого остаются в настоящее время не до конца выясненными. Предполагается, что в основе патогенеза лежат следующие факторы, а также их сочетания: • инфильтрация липопротеинов в стенке сосудов, • дисфункция эндотелия — первичное нарушение защитных свойств эндотелия и его медиаторов, • аутоиммунные нарушения — первичное нарушение функции макрофагов и лейкоцитов, инфильтрация ими сосудистой стенки, • первичное вирусное повреждение эндотелия, 15 • Среди первичное нарушение антиоксидантной системы (Орехов, 2013). причин, развития атеросклероза выделяют и генетическую предрасположенность. Однако вопрос о генетических факторах риска развития атеросклероза для конкретных популяций остается не до конца изученным. Интерес представляет изучение риска развития атеросклероза среди моно-и дизиготных близнецов. Так в исследовании, проведенном в Швеции, было показано, что уровень конкордантности по ИБС среди монозиготных близнецов намного выше, чем среди дизиготных (75 и 30 %, соответственно) (Marenberg et al., 1994). Относительный риск смерти от ИБС у мужчин, по данным тех же авторов, составляет 8.1 для монозиготных и 3.8 для дизиготных близнецов, а у женщин – 15.0 и 5.6, соответственно. Кроме того, работы, посвященные исследованию семей с ССЗ, показали наличие таких моногенных форм заболеваний, как семейная гиперхолестеринемия, семейная форма лигандповрежденных аполипопротеинов B (апо В) 100, ситостеролемия, аутосомнорецессивная гиперхолестеринемия, возникающие из-за мутации в генах, кодирующих рецепторы липопротеинов низкой плотности (ЛПНП), апо B100, АТФ-связывающих кассетных транспортеров G5 и G8) (Nabel et al., 2003). Установлено, что вне зависимости от национальности, социальноэтнических условий и пола в развитии атеросклероза нарушения липидного обмена занимают первое место среди всех факторов риска. Дислипидемия является признанным, доказанным в крупных эпидемиологических исследованиях, в том числе Фремингемском, фактором риска развития атеросклероза (Wilson et al., 1987). 1.1.2 Роль липопротеинов Как уже было сказано выше, липопротеины играют ключевую роль в атерогенезе. Нарушения липидного обмена, проявляющиеся при различных дислипопротеинемиях, влияет на патогенез заболеваний, ассоциированных с 16 атеросклерозом. Формирование обогащенных липидами пенистых клеток является одним из инициирующих моментов патогенеза атеросклероза. 1.1.2.1 Липопротеины низкой плотности Атерогенными свойствами обладают ЛПНП и липопротеины очень низкой плотности (ЛПОНП). ЛПНП образуются из ЛПОНП в процессе липолиза. ЛПНП относятся к классу липопротеинов с плотностью в интервале 1.019-1.063 г/мл и размером частиц 20-25нм (Badimon et al., 2009). Частицы ЛПНП состоят из гидрофобного ядра, содержащего триглицериды и эфиры холестерина и гидрофильной оболочки из фосфолипидов и свободного холестерина. В качестве белковой компоненты ЛПНП содержит молекулу белка апо B100, которая является лигандом для мембранных рецепторов (Levitan et al., 2010). Из общего количества апо В100 (примерно 1 г/л плазмы) подавляющая часть его (около 96%) находится в составе ЛПНП и только около 4% относится к ЛПОНП (Орехов, 2013). ЛПНП играют важную роль в процессе нормального клеточного функционирования, но в высоких концентрациях и, в особенности после окисления или карбонилирования (Yang et al., 2012), способствуют образованию атеросклеротических бляшек. За последние несколько десятилетий было доказано, что окисленные формы ЛПНП является более важным фактором в возникновении и прогрессии атеросклероза, чем неизмененной формы ЛПНП (Yang et al., 2012). Изначально ЛПНП накапливаются в интиме преимущественно за счет связывания с компонентами межклеточного вещества — протеогликанами. В интиме липопротеины, связанные с протеогликанами, могут вступать в химические реакции. Основную роль играют: окисление и неферментативное гликозилирование, что приводит к образованию смеси окисленных ЛПНП, причем окисляются как липиды, так и белковый компонент. После окисления ЛПНП становятся более токсичными и играют основную роль в развитии и прогрессии атеросклероза (Mitra et al., 2011). Продуктами окисления липидов являются гидроперекиси, лизофосфолипиды, оксистерины и альдегиды. 17 Окисление аполипопротеинов ведет к разрыву пептидных связей и соединению боковых цепей аминокислот с продуктами расщепления жирных кислот (4гидроксиноненалем и малоновым диальдегидом). Стойкая гипергликемия при сахарном диабете способствует неферментативному гликозилированию аполипопротеинов и собственных белков интимы, что также нарушает их функции и увеличивает вероятность атерогенеза (Орехов, 2013). Кроме того, окисленные формы ЛПНП могут индуцировать апоптоз эндотелиальных клеток (Yang et al., 2012). В настоящее время известно, что, индуцированные окисленными формами ЛПНП, токсические эффекты присутствуют на всех стадиях атеросклероза от его начала до острого тромбоза (Mitra et al., 2011). Окисленные ЛПНП также приводят к разрыву фиброзного покрытия атероматозной бляшки через активирование секреции MMP (Hagemann et al., 2012). Миграцию лейкоцитов, в основном моноцитов и лимфоцитов, в интиму обеспечивают расположенные на эндотелии рецепторы — молекулы адгезии VCAM-1 и ICAM-1 (из суперсемейства иммуноглобулинов) и Р-селектины. Окисленные ЛПНП также способствуют хемотаксису лейкоцитов. В интиме моноциты дифференцируются в макрофаги, которые, за счет опосредованного рецепторами эндоцитоза липопротеинов, образуют, обогащенные липидами, пенистые клетки. Также при поглощении модифицированных липопротеинов макрофаги выделяют цитокины и факторы роста, способствующие развитию атеросклеротической бляшки (Орехов, 2013). 1.1.2.2 Липопротеины высокой плотности Липопротеины высокой плотности были описаны как класс липопротеинов, обладающий антиатерогенными свойствами, такими как: антиокислительные, антиапоптотические, противовоспалительные, поддержание функций эндотелиальных клеток и обеспечение ОТХ из периферических тканей к печени. Частицы ЛПВП являются ключевыми акцепторами холестерина из нагруженных 18 липидами макрофагов и, таким образом, играют важную роль в поддержании баланса холестерина в артериальной стенке и уменьшении провоспалительного ответа обогащенных холестерином макрофагов (Ono, 2012). Считается, что именно участие ЛПВП в ОТХ является одной из важнейших функций, обусловливающих антиатерогенные свойства этого класса липопротеинов. ЛПВП являются самыми мелкими липопротеиновыми частицами с плотностью в интервале 1,063-1,210 г/мл и размером частиц 8-11 нм. В зависимости от величины плотности ЛПВП подразделяются на 2 подкласса – ЛПВП-2 и ЛПВП-3 (Липовецкий, 2000). На долю ЛПВП приходится 20-30% общего холестерина крови, но из всех липопротеидов именно эти частицы содержат наибольшее количество фосфолипидов и белка. В состав ЛПВП входят восемь аполипопротеинов. Среди них основными являются апо AI и апо АII. Содержание первого составляет около 67% и второго — около 22% от общего количества белка. Остальная часть приходится на долю минорных аполипопротеинов, среди которых в первую очередь следует отметить аполипопротеины семейства С (CI, СII и СIII) (Климов, Никульчева, 1999). Также важную роль в ОТХ из макрофагов играют обедненные липидами частицы, содержащие апо Е, которые продуцируют макрофаги. Последние исследования показали значительное снижение ОТХ in vivo у мышей дикого типа, к которым добавляли макрофаги линии мышей, дефицитных по апо Е (Zanotti et al., 2011). Клинические и эпидемиологические исследования продемонстрировали обратную связь между концентрацией холестерина ЛПВП (Х-ЛПВП) в плазме крови и развитием атеросклероза (Gordon et al., 1989; Miller et al., 1975; Miller et al., 2007). Увеличение уровня Х-ЛПВП на 1мг/дл (0.026мМ) ассоциировано со снижением риска развития коронарной болезни сердца на 2% у мужчин и на 3% у женщин (Gordon et al., 1989). Однако недавние исследования показали, что более точным прогнозирующим параметром риска развития атеросклероза является не 19 концентрация Х-ЛПВП в плазме крови, а уровень транспорта холестерина из периферических клеток (Brown et al., 2010; Khera et al., 2011). 1.1.3 Обратный транспорт холестерина Транспорт уменьшения холестерина содержание из клетки холестерина является в основным макрофагах и процессом регресса атеросклеротической бляшки (Meurs et al., 2010). Под обратным транспортом холестерина, (название первоначально предложено Гломсетом) (Glomset, 1968), в настоящее время понимается физиологический процесс, посредством которого холестерин из периферических тканей транспортируется ЛПВП в печень для его дальнейшей экскреции в составе желчи. Поддержание оптимального уровня холестерина в клетках является необходимым условиям для их нормального функционирования, а избыток холестерина вызывает цитотоксический эффект. Основным механизмом защиты клеток от токсичности холестерина является транспорт холестерина на внеклеточные акцепторы. Поскольку большинство периферических клеток и тканей не катаболизируют холестерин, то процесс удаления его из клеток возможен путем переноса свободного холестерина на внеклеточные акцепторы, такие как ЛПВП. Существуют различные пути переноса холестерина из периферических клеток на частицы ЛПВП. Одним из путей является пассивная диффузия холестерина через клеточную мембрану. Однако большая часть холестерина из клеток переносится посредством взаимодействия со специфическими рецепторами – перенос холестерина на частицы апо AI, опосредованный ABCA1 и перенос холестерина на зрелые ЛПВП частицы, опосредованный ABCG1 (Rothblat et al., 2010; Yang et al., 2010). Нагруженные холестерином макрофаги (так называемые «пенистые клетки») вызывают атеросклеротические повреждения и поэтому транспорт холестерина из макрофагов интимы сосудов может защищать артерии от 20 дальнейшего развития атеросклероза. Таким образом, усиление ОТХ может быть эффективной терапевтической стратегией уменьшения риска развития атеросклероза (Rader, 2006). ОТХ является комплексным процессом и включает в себя следующие этапы: перенос холестерина из периферических клеток на частицы ЛПВП, далее холестерин, поступивший на частицы ЛПВП, эстерифицируется под действием лецитин-холестерин-ацилтрансферазы, на последующих этапах происходит транспорт эфиров холестерина в печень и поглощение эфиров холестерина гепатоцитами (Oram, 2003). Первым шагом в ОТХ является удаление избыточного холестерина из нагруженных липидами макрофагов, присутствующих в атеросклеротической бляшке. Из макрофагов холестерин может быть транспортирован только если он находится в свободной форме (Oram, 2003). Перенос холестерина на частицы ЛПВП может осуществляться посредством нескольких механизмов (Рисунок 1), включая: 1. Транспорт, опосредованный ABCA1, на обедненные по холестерину аполипопротеины, 2. Перенос холестерина на зрелые частицы ЛПВП с помощью белка ABCG1, 3. Пассивная диффузия холестерина на зрелые частицы ЛПВП (Rader et al., 2009). 21 Рисунок 1. Перенос холестерина из клетки на липопротеины высокой плотности. Сокращения: апо AI – аполипопротеин АI, ЛПВП – липопротеины высокой плотности, ХС – холестерин, ЭХ – эфиры холестерина ОТХ из периферических клеток осуществляется преимущественно путем взаимодействия молекул свободного холестерина посредством транспортера ABCA1 с аполипопротеинами (в основном, группы А) или фосфолипидами (Chen et al., 2000; Singaraja et al., 2002). Удаление ABCA1 в макрофагах приводит к уменьшению оттока холестерина из пенистых клеток как в плазму, так и во фракцию желчных кислот (Wang et al., 2007 - a; Wang et al., 2007 - b). Ключевая роль, которую транспортер ABCA1 играет в определении уровня Х-ЛПВП, общепризнана. Пациенты с болезнью острова Танжер, являющиеся гомозиготами по мутации в гене ABCA1, приводящей к потере функциональной 22 активности этого белка, характеризуются дефицитом Х-ЛПВП и апо AI, но имеют высокое содержание триглицеридов (Oram, Heinecke, 2005). 1.2 ABCA1 транспортер ABCA1 относится к суперсемейству АТФ-связывающих кассетных транспортеров, которое представляет собой одно из наибольших семейств белков в живых организмах. Оно включает 49 генов, кодирующих ABC транспортеры у человека, 52 у мыши, 56 у Drosophila, 58 у Caenorhabditis elegans, 31 у дрожжей и 129 у Arabidopsis (Holland et al., 2003). Впервые ABC транспортер был клонирован в 1982 (Singaraja et al., 2003). ABC транспортеры млекопитающих разделены на 7 структурных классов, или подсемейств на основе их аминокислотной последовательности и доменной организации: ABCA, ABCB, ABCC, ABCD, ABCE, ABCF, ABCG. Подсемейство транспортеров ABCA, в свою очередь, представлено 12 кодирующими генами: ABCA1 (9q22-q31), ABCA2 (9q34), ABCA3 (16p13,3), ABCA4 (1p22), ABCA7 (19p13,3), ABCA11 (4p16), ABCA12 (2q35) и ABCA5, ABCA6, ABCA8, ABCA9 and ABCA10, локализованными в локусе 17q24 (Dean et al., 2001). ABC транспортеры характеризуются двумя высоко консервативными гидрофильными цитоплазматическими нуклеотидсвязывающими доменами (NBD) и двумя гидрофобными трансмембранными доменами (TMB), содержащими 6-12 трансмембранных α-спиралей. Субстратами для ABC транспортеров являются липиды, желчные кислоты, ксенобиотики, ионы тяжелых металлов, неорганические кислоты, конъюгаты глутатиона, сахаров и белков для презентации антигена (Rea et al., 1998). Ген АВСА1 локализован на длинном плече хромосомы 9 в локусе 9q31. Его открытая рамка считывания состоит из 6783 п.н. и содержит 50 экзонов. АВСА1 – трансмембранный белок, молекула которого состоит из 2261 аминокислотных остатков (Рисунок 2) (Oram, Heinecke, 2005). 23 Рисунок 2 Схематическое изображение белка АВСА1 (Kang et al., 2010). Белок АВСА1 состоит из двух трансмембранных доменов. Каждый домен содержит шесть гидрофобных трансмембранных спиралей. На N-терминальном конце белок АВСА1 содержит сигнальную последовательность (AК 1-60), которая ориентирует ABCA1 в бислойной мембране. Сигнальная пост-Гольджи последовательность (AA 9-14) служит для направления ABCA1 к везикулам. 11-58-14 мотив (AA 1245-1257) является сайтом связывания кальмодулина и связывание с кальмодулином защищает ABCA1 от калпаин-опосредованной деградации. PEST последовательность (АК 1245-1257) является мишенью для калпаин протеаз. NDF6F1 (АК 1311-1450) представляет собой последовательность аминокислот, которые используется для генерирования антител к ABCA1. Эти антитела имитируют апо AI и предполагается, что эта область имеет решающее значение для связывания ABCA1 с апо AI. PDZ белок связывающий мотив (AA 2258-2261), который обеспечивает связывание с PDZ белками, включая α1 и β1- 24 синтропином. Два нуклеотид связывающих домена (NBD) связывают и гидролизуют АТФ для транслокации субстратов через мембрану. Два ECD домена обеспечивают связывание с апо AI. Мотив VFVNFA (AA 2216-2221) является высоко консервативными среди ABCA транспортеров и играет важную роль в транспорте холестерина, хотя механизм остается неизвестным. 1.2.1 Болезнь острова Танжер Мутации в гене ABCA1 приводят к тяжелому наследственному заболеванию – болезни острова Танжер, сопряженной с практически полным отсутствием ЛПВП и апо AI в плазме крови, резким накоплением в ретикуло-эндотелиальной системе эфиров холестерина и тяжелыми атеросклеротическими поражениями сосудов (Bodzioch et al., 1999; Brooks-Wilson et al., 1999; Rust et al., 1999). Как было установлено, что необходимым условием эффективного ОТХ из макрофагов является количество акцепторов молекул холестерина, таких как апо AI (Oram, Heinecke, 2005). Апо АI составляет около 70% из всех аполипопротеинов, присутствующих в частицах ЛПВП, и его концентрация в плазме крови коррелирует с уровнем Х-ЛПВП (Ono, 2012). Гиперэкспрессия апо AI человека у мыши приводит к усилению ОТХ из макрофагов, что еще раз подтверждает концепцию, что увеличение уровня ЛПВП является атеропротективным за счет усиления ОТХ (Zhang et al., 2003). Открытие дефекта переноса холестерина и фосфолипидов на апо AI у пациентов с болезнью острова Танжер показывает, что ABCA1 транспортер является посредником и регулирует транспорт липидов на апо AI (Nofer, Remaley, 2005). В настоящее время идентифицировано более 70 мутаций в гене АВСА1 у лиц с низким уровнем ЛПВП и более половины из них относятся к миссенсмутациям (Oram, Heinecke, 2005). При гомозиготном носительстве мутаций уровень ЛПВП снижается до 45% (Voloshyna, Reiss, 2011). Уменьшение уровня ЛПВП при гетерозиготном носительстве мутаций ABCA1 сопровождается 25 снижением транспорта холестерина из клетки, увеличением частоты ИБС и повышенной толщиной артериальной стенки. Около 10% лиц с низким уровнем ЛПВП являются гетерозиготными носителями мутаций в гене ABCA1 (Voloshyna, Reiss, 2011). Внутривенная инъекция мышам аденовируса, экспрессирующего ABCA1, приводит к 2-3-х кратному увеличению уровня ЛПВП в плазме крови (Basso et al., 2003). Было также показано, что при гетерозиготном носительстве ABCA1 мутации наблюдается 2 – 3-х-кратный риск развития ИБС (Frikke-Schmidt et al., 2005). 1.2.2 Варианты гена АВСА1 Одними из наиболее важных генетических маркеров для анализа являются однонуклеотидные полиморфные варианты в регуляторных областях гена ABCA1, где расположены сайты связывания различных транскрипционных факторов. Эти варианты нуклеотидной последовательности могут влиять на уровень экспрессии гена ABCA1 и, следовательно, могут приводить к нарушению ОТХ и развитию атеросклероза. Группой исследователей была секвенирована промоторная, 5`- нетранслируемая область гена ABCA1 и первый интрон гена ABCA1 (Zwartz et al., 2002). Было идентифицировано 12 вариантов гена ABCA1, из которых с ИБС ассоциировались: C(-191)>G, 69T>C, G(-17)>C, 319ins<G (Zwarts et al., 2002). Аллель (-17)C ассоциировалась с пониженным относительным риском развития ИБС, а аллель 319G (319ins<G) – с меньшей степенью атеросклеротических повреждений артерий. Также было показано, что ни один из этих вариантов гена АВСА1 не коррелировал с уровнем Х-ЛПВП в плазме крови. Исследователями из Китая выявлена более высокая частота аллеля (-191)C (C(-191)>G) в группе пациентов с ИБС по сравнению с контрольной группой, что согласуется с результатами работы Zwarts и соавт. (Liu L. et al, 2005). В проспективном исследовании, проведенном в Дании, была показана ассоциация между носительством аллеля (-191)С (C(-191)>G) гена АВСА1 и снижением риска 26 развития ИБС, что противоречит результатам исследования Zwarts и соавт. (Jensen et al, 2007). Jensen и соавт. не показали корреляцию между вариантом (191)G (C(-191)>G) гена ABCA1 и уровнем липидов в плазме крови. Исследование не обнаружило также ассоциации варианта (-17)G (G(-17)>C) гена ABCA1с развитием ИБС, в отличие от результатов Zwarts и соавт. (Jensen et al, 2007). С момента открытия гена ABCA1 были идентифицированы также варианты в его кодирующей области, приводящие к аминокислотным заменам в молекуле белка АВСА1 транспортера и ассоциированные с относительным риском развития атеросклероза (Clee et al., 2000; Probst et al., 2004; Singaraja et al., 2003; Wang et al., 2006). Многочисленные эпидемиологические исследования подтверждают наличие ассоциации между однонуклеотидными заменами в кодирующей области гена АВСА1, приводящими к аминокислотным заменам в молекуле белка, R219K (rs2230806) и M883I (rs4149313) с риском развитием атеросклероза (Ma et al., 2011; Song et al., 2013; Yin et al., 2014). Согласно последним данным, в европейской популяции аллель 219К встречается у 27% индивидуумов (Balcerzyk et al., 2008; Frikke-Schmidt et al., 2008; Porchay-Balderelli et al., 2009). Носительство 219К аллеля ассоциируется с уменьшением локального и диффузного коронарного атеросклероза, снижением риска развития и замедлением прогрессирования ИБС. У носителей 219К аллеля был выявлен повышенный уровень Х-ЛПВП (Clee et al., 2000). Согласно результатам метаанализа 42 исследований, включившего 12251 пациентов с атеросклерозом и 19548 представителей контрольной группы, было показано, что вариант 219К (R219K) гена ABCA1 в европейской популяции является атеропротективной (OR (K vs. R) = 0.77 (95% ДИ: 0.71 – 0.84), p<0.01) (Yin et al., 2014). Однако данные об ассоциации варианта 219К гена АВСА1 с концентрацией липидов плазмы крови весьма противоречивы. Во многих исследованиях была выявлена ассоциация аллеля К219 гена ABCA1 с увеличенным уровнем Х-ЛПВП и/или с пониженным уровнем ТГ в плазме крови. Однако не была показана ассоциация с риском развития или степенью атеросклеротического поражения артерий (Benton et al., 27 2007; Mantaring M. et al., 2007). В исследовании Cenarro и соавт. антиатерогенность К219 аллеля гена ABCA1 была показана только для курящих индивидуумов (Cenarro et al., 2003), а в работе Kakko и соавт. – для женского пола (Kakko et al., 2003). В некоторых исследованиях не было установлено ассоциации варианта R219K гена ABCA1 ни с уровнем липидов в плазме крови, ни с атеросклерозом (Brousseau et al., 2001; Lutucuta et al., 2001; Saleheen et al., 2007; Frikke-Schmidt et al., 2008). В настоящее время продолжаются исследования, направленные на поиск вариантов в регуляторных и кодирующих областях гена ABCA1 и изучение их роли в развитии атеросклероза. 1.2.3 Функции ABCA1 транспортера ABCA1, относящийся к суперсемейству АТФ-связывающих кассетных транспортеров, осуществляет транспорт холестерина из макрофагов на апо AI (Yvan-Charvet et al., 2010). ABCA1 опосредованный перенос холестерина на апо AI может происходить как на плазматической мембране, так и на зрелых эндосомах с последующим освобождением комплекса апо AI -холестерин путем экзоцитоза (Yvan-Charvet et al., 2010). У мышей с нокаутом гена АВСА1 наблюдалось замедление ОТХ, что объясняет чрезвычайно низкий уровень ЛПВП в плазме крови и повышенное содержание нагруженных липидами макрофагов (Voloshyna, Reiss, 2011). При этом, исследования, выполненные на ABCA1 дефицитных мышах, показало, усиление атеросклероза (Aiello et al., 2002) и снижение уровня транспорта холестерина в печень и желчь на 50% (Wang et al., 2007 - a; Voloshyna, Reiss, 2011). Сокращение уровня клеточного ABCA1 в интима-медии артерий посредством воздействия антисмысловых ABCA1 олигонуклеотидов приводило к значительному снижению транспорта клеточного холестерина и фосфолипидов на апо AI (Wang et al., 2007 - a; Voloshyna, Reiss, 2011). Следует заметить, что апо AI- 28 опосредованный транспорт холестерина увеличивается при гиперэкспрессии ABCA1 как в адипоцитах, так и в макрофагах (Wang et al., 2007 - a; Voloshyna, Reiss, 2011). Известно, что опосредованный ABCA1 транспорт холестерина из периферических клеток может ингибировать развитие ССЗ независимо от его способности формировать частицы ЛПВП (Voloshyna, Reiss, 2011). Были получены данные, что при наличии мутаций в гене ABCA1 существует отрицательная корреляции между апо AI опосредованным транспортом холестерина и толщиной интима/медиа (Van Dam et al., 2002). Концентрация ABCA1 в печени является критической составляющей в биогенезе ЛПВП (Voloshyna, Reiss, 2011). В β-клетках ABCA1 необходим для поддержания гомеостаза холестерина и секреции инсулина (Brunham et al., 2007), в нейронах ABCA1 поддерживает моторную функцию и синаптические функции (Karasinska et al., 2009). Таким образом, все вышеперечисленные данные свидетельствуют, что функция ABCA1 в транспорте холестерина наиболее важна в макрофагах, где ABCA1 уменьшает образование пенистых клеток и снижает размер атероматозных бляшек (Zhao, Dahlman-Wright, 2010). 1.2.4 Роль ABCA1 транспортера в макрофагах В работе Khera и соавт. было показано наличие обратной ассоциации между транспортом холестерина из макрофагов и развитием атеросклероза независимо от уровня ЛПВП (Khera et al., 2011). Выявлено, что блокирование синтеза ABCA1 в макрофагах при трансплантация костного мозга от мышей с нокаутом гена АВСА1 приводит к увеличению степени атеросклеротических повреждений сосудов, не влияя на уровень Х-ЛПВП в плазме крови (Van Eck et al., 2002). Дефицит ABCA1 в макрофагах сопровождается повышенным уровнем холестерина в мембране, увеличением его отложения на артериальной стенке и более высоким образованием липидных рафтов (Choi et al., 2009; Francone et al., 29 2005; Yvan-Charvet et al., 2008). Также при анализе АВСА1-дефицитных макрофагов были получены данные о значительном уменьшении ОТХ in vivo (Wang et al., 2007 - b). Кроме того, анализ данных литературы позволяет заключить, что ABCA1 принимает активное участие и в противовоспалительных реакциях. Так, повышенная экспрессия толл-подобного рецептора 4 (TLR4), играющего ключевую роль во врожденном иммунитете, в макрофагах с отсутствием ABCA1 увеличивает воспалительный ответ к липополисахаридам (Yvan-Charvet et al., 2010). Перитонеальные макрофаги мышей с двойным нокаутом ABCA1 -/ABCG1 -/- выявили повышенную экспрессию и секрецию различных воспалительных цитокинов (фактора некроза опухоли TNF-α, интерлейкинов IL 6, IL -1β и IL-12p70) и хемокинов (воспалительных белков макрофагов MIP-1α, MIP-2, хемоаттрактанта моноцитов белка MCP -1) (Yvan-Charvet et al., 2007). В ABCA1 + / + макрофагах был отмечен повышенный уровень секреции IL-10, по сравнению с ABCA1-/ - макрофагами, что также свидетельствует о роли ABCA1в воспалительных реакциях (Ma et al., 2012). Было показано, что ABCA1 способствует секреции противовоспалительного цитокина IL-10 в макрофагах, в то время как уменьшение содержания ABCA1 или ABCG1 в макрофагах могло бы объяснить усиление воспаления при атеросклерозе (Tall et al., 2008) и, как результат, формирование и дальнейшее ускорение развития атеросклероза (YvanCharvet et al., 2007). Также усиление экспрессии гена ABCA1 сопровождается повышением скорости транспорта холестерина, активирует ОТХ, уменьшает воспаление и ингибирует развитие атероматозных бляшек на моделях атеросклероза у мышей (Toth, 2009). Все вышесказанное позволяет предположить, что нарушения функционирования белка АВСА1 или снижение экспрессии гена АВСА1 в макрофагах приводят к ускоренному темпу атерогенеза и раннему развитию атеросклероза (Oram, Heineckel, 2005). 30 1.2.5 ABCG1 транспортер Транспортер ABCG1 осуществляет перенос холестерина из внутриклеточного матрикса на зрелые частицы ЛПВП (Wang et al., 2004; Kennedy et al., 2005). У мышей с отсутствием ABCG1 при диете с повышенным содержанием жиров наблюдалось накопление холестерина в макрофагах (Kennedy et al., 2005). В макрофагах с дефицитом ABCG1 был уменьшен транспорт холестерина на ЛПВП и показано значительное снижение ОТХ (Wang et al., 2007 b). Известно, что транспортер ABCG1 работает в тандеме с транспортером ABCA1. В то время как транспортер ABCA1 переносит холестерин из клетки на апо AI, транспортер ABCG1 осуществляет насыщение холестерином зрелых частиц ЛПВП (Baldan et al., 2009). Показано, что одновременный нокаут генов и ABCA1, и ABCG1 в макрофагах приводит к уменьшению транспорту холестерина и ОТХ в большей степени, чем при отсутствии только одного из транспортеров (Wang et al., 2007 - b). Трансплантация костного мозга от мышей линии с двойным нокаутом по генам ABCA1/ABCG1 приводит к более ускоренному атеросклеротическому поражению сосудов и раннему развитию атеросклероза, чем трансплантация костного мозга от мыши с нокаутом только по одному гену (Yvan-Charvet et al., 2007). В значительном количестве мРНК генов ABCA1 и ABCG1 детектируется в интиме артерий при атеросклерозе (Seo et al., 2004), что предполагает участие белков ABCA1 и ABCG1 в удалении холестерина из атеросклеротических бляшек. 1.2.6 Индукция транскрипции гена АВСА1 Эпидемиологические исследования и изучение механизмов ОТХ на модельных животных выявили, что повышение экспрессии ABCA1 может приводить к увеличению уровня ЛПВП в плазме крови и уменьшению риска развития ССЗ (Liu, Tang, 2012). 31 За последние 10 лет исследования in vivo и in vitro показали LXRα / LXRβ зависимую индукцию ABCA1 и ABCG1 в макрофагах и, как следствие, усиление ОТХ и регрессию атероматозных поражений (Calkin, Tontonoz, 2010). ОТХ, вероятно, является важной частью механизма LXR-зависимой защиты от атеросклероза, поскольку ни регрессия атероматозных поражений, ни усиление ОТХ не наблюдаются у LXR нокаутных мышей (Tangirala et al., 2002). Активация транскрипции гена АВСА1 может осуществляться транскрипционными факторами LXRα/LXRβ, функционирующими в виде гетеродимера с RXR (Рисунок 3) (Zhao, Dahlman-Wright, 2010). При активации экспрессии гена ABCA1 LXR взаимодействует с его природными лигандами, оксистеролами, и образует гетеродимеры с RXR, которые связываются с промотером гена ABCA1 (Oram, Heinecke, 2005). Рисунок 3 Сайт связывания гетеродимеров LXR/RXR в промоторной области гена ABCA1 Было установлено, что транскрипционный фактор SP1 также регулирует экспрессию ABCA1 через взаимодействие с LXR / RXR гетеродимерами в клетках гепатомы человека (Thymiakou et al., 2007). В дополнение к транскрипционной фактор-опосредованной регуляции гена ABCA1, митоген-активированная протеинкиназа (МАРК) сигнальных каскадов 32 также может модулировать экспрессию ABCA1 (Chang et al., 2012). Семейство МАРК включает в себя киназы 1/2 (ERK1 / 2), C-Jun N-терминальные киназы 1/2 (JNK1 / 2) и p38. Ингибирование активации ERK приводит к увеличению содержания ABCA1 мРНК и стабильности белка ABCA1 (Zhou et al., 2010). Активация p38 может модулировать экспрессию ABCA1 в гладкомышечных клетках сосудов и в макрофагах (Kaplan et al., 2002; Yu et al., 2010). В работе Guay и соавт. было продемонстрировано существование эпигенетического регулирования экспрессии гена ABCA1. В промоторе гена ABCA1 находится область, которая может быть дифференцировано метилирована. Метилирование данного сайта негативно коррелирует с уровнем ЛПВП и ассоциировано с повышенным риском развития коронарной недостаточности (Guay et al., 2012). Экспрессия гена ABCA1 в макрофагах на уровне транскрипции может регулироваться различными агентами, такими как ацетилированные ЛПНП (Langmann et al., 1999), аналоги цАМФ (Oram et al., 2000; Wang et al., 2000) и агонисты LXR/RXR гидроксистеролы и 9-цис-ретиноевая кислота (Costet et al., 2000; Repa et al., 2000; Schwartz et al., 2000). Регуляция экспрессии гена ABCA1 отличается между различными типами клеток (Denis et al., 2003). Chen и соавторы (Chen et al., 2011) исследовали влияние нагрузки макрофагов ЛПНП и обнаружили повышенные уровни фосфорилированного Sp1 и увеличение количества Sp1 связанного с промотером гена ABCA1. Мутации на сайте связывания Sp1 в гене ABCA1 уменьшали ЛПНПиндуцированную экспрессию ABCA1 и транспорт холестерина из клетки, что показывает, что в макрофагах регуляция экспрессии ABCA1 также может быть опосредована Sp1(Chen et al., 2011). Таким образом, все вышеперечисленные данные указывают на наличие различных механизмов регуляции индукции транскрипции гена ABCA1. 33 1.2.7 Деградация белка АВСА1 Уровень экспрессии мРНК не всегда предсказывает уровень белка в клетках (Gygi et al., 1999). Показано, что у мышей сердце и почки, имея наивысший уровень экспрессии мРНК гена ABCA1, одновременно содержат наименьшее количество белка ABCA1 (Wellington et al., 2002). Также в работе Albrecht и соавт. было показано, что в атеросклеротических бляшках при увеличении экспрессии мРНК гена ABCA1 количество белка ABCA1 существенно снижается (Albrecht et al., 2004). Для ABCA1 транспортера было продемонстрировано существование большого количества возможных белок-белковых взаимодействий и посттрансляционных модификаций, таких как пальмитилирование, образование дисульфидных мостиков фосфорилирования и дефосфорилирование. (Рисунок 4) (Kang et al., 2010). Для ABCA1 показан быстрый распад белка со временем полу-жизни менее 1 часа в макрофагах (Arakawa et al. 2004; Oram J.F. et al., 2000). Такое короткое время жизни указывает, что модификация белка ABCA1 на посттрансляционном уровне может быть важным фактором, определяющим его функции. Состав и микроокружение атеросклеротической бляшки могут оказывать влияние на деградацию белка ABCA1. При атеросклеротическом поражении сосудов макрофаги имеют тенденцию накапливать большое количество свободного холестерина (Tabas, 1997). Увеличение содержания внутриклеточного свободного холестерина, как было показано, ускоряет деградацию ABCA1 в макрофагах (Feng, Tabas, 2002). Длинноцепочечные жирные кислоты, присутствующие в атеросклеротической бляшке, также могут способствовать деградации ABCA1 белка в макрофагах (Wang et al., 2004). Следует заметить, что связывание ABCA1 с аполипопротеинами апо AI и апо АII, но не с ЛПВП, замедляло его деградацию в макрофагах (Arakawa et al. 2004). 34 Рисунок 4 Сайты пост-трансляционной модификации ABCA1 (Kang et al., 2010) Пальмитилирование (PALM) ABCA1 (C3, C23, C1110, C1111) локализует ABCA1 в плазматической мембране. Образование дисульфидных мостиков (S-S) между C75 и C309; или между C1463или C1465 и C1477 необходимо для транспорта холестерина. Сайты гликозилирования (N-GLY) имеют неизвестный эффект на ABCA1. Сокращение фосфорилирования (PHOS) ABCA1 в положении S2054 снижает опосредованный ABCA1 отток фосфолипидов, дефосфорилирование конститутивно фосфорилированных остатков T1286 и T1305 ингибирует калпаин-опосредованную деградацию белка ABCA1. И именно связывание апо AI с ABCA1 дефосфорилирует данные сайты T1286 и T1305 (Kang et al., 2010). Кроме того, установлено, что белок ABCA1 содержит богатые пролином, глютаминовой кислотой, серином и треонином "PEST последовательности", которые способствуют деградации белка под действием калпаиновой протеазы (Wang et al., 2003). Следует также заметить, что фосфорилирование PEST 35 последовательности белка ABCA1 ведет к ускоренному протеолизу белка калпаином, в то время как внеклеточный апо AI, уменьшая фосфорилирование PEST последовательности, повышает продукцию ABCA1 (Martinez et al., 2003). Эти данные позволяют предположить, что существует положительная обратная связь между уровнем взаимодействия апо AI с ABCA1и стабильностью ABCA1 (Wang et al., 2003). Фосфорилирование Thr-1286 и Thr-1305 также увеличивает деградацию белка ABCA1 под действием калпаина (Martinez et al., 2003; Wang et al, 2003). Эти данные свидетельствуют, что уровень белка ABCA1, вероятно, определяется большим количеством факторов и требует дальнейшего изучения. 1.3 Роль колониестимулирующего фактора макрофагов М-CSF Характерным свойством атеросклеротической бляшки является дифференциация моноцитов в макрофаги, которые аккумулируют холестерин липопротеинов и образуют пенистые клетки с внутренней стороны артериальной стенки (Chen et al., 2010). Нагруженные холестерином макрофаги, образующиеся из моноцитов, являются основной составляющей раннего атеросклеротического поражения. Миграция моноцитов/макрофагов в интиму сосудов представляет собой ключевой момент в формировании атеросклеротического повреждения сосудов и этот процесс стимулируется атерогенными липопротеинами и воспалительными цитокинами (Lundberg, Hansson, 2010). Исследования с использованием меченых моноцитов показали, что их количество в стенке аорты положительно коррелирует с площадью атеросклеротического повреждения (Swirski et al., 2006). Процесс дифференциации моноцитов в макрофаги происходит при их взаимодействии с внеклеточным матриксом и цитокинами. Одним из цитокинов, стимулирующих превращение колониестимулирующий фактор моноцитов макрофагов в макрофаги, (М-CSF). M-CSF является усиливает экспрессию скавенджер-рецептора А, повышает продукцию цитокинов и 36 факторов роста макрофагами (Clinton et al., 1992). Экспрессия M-CSF повышена в атеросклеротических бляшках человека и животных (Clinton et al., 1992). У мышей, с гомозиготной или гетерозиготной мутацией, инактивирующей M-CSF (мутация op/op), наблюдается высокая устойчивость к развитию атеросклероза (Smith et al., 1995; Qiao et al., 1997; De Villiers et al., 1998). M-CSF играет важную роль в инициации воспалительного компонента атерогенеза и адгезии моноцитов к образованной атероматозной бляшке и может способствовать фиброзу и стабильности бляшки (Clinton et al., 1992). Также на модельных животных была показана обратная зависимость между площадью атеросклеротической бляшки и дозой гена M-CSF (Smith et al., 1995; Qiao et al., 1997; De Villiers et al., 1998). Все вышеуказанное дает основание предполагать, что M-CSF играет одну из ключевых ролей в формировании атеросклеротического повреждения сосудов путем влияния на дифференциацию моноцитов в макрофаги. 1.4 Матричная металлопротеиназа-9 Активация моноцитов в атеросклеротической бляшке сопровождается увеличением синтеза MMP и продукцией активных форм кислорода (Reactive oxygen species (ROS) (Soumyarani, Jayakumari, 2012). Анализ литературных источников последнего времени показывает значительное внимание исследователей к изучению роли MMP при развитии атеросклероза. MMP относятся к семейству внеклеточных цинк-зависимых эндопептидаз, которые обладают способностью расщеплять белки внеклеточного матрикса. MMP играют роль в ангиогенезе, процессах иммунного ответа, воспалительных процессах, апоптозе, пролиферации и миграции клеток, замедление роста опухолей (López-Otín et al., 2009; Amălinei et al., 2010; Cauwe , Opdenakker, 2010; Khokha et al., 2013; Mirsha et al., 2013). Функцией MMP также является активация и деактивация хемокинов и цитокинов. 37 На начальных этапах формирования атеросклеротической бляшки липопротеины, которые накапливаются в интиме, связываются с внеклеточным матриксом, окисляются вызывая местное воспаление. Под действием окисленных липопротеинов вырабатываются хемо- и цитокины, которые активируют миграцию лейкоцитов в интиму и секрецию макрофагами MMP. Было показано, что при воздействии на клетки окисленных ЛПВП также увеличивается продукция MMP (Soumyarani, Jayakumari, 2012). Повышенное содержание MMP приводит к разрушению коллагена интимы и внутренней базальной мембраны, что в свою очередь приводит к разрастанию атеросклеротической бляшки (Feig, Feig, 2012). Под действием оксидативного стресса или про-воспалительного стимула происходит активация моноцитов/макрофагов. Уровень MMP является маркером моноцит/макрофагального воспалительного ответа и активации (Feig, Feig, 2012). Известно, что макрофаги вносят вклад в формирование толщины фиброзного покрова атеросклеротической бляшки, которая характеризует ее стабильность (Feig, Feig, 2012). Было показано, что макрофаги синтезируют матриксные металлопротеиназы, которые относятся к семейству белков, осуществляющих деградацию различных типов внеклеточного матрикса и, таким образом, способствующих разрыву бляшки. Секреция макрофагами MMP-9 приводит к разрушению эластина внеклеточного матрикса, выполняющего функцию стабилизации атеросклеротической бляшки, и стимулирует ее отрыв (Feig, Feig, 2012). Более того, будучи однажды активированными, некоторые матричные металлопротеиназы способны активировать другие (Feig, Feig, 2012). Члены семейства металлопротеиназ и катепсинов обладают коллагенолитической и эластинолитической активностью, дестабилизирующей атеросклеротические бляшки (Gough et al., 2006). В районе атеросклеротического повреждения сосудов данные энзимы синтезируются макрофагами (Gough et al., 2006). Было показано наличие корреляции между присутствием макрофагов в местах разрыва атеросклеротической бляшки, толщиной фиброзного покрова и 38 локальным накоплением активированных матриксных металлопротеиназ (Galis et al., 1994). Кроме того, данные эпидемиологических и генетических исследований дают возможность предположить, что именно MMP-9 (или желатиназа B) является основным фактором, индуцирующим разрыв бляшки и его экспрессия коррелирует с нестабильностью атеросклеротического повреждения и клинической манифестацией атеросклероза (Gough et al., 2006). MMP-9 увеличивает подвижность атеромы, вероятность ее отрыва от сосудистой стенки и появление эмбола, способного вызвать закупорку сосуда (Gough et al., 2006). Показано, что уровень ММР-9 тем выше, чем больше объем атеросклеротического поражения коронарного русла (Gough et al., 2006). MMP-9 секретируется в виде зимогенов массой 92 кДа, которые в дальнейшем активируются различными протеиназами. MMP-9 принимает участие в процессах воспаления, ремоделирования ткани и репарации, мобилизации матрикссвязанных факторов роста и процессинга цитокинов. Субстратами для MMP-9 являются денатурированный коллаген I типа, нативные коллагены IV, V, VII, X типов, желатин, эластин, протеогликан-связанный белок, плазминоген, фибриноген и IL-1β. Было установлено, что MMP-9 расщепляет коллаген IV типа, находящийся в составе базальных мембран артерий (Ikeda et al., 2003). Повышение содержания MMP-9 было показано у пациентов с нестабильной стенокардией (Inokubo et al., 2001). MMP-9 секретируется воспалительными клетками в поврежденных артериях, таким образом, являясь маркером системного воспаления (Ferroni et al., 2003). О связи MMP-9 в плазме с воспалением свидетельствует найденная корреляция между концентрациями ММП-9 и C-реактивного белка (Blankenberg et al., 2003). 39 В проспективном исследовании AtheroGene было выявлено, что ММP-9 является независимым предиктором ССЗ и сердечно-сосудистой смертности у пациентов с ИБС (Blankenberg et al., 2003). Несмотря на вышеприведенные факты, роль экспрессии MMP-9 в макрофагах остаются не до конца выясненной. 1.5 Ядерные рецепторы Ядерные рецепторы играют ведущую роль в транскрипционной регуляции генов белков липидного обмена. Ядерные рецепторы представляют собой ДНКсвязывающие транскрипционные организацией. Их активность факторы с контролируется консервативной липофильными доменной лигандами, фосфорилированием и взаимодействиями с другими белками. Геном человека и мыши кодирует 48 и 49 различных ядерных рецепторов, соответственно. Ядерные рецепторы имеют общую доменную структуру, состоящую из N-концевого регуляторного домена (AF-1), ДНК-связывающего (DBD), лиганд связывающего (LBD) и С-концевого домена (AF-2). ДНК-связывающий домен, содержащий два цинк-связывающих мотива, является высоко консервативным и ответственным за ядерную локализацию рецептора, в то время как лиганд связывающие домены более разнообразны и содержат последовательности, специфичные для каждого типа рецептора. С-концевой домен опосредует перемещения ко-репрессоров и набор ко-активаторов (Abbott, 2009). 1.5.1 Семейство PPAR Среди ядерных рецепторов наиболее изученными являются рецепторы активаторов пролиферации пероксисом. Эти белки играют ключевую роль в регуляции липидного обмена и энергетического гомеостаза посредством активации экспрессии генов, контролирующих процессы внутриклеточного обмена, роста, дифференциации и апоптоза клеток животных и человека (Wahli, Michalik, 2012). PPAR образуют гетеродимеры с ретиноидным Х рецептором (RXR) и связываются со специфичными ДНК повторами из 6 нуклеотидов 40 AGGTCA разделенными 1 нуклеотидом (DR1 последовательности) (Berger, Moller, 2002). 1.5.1.1 Формы PPAR Среди PPAR рецепторов выделяют 3 подтипа: PPARα, PPARβ и PPARγ (Mangelsdorf et al., 1995). Необходимо отметить, что для данного семейства ядерных рецепторов показана высокая гомология среди представителей различных видов. Так, белок PPARα у крыс и мышей на 92% гомологичен PPARα рецептору человека, гомология PPARβ крыс и PPARβ мышей составляет 91% и 92%, соответственно, с аминокислотной последовательностью PPARβ человека, а PPARγ крыс и мышей на 98% идентичен рецептору человека (Borel et al., 2008). PPAR воздействует на регулирование таких процессов как клеточная пролиферация, дифференцировка и апоптоз (Feige et al., 2006). PPARα является активатором β-окисления жирных кислот в митохондриях и пероксисосмах и интенсивно экспрессируется в сердце, печени, почках, кишечнике, буром жире, т.е. в тканях с высокой скоростью β-окисления жирных кислот. Также PPARα. регулирует пролиферацию пероксисом, катаболизм липидов, воспалительные реакции, обмен арахидоновой кислоты. Экспрессия PPARα контролируется глюкокортикоидами и инсулином (Abbott, 2009). Также PPARα активируется жирными кислотами, эйкозаноидами, карбапростациклином, нестероидными противовоспалительными препаратами, лейкотриеном В4. Активация PPARβ влияет на пролиферацию клеток, миелинизацию, эмбриональную имплантацию, дифференциацию адипоцитов, катаболизм жирных кислот в скелетной мускулатуре, метаболизм глюкозы и процесс воспаления. PPARβ является регулятором окисления жирных кислот и экспрессируется более широко, включая мозг, почки, кишечник, клетки Сертоли (Abbott, 2009). PPARβ и PPARγ активируются общими для всех PPAR лигандами (докозагексеновой кислотой, некоторыми специфически простагландинами) активируется противодиабетических лекарств, (Abbott, 2009). тиазолидиндионами метаболитом PPARγ – также группой простагландинов – 41 простагландином J2 (PGJ2), полиненасыщенными жирными кислотами и нестероидными противовоспалительными препаратами (например, ибупрофеном). Кроме низкомолекулярных лигандов, регуляторами активности PPAR могут служить протеинкиназы МАРК (Yessoufou, Wahli, 2010). Изоформы PPARγ экспрессируются тканеспецифично: PPARγ1 экспрессируется повсеместно, включая сердце, мускулатуру, селезенку, PPARγ2 – предпочтительно в адипоцитах, PPARγ 3 – в макрофагах, толстом кишечнике, белой жировой ткани (Abbott, 2009). PPARγ регулирует хранение липидов, созревание макрофагов, имплантацию эмбриона, дифференциацию адипоцитов и контроль воспаления. 1.5.1.2 PPARγ Многочисленными исследованиями показано, что в атеросклеротическом поражении сосудов важнейшую роль играют три компонента: дисфункция эндотелия, нагруженные окисленными липопротеинами макрофаги, мигрирующие в очаг липидоза и воспаления стенки сосуда и гладкомышечные клетки медии (Rader, Pure, 2005; Badimon et al., 2009; Lundberg, Hansson, 2010). Таким образом, эндотелиоцитах, транскрипционный в гладкомышечных фактор клетках PPARγ, сосудов, выявляемый а также в в моноцитах/макрофагах, можно рассматривать как ключевого участника на всех этапах атеросклеротического процесса. (Hsueh, Bruemmer, 2004). Атеропротективная роль PPARγ была установлена многочисленными исследованиями как на PPARγ дефицитных животных, так и с использованием PPARγ агонистов (15-деокси-дельта-12,14-простагландин J2 и тиазолидиндион) (Babaev et al., 2005; Chawla et al., 2001). Лиганды PPARγ уменьшали атеросклеротическое поражение и гиперплазию интимы у мышей (Nagy et al., 2013). Показано, что агонист PPARγ телмисартан усиливал экспрессию CD36 у апо Е -/- мышей, что сопровождалось уменьшением захвата окисленных липопротеинов макрофагами и торможением развития атеросклероза. Активация 42 глитазонами PPARγ подавляла продукцию моноцитами/макрофагами воспалительных цитокинов, фактора некроза опухоли α (ФНО-α), интерлейкина (ИЛ) 1β, индуцибельной NO синтазы (iNOS) и желатиназы В (Nagy et al., 2013). Было показано, что PPARγ ингибирует образование макрофагами пенистых клеток, а агонисты противовоспалительное PPARγ и (росиглитазон антиатерогенное и действие GW7845) (Li et оказывают al., 2004). Трансплантация PPARγ-дефицитного костного мозга мышам с отсутствием рецептора ЛПНП -/- приводит к продукции PPARγ-дефицитных макрофагов и усилению атеросклероза (Chawla et al., 2001). Эти эксперименты подчеркивают атеропротективную роль PPARγ в макрофагах. 1.5.1.3 Роль PPARγ в макрофагах Было показано, что PPARγ экспрессируется в макрофагах и в пенистых клетках в местах атеросклеротических поражений (Ricote et al.,1998; Tontonoz et al., 1998). При этом его экспрессия может критически влиять на активацию макрофагов, продукцию цитокинов и их преобразования в пенистые клетки. Несколько исследований показали, что агонисты PPARγ могут тормозить развитие атеросклероза в линиях мышей с дефицитом рецептора ЛПНП -/- (Li et al., 2000) и апо E -/- (Chen et al., 2001), моделирующих развитие атеросклероза. Эти данные объясняют эксперименты, в которых мыши, которым был трансплантирован костный мозга от PPARγ -/- мышей демонстрировали значительное усиление атеросклероза (Chawla et al., 2001). Было высказано предположение, что антиатерогенные эффекты PPARγ в макрофагах обусловлены его влиянием на экспрессию генов, ответственных за транспорт холестерина. Таким образом, PPARγ осуществляет контроль баланса между поглощением и оттоком липидов из клетки (Chawla et al., 2001). Однако другие исследования не подтвердили роль лигандов PPARγ в транспорте холестерина макрофагами (Babaev et al., 2005). 43 PPARγ также может оказывать противовоспалительное влияние в макрофагах как непосредственно, так и через LXRα, активирующий протеин-1 (АР-1), ядерный фактор «каппа-би» (NF-κB) и белок сигнальной трансдукции и активации транскрипции (STAT) (Babaev et al., 2005). В исследовании, выполненном на мышах с нокаутом гена PPARγ в макрофагах (Mac PPARγ KO) было показано, что уровни липидов в плазме и липидный профиль не отличались между контрольной группой и мышами Mac PPARγ KO (Babaev et al., 2005). В то же время, у мышей Mac PPARγ.KO была отмечена более высокая степень атеросклеротических повреждений сосудов по сравнению с контрольной группой. Также в данной работе было показано, что Mac PPARγ KO макрофаги имеют пониженное поглощение окисленных ЛП НП (Babaev et al., 2005). Таким образом, экспрессия PPARγ в макрофагах в артериальных стенках играет защитную антиатерогенную роль. И уровень PPARγ может рассматриваться как один из факторов, влияющих на развитие атероматозной бляшки. 1.5.2 Семейство LXR Печеночные X рецепторы относятся к суперсемейству ядерных рецепторов и являются транскрипционными факторами, регулирующими экспрессию генов, вовлеченных в процессы биосинтеза и транспорта холестерина. Активация LXR приводит к образованию гетеродимеров LXR с ретиноидными Х-рецепторами (RXR), которые транслоцируются в ядро и связываются с консервативными прямыми повторами AGGTCA, разделенными 4 нуклеотидами (DR4) в промоторной области генов-мишеней (Costet et al., 2000; Repa et al., 2000). 1.5.2.1 Формы LXR LXR подразделяются на два субсемейства LXRα (ген NR1H3) и LXRβ (ген NR1H2), локализованные на хромосомах человека в позициях 11p11.2 и 19q13.3, 44 соответственно. LXRβ экспрессируется во всех тканях, в то время как LXRα экспрессируется преимущественно в печени, в жировой ткани, в кишечнике, почках, а также в макрофагах. LXRα и LXRβ идентичны более чем на 75% и оба требуют гетеродимеризации с RXR для взаимодействия с их генами-мишенями, включая гены ABCA1, ABCG1, апо Е и ген белка переноса холестеринового эфира (CETP) (Bensinger, Tontonoz, 2008; Chinetti-Gbaguidi, Staels, 2009; Oosterveer et al., 2010). Хотя функциональное дублирование между LXRα и LXRβ нашло свое подтверждение в многочисленных исследованиях (Bensinger, Tontonoz, 2008; Chinetti-Gbaguidi, Staels, 2009; Oosterveer et al., 2010), в последнее время появились работы о возможных отличиях между ними. Так, активация LXRβ агонистом Glaxo GW3965 у мышей с отсутствием LXRα и апо Е хотя и приводит к регрессии атеросклеротической бляшки и накоплению клеточного холестерина, но не сопровождается повышением уровня триглицеридов в плазме крови как это можно было бы ожидать при функциональном дублировании LXRα. (Bradley et al., 2007). Кроме того, обработка Tularik TO901317 мышей с нокаутом LXRα -/- не была ассоциирована со значительным изменением в уровне триглицеридов в плазме крови (Quinet et al., 2004). 1.5.2.2 Регуляция экспрессии LXR Селективными активаторами LXR служат моноокисленные производные холестерина – оксистеролы: 22(R)-гидроксихолестерол, 24(S)-гидроксихолестерол и 24(S),25-эпоксихолестерол. Эти оксистеролы, которые являются промежуточными продуктами в синтезе стероидов и желчных кислот (Bensinger, Tontonoz, 2008; Chinetti-Gbaguidi, Staels, 2009; Oosterveer et al., 2010). Также активаторами LXR рецепторов являются метаболиты холестерина и синтетические лиганды, такие как Tularik TO901317 (Repa et al., 2000) и Glaxo GW3965 (Laffitte et al., 2001). 45 Активаторы LXR увеличивают ОТХ из макрофагов за счет усиления экспрессии апо Е и транспортеров ABCA1 и ABCG1 в макрофагах, что является ключевым моментом механизма LXR-зависимой защиты от атеросклероза (Tangirala et al., 2002). Исследования, выполненные на мышах, подтверждают, что агонист LXR Glaxo GW3965 значительно повышает уровень ОТХ (Naik et al., 2006). Другой агонист LXR, Tularik TO901317, как было выявлено, существенно снижает размер атеросклеротической бляшки в линии мышей ЛПНП -/-, являющихся моделью атеросклероза, и этот процесс является LXR зависимым (Michael et al., 2012). Кроме того, Tularik TO901317 ингибирует инициацию и развитие атеросклеротической бляшки и активирует регрессию уже существующей атеросклеротической бляшки у мышей апо Е*3-Лейден при высоко холестериновой диете (Michael et al., 2012). 1.5.2.3 Роль LXR в макрофагах Как было уже отмечено выше, макрофаги играют ключевую роль в метаболизме липидов и в обменных процессах при атеросклерозе (Rader, Pure, 2005). LXR являются регуляторами гомеостаза холестерина макрофагов, ОТХ и абсорбции холестерина в кишечнике (Bensinger, Tontonoz, 2008; Chinetti-Gbaguidi, Staels, 2009; Oosterveer et al., 2010). Избыточное накопление холестерина в макрофагах в местах атеросклеротических поражений преобразует их в пенистые клетки, являющиеся непосредственными предшественниками атеросклеротических повреждений. Стимулируя ОТХ, LXR может снижать образование пенистых клеток и уменьшать содержание холестерина в макрофагах (Valledor, Ricote, 2004). Недавние исследования показали, что PPARγ повышает уровень экспрессии LXR, что, в свою очередь, приводит к повышенному уровню ABCA1 в макрофагах (Chawla et al., 2001). При развитии атеросклероза основная роль LXR заключается в контроле образования макрофагами пенистых клеток, обусловленном захватом 46 макрофагами ЛПНП в субэндотелиальном слое артерии через скавенджеррецепторы (McLaren et al., 2011). Кроме того, в исследованиях in vitro также было отмечено, что активации LXR в первичных макрофагах человека индуцирует поглощение эфиров холестерина из ЛПВП (Michael et al., 2012). 1.5.2.4 Антиатерогенные и противоспалительные эффекты LXR Множество исследований in vivo подтверждают антиатерогенных роль LXR. При двойном нокауте LXR-α/-β у мышей происходит увеличение накопления пенистых клеток в аорте после 18 месяцев нормальной диеты (Schuster et al., 2002). В макрофагах с двойным нокаутом LXR-α/- β показано повышенное накопление холестерина (Tangirala et al., 2002). Кроме того, трансплантация костного мозга LXR- / - мышей для генерации макрофагов с отсутствием LXR приводит в результате сильному увеличению размеров атеросклеротических поражений и накоплению липидов (Tangirala et al., 2002). Было показано, что у мышей с гиперэкспрессией LXRα в макрофагах наблюдается сокращение на 83% размеров атеросклеротических поражений и увеличивается экспрессия ABCA1 и ABCG1 (Teupser et al., 2008). Увеличение экспрессии LXR в макрофагах уменьшало размер атеросклеротического повреждения на 30% и повышало экспрессию макрофагами апо Е и ABCA1. Одновременно с этим было отмечено снижение уровня триглицеридов на 50% при гиперэкспрессии LXR в макрофагах у ЛПНП -/- мышей, которые являются моделью атеросклероза (Li et al., 2011). Кроме того, индуцированная гиперэкспрессия LXRα в макрофагах у ЛПНП -/- мышей приводит к уменьшению атеросклеротических бляшек и значительному увеличению оттока холестерина из клеток (Teupser et al., 2008). В работе Lo Sasso и соавт. было продемонстрировано, что у ЛПНП -/- мышей индукция LXRα в кишечнике приводит к сокращению кишечной абсорбции холестерина, усилению ОТХ и, в результате, к замедлению развития атеросклероза (Lo Sasso et al., 2010). 47 LXR могут играть ключевую роль в ответах на воспаление. Активация LXR ослабляет воспаление и экспрессию воспалительных генов во многих клеточных типах – макрофагах, CD-позитивных лимфоцитах, микроглии, астроцитах (Michael et al., 2012). Было показано, что LXR ингибируют продуцирование TNFα и IL-1βи экспрессию таких воспалительных медиаторов как СОХ2, iNOS, IL-6 (Steffensen et al., 2004). Таким образом, многочисленными исследованиями показано, что уровень экспрессии LXRα и LXRβ может учитываться в качестве фактора, влияющего на развитие атеросклероза. Развитие атеросклеротических поражений включает в себя сложное взаимодействие между различными про- и анти-атерогенных процессами. В последнее время, с появлением трансгенных моделей атеросклероза стали активно изучаться механизмы влияния уровня экспрессии генов на развитие атеросклеротических поражений и основанное на этом прогрессирование заболеваний сосудистой системы. Из совокупности вышеприведенных данных можно сделать вывод, что определение уровня мРНК генов PPARγ, LXRα, LXRβ, MMP-9 и ABCА1 и уровня белка ABCА1 в макрофагах могут вносить вклад в понимание наследственной предрасположенности к атеросклерозу. Именно этой проблеме посвящено настоящее исследование. 48 Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 2.1 Характеристика обследованных групп. В соответствии с поставленными задачами были выбраны следующие группы: пациенты с атеросклерозом, подтвержденным на основании ангиографического исследования и соответствующие контрольная группа. Группа пациентов с атеросклерозом и контрольная группа являлись представителями европеоидной расы, жителями Северо-Западного региона Российской Федерации и не были связаны узами родства. Проведение настоящей работы было одобрено этическим комитетом Первого Санкт-Петербургского государственного медицинского университета имени академика И.П. Павлова. Для оценки вклада вариантов гена АВСА1 в развитие атеросклероза была отобрана группа пациентов, которая состояла из 119 человек (79.0% мужчин и 21.0% женщин) с атеросклерозом, подтвержденным ангиографическим исследованием (средний возраст – 51.41±6.21 года). Первые клинические проявления атеросклероза у пациентов наблюдались в возрасте 47.87±7.05 лет. Обследование и ангиографическую диагностику артериального стеноза, отражающего атеросклеротические изменения в сосудах, проводили в Первом Санкт-Петербургском государственном медицинском университете имени академика И.П. Павлова. Локализация пораженных атеросклерозом артерий была как минимум в одной артерии одного из трех артериальных бассейнов (церебральный, коронарный или бассейн артерий нижних конечностей). Группа больных была гетерогенной по степени локального (% окклюзии артерии атерогенной бляшкой) и диффузного (общее количество артерий, пораженных атеросклерозом) атеросклероза. Пациенты, вошедшие в выборку, не принимали ни статинов, ни каких-либо иных гиполипидемических средств. Контрольную группу состояла из 300 человек (63% мужчин и 37% женщин) без ССЗ в анамнезе и соответствовала группе пациентов по полу и возрасту (средний возраст 45.60±6.30 года). Возраст контрольной группы 49 соответствовал возрасту начала заболевания у пациентов. Данная выборка является случайной и принадлежит к тому же географическому региону, что и включенная в анализ группа лиц больных атеросклерозом. Все лица, вошедшие в контрольную группу, проходили обследование врача кардиолога и проведенные обследования данных лиц включали электрокардиографию, велоэргометрию и ЭХО кардиографию. Все пациенты и лица, вошедшие в контрольную группу, являлись жителями Санкт-Петербурга и не были связаны узами родства. Для оценки вклада уровня мРНК генов PPARγ, LXRα, LXRβ, MMP-9 и ABCА1 и уровня белка ABCА1 в развитие атеросклероза была отобрана группа пациентов, которая состояла из 15 мужчин с атеросклерозом, подтвержденным ангиографическим исследованием (средний возраст – 53.87±6.78 года). Первые клинические проявления атеросклероза у пациентов наблюдались в возрасте 47.73±4.33 лет. Обследование и ангиографическую диагностику артериального стеноза, отражающего атеросклеротические изменения в сосудах, проводили в Первом Санкт-Петербургском государственном медицинском университете имени академика И.П. Павлова. Пораженные атеросклерозом артерии располагались в коронарном бассейне. На рисунках 5 и 6 представлены ангиограммы двух пациентов с различной степенью стеноза коронарных артерий. Однако у всех больных, в как минимум, в одной артерии коронарного бассейна выявлен стеноз более 50%. Пациенты, вошедшие в выборку, не принимали ни статинов, ни каких-либо иных гиполипидемических средств. Контрольная группа состояла из 11 человек без ССЗ в анамнезе и соответствовала группе пациентов по полу и возрасту (средний возраст – 52.05±6.05лет). Возраст контрольной группы соответствовал возрасту начала заболевания у пациентов. Все члены контрольной группы проходили обследование врача кардиолога. Данная выборка является случайной и принадлежит к тому же географическому региону, что и включенная в анализ группа лиц больных атеросклерозом. 50 Рисунок 5. Ангиограмма пациента. Показан 99% стеноз ствола левой коронарной артерии. Рисунок 6. Ангиограмма пациента. Показаны: 1- стеноз 50% и 3 – стеноз 99% передней межжелудочковой артерии; 2 – стеноз 75% огибающей ветви левой коронарной артерии. 51 У всех пациентов и представителей контрольной группы измеряли энзиматическим методом с использованием наборов ByoSystems (Испания) концентрацию общего холестерина (ОХ) и Х-ЛПВП в плазме крови. Уровень ОХ сыворотки крови и Х-ЛПВП выражали в ммоль/л. 2.2 Выделение ДНК из периферической крови человека Выделение ДНК проводили из венозной крови, забранной из локтевой вены в объеме 5 мл в стерильные пластиковые пробирки, содержащие 50 мкл 0.5М ЭДТА рН=8.0 как антикоагулянта. Собранная данным образом кровь подвергалась замораживанию и хранилась при температуре -20°С. ДНК выделяли из лейкоцитов крови стандартным фенол-хлороформным методом (Маниатис и соавт., 1984). Лизис клеточных элементов крови проводили по методу Канкеля (Lahiri et al., 1992): к 500 мл крови добавляли 500 мкл раствора для лизиса эритроцитов (29 мМ Tris-HCl pH 7.4, 10 мМ NaCl, 3 мМ MgCl2, 5% сахароза, 1% тритон Х100), инкубировали в течение 5 мин., осторожно перемешивая, и затем центрифугировали 10 минут при +9°С, 4000 оборотов в минуту. Супернатант сливали и осадок лейкоцитов ресуспендировали в растворе для лизиса клеточных мембран (29 мМ Tris-HCl pH 7.4, 10 мМ NaCl, 1 мМ MgCl2, 0.25 М сахароза). Смесь центрифугировали при тех же условиях, супернатант сливали. К осадку добавляли 300 мкл раствора для протеиназы К (0.01 М Tris-HCl, 0.01 М NaCl, 0.01 М ЭДТА pH 8.0), 30 мкл 30% додецилсульфата натрия и протеиназу К до ее конечной концентрации 100 мкг/мл. Смесь инкубировали в течение 2-3 часов при +50°С для протеолиза. Получившийся в результате гомогенный раствор последовательно обрабатывали 300 мкл фенола, 300 мкл смеси фенола с хлороформом в соотношении 1:1, 300 мкл хлороформа. После каждой экстракции в течение 10 мин при аккуратном перемешивании смесь центрифугировали 10 мин. при +20°С 4000 об/мин и отбирали водную фазу. По окончании экстракции к водной фазе добавляли 1/10 объема 3М ацетата натрия и 2 объема 96% этанола. Осадок ДНК центрифугировали при +9°С, 10000 оборотов в минуту, в течение 10 минут. Затем осадок дважды промывали 70% этанолом при тех же условиях 52 центрифугирования, высушивали на воздухе, при комнатной температуре, в течение 12 часов, и растворяли в 100 мкл стерильной дистиллированной воды. Выход ДНК в результате такой очистки составлял 40-50 мкг ДНК из 500 мкл цельной крови. 2.3 Полимеразная цепная реакция и рестрикционный анализ Для типирования исследуемых вариантов гена АВСА1 использовали амплификацию соответствующих участков ДНК методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с последующим рестрикционным анализом амплифицированных фрагментов. Продукты ПЦР и рестрикционного анализа подвергали электрофоретическому разделению при силе тока 30мА и напряжении 150В в полиакриламидном геле (ПААГ) соответствующей концентрации в трис-боратном буфере (0.9M Tris-OH, 0.9M борной кислоты, 20мM ЭДТА). Продолжительность электрофореза определяли по движению в ПААГ красителей ксилен-цианола и бромфенолового синего, входящих в состав буфера для нанесения проб (водный раствор 0.25% ксилен-цианола, 0.25% бромфенолового синего, 30% глицерина), результаты визуализировали в ультрафиолете после окрашивания бромистым этидием (Маниатис и соавт., 1984).Использовали аппарат для вертикального электрофореза VE-4 фирмы "Helicon" (Россия). Последовательности использованных праймеров и зондов (Бигль, СанктПетербург), представлены в Таблице 1 53 Таблица 1 R219K FOR 5`- TGACAAGTCTGTGCAATGGA -3` REV 5`- GGCTTAAACTCAGCCACACC -3` FOR 5`- G(-17)>C CTGCTGAGTGACTGAACTACATAAACAGAGGCCGGGTA -3` REV 5`- CCACTCACTCTCGTCCGCAATTAC -3` FOR 5`319ins<G CCCCTCCTGCTTTATCTTTCAGTTAATGACCAGCCCCG -3` REV 5`- ATCCCCAACTCAAAACCACA -3` 2.3.1 Идентификация варианта R219K гена ABCA1 ПЦР проводили в 15 мкл амплификационной смеси, содержащей 67 мМ Tris-HCl, pH 8.8; 16,6 мМ (NH4)2SO4; 1,5 мМ MgCl2; 0.2 мМ каждого из четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов (дАТФ, дГТФ, дЦТФ, дТТФ); 1,5 мкМ каждого праймера и 1 единицу активности Taq-полимеразы 1мкг геномной ДНК. Сверху наносили 20 мкл вазелинового масла для предотвращения испарения раствора. После первоначальной денатурации при 95оС в течение 5 мин. 35 циклов амплификации проводили в следующем температурно-временном режиме: плавление 92оС – 1мин., отжиг 52оС – 1мин., синтез 72оС – 1мин. После завершения 35 циклов амплификации проводили заключительный синтез при 72оС в течение 7 мин. В результате амплификации получали ПЦР продукт размером 177 п.н.. Затем ПЦР продукт обрабатывали 1 единицей активности рестриктазы Hag I (Fermentas, Литва) (1ед.) в буфере R (Fermentas, Литва). Состав буфера: 10 mM Tris-HCl (pH 8.5 при 37°C); 10 mM MgCl2; 100 mM KCl; 0,1 mg/ml BSA при 37°С в течение ночи. Фрагменты ДНК подвергали электрофоретическому разделению в 8% ПААГ с последующей окраской бромистым этидием и визуализацией в ультрафиолете (Рисунок 7). 54 Hag I K 219 107 п.н. R 219 70 п.н. 177 п.н. 1 2 7а 7б Рисунок 7. Идентификация варианта R219K гена ABCA1c помощью ПЦР и рестрикционного анализа. а. Фрагменты, образующиеся при инкубации продукта ПЦР с рестриктазой Hag I: 1 – K219 ABCA1; 2 – R219 ABCA1 б. Электрофоретическая картина продуктов рестрикционного анализа: 1 – ПЦР продукт, 2 – маркер молекулярного веса pВR322/BsuRI, 3 – гомозигота RR219, 4 – гетерозигота RK219, 5 – гомозигота KK219 2.3.2 Идентификация варианта G(-17)>C гена АВСА1 Условия проведения ПЦР описаны выше. Температура отжига праймеров – 60 °С. В результате амплификации получался фрагмент размером 161 п.н.. ПЦР продукт обрабатывали 1 единицей активности рестриктазы (Fermentas, Литва) в буфере R (Fermentas, Литва). Состав буфера: 10 mM Tris-HCl (pH 8.5 при 37°C); 10 55 mM MgCl2; 100 mM KCl; 0,1 mg/ml BSA при 37°С в течение ночи. Фрагменты ДНК подвергали электрофоретическому разделению в 6% ПААГ с последующей окраской бромистым этидием и визуализацией в ультрафиолете (Рисунок 8). Rsa I G (-17) C (-17) 124 п.н. 37 п.н. 161 п.н. 1 2 9а 9б Рисунок 8. Идентификация варианта G(-17)>C гена АВСА1 c помощью ПЦР и рестрикционного анализа. а. Фрагменты, образующиеся при инкубации продукта ПЦР с рестриктазой Rsa I: 1 – G(-17) ABCA1; 2 – C(-17) ABCA1 б. Электрофоретическая картина продуктов рестрикционного анализа: 1 – ПЦР продукт, 2 – маркер молекулярного веса pВR322/BsuRI, 3 – гомозигота, CС(-17), 4 – гетерозигота CG(-17), 5 – гомозигота GG(-17) 2.3.3 Идентификация варианта 319ins<G гена ABCA1 Условия проведения ПЦР описаны выше. Температура отжига праймеров – 55°С. 56 В результате амплификации получался фрагмент размером 246 п.н.. ПЦР продукт обрабатывали 1 единицей активности рестриктазы Sma I (Fermentas, Литва), в буфере Tango (Fermentas, Литва). Состав буфера: 33 mM Tris-ацетат (pH 7.9 при 37°C); 10 mM магний-ацетат; 66 mM калий-ацетат; 1 mg/ml BSA, при 25°С в течение ночи. Фрагменты ДНК подвергали электрофоретическому разделению в 6% ПААГ с последующей окраской бромистым этидием и визуализацией в ультрафиолете (Рисунок 9). N319 insG319 210п.н. 37Iп.н. 1 Hag 246 п.н. 2 8a 8б Рисунок 9. Идентификация варианта 319ins<G гена ABCA1 c помощью ПЦР и рестрикционного анализа. а. Фрагменты, образующиеся при инкубации продукта ПЦР с рестриктазой Sma I: 1 – N319 ABCA1; 2 – insG319 ABCA1 б. Электрофоретическая картина продуктов рестрикционного анализа: 1 – ПЦР продукт, 2 – маркер молекулярного веса pВR322/BsuRI, 3 – гомозигота NN319, 4 – гетерозигота NG319, 5 – гомозигота GG319 57 2.3 Выделение фракции моноцитов периферической крови. Для создания банка M-CSF макрофагов был осуществлен забор крови в обследованных группах. Из локтевой вены утром натощак брали 40 мл крови в стерильную пластиковую пробирку объемом 50 мл, содержащую 3 мл стерильного 3,8% цитрата натрия в 0,15 М изотоническом фосфатном буфере (рН=7,35). Для получения макрофагов свежесобранную кровь смешивали в равном соотношении с фосфатно-солевым буферным раствором (PBS). В стерильную пластиковую пробирку вносили фиколл (р=1.077, БиоЛот, СанктПетербург) из расчета 0,5 мл на 1 мл полученной суспензии крови. Смесь наслаивали на фиколл, центрифугировали (1500 об/мин, 30 мин). В стерильных условиях пипеткой с границы раздела плотности отбирали фракцию мононуклеаров. Мононуклеары промывали в PBS, центрифугировали (1500 об/мин, 15 мин.). Клетки инкубировали в СО2-инкубаторе (5% СО2 и 95% атмосферного воздуха) при 100% влажностив и 37ºС течение 2 ч. После чего следовала трехкратная промывка в PBS и прикрепившиеся к чашкам Петри моноциты культивировали в культуральной среде альфаMEM, содержащей 10 % сыворотку крови плодов коровы, 5 мкг/мл антибиотиков (пенициллин G и стрептомицин) в присутствие 15 нг/мл колониестимулирующего фактора макрофагов M-CSF (R&D Systems, США) в СО2-инкубаторе (5% СО2 и 95% атмосферного воздуха) при 100% влажностив и 37ºС в течение 5 суток с ежедневной заменой инкубационной среды. Клетки отмывали в PBS, центрифугировали, хранили при температуре –86 ºС. 2.4 Оценка уровня мРНК генов ABCA1, LXRα, LXRß, PPARγ и MMP-9. Для выделения тотальной мРНК и проведения реакции обратной транскрипции использовали наборы RNeasy Minikit (Qiagen, Германия) и cDNA synthesis kit (Fermentas, Литва). Чистоту РНК оценивали по отношению поглощения при длинах волн 260 и 280 нм (критерий чистоты 1.8). 58 Уровень мРНК генов ABCA1, LXRα, LXRß, PPARγ и MMP-9 определяли методом количественной ПЦР в режиме реального времени с флуоресцентными зондами TaqMan на приборе CFX96 Touch (BioRad, США). В качестве референсного гена был использован конститутивно экспрессирующийся в клетках ген β-актина (ACTB). Последовательности праймеров и зондов, использованные в данной работе (Бигль, Санкт-Петербург), представлены в Таблице 2. 59 Таблица 2 Нуклеотидные последовательности праймеров и проб ABCA1 MMP-9 Последовательно сть праймеров LXRα LXRβ PPARγ ACTB FOR 5`-GGGAGGCTCCCGGAGTT-3` REV 5`-GTATAAAAGAAGCCTCCGAGCATC-3` FOR 5`-CCTGGAGACCTGAGAACCAAT-3` REV 5`-GCCACCCGAGTGTAACCATAG -3` FOR 5`-CTTGCTCATTGCTATCAGCATCTT-3` REV 5`-ACATATGTGTGCTGCAGCCTCT-3` FOR 5`-CTTCGCTAAGCAAGTGCCTG-3` REV 5`-GCAGCATGATCTCGATAGTGG-3` FOR 5` - GATGTCTCATAATGCCATCAGGTT -3` REV 5`- GGATTCAGCTGGTCGATATCACT -3` FOR 5`- CGTGCTGCTGACCGAGG-3` REV 5`-ACAGCCTGGATAGCAACGTACA-3` 5`-FAM- ABCA1 AACTTTAACAAATCCATTGTGGCTCGCCTGTRTQ1-3` 5`-FAMПоследовательно сть MMP-9 ACAGGCAGCTGGCAGAGGAATACCTGTACRTQ1-3 проб, меченных LXRα флуоресцентной меткой LXRβ PPARγ ACTB 5` -FAM-TCTGCAGACCGGCCCAACGTG -RTQ13` 5` -FAM- CGGGAGGACCAGATCGCCCT-RTQ13` 5` -FAM- CAGGCCGAGAAGGAGAAGCTGTTGGRTQ1-3` 5`-R6G-CCAACCGCGAGAAGATGACCCAGATBHQ1-3` 60 Зонды отжигались на кДНК в местах экзон-экзонных стыков с целью исключения амплификации геномной ДНК. Амплификацию проводили в 25 мкл реакционной смеси, содержащей 16,6 мМ (NH4)2SO4, 20 мМ Tris-HCl pH 8.8, 0.1% тритон X-100, 2.5мМ MgCl2, 0.25 мкМ каждого праймера, 0.7 мкМ каждого зонда TaqMan, 200 мкМ dNTP, 5 единиц активности Taq ДНК полимеразы фирмы «Fermentas» (Литва). После денатурации при 95ºС в течение 10 мин проводили 45 циклов амплификации в следующем температурно-временном режиме: плавление – 95 ºС 30 с, отжиг-синтез – 60ºС 30 с. В результате проведения ПЦР с использованием зонда на кДНК исследуемого гена и соответствующего референсного гена ACTB получали кинетические кривые, отображающие накопление ПЦР-продукта (Рисунок 10). Измерения для каждой пробы проводили в трех экземплярах. Относительное содержание мРНК генов ABCA, LXRα, LXRß, PPARγ и MMP-9 рассчитывали методом стандартных кривых. Стандартная кривая строилась в каждом эксперименте как для исследуемого гена, так и референсного гена ACTB (Рисунок 11). Количество мРНК ABCA, LXRα, LXRß, PPARγ и MMP-9 нормировали по отношению к мРНК эндогенного гена ACTB, т.е. делили количество мРНК исследуемых генов, рассчитанное с использованием CFX96 (BioRad, США), на количество мРНК ACTB. Относительное содержание мРНК исследуемых генов рассчитывали методом стандартных кривых согласно методическим указаниям фирмыизготовителя. 61 Рисунок 10. Кинетические кривые, отображающие накопление ПЦРпродукта. Рисунок 11. Стандартные кривые. 62 2.5 Измерение уровня белка ABCA1. Относительный уровень белка ABCA1 в макрофагах определяли методом вестерн-блоттинга. Для выделения мембранной фракции макрофаги лизировали в растворе следующего состава: 150 мМ NaCl, 1 % Triton X-100, 50 мМ Tris, pH 8, 0,5% дезоксихолат натрия, 0,1% SDS, включающем коктейль из ингибиторов протеаз (Roche, США). Количество общего белка определяли по методу Бредфорд с использованием реагентов фирмы «Силекс» (Россия) на спекртрофотометре SmartSpecTMPlus (BioRad, США). Равные количества белка макрофагальных лизатов смешивали с 4х буфером Лаемли (200мМ Tris-HCl pH 6,8, 400 мМ βмеркаптоэтанол, 4 % додецилсульфат, 0,01 % бромфенол, 40 % гицерол (Laemmli et al., 1970) в соотношении 2 объёма белка/1 объем буфера, после чего кипятили в течение 5 мин. при температуре 1000С. После кипячения пробы (5мкг на лунку), а также маркер молекулярного веса (Thermo Fisher Scientific, США), наносились на полиакриламидный гель (SDS-PAGE) с последующим проведением электрофореза в 1Х трисглициновом буфере (5Х стоковый раствор содержит: 25мM Tris-HCl pH 8,8, 250 мM глицина (pH 8,3), 0,1 % додецилсульфата). После этого с использованием прибора для полусухого переноса Semi-dry (Хеликон, Москва) проводился перенос белка с полиакриламидного геля на PVDF мембрану (Millipore, Massachusetts, США) с использованием буфера для переноса (39 mM глицина, 48 мМ Tris-HCl pH 8,8, 0,037 % додецилсульфата, 20 % метанола). Далее согласно молекулярному весу белка ABCA1 и β-актина мембрану разрезали и полученные фрагменты однократно промывали в растворе PBS, после чего производили их «забивку» 5% разведённым в растворе PBS обезжиренным сухим молоком в течение 1 часа при комнатной температуре. После «забивки» фрагмент PVDF мембраны, содержащий ABCA1, инкубировали с первичными кроличьими поликлональными антителами к ABCA1 (1:1000; ab7360, Abcam, Великобритания), а фрагмент PVDF мембраны, содержащий β-актин, с антителами к ß-актину (1:10000; ab8227, Abcam, Великобритания) в течение ночи при +4 0С. После этого трижды промывали в холодном растворе PBS фрагменты мембраны и инкубировали их в течение 1 часа при комнатной температуре со 63 вторичными антикроличьими антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена (1:3000; ab6721, Abcam, Великобритания). Затем снова трижды промывали холодным PBS. Далее связанные с соответствующим белком на обоих фрагментах мембраны вторичные антитела идентифицировали с использованием набора Amersham ECL Plus System (Amersham Biosciences, Великобритания) с использованием фотоплёнки KODAK BioMax. Данные вестерн-блоттинга анализировали с помощью программы ImageJ (Версия 1.38a для Windows, http://rsb.info.nih.gov/ij/). Содержание ABCA1 нормировали к содержанию ß-актина. 2.6 Статистическая обработка данных. Статистический анализ данных был проведен с использованием пакета программ Statistica 6.0. Для качественных данных определяли частоты встречаемости в %. Проверку соответствия полученного распределения генотипов равновесию Харди-Вайнберга осуществляли при помощи непараметрического критерия χ2. Соответствие полученных данных нормальному распределению проверялось с помощью критериев Шапиро-Уилка или Колмогорова-Смирнова в зависимости от размера выборки. Для сравнения количественных данных использовали метод дисперсионного анализа ANOVA для нескольких групп и непараметрический метод U-теста Манна-Уитни. Значения p<0.05 считались статистически значимыми. Для определения относительного риска использовали показатель соотношения шансов (odds ratio, OR), рассчитываемый по формуле OR=a/bxd/c, где a – количество пациентов, имеющих более редкую аллель, b – количество пациентов, не имеющих более редкую аллель, c – количество индивидуумов из контрольной группы, имеющих более редкую аллель, d – количество индивидуумов из контрольной группы, не имеющих более редкую аллель. Для определения корреляции между количественными характеристиками пользовались корреляционным анализом по Спирмену. Коэффициент корреляции r>0.5 при р<0.05 означал положительную и статистически значимую корреляцию 64 между признаками, а отрицательное значение r соответствовало обратной корреляции. Средние величины в тексте диссертации и в таблицах приведены в виде среднего значения ± стандартное отклонение. В случае достоверных различий дополнительно приведены значения медианы (минимум – максимум). 65 Глава 3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Общая характеристика группы больных с атеросклерозом, подтвержденным ангиографическим методом, и контрольной группы, приведена в таблице 3. Таблица 3 Характеристика группы пациентов с атеросклерозом, подтвержденным методом ангиографии, и контрольной группы Параметр Возраст (лет) Возраст первых клинических Группа пациентов с Контрольная атеросклерозом группа (N=119) (N=300) 51.41±6.21 45.60±6.30 47.87±7.05 манифестаций (лет) Пол (%мужчин/%женщин) 79/21 63/37 Курение (%) 57.14* 43.53 ОХС, ммоль/л 5.82±0.53 5.44±0.39 Х-ЛПВП, ммоль/л 0.93±0.11* 1.17±0.09 Сокращения: ОХС – общий холестерин, Х-ЛПВП – холестерин липопротеинов высокой плотности. Примечание: Данные представлены в виде M±SD, где M – среднее значение, SD – стандартное отклонение; N – объем выборки, *p<0.05. В таблице 3 представлены средние значения основных показателей липидного обмена. Проведенный нами сравнительный анализ содержания 66 холестерина и его фракций в сыворотке крови больных и контрольной группы соответствовал общепринятому определению состояния обмена липидов согласно рекомендациям Всероссийского научного общества кардиологов (ВНОК) (Рекомендации ВНОК, 2009). У большинства пациентов с атеросклерозом были традиционные факторы риска развития данного заболевания – курение и пониженный уровень Х-ЛПВП. Данные показатели достоверно отличались от показателей лиц контрольной группы (p<0.05). Таким образом, подтверждается вклад в риск развития атеросклероза таких факторов, как курение и снижение уровня антиатерогенного Х-ЛПВП. Однако в настоящее время, несмотря на многочисленные доказательства связи курения с сосудистыми патологиями, точные механизмы, посредством которых они оказывают отрицательное влияние, окончательно не определены. В изучение молекулярных механизмов атеросклероза артерий особое внимание уделяется исследованием экспрессии генов липидного обмена в макрофагах артериальной стенки, представляющих собой основной тип клеток, участвующих в образовании очагов поражения при атеросклерозе. Для оценки уровня мРНК генов PPARγ, LXRα, LXRβ, MMP-9 и ABCА1 и уровня белка ABCА1 в макрофагах, активированных M-CSF, были сформированы группы пациентов и контрольная группа. Общая характеристика группы больных с атеросклерозом, подтвержденным ангиографическим методом, и контрольной группы, приведена в таблице 4. Поскольку мужской пол является фактором риска развития атеросклероза и ССЗ нами была подобрана группа больных мужского пола (15 человек, 53.87+6.78 лет) и контрольная группа, состоящая из 19 человек (52.05±6.05) также мужского пола. Курение является одним из традиционных факторов риска развития атеросклероза. В таблице 4 представлены частоты курящих индивидов в 67 исследуемых группах. По данному показателю не было отмечено достоверных различий между исследуемыми группами. Таблица 4 Характеристика группы пациентов с атеросклерозом, подтвержденным методом ангиографии, и контрольной группы, отобранных для изучения уровня мРНК генов PPARγ, LXRα, LXRβ, MMP-9 и ABCА1 и уровня белка ABCА1. Параметр Возраст (лет) Возраст первых клинических Группа пациентов с Контрольная атеросклерозом группа (N=15) (N=19) 53.87±6.78 52.05±6.05 47.73±4.33 манифестаций (лет) Пол (%мужчин/%женщин) 100/0 100/0 Курение (%) 33.33 31.58 ОХС, ммоль/л 4.75±1.17 4.84±1.11 Х-ЛПВП, ммоль/л 1.15±0.26* 1.39±0.30 Сокращения: ОХС – общий холестерин, Х-ЛПВП – холестерин липопротеинов высокой плотности. Примечание: Данные представлены в виде M±SD, где M – среднее значение, SD – стандартное отклонение; N – объем выборки, *p <0.05. При парном сравнении двух выборок – независимой группы здоровых индивидуумов и пациентов с атеросклерозом, выявлены статистически значимые различия в уровне Х-ЛПВП. Средний уровень Х-ЛПВП был ниже в группе 68 больных, чем в контрольной группе (p<0.05). Однако средние уровни ОХС в плазме крови не различались между исследуемыми группами. Современные клинические рекомендации рассматривают Х-ЛПВП как один из важнейших факторов кардиоваскулярного риска, мониторинг которого необходим для оценки качества гиполипидемических мероприятий (Adult Treatment Panel III of the National Cholesterol Education Programme, 2002). В настоящее время снижение уровня Х-ЛПВП в плазме крови ассоциируется с повышением уровня Х-ЛПНП и Х-ЛПОНП в эндотелии артерий, нарушением их транспорта в гепатоциты, активацией продукции провоспалительных цитокинов, локальным образованием пенистых клеток, формированием дисфункции эндотелия. Показано, что все эти процессы негативно влияют и на величины риска развития мероприятий атеросклероза. наибольшая роль При проведении отводится статинам, гиполипидемических которые снижают образование холестерина и ЛПНП, увеличивают соотношение ЛПВП/ЛПНП. снижают включение холестерина в субинтиму сосудов. Однако было показано, что статины также могут снижать экспрессию гена ABCA1 в моноцитах и макрофагах у человека (Wong et al., 2008). Поэтому, нами были отобраны пациенты с атеросклерозом, которые не получали статинов либо других гиполиподемических препаратов, чтобы исключить влияние данных препаратов на экспрессию исследуемых генов и уровня липопротеинов в плазме крови. Задачей нашего исследования было изучение экспрессии генов PPARγ, LXRα, LXRβ, MMP-9 и ABCА1 в макрофагах, активированных фактором M-CSF. Выбор этих параметров был продиктован тем, что они в значительной мере определяют характеристику липидного обмена в макрофагах и механизмы развитие атеросклероза. Ранее было показано, фактор M-CSF действует на моноциты in vivo, стимулируя их характеризуются дифференцировку проатерогенным в макрофаги. фенотипом, и Данные именно этот макрофаги подкласс макрофагов преимущественно присутствует в атеросклеротических бляшках (Di 69 Gregoli, Johnston, 2012). Экспрессия M-CSF повышена в атеросклеротических бляшках человека и животных (Clinton et al., 1992). Таким образом, инкубирование моноцитов в течение 5 суток в присутствии M-CSF позволяет получить макрофаги и исследовать экспрессию генов PPARγ, LXRα, LXRβ, MMP-9 и ABCА1 в условиях, приближенных к условиям in vivo. Микрофотографии моноцитов и макрофагов представлены на Рисунок 12. Популяция моноцитов характеризовалась значительным числом клеток сферической и овальной формы, имеющих округлое тёмное ядро, а макрофаги были представлены крупными клетками с выраженной адгезией на стекле и значительным присутствием полигональных клеток с множеством псевдоподий. Рисунок 12. Дифференцировка моноцитов, культивированных в присутствии М-CSF, в макрофаги. а - Моноциты, культивированные 2 часа; б Макрофаги после 5 суток культивирования в присутствии M-CSF. 3.2 Анализ вклада вариантов гена АВСА1 (R219K, 319ins<G, G(-17)>C) в развитие атеросклероза Частоты вариантов гена АВСА1 (R219K, 319ins<G, G(-17)>C) в группе больных с атеросклерозом и в контрольной группе представлены в таблице 5. В 70 исследуемых группах распределение генотипов гена ABCA1 находилось в соответствии с распределением Харди-Вайнберга. Таблица 5 Частоты вариантов гена АВСА1 в группе пациентов с атеросклерозом, и в контрольной группе Варианты гена АВСА1 R219K G(-17)>C InsG319 Группа пациентов с Контрольная атеросклерозом группа Частота Частота аллелей аллелей n (%) n (%) RR 60(50.4) 150(50.0) RK 52(43.7) 131(43.7) KK 7(5.9) 19(6.3) f(R аллель) 0.72 0.72 f(К аллель) 0.28 0.28 CC 68(57.1) 156(52.0) CG 44(37.0) 131(43.7) GG 7(5.9) 13(4.3) f(G аллель) 0.76 0.74 f(С аллель) 0.24 0.26 NN 101(84.9) 224(74.6) NG+GG 18(15.1)* 75+1(25.4) *p<0.05, OR (NG+GG vs NN) = 0.55, (95%ДИ: 0.35-0.86) В нашем исследовании показано, что в контрольной группе, которую составили представители Санкт-Петербурга, частоты вариантов гена АВСА1 (R219K, 319ins<G, G(-17)>C) были аналогичны значениям, полученным в европейских популяциях (Zwartz et al., 2002; Jensen et al., 2007;Ma et al., 2011). 71 Различий в частотах вариантов R219K и G(-17)>C гена АВСА1 между группой пациентов с атеросклерозом и контрольной группой не было обнаружено (Таблица 5). В группе пациентов с атеросклерозом наблюдалось достоверное снижение частоты варианта G319 гена АВСА1 по сравнению с контрольной группой (15.1% и 25.4%, соответственно, р=0.03, df=1). В нашей работе был показан пониженный относительный риск развития атеросклероза у носителей варианта G319 гена АВСА1 по сравнению с лицами, у которых отсутствует вставка нуклеотида G в 319 положении гена АВСА1 (OR = 0.55 (95%ДИ: 0.86 – 0.35)). Таким образом, в носительство аллеля G319 гена АВСА1 ассоциировано со снижением относительного риска развития атеросклероза в популяции Санкт-Петербурга. Ассоциации полиморфных вариантов гена ABCA1 с показателями липидного спектра плазмы крови ни в группе пациентов, ни в контрольной группе выявлено не было. Ранее в исследовании Zwartz и соавт. было показано, что носительство аллеля G в положении 319 гена АВСА1 ассоциировано со снижением локального и диффузного атеросклероза по сравнению с вариантом, когда аллель G в положении 319 отсутствовала (Zwartz et al., 2002). Однако механизмы, объясняющие функциональный эффект этого варианта на развитие и прогрессирование атеросклероза, остаются в настоящее время не изученными. Поскольку вариант 319insG расположен в 5`-нетранслируемой области гена АВСА1, возможно предположить, что вставка нуклеотида G в 319 положении гена АВСА1 может затрагивать регуляторные элементы, отвечающие за стабильность мРНК гена АВСА1. Что, в свою очередь, может приводить как к измененной экспрессии гена АВСА1, так и, соответственно, влиять на эффективность ОТХ. Однако работы, направленные на выявление ассоциации между носительством варианта G в положении 319 гена АВСА1 с концентрацией и активностью АВСА1 транспортера, не проводились. Для выяснения механизмов, обусловливающих 72 возможные антиатерогенные свойства варианта 319insG гена АВСА1, необходимы дальнейшие исследования. 3.2 Уровень мРНК гена ABCА1 в макрофагах, активированных М-CSF исследуемых групп Анализ литературы показывает, что ОТХ является ключевых звеном липидного обмена в макрофагах. Поскольку транспортер холестерина ABCA1 необходим для обеспечения эффективного ОТХ, можно предположить, что при развитии атеросклероза экспрессия гена ABCA1 в макрофагах может быть изменена. В настоящем исследовании для измерения уровня мРНК ABCA1 был создан банк макрофагов, активированных фактором M-CSF. Уровень мРНК гена ABCA1 через 5 суток культивирования клеток в присутствии M-CSF определяли методом количественной ПЦР в режиме реального времени с флуоресцентными зондами TaqMan на приборе CFX96 Touch (BioRad, США). Значения уровня мРНК гена ABCA1, нормированного на соответствующие показатели для референсного гена, представлены на Рисунок 13. Мы показали, что в макрофагах пациентов с атеросклерозом уровень мРНК ABCA1 (медиана 1.60 (мин-макс 0.83-2.73)) повышен по сравнению с макрофагами лиц контрольной группы (медиана 0.66 (мин-макс 0.15-1.66)) (p <0.001). Данное повышении уровня мРНК гена ABCA1 указывает на измененную экспрессию гена АВСА1 и, соответственно, может приводить к более эффективному ОТХ и обуславливать замедление темпов атерогенеза. Показано, что нокаут ABCA1 в макрофагах мышей сопровождается усилением атеросклеротических повреждений сосудов. У мышей с нокаутом гена ABCA1 выявлялось усиление отложения липидов в макрофагах сосудистой стенки без изменений уровня липидов в плазме крови (Yvan-Charvet et al, 2007). При этом трансплантация костного мозга от мышей с нокаутом гена АВСА1 мышам с выключенным геном рецептора к холестерину низкой плотности (стандартной 73 модели атеросклероза) приводит к увеличению степени атеросклеротических повреждений сосудов, не влияя на уровень Х-ЛПВП в плазме крови (Van Eck et al., 2002). В то же время мыши, которым был трансплантирован костный мозг от мышей линии с гиперэкспрессией гена АВСА1, характеризовались уменьшением степени атеросклеротических повреждений сосудов (Van Eck et al., 2006). Кроме того, были получены результаты о значительном уменьшении in vivo ОТХ в макрофагах АВСА1-дефицитных мышей (Wang et al., 2007). Таким образом, исследование экспрессии гена ABCA1 именно в макрофагах актуально для изучения развития атеросклероза. Рисунок 13. Относительный уровень мРНК гена ABCA1 в макрофагах, активированных M-CSF, после 5 суток культивирования у пациентов с атеросклерозом (N=15) и в контрольной группе (N=19), * p<0.001. Нормирование результатов проведено с помощью измерений соответствующих показателей для гена ß-актина. Ось абсцисс - исследуемые группы; ось ординат - относительный уровень мРНК (отн. ед.) 74 Интересно, что в работе Sivapalaratnam и соавт. напротив, было отмечено снижение экспрессии гена ABCA1 в циркулирующих моноцитах у пациентов, страдающих коронарной болезнью сердца и перенесших инфаркт миокарда в молодом возрасте (до 40 лет) (Sivapalaratnam et al., 2012). Этот результат мог быть обусловлен тем, что все пациенты, принявшие участие в этом исследовании, принимали симвастатин, снижающий экспрессию генов ABCA1 и ABCG1 в моноцитах у человека (Wong et al., 2008; Genvigir et al., 2010). Важно отметить, что в нашем исследовании пациенты не получали статинов и других гиполиподемических препаратов. Кроме того, показано что популяция макрофагов в организме человека отличается гетерогенностью и отличаются эффективностью накопления холестерина (Waldo et al, 2008). Таким образом, данные экспрессии гена ABCA1, полученные на циркулирующих лейкоциты и моноцитах периферической крови в работе Sivapalaratnam и соавт. могут не отражать патологические процессов, происходящих в интиме артерии. В нашем исследовании для определения уровня мРНК были использованы макрофаги, стимулированных фактором M-SCF, которые являются наиболее адекватной моделью для изучения патологических процессов при атерогенезе в клетках интимы in vivo (Di Gregoli, Johnston, 2012). С другой стороны, полученные нами данные, согласуются с результатами, в которых показано повышение уровня экспрессии гена ABCA1 в атероматозных бляшках по сравнению со здоровыми артериями (Albrecht et al., 2004). Сравнение пациентов с аневризмой сонной артерии и пациентов с аневризмой брюшной аорты с лицами контрольной группы без признаков атеросклероза показало, что уровень мРНК ABCA1 при атеросклерозе повышен (Soumian et al., 2005), что также согласуется с полученными нами данными. 75 3.3 Измерение уровня белка ABCА1 в макрофагах, активированных МCSF Измерение ABCA1 в макрофагах было проведено с использованием метода вестерн блоттинга в группе больных с атеросклерозом и в контрольной группе. Пример результатов вестерн блоттинга приведен на Рисунок 14. Рисунок 14. Результаты вестерн-блоттинга белка ABCA1 в макрофагах, активированных М-CSF. Показаны результаты для различных представителей группы пациентов (дорожки 1, 2) и контрольной группы (дорожки 3, 4). Нами выявлено снижение относительного содержания белка ABCA1 (медиана 0.14 (мин-макс 0.07-0.54)) в макрофагах пациентов через 5 суток культивирования по сравнению с контрольной группой (медиана 0.44 (мин-макс 0.14-0.97)) (p <0.001) (Рисунок 15). 76 Рисунок 15. Уровень белка ABCA1 в макрофагах, активированных M-CSF, после 5 суток культивирования у пациентов с атеросклерозом (N=15) и в контрольной группе (N=19), * p<0.001. Нормирование результатов проведено с помощью измерений соответствующих показателей для гена ß-актина. Ось абсцисс - исследуемые группы; ось ординат - относительный уровень мРНК (отн. ед.). Известно, что усиление транспорта холестерина из периферических клеток, посредством ОТХ, основным белком которого и является транспортер ABCA1, предотвращает от образования пенистых клеток, обеспечивая атеропротективные свойства данного процесса. Таким образом, полученные данные могут свидетельствовать о нарушении элиминации холестерина из макрофагов у пациентов с атеросклерозом. Подобные результаты отмечены и при изучении трансгенных животных. Так, селективная инактивация ABCA1 в макрофагах как в линии мышей ЛПНП -/-, так и у апоЕ -/- мышей достоверно увеличивал уровень атеросклеротического повреждения сосудов при отсутствии изменений в 77 липидном профиле (Aiello et al., 2002). Кроме того, у линии мышей с нокаутом гена ABCA1 -/- также было продемонстрировано усиление атеросклероза без изменения уровня липидов в плазме крови (Zhu et al., 2008). В то же время при пересадке костного мозга с гиперэкспрессией гена ABCA1 было отмечено резкое снижение уровня атеросклеросклеротического повреждения сосудов (Van Eck et al., 2006). Эти данные свидетельствуют о том, что белок ABCA1 связан со степенью атеросклеротического повреждения сосудов и уровень белка ABCA1 может служить маркером атерогенеза. Результаты исследований, приведенные выше, и полученные нами данные дают основание предполагать, что сниженный уровень белка АВСА1 является фактором риск развития атеросклероза. Интересно, что в нашем исследовании в макрофагах пациентов с атеросклерозом было выявлено увеличение уровня экспрессии мРНК ABCA1 и в то же время отмечалось снижение содержание белка ABCA1 по сравнению с макрофагами контрольной группы. Необходимо отметить, что уровень экспрессии мРНК ABCA1 не всегда отражает уровень белка (Gygi et al., 1999). Было показано, что имеется несоответствие между уровнем мРНК ABCA1 и количеством белка ABCA1 в различных тканях животных, что предполагает наличие пост-трансляционной регуляции белка ABCA1 in vivo (Wellington et al., 2002). В литературе есть данные, аналогичные нашим, о том, что в атеросклеротических бляшках человека на фоне увеличения содержания мРНК ABCA1 содержание белка ABCA1 существенно снижается по сравнению с неповрежденными артериями (Albrecht et al., 2004). Исследования in vitro подтверждают, что белок ABCA1 подвержен посттрансляционной регуляции в основном через контроль уровня его деградации. Скорость деградации ABCA1 уменьшается при взаимодействии с апо-АI и стимулируется ненасыщенными жирными кислотами (Kang et al., 2010). Также стабильность белка ABCA1 контролируется внутриклеточными белками, такими как оксистеролсвязывающий белок и α1-синтрофин (Hsieh, 2014). Таким образом, 78 эти данные подтверждают возможность контроля уровня белка ABCA1 на посттрансляционном уровне независимо от уровня экспрессии ABCA1. Доказано, что состав и микроокружение атеросклеротической бляшки также могут влиять на деградацию белка ABCA1(Albrecht et al., 2004). В макрофагах показан быстрый распад белка ABCA1 со временем полураспада менее 1 ч (Oram et al., 2000; Arakawa, Yokoyama, 2002). При атеросклеротическом поражении сосудов макрофаги имеют тенденцию накапливать большое количество свободного холестерина (Tabas, 1997), которое ускоряет деградацию ABCA1 в макрофагах (Feng, Tabas, 2002). В то же время, связывание ABCA1 с апо АI и апо АII замедляет деградацию ABCA1 в THP-1 клетках, защищая ABCA1 в макрофагах от разрушения тиоловой и калпаиновой протеазами (Arakawa, Yokoyama, 2002; Wang et al., 2003). Таким образом, отмеченное снижение содержания белка ABCA1 в макрофагах пациентов позволяет предположить, что важным фактором, определяющим функции транспортера ABCA1 и эффективность ОТХ при атеросклерозе, является регулирование ABCA1 именно на посттранскрипционном уровне. 3.4 Уровень мРНК гена MMP-9 в макрофагах, активированных М-CSF в исследуемых группах. В нашем исследовании установлено повышенное содержания мРНК MMP-9 (медиана 1.63 (мин-макс 0.97-2.37)) в макрофагах, активированных M-CSF, после 5 суток культивирования у пациентов с атеросклерозом по сравнению с контрольной группой (медиана 0.85 (мин-макс 0.61-1.66)) (p <0.001) (Рисунок 16). 79 Рисунок 16. Относительный уровень мРНК гена MMP-9 в макрофагах, активированных M-CSF, после 5 суток культивирования у пациентов с атеросклерозом (N=15) и в контрольной группе (N=19), * p<0.001. Нормирование результатов проведено с помощью измерений соответствующих показателей для гена ß-актина. Ось абсцисс - исследуемые группы; ось ординат - относительный уровень мРНК (отн. ед.). Ремоделирование внеклеточного матрикса играет важную роль в развитии различных сосудистых патологий, включая прогрессирование атреросклероза, разрыв атеросклеротической бляшки и развитие повторного сужения сосудов или рестеноза (Galis, Khatri, 2002). Необходимо отметить, что активированные макрофаги, продуцирующие металлопротеиназы и коллагеназу, способствуют распаду коллагена в атеросклеротической бляшке и возникновению такого 80 осложнения, как разрыв бляшки, образование тромба и развитию инфаркта миокарда. Одним из основных патогенетических механизмов ССЗ, в том числе атеросклероза, является нарушение функции эндотелия. Ранее было показано, что важнейшим звеном, регулирующим расщепление коллагена IV типа и обеспечение возможности проникнуть моноцитам сквозь эндотелий к месту атеросклеротического поражения сосудов, является активность MMP-9, синтезируемая макрофагами (Mishra et al., 2013). Кроме того, у пациентов со стенозом сонных артерий уровень MMP-9 в плазме крови был отмечен в 2 раза выше популяционного и был тесно ассоциирован с риском развития мозгового инсульта (Eldrup et al., 2006). Изложенные выше данные позволяют рассматривать MMP-9 в настоящее время как весьма перспективный в отношении мониторирования провоспалительный фактор кардиоваскулярного риска. Таким образом, возрастание экспрессии гена MMP-9 в макрофагах, активированных M-CSF, пациентов с атеросклерозом может ассоциироваться с увеличением нестабильности атеросклеротической бляшки и прогрессированием атерогенеза. Необходимо отметить, что ранее были получены данные, что гиперэкспрессия гена MMP-9 в нестабильных атеросклеротических бляшках и повышенный уровень MMP-9 в плазме крови у пациентов с острым коронарным синдромом ассоциированы с нестабильностью атероматозной бляшки (Inokubo et al., 2001). Полученные нами данные, также согласуются с результатами, в которых показано повышение уровня мРНК MMP-9 у лиц с аневризмой сонной артерии и в атероматозных бляшках по сравнению с артериями лиц контрольной группы (Soumian et al., 2005). В то же время в исследовании Gough и соавторов было отмечено, что гиперэкспрессия MMP-9 у Апо Е -/ - мышей не имеет прямого эффекта на разрыв атеросклеротической бляшки вследствие отсутствия MMP-9 активации. При этом 81 гиперэкспрессия активированной формы MMP-9 приводила к разрыву бляшки (Gough et al., 2006). Эти данные свидетельствуют, что при оценке влияния уровня мРНК MMP-9 на развитие атеросклеротического повреждения необходимо учитывать активацию данной металлопротеиназы. В настоящем исследовании впервые выявлена отрицательная корреляция (r=-0.79, p<0.05) между уровнем ABCA1 и уровнем мРНК MMP-9 в группе пациентов с атеросклерозом (Рисунок 17). Рисунок 17. Корреляция между уровнем мРНК гена MMP-9 и уровнем белка ABCA1 в макрофагах, активированных M-CSF, после 5 суток культивирования у пациентов с атеросклерозом (N=15) (r = -0.79, p < 0.05). Можно предположить, что пути общей белковой деградации, включающие MMP-9 и калпаин, могут быть вовлечены и в деградацию ABCA1, и в то же время уменьшение транспорта липидов. В поддержку данной гипотезы ранее было показано, что протеазы, такие как калпаин, вовлечены в деградацию белка ABCA1 (Wang et al., 2003). В то же время в работах in vitro установлено, что 82 MMP, отвечающие за расщепление белков внеклеточного матрикса, также коррелируют с калпаином (Soumian et al., 2005), что может объяснять показанное в настоящем исследовании снижение уровня ABCA1 и повышение уровнем мРНК MMP-9 в группе пациентов с атеросклерозом. Эти данные также могут отражать причины снижения уровня белка ABCA1 при повышенной экспрессии гена ABCA1 в группе лиц с атеросклерозом. Кроме того, было показано, что ядерные рецепторы LXRα/ LXRß и PPARγ имеют антивоспалительную и анти-MMP активность (Soumian, 2005). Эти данные дают возможность предположить, что изменение уровня экспрессии вышеуказанных ядерных рецепторов в макрофагах могут вносить вклад в дестабилизацию атеросклеротической бляшки. Исходя из вышеизложенного, в нашей работе мы также провели оценку уровня экспрессии генов LXRα/ LXRß и PPARγ. 3.5 Уровень мРНК генов ядерных рецепторов PPARγ, LXRα, LXRβ в макрофагах, активированных М-CSF Наши эксперименты продемонстрировали снижение содержания мРНК LXRß (медиана 0.42 (мин-макс 0.10-0.72)) (p<0.001) и мРНК PPARγ (медиана 0.30 (мин-макс 0.13-0.81)) (p<0.001) в макрофагах, стимулированных колониестимулирующим фактором М-CSF, у пациентов с атеросклерозом по сравнению с контрольной группой (медиана 0.67 (мин-макс 0.43-1.04) и медиана 1.36 (мин-макс 0.61-2.09), соответственно) (Рисунок 18-19). 83 Рисунок 18. Относительный уровень мРНК гена LXRß в макрофагах, активированных M-CSF, после 5 суток культивирования у пациентов с атеросклерозом (N=15) и в контрольной группе (N=19), * p<0.001. Нормирование результатов проведено с помощью измерений соответствующих показателей для гена ß-актина. Ось абсцисс - исследуемые группы; ось ординат - относительный уровень мРНК (отн. ед.). 84 Рисунок 19. Относительный уровень мРНК гена PPARγ в макрофагах, активированных M-CSF, после 5 суток культивирования у пациентов с атеросклерозом (N=15) и в контрольной группе (N=19), * p<0.001. Нормирование результатов проведено с помощью измерений соответствующих показателей для гена ß-актина. Ось абсцисс - исследуемые группы; ось ординат - относительный уровень мРНК (отн. ед.). 85 Уровень мРНК LXRα в макрофагах в исследуемых группах не отличался, (p=0.06) (Рисунок 20). Медиана 0.58 (мин-макс 0.12-1.30) и 0.82 (мин-макс 0.341.77) для группы пациентов с атеросклерозом и контрольной группы, соответственно. Рисунок 20. Относительный уровень мРНК гена LXRα в макрофагах, активированных M-CSF, после 5 суток культивирования у пациентов с атеросклерозом (N=15) и в контрольной группе (N=19). Нормирование результатов проведено с помощью измерений соответствующих показателей для гена ß-актина. Ось абсцисс - исследуемые группы; ось ординат - относительный уровень мРНК (отн. ед.). Известно, что ядерные рецепторы, такие как PPARγ и LXRα/LXRß модулируют атерогенез на различных его стадиях – от аккумуляции липидов 86 макрофагами до локального воспалительного ответа (Soumian et al., 2005). Несмотря на наличие большого количества информации о роли LXRα, LXRβ и PPARγ как противовоспалительных и антиатерогенных медиаторах, в настоящее время практически нет данных о роли экспрессии данных генов в развитии атеросклероза. Поэтому мы транскрипционных провели факторов определение в уровня макрофагах, экспрессии этих стимулированных колониестимулирующим фактором М-CSF. Было показано статистически значимое снижение содержания PPARγ мРНК в макрофагах, активированных M-CSF, после 5 суток культивирования у пациентов с атеросклерозом по сравнению с контрольной группой. Полученные данные могут свидетельствовать о том, что уменьшение уровня мРНК PPARγ может быть ассоциировано с развитием атеросклероза. Как было показано ранее PPARγ вносит вклад в процесс регуляции дифференциации моноцитов в макрофаги (Tontonoz et al., 1998). В литературе существуют значительные противоречия относительно роли PPARγ в развитии атеросклероза. Наши данные согласуются с результатами, в которых было отмечено снижение уровня экспрессии PPARγ в атеросклеротических бляшках (Soumian et al., 2005) и в макрофагах, коррелировавшее с прогрессией атеросклероза (Giaginis et al., 2011). С другой стороны, было показано значительное повышение содержания PPARγ в макрофагах человека при атеросклерозе (Amoruso et al., 2009). В исследовании Spucci и соавт. было отмечено повышение экспрессии гена PPARγ как в моноцитах, так и в атеросклеротических бляшках (Pucci et al., 2011). Однако данное увеличение уровня мРНК гена PPARγ было показано на фоне приема статинов, которое не наблюдалось у лиц, вошедших в наши выборки. В работе Sueyoshi и др. (Sueyoshi et al., 2010) также было выявлено, что уровень PPARγ мРНК в атероматозных бляшках был достоверно выше, чем содержание PPARγ мРНК в интиме сосуда. Таким образом, вышеприведенные исследования ставят вопрос о том, является ли 87 повышение экспрессии PPARγ положительно модулирующим фактором развития атеросклероза, фактором, негативно влияющим на атерогенез или не имеющим прямой патофизиологической роли в этом процесс. В пользу того, что повышение экспрессии гена PPARγ имеет положительное влияние на развитие атеросклероза, были получены данные, о том, что активация PPARγ способствует дифференциации моноцитов человека в анти-воспалительные М2 макрофаги (Bouhlel, 2007). Кроме того, существование положительной корреляции между уровнем мРНК гена PPARγ и маркерами М2 макрофагов в атеросклеротических бляшках также может служить доказательством данного предположения (Bouhlel, 2007). В недавно проведенном мета-анализе, было показано, что аллельный вариант 12A (P12A) гена PPARγ, ассоциированный со сниженной экспрессией гена PPARγ, повышает риск развития ССЗ (Wu et al., 2012). Вышеизложенные результаты дают возможность предположить, что экспрессия PPARγ может быть связана с формированием атеросклеротических бляшек и PPARγ участвует в ранних стадиях развития атеросклероза у человека. В настоящей работе для определения роли изменения уровня экспрессии LXRα, LXRβ у лиц с атеросклерозом мы провели анализ уровня мРНК LXRα и LXRβ в макрофагах пациентов с атеросклерозом по сравнению с контрольной группой. LXR играют ключевую роль в патогенезе атеросклероза, регулируя экспрессию важных генов, вовлеченных в липидный гомеостаз и воспалительную реакцию в макрофагах (Bensinger et al., 2008; Oosterveer et al., 2010). Более того установлено, что LXR ингибируют атеросклероз in vitro и in vivo (Calkin et al., 2012). При этом было продемонстрировано, что активация LXR увеличивает ОТХ за счет усиления экспрессии транспортеров ABCA1 и ABCG1 в макрофагах, что является основным моментом механизма LXR-зависимой защиты от атеросклероза (Calkin et al., 2012). В нашем исследовании установлено сниженное содержания мРНК LXRβ в макрофагах, активированных M-CSF, после 5 суток культивирования у пациентов 88 с атеросклерозом по сравнению с контрольной группой, в то время как в содержании мРНК LXRα разница не показана, что может свидетельствовать о влиянии экспрессии LXRβ в развитии атеросклероза. В недавней работе Shchelkunova с соавторами было показано, увеличение экспрессии гена LXRβ в макрофагах, нагруженных модифицированными ЛПНП, по сравнению с контрольными макрофагами (Shchelkunova, 2013). Необходимо отметить, что взаимодействие с модифицированными ЛПНП существенно усиливает воспалительный потенциал макрофагов и дальнейшую аккумуляцию липидов. Также влияние повышенной концентрации холестерина в клетке на уровень экспрессии генов ядерных рецепторов LXR подтверждаются в работе Albrehch и соавторы. Так, в атеросклеротических бляшках сосудов уровень мРНК гена LXRα был повышен по сравнению со здоровыми артериями (Albrecht et al., 2004). Таким образом, данные о взаимосвязи уровня экспрессии генов LXR и уровня холестерина в клетке могут объяснять снижение содержания мРНК LXRβ в макрофагах после 5 суток культивирования у пациентов с атеросклерозом по сравнению с контрольной группой наблюдаемое в нашем исследовании. Суммируя наши результаты, можно предположить, что уровни экспрессии генов LXRß и PPARγ в макрофагах, активированных M-CSF, могут быть значимыми факторами, ассоциированными с развитием атеросклероза. 3.6 Корреляция между содержанием липидов в плазме крови и уровнем мРНК PPARγ, LXRα, LXRβ, MMP-9, ABCА1 и уровнем белка ABCA1 При анализе вклада уровня мРНК PPARγ, LXRα, LXRβ, MMP-9 и ABCА1 и уровня белка ABCА1 в макрофагах, активированных M-CSF, на развитие атеросклероза была оценена их корреляция с показатели липидного обмена, которые также являются факторами риска развития атеросклероза. В контрольной группе мы обнаружили корреляцию уровня мРНК ABCA1 в макрофагах, активированных M-CSF, с уровнем Х-ЛПВП (коэффициент корреляции r =0.74, p <0.05) (Рисунок 21). Такой корреляции в группе пациентов 89 не было. Не обнаружено выраженных корреляций между уровнем Х-ЛПВП и уровнем белка ABCA1 в макрофагах и у лиц контрольной группы, и у пациентов. Рисунок 21. Корреляция между уровнями мРНК ABCA1 и Х-ЛПВП макрофагов контрольной группы (r = 0.74, p <0.05). Действительно, в настоящее время транспортер ABCA1 рассматривается как один из основных детерминантов образования пре-β-ЛПВП и, следовательно, концентрации Х-ЛПВП в плазме крови (Oram, 2002). При дефекте транспортера ABCA1 обедненные липидами частицы апо АI не трансформируются в пре-βЛПВП, и далее в нативную форму ЛПВП. Было отмечено, что нокаут ABCA1 в тонком кишечнике мышей сопровождается снижением уровня Х-ЛПВП на 30%, а при одновременном нокауте ABCA1 как в тонком кишечнике, так и в печени уровень Х-ЛПВП был уменьшен на 90% (Brunham et al., 2006). В работе Singaraja и соавторы было показано, что альтернативный промотор в интроне 1 гена ABCA1 приводит как к повышенной экспрессии гена ABCА1, так и к возрастанию уровня 90 ЛПВП, что в свою очередь дает основание предположить связь между уровня мРНК ABCA1 и уровнем ЛПВП (Singaraja et al., 2001). Кроме того, в этой работе была также выявлена линейная корреляция между транспортом холестерина из макрофагов и уровнем ЛПВП в плазме крови, что свидетельствует о прямой ассоциации между повышенным уровнем оттока холестерина из клеток и пропорциональном увеличением уровня ЛПВП in vivo (Singaraja et al. , 2001). Таким образом, вышеизложенные результаты могут указывать на то, что высокий уровень экспрессии ABCA1 может индуцировать образование частиц ЛПВП (Denis et al. 2003), однако механизм влияния уровня мРНК ABCA1 в макрофагах на уровень Х-ЛПВП в плазме крови остается не до конца изученным. Наше исследование продемонстрировало отсутствие корреляции уровня экспрессии генов LXRα, LXRß, PPARγ и MMP-9 с показателями липидного спектра крови. Логично предположить, что только уровень мРНК генов ядерных рецепторов и MMP-9 не определяет концентрацию липидов плазмы крови. Полученные данные свидетельствует, что в липидный обмен вовлечены многие факторы, и нет прямой связи между показателями липидного спектра крови с уровнем транскрипционных факторов. Заключение Нами было показано, что вариант G319 гена АВСА1 снижает относительный риск развития атеросклероза у жителей Санкт-Петербурга. Был определен уровень мРНК генов PPARγ, LXRα, LXRβ, MMP-9 и ABCА1 в макрофагах, активированных М-CSF, у пациентов с атеросклерозом и у лиц без сердечно-сосудистой патологии. Было показано повышение уровня мРНК ABCА1 и MMP-9 и снижение уровня мРНК LXRβ и PPARγ в макрофагах больных атеросклерозом по сравнению с контрольной группой. Полученные результаты указывают, что уровень экспрессии данных генов может быть значимым фактором в развитии атеросклероза и может представлять мишень для антиатерогенной терапии. Выявленное в настоящем исследовании достоверное 91 снижение уровня белка ABCA1 в группе пациентов с атеросклерозом по сравнению с контрольной группой может отражать важность посттрансляционных модификаций данного транспортера и свидетельствовать о его повышенном уровне деградации в макрофагах. 92 ВЫВОДЫ Носительство аллеля G319 гена АВСА1 ассоциировано со снижением 1. относительного риск развития атеросклероза (OR = 0.55, df=1, (95% ДИ: 0.860.35) в популяции Санкт-Петербурга. Выявлены изменения уровней мРНК генов ABCА1, MMP-9 и генов 2. транскрипционных факторов LXRβ и PPARγ в макрофагах, активированных МCSF. У больных атеросклерозом показано повышение уровня транскриптов генов ABCА1, MMP-9 и понижение уровня транскриптов генов LXRβ и PPARγ по сравнению с контрольной группой. Определение уровня белка ABCA1 в макрофагах, активированных М- 3. CSF, выявило достоверное снижение содержание белка ABCA1 у пациентов с атеросклерозом по сравнению с контрольной группой. Показано наличие обратной корреляции между уровнем мРНК гена 4. MMP-9 и уровнем белка ABCA1 в макрофагах, активированных М-CSF, у пациентов с атеросклерозом (r = -0.79, p < 0.05). 5. При оценке ассоциации уровня мРНК генов PPARγ, LXRα, LXRβ, MMP-9, ABCА1 и уровня белка ABCA1с содержанием липидов в плазме крови была выявлена прямая корреляция между уровнем мРНК гена ABCA1 и уровнем Х-ЛПВП в плазме крови контрольной группы (r = 0.74, p <0.05). 93 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Климов А.Н., Никульчева Н.Г. Обмен липидов и липопротеидов и его нарушения // СПб.: Питер. 1999. — С. 432. 2. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук. Дж. Молекулярное клонирование // Москва: Мир.- 1984. — С. 479. 3. Липовецкий Б.М. Клиническая липидология // СПб.: Наука. 2000. — 4. Орехов А.Н. Атеросклероз. Молекулярно-клеточные механизмы С. 119. атерогенеза человека; антиатеросклеротическая терапия. // Germany: LAP LAMBERT Academic Publishing. 2013. — С.544. 5. Чернявский А.М, Караськов А.М., Мироненко С.П., Ковляков В.А. Хирургическое лечение мультифокального атеросклероза // Бюллетень СО РАМН. 2006. Т.2. №120. — С. 120-125. 6. ВОЗ. Ситуация в области неинфекционных болезней в странах на 2011 г. Глобальный доклад ВОЗ, 2011. [Электронный ресурс]. Доступ: (дата обращения http://www.who.int/nmh/publications/ncd_profiles2011/ru/ 26.04.2014) 7. Диагностика и коррекция нарушений липидного обмена с целью профилактики и лечения атеросклероза. ВНОК, Российские рекомендации (IV пересмотр). Кардиоваскулярная терапия и профилактика //Москва. 2009. — С. 82. 8. Душкин М.И. Макрофаги и атеросклероз: патофизиологические и терапевтические аспекты // Бюллетень СО РАМН. 2006. Т.2. №120. — С. 47-55. 9. Abbott B.D. Review of the expression of peroxisome proliferator-activated receptors alpha (PPAR alpha), beta (PPAR beta), and gamma (PPAR gamma) in rodent and human development // Reprod Toxicol. 2009. Т. 27. № 3-4. — C. 246-57. 10. Aiello R.J., Brees D., Bourassa P.A., Royer L., Lindsey S., Coskran T., Haghpassand M., Francone O.L. Increased atherosclerosis in hyperlipidemic mice with 94 inactivation of ABCA1 in macrophages // Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2002. Т. 22. № 4. — C. 630-7. 11. Albrecht C., Soumian S., Amey J.S., Sardini A., Higgins C.F., Davies A.H., Gibbs R.G. ABCA1 expression in carotid atherosclerotic plaques // Stroke. 2004. Т. 35. № 12. — C. 2801-2806. 12. Amalinei C., Caruntu I.D., Giusca S.E., Balan R.A. Matrix metalloproteinases involvement in pathologic conditions // Rom J Morphol Embryol. 2010. Т. 51. № 2. — C. 215-28. 13. Amoruso A., Bardelli C., Fresu L.G., Palma A., Vidali M., Ferrero V., Ribichini F., Vassanelli C., Brunelleschi S. Enhanced peroxisome proliferator-activated receptor-gamma expression in monocyte/macrophages from coronary artery disease patients and possible gender differences // J Pharmacol Exp Ther. 2009. Т. 331. № 2. — C. 531-8. 14. Apostoli A.J., Nicol C.J. PPAR Medicines and Human Disease: The ABCs of It All // PPAR Res. 2012. Т. 2012. — C. 504918. 15. Arakawa R., Hayashi M., Remaley A.T., Brewer B.H., Yamauchi Y., Yokoyama S. Phosphorylation and stabilization of ATP binding cassette transporter A1 by synthetic amphiphilic helical peptides // J Biol Chem. 2004. Т. 279. № 8. — C. 6217-20. 16. Arakawa R., Yokoyama S. Helical apolipoproteins stabilize ATP-binding cassette transporter A1 by protecting it from thiol protease-mediated degradation // J Biol Chem. 2002. Т. 277. № 25. — C. 22426-9. 17. Babaev V.R., Yancey P.G., Ryzhov S.V., Kon V., Breyer M.D., Magnuson M.A., Fazio S., Linton M.F. Conditional knockout of macrophage PPARgamma increases atherosclerosis in C57BL/6 and low-density lipoprotein receptor-deficient mice // Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2005. Т. 25. № 8. — C. 1647-53. 18. Badimon L., Vilahur G., Padro T. Lipoproteins, platelets and atherothrombosis // Rev Esp Cardiol. 2009. Т. 62. № 10. — C. 1161-78. 19. Baldan A., Bojanic D.D., Edwards P.A. The ABCs of sterol transport // J Lipid Res. 2009. Т. 50 Suppl. — C. S80-5. 95 20. Balcerzyk A., Zak I., Krauze J. Protective effect of R allele of PON1 gene on the coronary artery disease in the presence of specific genetic background // Dis Markers. 2008. Т. 24. № 2. — C. 81-8. 21. Basso F., Freeman L., Knapper C.L., Remaley A., Stonik J., Neufeld E.B., Tansey T., Amar M.J., Fruchart-Najib J., Duverger N., Santamarina-Fojo S., Brewer H.B., Jr. Role of the hepatic ABCA1 transporter in modulating intrahepatic cholesterol and plasma HDL cholesterol concentrations // J Lipid Res. 2003. Т. 44. № 2. — C. 296302. 22. Bensinger S.J., Tontonoz P. Integration of metabolism and inflammation by lipid-activated nuclear receptors // Nature. 2008. Т. 454. № 7203. — C. 470-7. 23. Benton J.L., Ding J., Tsai M.Y., Shea S., Rotter J.I., Burke G.L., Post W. Associations between two common polymorphisms in the ABCA1 gene and subclinical atherosclerosis: Multi-Ethnic Study of Atherosclerosis (MESA) // Atherosclerosis. 2007. Т. 193. № 2. — C. 352-60. 24. Berger J., Moller D.E. The mechanisms of action of PPARs // Annu Rev Med. 2002. Т. 53. — C. 409-35. 25. Blankenberg S., Rupprecht H.J., Poirier O., Bickel C., Smieja M., Hafner G., Meyer J., Cambien F., Tiret L., AtheroGene I. Plasma concentrations and genetic variation of matrix metalloproteinase 9 and prognosis of patients with cardiovascular disease // Circulation. 2003. Т. 107. № 12. — C. 1579-85. 26. Bodzioch M., Orso E., Klucken J., Langmann T., Bottcher A., Diederich W., Drobnik W., Barlage S., Buchler C., Porsch-Ozcurumez M., Kaminski W.E., Hahmann H.W., Oette K., Rothe G., Aslanidis C., Lackner K.J., Schmitz G. The gene encoding ATP-binding cassette transporter 1 is mutated in Tangier disease // Nat Genet. 1999. Т. 22. № 4. — C. 347-51. 27. Borel V., Gallot D., Marceau G., Sapin V., Blanchon L. Placental implications of peroxisome proliferator-activated receptors in gestation and parturition // PPAR Res. 2008. Т. 2008. — C. 758562. 28. Bouhlel M.A., Derudas B., Rigamonti E., Dievart R., Brozek J., Haulon S., Zawadzki C., Jude B., Torpier G., Marx N., Staels B., Chinetti-Gbaguidi G. 96 PPARgamma activation primes human monocytes into alternative M2 macrophages with anti-inflammatory properties // Cell Metab. 2007. Т. 6. № 2. — C. 137-43. 29. Bradley M.N., Hong C., Chen M., Joseph S.B., Wilpitz D.C., Wang X., Lusis A.J., Collins A., Hseuh W.A., Collins J.L., Tangirala R.K., Tontonoz P. Ligand activation of LXR beta reverses atherosclerosis and cellular cholesterol overload in mice lacking LXR alpha and apoE // J Clin Invest. 2007. Т. 117. № 8. — C. 2337-46. 30. Brooks-Wilson A., Marcil M., Clee S.M., Zhang L.H., Roomp K., van Dam M., Yu L., Brewer C., Collins J.A., Molhuizen H.O., Loubser O., Ouelette B.F., Fichter K., Ashbourne-Excoffon K.J., Sensen C.W., Scherer S., Mott S., Denis M., Martindale D., Frohlich J., Morgan K., Koop B., Pimstone S., Kastelein J.J., Genest J., Jr., Hayden M.R. Mutations in ABC1 in Tangier disease and familial high-density lipoprotein deficiency // Nat Genet. 1999. Т. 22. № 4. — C. 336-45. 31. Brousseau M.E., Bodzioch M., Schaefer E.J., Goldkamp A.L., Kielar D., Probst M., Ordovas J.M., Aslanidis C., Lackner K.J., Bloomfield Rubins H., Collins D., Robins S.J., Wilson P.W., Schmitz G. Common variants in the gene encoding ATPbinding cassette transporter 1 in men with low HDL cholesterol levels and coronary heart disease // Atherosclerosis. 2001. Т. 154. № 3. — C. 607-11. 32. Brown W.V., Brewer H.B., Rader D.J., Schaefer E.J. HDL as a treatment target // J Clin Lipidol. 2010. Т. 4. № 1. — C. 5-16. 33. Brunham L.R., Kruit J.K., Iqbal J., Fievet C., Timmins J.M., Pape T.D., Coburn B.A., Bissada N., Staels B., Groen A.K., Hussain M.M., Parks J.S., Kuipers F., Hayden M.R. Intestinal ABCA1 directly contributes to HDL biogenesis in vivo // J Clin Invest. 2006. Т. 116. № 4. — C. 1052-62. 34. Brunham L.R., Kruit J.K., Pape T.D., Timmins J.M., Reuwer A.Q., Vasanji Z., Marsh B.J., Rodrigues B., Johnson J.D., Parks J.S., Verchere C.B., Hayden M.R. Beta-cell ABCA1 influences insulin secretion, glucose homeostasis and response to thiazolidinedione treatment // Nat Med. 2007. Т. 13. № 3. — C. 340-7. 35. Calkin A.C., Tontonoz P. Liver x receptor signaling pathways and atherosclerosis // Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2010. Т. 30. № 8. — C. 1513-8. 97 36. Calkin A.C., Tontonoz P. Transcriptional integration of metabolism by the nuclear sterol-activated receptors LXR and FXR // Nat Rev Mol Cell Biol. 2012. Т. 13. № 4. — C. 213-24. 37. Cauwe B., Opdenakker G. Intracellular substrate cleavage: a novel dimension in the biochemistry, biology and pathology of matrix metalloproteinases // Crit Rev Biochem Mol Biol. 2010. Т. 45. № 5. — C. 351-423. 38. Cenarro A., Artieda M., Castillo S., Mozas P., Reyes G., Tejedor D., Alonso R., Mata P., Pocovi M., Civeira F., Spanish F.H.g. A common variant in the ABCA1 gene is associated with a lower risk for premature coronary heart disease in familial hypercholesterolaemia // J Med Genet. 2003. Т. 40. № 3. — C. 163-8. 39. Chang Y.C., Lee T.S., Chiang A.N. Quercetin enhances ABCA1 expression and cholesterol efflux through a p38-dependent pathway in macrophages // J Lipid Res. 2012. Т. 53. № 9. — C. 1840-50. 40. Chawla A., Boisvert W.A., Lee C.H., Laffitte B.A., Barak Y., Joseph S.B., Liao D., Nagy L., Edwards P.A., Curtiss L.K., Evans R.M., Tontonoz P. A PPAR gamma-LXR-ABCA1 pathway in macrophages is involved in cholesterol efflux and atherogenesis // Mol Cell. 2001. Т. 7. № 1. — C. 161-71. 41. Chen F., Eriksson P., Hansson G.K., Herzfeld I., Klein M., Hansson L.O., Valen G. Expression of matrix metalloproteinase 9 and its regulators in the unstable coronary atherosclerotic plaque // Int J Mol Med. 2005. Т. 15. № 1. — C. 57-65. 42. Chen S.G., Xiao J., Liu X.H., Liu M.M., Mo Z.C., Yin K., Zhao G.J., Jiang J., Cui L.B., Tan C.Z., Yin W.D., Tang C.K. Ibrolipim increases ABCA1/G1 expression by the LXRalpha signaling pathway in THP-1 macrophage-derived foam cells // Acta Pharmacol Sin. 2010. Т. 31. № 10. — C. 1343-9. 43. Chen W., Silver D.L., Smith J.D., Tall A.R. Scavenger receptor-BI inhibits ATP-binding cassette transporter 1- mediated cholesterol efflux in macrophages // J Biol Chem. 2000. Т. 275. № 40. — C. 30794-800. 44. Chen X., Zhao Y., Guo Z., Zhou L., Okoro E.U., Yang H. Transcriptional regulation of ATP-binding cassette transporter A1 expression by a novel signaling pathway // J Biol Chem. 2011. Т. 286. № 11. — C. 8917-23. 98 45. Chen Z., Ishibashi S., Perrey S., Osuga J., Gotoda T., Kitamine T., Tamura Y., Okazaki H., Yahagi N., Iizuka Y., Shionoiri F., Ohashi K., Harada K., Shimano H., Nagai R., Yamada N. Troglitazone inhibits atherosclerosis in apolipoprotein Eknockout mice: pleiotropic effects on CD36 expression and HDL // Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2001. Т. 21. № 3. — C. 372-7. 46. Chinetti-Gbaguidi G., Staels B. Lipid ligand-activated transcription factors regulating lipid storage and release in human macrophages // Biochim Biophys Acta. 2009. Т. 1791. № 6. — C. 486-93. 47. Choi H.Y., Rahmani M., Wong B.W., Allahverdian S., McManus B.M., Pickering J.G., Chan T., Francis G.A. ATP-binding cassette transporter A1 expression and apolipoprotein A-I binding are impaired in intima-type arterial smooth muscle cells // Circulation. 2009. Т. 119. № 25. — C. 3223-31. 48. Clee S.M., Kastelein J.J., van Dam M., Marcil M., Roomp K., Zwarts K.Y., Collins J.A., Roelants R., Tamasawa N., Stulc T., Suda T., Ceska R., Boucher B., Rondeau C., DeSouich C., Brooks-Wilson A., Molhuizen H.O., Frohlich J., Genest J., Jr., Hayden M.R. Age and residual cholesterol efflux affect HDL cholesterol levels and coronary artery disease in ABCA1 heterozygotes // J Clin Invest. 2000. Т. 106. № 10. — C. 1263-70. 49. Clinton S.K., Underwood R., Hayes L., Sherman M.L., Kufe D.W., Libby P. Macrophage colony-stimulating factor gene expression in vascular cells and in experimental and human atherosclerosis // Am J Pathol. 1992. Т. 140. № 2. — C. 30116. 50. Costet P., Luo Y., Wang N., Tall A.R. Sterol-dependent transactivation of the ABC1 promoter by the liver X receptor/retinoid X receptor // J Biol Chem. 2000. Т. 275. № 36. — C. 28240-5. 51. De Villiers W.J., Smith J.D., Miyata M., Dansky H.M., Darley E., Gordon S. Macrophage phenotype in mice deficient in both macrophage-colony-stimulating factor (op) and apolipoprotein E // Arterioscler Thromb Vasc Biol. 1998. Т. 18. № 4. — C. 631-40. 99 52. Dean M., Rzhetsky A., Allikmets R. The human ATP-binding cassette (ABC) transporter superfamily // Genome Res. 2001. Т. 11. № 7. — C. 1156-66. 53. Denis M., Bissonnette R., Haidar B., Krimbou L., Bouvier M., Genest J. Expression, regulation, and activity of ABCA1 in human cell lines // Mol Genet Metab. 2003. Т. 78. № 4. — C. 265-74. 54. Di Gregoli K., Johnson J.L. Role of colony-stimulating factors in atherosclerosis // Curr Opin Lipidol. 2012. Т. 23. № 5. — C. 412-21. 55. Eldrup N., Gronholdt M.L., Sillesen H., Nordestgaard B.G. Elevated matrix metalloproteinase-9 associated with stroke or cardiovascular death in patients with carotid stenosis // Circulation. 2006. Т. 114. № 17. — C. 1847-54. 56. Feig J.E., Feig J.L. Macrophages, dendritic cells, and regression of atherosclerosis // Front Physiol. 2012. Т. 3. — C. 286. 57. Feig J.E., Shamir R., Fisher E.A. Atheroprotective effects of HDL: beyond reverse cholesterol transport // Curr Drug Targets. 2008. Т. 9. № 3. — C. 196-203. 58. Feige J.N., Gelman L., Michalik L., Desvergne B., Wahli W. From molecular action to physiological outputs: peroxisome proliferator-activated receptors are nuclear receptors at the crossroads of key cellular functions // Prog Lipid Res. 2006. Т. 45. № 2. — C. 120-59. 59. Feng B., Tabas I. ABCA1-mediated cholesterol efflux is defective in free cholesterol-loaded macrophages. Mechanism involves enhanced ABCA1 degradation in a process requiring full NPC1 activity // J Biol Chem. 2002. Т. 277. № 45. — C. 4327180. 60. Ferroni P., Basili S., Martini F., Cardarello C.M., Ceci F., Di Franco M., Bertazzoni G., Gazzaniga P.P., Alessandri C. Serum metalloproteinase 9 levels in patients with coronary artery disease: a novel marker of inflammation // J Investig Med. 2003. Т. 51. № 5. — C. 295-300. 61. Francone O.L., Royer L., Boucher G., Haghpassand M., Freeman A., Brees D., Aiello R.J. Increased cholesterol deposition, expression of scavenger receptors, and response to chemotactic factors in Abca1-deficient macrophages // Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2005. Т. 25. № 6. — C. 1198-205. 100 62. Frikke-Schmidt R., Nordestgaard B.G., Schnohr P., Steffensen R., Tybjaerg-Hansen A. Mutation in ABCA1 predicted risk of ischemic heart disease in the Copenhagen City Heart Study Population // J Am Coll Cardiol. 2005. Т. 46. № 8. — C. 1516-20. 63. Frikke-Schmidt R., Nordestgaard B.G., Jensen G.B., Steffensen R., Tybjaerg-Hansen A. Genetic variation in ABCA1 predicts ischemic heart disease in the general population // Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2008. Т. 28. № 1. — C. 180-6. 64. Galis Z.S., Khatri J.J. Matrix metalloproteinases in vascular remodeling and atherogenesis: the good, the bad, and the ugly // Circ Res. 2002. Т. 90. № 3. — C. 251-62. 65. Galis Z.S., Sukhova G.K., Lark M.W., Libby P. Increased expression of matrix metalloproteinases and matrix degrading activity in vulnerable regions of human atherosclerotic plaques // J Clin Invest. 1994. Т. 94. № 6. — C. 2493-503. 66. Genvigir F.D., Rodrigues A.C., Cerda A., Arazi S.S., Willrich M.A., Oliveira R., Hirata M.H., Dorea E.L., Bernik M.M., Curi R., Hirata R.D. Effects of lipid-lowering drugs on reverse cholesterol transport gene expressions in peripheral blood mononuclear and HepG2 cells // Pharmacogenomics. 2010. Т. 11. № 9. — C. 1235-46. 67. Giaginis C., Klonaris C., Katsargyris A., Kouraklis G., Spiliopoulou C., Theocharis S. Correlation of Peroxisome Proliferator-Activated Receptor-gamma (PPAR-gamma) and Retinoid X Receptor-alpha (RXR-alpha) expression with clinical risk factors in patients with advanced carotid atherosclerosis // Med Sci Monit. 2011. Т. 17. № 7. — C. CR381-91. 68. Glomset J.A. The plasma lecithins:cholesterol acyltransferase reaction // J Lipid Res. 1968. Т. 9. № 2. — C. 155-67. 69. Gordon D.J., Probstfield J.L., Garrison R.J., Neaton J.D., Castelli W.P., Knoke J.D., Jacobs D.R., Jr., Bangdiwala S., Tyroler H.A. High-density lipoprotein cholesterol and cardiovascular disease. Four prospective American studies // Circulation. 1989. Т. 79. № 1. — C. 8-15. 101 70. Gough P.J., Gomez I.G., Wille P.T., Raines E.W. Macrophage expression of active MMP-9 induces acute plaque disruption in apoE-deficient mice // J Clin Invest. 2006. Т. 116. № 1. — C. 59-69. 71. Guay S.P., Brisson D., Munger J., Lamarche B., Gaudet D., Bouchard L. ABCA1 gene promoter DNA methylation is associated with HDL particle profile and coronary artery disease in familial hypercholesterolemia // Epigenetics. 2012. Т. 7. № 5. — C. 464-72. 72. Gygi S.P., Rochon Y., Franza B.R., Aebersold R. Correlation between protein and mRNA abundance in yeast // Mol Cell Biol. 1999. Т. 19. № 3. — C. 172030. 73. Hagemann C., Anacker J., Ernestus R.I., Vince G.H. A complete compilation of matrix metalloproteinase expression in human malignant gliomas // World J Clin Oncol. 2012. Т. 3. № 5. — C. 67-79. 74. Holland I Barry, Susan P. C. Cole, Karl Kuchler, Christopher F. Higgins ABC Proteins: From Bacteria to Man // Academic Press. 2003. — С.530. 75. Hsieh V., Kim M.J., Gelissen I.C., Brown A.J., Sandoval C., Hallab J.C., Kockx M., Traini M., Jessup W., Kritharides L. Cellular Cholesterol Regulates Ubiquitination and Degradation of the Cholesterol Export Proteins ABCA1 and ABCG1 // J Biol Chem. 2014. Т. 289. № 11. — C. 7524-36. 76. Hsueh W.A., Bruemmer D. Peroxisome proliferator-activated receptor gamma: implications for cardiovascular disease // Hypertension. 2004. Т. 43. № 2. — C. 297-305. 77. Ikeda U., Shimada K. Matrix metalloproteinases and coronary artery diseases // Clin Cardiol. 2003. Т. 26. № 2. — C. 55-9. 78. Inokubo Y., Hanada H., Ishizaka H., Fukushi T., Kamada T., Okumura K. Plasma levels of matrix metalloproteinase-9 and tissue inhibitor of metalloproteinase-1 are increased in the coronary circulation in patients with acute coronary syndrome // Am Heart J. 2001. Т. 141. № 2. — C. 211-7. 102 79. Jensen M.K., Pai J.K., Mukamal K.J., Overvad K., Rimm E.B. Common genetic variation in the ATP-binding cassette transporter A1, plasma lipids, and risk of coronary heart disease // Atherosclerosis. 2007. Т. 195. № 1. — C. e172-80. 80. Kakko S., Kelloniemi J., von Rohr P., Hoeschele I., Tamminen M., Brousseau M.E., Kesaniemi Y.A., Savolainen M.J. ATP-binding cassette transporter A1 locus is not a major determinant of HDL-C levels in a population at high risk for coronary heart disease // Atherosclerosis. 2003. Т. 166. № 2. — C. 285-90. 81. Kang M.H., Singaraja R., Hayden M.R. Adenosine-triphosphate-binding cassette transporter-1 trafficking and function // Trends Cardiovasc Med. 2010. Т. 20. № 2. — C. 41-9. 82. Kaplan R., Gan X., Menke J.G., Wright S.D., Cai T.Q. Bacterial lipopolysaccharide induces expression of ABCA1 but not ABCG1 via an LXRindependent pathway // J Lipid Res. 2002. Т. 43. № 6. — C. 952-9. 83. Karasinska J.M., Rinninger F., Lutjohann D., Ruddle P., Franciosi S., Kruit J.K., Singaraja R.R., Hirsch-Reinshagen V., Fan J., Brunham L.R., Bissada N., Ramakrishnan R., Wellington C.L., Parks J.S., Hayden M.R. Specific loss of brain ABCA1 increases brain cholesterol uptake and influences neuronal structure and function // J Neurosci. 2009. Т. 29. № 11. — C. 3579-89. 84. Kennedy M.A., Barrera G.C., Nakamura K., Baldan A., Tarr P., Fishbein M.C., Frank J., Francone O.L., Edwards P.A. ABCG1 has a critical role in mediating cholesterol efflux to HDL and preventing cellular lipid accumulation // Cell Metab. 2005. Т. 1. № 2. — C. 121-31. 85. Khera A.V., Cuchel M., de la Llera-Moya M., Rodrigues A., Burke M.F., Jafri K., French B.C., Phillips J.A., Mucksavage M.L., Wilensky R.L., Mohler E.R., Rothblat G.H., Rader D.J. Cholesterol efflux capacity, high-density lipoprotein function, and atherosclerosis // N Engl J Med. 2011. Т. 364. № 2. — C. 127-35. 86. Khokha R., Murthy A., Weiss A. Metalloproteinases and their natural inhibitors in inflammation and immunity // Nat Rev Immunol. 2013. Т. 13. № 9. — C. 649-65. 103 87. Kiss M., Czimmerer Z., Nagy L. The role of lipid-activated nuclear receptors in shaping macrophage and dendritic cell function: From physiology to pathology // J Allergy Clin Immunol. 2013. Т. 132. № 2. — C. 264-86. 88. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. 1970. Т. 227. № 5259. — C. 680-5. 89. Laffitte B.A., Joseph S.B., Walczak R., Pei L., Wilpitz D.C., Collins J.L., Tontonoz P. Autoregulation of the human liver X receptor alpha promoter // Mol Cell Biol. 2001. Т. 21. № 22. — C. 7558-68. 90. Lahiri D.K., Bye S., Nurnberger JI.Jr., Hodes M.E., Crisp M. A nonorganic and non-enzymatic extraction method gives higher yields of genomic DNA from whole-blood samples than do nine other methods tested // J. Biochem. Biophys. Methods. 1992. Т.25, № 4. – C.193-205 91. Langmann T., Klucken J., Reil M., Liebisch G., Luciani M.F., Chimini G., Kaminski W.E., Schmitz G. Molecular cloning of the human ATP-binding cassette transporter 1 (hABC1): evidence for sterol-dependent regulation in macrophages // Biochem Biophys Res Commun. 1999. Т. 257. № 1. — C. 29-33. 92. Levitan I., Volkov S., Subbaiah P.V. Oxidized LDL: diversity, patterns of recognition, and pathophysiology // Antioxid Redox Signal. 2010. Т. 13. № 1. — C. 3975. 93. Li A.C., Binder C.J., Gutierrez A., Brown K.K., Plotkin C.R., Pattison J.W., Valledor A.F., Davis R.A., Willson T.M., Witztum J.L., Palinski W., Glass C.K. Differential inhibition of macrophage foam-cell formation and atherosclerosis in mice by PPARalpha, beta/delta, and gamma // J Clin Invest. 2004. Т. 114. № 11. — C. 156476. 94. Li A.C., Brown K.K., Silvestre M.J., Willson T.M., Palinski W., Glass C.K. Peroxisome proliferator-activated receptor gamma ligands inhibit development of atherosclerosis in LDL receptor-deficient mice // J Clin Invest. 2000. Т. 106. № 4. — C. 523-31. 95. Li G., Biju K.C., Xu X., Zhou Q., Chen C., Valente A.J., He W., Reddick R.L., Freeman G.L., Ahuja S.S., Clark R.A., Li S. Macrophage LXRalpha gene therapy 104 ameliorates atherosclerosis as well as hypertriglyceridemia in LDLR(-/-) mice // Gene Ther. 2011. Т. 18. № 8. — C. 835-41. 96. Liu Y., Tang C. Regulation of ABCA1 functions by signaling pathways // Biochim Biophys Acta. 2012. Т. 1821. № 3. — C. 522-9. 97. Lo Sasso G., Murzilli S., Salvatore L., D'Errico I., Petruzzelli M., Conca P., Jiang Z.Y., Calabresi L., Parini P., Moschetta A. Intestinal specific LXR activation stimulates reverse cholesterol transport and protects from atherosclerosis // Cell Metab. 2010. Т. 12. № 2. — C. 187-93. 98. Lopez-Otin C., Palavalli L.H., Samuels Y. Protective roles of matrix metalloproteinases: from mouse models to human cancer // Cell Cycle. 2009. Т. 8. № 22. — C. 3657-62. 99. Lundberg A.M., Hansson G.K. Innate immune signals in atherosclerosis // Clin Immunol. 2010. Т. 134. № 1. — C. 5-24. 100. Lutucuta S., Ballantyne C.M., Elghannam H., Gotto A.M., Jr., Marian A.J. Novel polymorphisms in promoter region of atp binding cassette transporter gene and plasma lipids, severity, progression, and regression of coronary atherosclerosis and response to therapy // Circ Res. 2001. Т. 88. № 9. — C. 969-73. 101. Ma L., Dong F., Zaid M., Kumar A., Zha X. ABCA1 protein enhances Toll-like receptor 4 (TLR4)-stimulated interleukin-10 (IL-10) secretion through protein kinase A (PKA) activation // J Biol Chem. 2012. Т. 287. № 48. — C. 40502-12. 102. Ma X.Y., Liu J.P., Song Z.Y. Associations of the ATP-binding cassette transporter A1 R219K polymorphism with HDL-C level and coronary artery disease risk: a meta-analysis // Atherosclerosis. 2011. Т. 215. № 2. — C. 428-34. 103. Mangelsdorf D.J., Thummel C., Beato M., Herrlich P., Schutz G., Umesono K., Blumberg B., Kastner P., Mark M., Chambon P., Evans R.M. The nuclear receptor superfamily: the second decade // Cell. 1995. Т. 83. № 6. — C. 835-9. 104. Marenberg M.E., Risch N., Berkman L.F., Floderus B., de Faire U. Genetic susceptibility to death from coronary heart disease in a study of twins // N Engl J Med. 1994. Т. 330. № 15. — C. 1041-6. 105 105. Martinez L.O., Agerholm-Larsen B., Wang N., Chen W., Tall A.R. Phosphorylation of a pest sequence in ABCA1 promotes calpain degradation and is reversed by ApoA-I // J Biol Chem. 2003. Т. 278. № 39. — C. 37368-74. 106. McLaren J.E., Michael D.R., Ashlin T.G., Ramji D.P. Cytokines, macrophage lipid metabolism and foam cells: implications for cardiovascular disease therapy // Prog Lipid Res. 2011. Т. 50. № 4. — C. 331-47. 107. Meurs I., Van Eck M., Van Berkel T.J. High-density lipoprotein: key molecule in cholesterol efflux and the prevention of atherosclerosis // Curr Pharm Des. 2010. Т. 16. № 13. — C. 1445-67. 108. Michael D.R., Ashlin T.G., Buckley M.L., Ramji D.P. Liver X receptors, atherosclerosis and inflammation // Curr Atheroscler Rep. 2012. Т. 14. № 3. — C. 28493. 109. Miller G.J., Miller N.E. Plasma-high-density-lipoprotein concentration and development of ischaemic heart-disease // Lancet. 1975. Т. 1. № 7897. — C. 16-9. 110. Miller M., Rhyne J., Hong S.H., Friel G., Dolinar C., Riley W. Do mutations causing low HDL-C promote increased carotid intima-media thickness? // Clin Chim Acta. 2007. Т. 377. № 1-2. — C. 273-5. 111. Mishra P.K., Givvimani S., Chavali V., Tyagi S.C. Cardiac matrix: a clue for future therapy // Biochim Biophys Acta. 2013. Т. 1832. № 12. — C. 2271-6. 112. Mitra S., Goyal T., Mehta J.L. Oxidized LDL, LOX-1 and atherosclerosis // Cardiovasc Drugs Ther. 2011. Т. 25. № 5. — C. 419-29 - b. 113. Morishige K., Shimokawa H., Matsumoto Y., Eto Y., Uwatoku T., Abe K., Sueishi K., Takeshita A. Overexpression of matrix metalloproteinase-9 promotes intravascular thrombus formation in porcine coronary arteries in vivo // Cardiovasc Res. 2003. Т. 57. № 2. — C. 572-85. 114. Nabel E.G. Cardiovascular disease // N Engl J Med. 2003. Т. 349. № 1. — C. 60-72. 115. Nagy Z.S., Czimmerer Z., Nagy L. Nuclear receptor mediated mechanisms of macrophage cholesterol metabolism // Mol Cell Endocrinol. 2013. Т. 368. № 1-2. — C. 85-98. 106 116. Naik S.U., Wang X., Da Silva J.S., Jaye M., Macphee C.H., Reilly M.P., Billheimer J.T., Rothblat G.H., Rader D.J. Pharmacological activation of liver X receptors promotes reverse cholesterol transport in vivo // Circulation. 2006. Т. 113. № 1. — C. 90-7. 117. National Cholesterol Education Program Expert Panel on Detection E., Treatment of High Blood Cholesterol in A. Third Report of the National Cholesterol Education Program (NCEP) Expert Panel on Detection, Evaluation, and Treatment of High Blood Cholesterol in Adults (Adult Treatment Panel III) final report // Circulation. 2002. Т. 106. № 25. — C. 3143-421. 118. Nofer J.R., Remaley A.T. Tangier disease: still more questions than answers // Cell Mol Life Sci. 2005. Т. 62. № 19-20. — C. 2150-60. 119. Ono K. Current concept of reverse cholesterol transport and novel strategy for atheroprotection // J Cardiol. 2012. Т. 60. № 5. — C. 339-43. 120. Oosterveer M.H., Grefhorst A., Groen A.K., Kuipers F. The liver X receptor: control of cellular lipid homeostasis and beyond Implications for drug design // Prog Lipid Res. 2010. Т. 49. № 4. — C. 343-52. 121. Oram J.F. ATP-binding cassette transporter A1 and cholesterol trafficking // Curr Opin Lipidol. 2002. Т. 13. № 4. — C. 373-81. 122. Oram J.F. HDL apolipoproteins and ABCA1: partners in the removal of excess cellular cholesterol // Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2003. Т. 23. № 5. — C. 720-7. 123. Oram J.F., Heinecke J.W. ATP-binding cassette transporter A1: a cell cholesterol exporter that protects against cardiovascular disease // Physiol Rev. 2005. Т. 85. № 4. — C. 1343-72. 124. Oram J.F., Lawn R.M., Garvin M.R., Wade D.P. ABCA1 is the cAMPinducible apolipoprotein receptor that mediates cholesterol secretion from macrophages // J Biol Chem. 2000. Т. 275. № 44. — C. 34508-11. 125. Porchay-Balderelli I., Pean F., Emery N., Maimaitiming S., Bellili N., Travert F., Mohammedi K., Roussel R., Marre M., Fumeron F., Group D.S. Relationships between common polymorphisms of adenosine triphosphate-binding 107 cassette transporter A1 and high-density lipoprotein cholesterol and coronary heart disease in a population with type 2 diabetes mellitus // Metabolism. 2009. Т. 58. № 1. — C. 74-9. 126. Probst M.C., Thumann H., Aslanidis C., Langmann T., Buechler C., Patsch W., Baralle F.E., Dallinga-Thie G.M., Geisel J., Keller C., Menys V.C., Schmitz G. Screening for functional sequence variations and mutations in ABCA1 // Atherosclerosis. 2004. Т. 175. № 2. — C. 269-79. 127. Pucci A., Formato L., Muscio M., Brscic E., Pizzimenti S., Ferroni F., Ribezzo M., Toaldo C., Pettazzoni P., Ciamporcero E., Barrera G., Rinaldi M., Bergamasco L., Sheiban I., Spinnler M.T. PPARgamma in coronary atherosclerosis: in vivo expression pattern and correlations with hyperlipidemic status and statin treatment // Atherosclerosis. 2011. Т. 218. № 2. — C. 479-85. 128. Qiao J.H., Tripathi J., Mishra N.K., Cai Y., Tripathi S., Wang X.P., Imes S., Fishbein M.C., Clinton S.K., Libby P., Lusis A.J., Rajavashisth T.B. Role of macrophage colony-stimulating factor in atherosclerosis: studies of osteopetrotic mice // Am J Pathol. 1997. Т. 150. № 5. — C. 1687-99. 129. Quinet E.M., Savio D.A., Halpern A.R., Chen L., Miller C.P., Nambi P. Gene-selective modulation by a synthetic oxysterol ligand of the liver X receptor // J Lipid Res. 2004. Т. 45. № 10. — C. 1929-42. 130. Rader D.J. Molecular regulation of HDL metabolism and function: implications for novel therapies // J Clin Invest. 2006. Т. 116. № 12. — C. 3090-100. 131. Rader D.J., Alexander E.T., Weibel G.L., Billheimer J., Rothblat G.H. The role of reverse cholesterol transport in animals and humans and relationship to atherosclerosis // J Lipid Res. 2009. Т. 50 Suppl. — C. S189-94. 132. Rader D.J., Pure E. Lipoproteins, macrophage function, and atherosclerosis: beyond the foam cell? // Cell Metab. 2005. Т. 1. № 4. — C. 223-30. 133. Rea P.A., Li Z.S., Lu Y.P., Drozdowicz Y.M., Martinoia E. From Vacuolar Gs-X Pumps to Multispecific Abc Transporters // Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol. 1998. Т. 49. — C. 727-760. 108 134. Repa J.J., Turley S.D., Lobaccaro J.A., Medina J., Li L., Lustig K., Shan B., Heyman R.A., Dietschy J.M., Mangelsdorf D.J. Regulation of absorption and ABC1-mediated efflux of cholesterol by RXR heterodimers // Science. 2000. Т. 289. № 5484. — C. 1524-9. 135. Ricote M., Huang J., Fajas L., Li A., Welch J., Najib J., Witztum J.L., Auwerx J., Palinski W., Glass C.K. Expression of the peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARgamma) in human atherosclerosis and regulation in macrophages by colony stimulating factors and oxidized low density lipoprotein // Proc Natl Acad Sci U S A. 1998. Т. 95. № 13. — C. 7614-9. 136. Roger V.L., Go A.S., Lloyd-Jones D.M., Benjamin E.J., Berry J.D., Borden W.B., Bravata D.M., Dai S., Ford E.S., Fox C.S., Fullerton H.J., Gillespie C., Hailpern S.M., Heit J.A., Howard V.J., Kissela B.M., Kittner S.J., Lackland D.T., Lichtman J.H., Lisabeth L.D., Makuc D.M., Marcus G.M., Marelli A., Matchar D.B., Moy C.S., Mozaffarian D., Mussolino M.E., Nichol G., Paynter N.P., Soliman E.Z., Sorlie P.D., Sotoodehnia N., Turan T.N., Virani S.S., Wong N.D., Woo D., Turner M.B., American Heart Association Statistics C., Stroke Statistics S. Heart disease and stroke statistics-2012 update: a report from the American Heart Association // Circulation. 2012. Т. 125. № 1. — C. e2-e220. 137. Rothblat G.H., Phillips M.C. High-density lipoprotein heterogeneity and function in reverse cholesterol transport // Curr Opin Lipidol. 2010. Т. 21. № 3. — C. 229-38. 138. Rust S., Rosier M., Funke H., Real J., Amoura Z., Piette J.C., Deleuze J.F., Brewer H.B., Duverger N., Denefle P., Assmann G. Tangier disease is caused by mutations in the gene encoding ATP-binding cassette transporter 1 // Nat Genet. 1999. Т. 22. № 4. — C. 352-5. 139. Saleheen D., Khanum S., Haider S.R., Nazir A., Ahmad U., Khalid H., Hussain I., Shuja F., Shahid K., Habib A., Frossard P.M. A novel haplotype in ABCA1 gene effects plasma HDL-C concentration // Int J Cardiol. 2007. Т. 115. № 1. — C. 713. 109 140. Schuster G.U., Parini P., Wang L., Alberti S., Steffensen K.R., Hansson G.K., Angelin B., Gustafsson J.A. Accumulation of foam cells in liver X receptordeficient mice // Circulation. 2002. Т. 106. № 9. — C. 1147-53. 141. Schwartz K., Lawn R.M., Wade D.P. ABC1 gene expression and ApoA-Imediated cholesterol efflux are regulated by LXR // Biochem Biophys Res Commun. 2000. Т. 274. № 3. — C. 794-802. 142. Seo D., Wang T., Dressman H., Herderick E.E., Iversen E.S., Dong C., Vata K., Milano C.A., Rigat F., Pittman J., Nevins J.R., West M., GoldschmidtClermont P.J. Gene expression phenotypes of atherosclerosis // Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2004. Т. 24. № 10. — C. 1922-7. 143. Shchelkunova T.A., Morozov I.A., Rubtsov P.M., Bobryshev Y.V., Sobenin I.A., Orekhov A.N., Andrianova I.V., Smirnov A.N. Lipid regulators during atherogenesis: expression of LXR, PPAR, and SREBP mRNA in the human aorta // PLoS One. 2013. Т. 8. № 5. — C. e63374. 144. Singaraja R.R., Brunham L.R., Visscher H., Kastelein J.J., Hayden M.R. Efflux and atherosclerosis: the clinical and biochemical impact of variations in the ABCA1 gene // Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2003. Т. 23. № 8. — C. 1322-32. 145. Singaraja R.R., Fievet C., Castro G., James E.R., Hennuyer N., Clee S.M., Bissada N., Choy J.C., Fruchart J.C., McManus B.M., Staels B., Hayden M.R. Increased ABCA1 activity protects against atherosclerosis // J Clin Invest. 2002. Т. 110. № 1. — C. 35-42. 146. Sivapalaratnam S., Basart H., Watkins N.A., Maiwald S., Rendon A., Krishnan U., Sondermeijer B.M., Creemers E.E., Pinto-Sietsma S.J., Hovingh K., Ouwehand W.H., Kastelein J.J., Goodall A.H., Trip M.D. Monocyte gene expression signature of patients with early onset coronary artery disease // PLoS One. 2012. Т. 7. № 2. — C. e32166. 147. Smith J.D., Trogan E., Ginsberg M., Grigaux C., Tian J., Miyata M. Decreased atherosclerosis in mice deficient in both macrophage colony-stimulating factor (op) and apolipoprotein E // Proc Natl Acad Sci U S A. 1995. Т. 92. № 18. — C. 8264-8. 110 148. Song C., Pedersen N.L., Reynolds C.A., Sabater-Lleal M., Kanoni S., Willenborg C., Consortium C.A.D., Syvanen A.C., Watkins H., Hamsten A., Prince J.A., Ingelsson E. Genetic variants from lipid-related pathways and risk for incident myocardial infarction // PLoS One. 2013. Т. 8. № 3. — C. e60454. 149. Soumian S., Gibbs R., Davies A., Albrecht C. mRNA expression of genes involved in lipid efflux and matrix degradation in occlusive and ectatic atherosclerotic disease // J Clin Pathol. 2005. Т. 58. № 12. — C. 1255-60. 150. Soumyarani V.S., Jayakumari N. Oxidatively modified high density lipoprotein promotes inflammatory response in human monocytes-macrophages by enhanced production of ROS, TNF-alpha, MMP-9, and MMP-2 // Mol Cell Biochem. 2012. Т. 366. № 1-2. — C. 277-85. 151. Steffensen K.R., Gustafsson J.A. Putative metabolic effects of the liver X receptor (LXR) // Diabetes. 2004. Т. 53 Suppl 1. — C. S36-42. 152. Sueyoshi S., Mitsumata M., Kusumi Y., Niihashi M., Esumi M., Yamada T., Sakurai I. Increased expression of peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR)-alpha and PPAR-gamma in human atherosclerosis // Pathol Res Pract. 2010. Т. 206. № 7. — C. 429-38. 153. Swirski F.K., Pittet M.J., Kircher M.F., Aikawa E., Jaffer F.A., Libby P., Weissleder R. Monocyte accumulation in mouse atherogenesis is progressive and proportional to extent of disease // Proc Natl Acad Sci U S A. 2006. Т. 103. № 27. — C. 10340-5. 154. Tabas I. Free cholesterol-induced cytotoxicity a possible contributing factor to macrophage foam cell necrosis in advanced atherosclerotic lesions // Trends Cardiovasc Med. 1997. Т. 7. № 7. — C. 256-63. 155. Tall A.R., Yvan-Charvet L., Terasaka N., Pagler T., Wang N. HDL, ABC transporters, and cholesterol efflux: implications for the treatment of atherosclerosis // Cell Metab. 2008. Т. 7. № 5. — C. 365-75. 156. Tangirala R.K., Bischoff E.D., Joseph S.B., Wagner B.L., Walczak R., Laffitte B.A., Daige C.L., Thomas D., Heyman R.A., Mangelsdorf D.J., Wang X., Lusis A.J., Tontonoz P., Schulman I.G. Identification of macrophage liver X receptors as 111 inhibitors of atherosclerosis // Proc Natl Acad Sci U S A. 2002. Т. 99. № 18. — C. 11896-901. 157. Teupser D., Kretzschmar D., Tennert C., Burkhardt R., Wilfert W., Fengler D., Naumann R., Sippel A.E., Thiery J. Effect of macrophage overexpression of murine liver X receptor-alpha (LXR-alpha) on atherosclerosis in LDL-receptor deficient mice // Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2008. Т. 28. № 11. — C. 2009-15. 158. Thymiakou E., Zannis V.I., Kardassis D. Physical and functional interactions between liver X receptor/retinoid X receptor and Sp1 modulate the transcriptional induction of the human ATP binding cassette transporter A1 gene by oxysterols and retinoids // Biochemistry. 2007. Т. 46. № 41. — C. 11473-83. 159. Tontonoz P., Nagy L., Alvarez J.G., Thomazy V.A., Evans R.M. PPARgamma promotes monocyte/macrophage differentiation and uptake of oxidized LDL // Cell. 1998. Т. 93. № 2. — C. 241-52. 160. Toth P.P. Should we target HDL cholesterol level in lowering cardiovascular risk? // Pol Arch Med Wewn. 2009. Т. 119. № 10. — C. 667-72. 161. Valledor A.F., Ricote M. Nuclear receptor signaling in macrophages // Biochem Pharmacol. 2004. Т. 67. № 2. — C. 201-12. 162. Van Dam M.J., de Groot E., Clee S.M., Hovingh G.K., Roelants R., Brooks-Wilson A., Zwinderman A.H., Smit A.J., Smelt A.H., Groen A.K., Hayden M.R., Kastelein J.J. Association between increased arterial-wall thickness and impairment in ABCA1-driven cholesterol efflux: an observational study // Lancet. 2002. Т. 359. № 9300. — C. 37-42. 163. Van Eck M., Bos I.S., Kaminski W.E., Orso E., Rothe G., Twisk J., Bottcher A., Van Amersfoort E.S., Christiansen-Weber T.A., Fung-Leung W.P., Van Berkel T.J., Schmitz G. Leukocyte ABCA1 controls susceptibility to atherosclerosis and macrophage recruitment into tissues // Proc Natl Acad Sci U S A. 2002. Т. 99. № 9. — C. 6298-303. 164. Van Eck M., Singaraja R.R., Ye D., Hildebrand R.B., James E.R., Hayden M.R., Van Berkel T.J. Macrophage ATP-binding cassette transporter A1 overexpression 112 inhibits atherosclerotic lesion progression in low-density lipoprotein receptor knockout mice // Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2006. Т. 26. № 4. — C. 929-34. 165. Voloshyna I., Reiss A.B. The ABC transporters in lipid flux and atherosclerosis // Prog Lipid Res. 2011. Т. 50. № 3. — C. 213-24. 166. Wahli W., Michalik L. PPARs at the crossroads of lipid signaling and inflammation // Trends Endocrinol Metab. 2012. Т. 23. № 7. — C. 351-63. 167. Waldo S.W., Li Y., Buono C., Zhao B., Billings E.M., Chang J., Kruth H.S. Heterogeneity of Human Macrophages in Culture and in Atherosclerotic Plaques // American Journal of Pathology. 2008. Т.172. — С.1112 – 1126. 168. Wang M.D., Franklin V., Marcel Y.L. In vivo reverse cholesterol transport from macrophages lacking ABCA1 expression is impaired // Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2007. Т. 27. № 8. — C. 1837-42 - a. 169. Wang N., Chen W., Linsel-Nitschke P., Martinez L.O., Agerholm-Larsen B., Silver D.L., Tall A.R. A PEST sequence in ABCA1 regulates degradation by calpain protease and stabilization of ABCA1 by apoA-I // J Clin Invest. 2003. Т. 111. № 1. — C. 99-107. 170. Wang N., Lan D., Chen W., Matsuura F., Tall A.R. ATP-binding cassette transporters G1 and G4 mediate cellular cholesterol efflux to high-density lipoproteins // Proc Natl Acad Sci U S A. 2004. Т. 101. № 26. — C. 9774-9. 171. Wang N., Silver D.L., Costet P., Tall A.R. Specific binding of ApoA-I, enhanced cholesterol efflux, and altered plasma membrane morphology in cells expressing ABC1 // J Biol Chem. 2000. Т. 275. № 42. — C. 33053-8. 172. Wang Q.G., Guo Z.G., Lai W.Y., Zha Z., Liu Y.Y., Liu L. [Detection of single nucleotide polymorphism of all coding regions in ABCA1 gene in patients with coronary heart disease] // Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao. 2006. Т. 26. № 1. — C. 42-5. 173. Wang X., Collins H.L., Ranalletta M., Fuki I.V., Billheimer J.T., Rothblat G.H., Tall A.R., Rader D.J. Macrophage ABCA1 and ABCG1, but not SR-BI, promote macrophage reverse cholesterol transport in vivo // J Clin Invest. 2007. Т. 117. № 8. — C. 2216-24 - b. 113 174. Wang Y., Kurdi-Haidar B., Oram J.F. LXR-mediated activation of macrophage stearoyl-CoA desaturase generates unsaturated fatty acids that destabilize ABCA1 // J Lipid Res. 2004. Т. 45. № 5. — C. 972-80. 175. Wellington C.L., Walker E.K., Suarez A., Kwok A., Bissada N., Singaraja R., Yang Y.Z., Zhang L.H., James E., Wilson J.E., Francone O., McManus B.M., Hayden M.R. ABCA1 mRNA and protein distribution patterns predict multiple different roles and levels of regulation // Lab Invest. 2002. Т. 82. № 3. — C. 273-83. 176. Wilson P.W., Castelli W.P., Kannel W.B. Coronary risk prediction in adults (the Framingham Heart Study) // Am J Cardiol. 1987. Т. 59. № 14. — C. 91G94G. 177. Wong J., Quinn C.M., Gelissen I.C., Jessup W., Brown A.J. The effect of statins on ABCA1 and ABCG1 expression in human macrophages is influenced by cellular cholesterol levels and extent of differentiation // Atherosclerosis. 2008. Т. 196. № 1. — C. 180-9. 178. Wu Z., Lou Y., Jin W., Liu Y., Lu L., Lu G. The Pro12Ala polymorphism in the peroxisome proliferator-activated receptor gamma-2 gene (PPARgamma2) is associated with increased risk of coronary artery disease: a meta-analysis // PLoS One. 2012. Т. 7. № 12. — C. e53105. 179. Yang H., Mohamed A.S., Zhou S.H. Oxidized low density lipoprotein, stem cells, and atherosclerosis // Lipids Health Dis. 2012. Т. 11. — C. 85. 180. Yang Y., Jiang Y., Wang Y., An W. Suppression of ABCA1 by unsaturated fatty acids leads to lipid accumulation in HepG2 cells // Biochimie. 2010. Т. 92. № 8. — C. 958-63. 181. Yessoufou A., Wahli W. Multifaceted roles of peroxisome proliferatoractivated receptors (PPARs) at the cellular and whole organism levels // Swiss Med Wkly. 2010. Т. 140. — C. w13071. 182. Yin Y.W., Li J.C., Gao D., Chen Y.X., Li B.H., Wang J.Z., Liu Y., Liao S.Q., Zhang M.J., Gao C.Y., Zhang L.L. Influence of ATP-binding cassette transporter 1 R219K and M883I polymorphisms on development of atherosclerosis: a metaanalysis of 58 studies // PLoS One. 2014. Т. 9. № 1. — C. e86480. 114 183. Yu X., Murao K., Imachi H., Li J., Nishiuchi T., Hosomi N., Masugata H., Zhang G.X., Iwama H., Ishida T. Hyperglycemia suppresses ABCA1 expression in vascular smooth muscle cells // Horm Metab Res. 2010. Т. 42. № 4. — C. 241-6. 184. Yvan-Charvet L., Ranalletta M., Wang N., Han S., Terasaka N., Li R., Welch C., Tall A.R. Combined deficiency of ABCA1 and ABCG1 promotes foam cell accumulation and accelerates atherosclerosis in mice // J Clin Invest. 2007. Т. 117. № 12. — C. 3900-8. 185. Yvan-Charvet L., Wang N., Tall A.R. Role of HDL, ABCA1, and ABCG1 transporters in cholesterol efflux and immune responses // Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2010. Т. 30. № 2. — C. 139-43. 186. Yvan-Charvet L., Welch C., Pagler T.A., Ranalletta M., Lamkanfi M., Han S., Ishibashi M., Li R., Wang N., Tall A.R. Increased inflammatory gene expression in ABC transporter-deficient macrophages: free cholesterol accumulation, increased signaling via toll-like receptors, and neutrophil infiltration of atherosclerotic lesions // Circulation. 2008. Т. 118. № 18. — C. 1837-47. 187. Zanotti I., Pedrelli M., Poti F., Stomeo G., Gomaraschi M., Calabresi L., Bernini F. Macrophage, but not systemic, apolipoprotein E is necessary for macrophage reverse cholesterol transport in vivo // Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2011. Т. 31. № 1. — C. 74-80. 188. Zhang Y., Zanotti I., Reilly M.P., Glick J.M., Rothblat G.H., Rader D.J. Overexpression of apolipoprotein A-I promotes reverse transport of cholesterol from macrophages to feces in vivo // Circulation. 2003. Т. 108. № 6. — C. 661-3. 189. Zhao C., Dahlman-Wright K. Liver X receptor in cholesterol metabolism // J Endocrinol. 2010. Т. 204. № 3. — C. 233-40. 190. Zhou X., Yin Z., Guo X., Hajjar D.P., Han J. Inhibition of ERK1/2 and activation of liver X receptor synergistically induce macrophage ABCA1 expression and cholesterol efflux // J Biol Chem. 2010. Т. 285. № 9. — C. 6316-26. 191. Zhu X., Lee J.Y., Timmins J.M., Brown J.M., Boudyguina E., Mulya A., Gebre A.K., Willingham M.C., Hiltbold E.M., Mishra N., Maeda N., Parks J.S. Increased cellular free cholesterol in macrophage-specific Abca1 knock-out mice 115 enhances pro-inflammatory response of macrophages // J Biol Chem. 2008. Т. 283. № 34. — C. 22930-41. 192. Zwarts K.Y., Clee S.M., Zwinderman A.H., Engert J.C., Singaraja R., Loubser O., James E., Roomp K., Hudson T.J., Jukema J.W., Kastelein J.J., Hayden M.R. ABCA1 regulatory variants influence coronary artery disease independent of effects on plasma lipid levels // Clin Genet. 2002. Т. 61. № 2. — C. 115-25.
