008180 Настоящее изобретение относится к соединениям, которые ингибируют адгезию лейкоцитов, и... α

008180
Настоящее изобретение относится к соединениям, которые ингибируют адгезию лейкоцитов, и в частности
адгезию лейкоцитов, опосредованную α4-интегринами, где α4-интегрином предпочтительно является VLA-4.
Следующие публикации, патенты и патентные заявки цитируются в данном описании в виде надстрочных цифр:
1
Hemler and Takada, European Patent Application Publication No. 330,506, published August 30, 1989.
2
Elices, et al., Cell, 60:577-584 (1990).
3
Springer, Nature, 346:425-434 (1990).
4
Osborn, Cell, 62:3-6 (1990).
5
Vedder, et al., Surgery, 106:509 (1989).
6
Pretolani, et al., J. Exp. Med., 180:795 (1994).
7
Abraham, et al., J. Clin. Invest., 93:776 (1994).
8
Mulligan, et al., J. Immunology, 150:2407 (1993).
9
Cybulsky, et al., Science, 251:788 (1991).
10
Li, et al., Arterioscler. Thromb., 13:197 (1993).
11
Sasseville, et al., Am. J. Path., 144:27 (1994).
12
Yang, et al., Proc. Nat. Acad. Science (USA), 90:10494 (1993).
13
Burkly, et al., Diabetes, 43:529 (1994).
14
Baron, et al., J. Clin. Invest., 93:1700 (1994).
15
Hamann, et al., J. Immunology, 152:3238 (1994).
16
Yednock, et al., Nature, 356:63 (1992).
17
Baron, et al., J. Exp. Med., 177:57 (1993).
18
van Dinther-Janssen, et al., J. Immunology, 147:4207 (1991).
19
van Dinther-Janssen, et al., Annals. Rheumatic Dis., 52:672 (1993).
20
Elices, et al., J. Clin. Invest., 93:405 (1994).
21
Postigo, et al., J. Clin. Invest., 89:1445 (1991).
22
Paul, et al., Transpl. Proceed., 25:813 (1993).
23
Okarhara, et al., Can. Res., 54:3233 (1994).
24
Paavonen, et al., Int. J. Can., 58:298 (1994).
25
Schadendorf, et al., J. Path., 170:429 (1993).
26
Bao, et al., Diff., 52:239 (1993).
27
Lauri, et al., British J. Cancer, 68:862 (1993).
28
Kawaguchi, et al., Japanese J. Cancer Res., 83:1304 (1992).
29
Konradi, et al., PCT/US00/01686, filed, January 21, 2000.
Все приведенные выше публикации целиком включены в настоящее описание во всей своей полноте ссылкой в такой степени, как если бы каждая индивидуальная публикация была специально и индивидуально указана для включения в настоящее описание в качестве ссылки во всей своей полноте.
VLA-4 (также относящейся как к α4β1-интегрину, так и к CD49d/CD29), впервые идентифицированный Hemler и Takada1, является членом семейства рецепторов β1-интегринов, располагающихся на поверхности клетки, каждый из которых включает две субъединицы - α-цепь и β-цепь. VLA-4 содержит α4цепь и β1-цепь. Существует, по крайней мере, девять β1-интегринов, которые имеют одинаковую β1-цепь
и каждый из которых имеет индивидуальную α-цепь. Все эти девять рецепторов связывают различный
комплемент разнообразных молекул клеточного матрикса, таких как фибронектин, ламинин и коллаген.
Например, VLA-4 связывается с фибронектином. VLA-4 связывает также нематриксные молекулы, которые экспрессируются эндотелиальными и другими клетками. Указанные нематриксные молекулы включают VCAM-1, который экспрессируется в культуре активированных цитокином эндотелиальных клеток
пупочной вены человека. Отдельные эпитопы VLA-4 отвечают за активность при связывании фибронектина и VCAM-1, и было показано, что каждая активность ингибируется независимо.2
Внеклеточная адгезия, опосредованная VLA-4 и другими рецепторами, располагающимися на поверхности клетки, связана с рядом ответных реакций на воспаление. На месте поражения или другого
воспалительного раздражителя активированные эндотелиальные клетки сосудов экспрессируют молекулы, которые обладают адгезией по отношению к лейкоцитам. Механизм адгезии лейкоцитов к эндотелиальным клеткам включает, частично, распознавание и связывание рецепторов, располагающихся на поверхности лейкоцитов, с соответствующими молекулами, находящимися на поверхности эндотелиальных клеток. Сразу после связывания лейкоциты мигрируют по стенке кровеносного сосуда, чтобы попасть к месту воспаления и высвободить химические посредники для борьбы с инфекцией. Обзоры по
рецепторам адгезии в иммунной системе см., например, у Springer3 и Osborn.4
Воспалительные заболевания мозга, такие как экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит
(ЕАЕ), рассеянный склероз (MS) и менингит, являются примерами заболеваний центральной нервной
системы, при которых механизм адгезии эндотелий/лейкоцит приводит к разрушению здоровой ткани
мозга. В связи с указанными воспалительными заболеваниями через гематоэнцефалический барьер (ВВВ)
мигрирует большое количество лейкоцитов. Лейкоциты высвобождают токсические посредники, которые
-1-
008180
вызывают экстенсивное повреждение тканей, приводящее к нарушению нервной проводимости и параличу.
В системе других органов повреждение тканей также происходит через механизм адгезии, приводящий
к миграции или активации лейкоцитов. Так, было показано, что первичный инсульт сердечной ткани после
ишемии миокарда может быть осложнен тем, что лейкоциты проникают в поврежденную ткань и вызывают
еще больший инсульт (Vedder et al.).5 Другие воспалительные или медицинские состояния, которые протекают посредством механизма адгезии, включают, например, астму6-8, болезнь Альцгеймера, атеросклероз9-10,
вызванную СПИД деменцию11, диабет12-14 (в том числе острый юношеский диабет), воспаление кишечника15
(включая язвенный колит и болезнь Крона), рассеянный склероз16-17, ревматоидный артрит18-21, трансплантацию тканей22, метастаз опухоли23-28, менингит, энцефалит, удар и другие травмы головного мозга, нефрит, ретинит, атопический дерматит, псориаз, ишемию миокарда и опосредованное лейкоцитами острое
поражение легкого, такое как поражение, наблюдаемое при респираторном дистресс-синдроме у взрослых.
Замещенные аминопиримидины описаны как класс ингибиторов связывания VLA-4 к VCAM-1, и,
следовательно, они обладают противовоспалительными свойствами.29 Поскольку указанные соединения
обладают антагонистическими свойствами по отношению к такому связыванию, то увеличение биодоступности указанных соединений приведет к усилению их эффективности.
Настоящее изобретение направлено на открытие того, что определенные N-[2-N',N'-диэтиламино-5аминосульфонилфенилпиримидин-4-ил]паракарбомилоксифенилаланиновые соединения неожиданно
обладают повышенной биодоступностью, которая определяется как площадь под кривой (AUC), по сравнению с другими ранее раскрытыми замещенными аминопиримидиновыми соединениями.
Один из аспектов настоящего изобретения относится к соединению формулы (I)
где каждый X независимо означает фтор, хлор или бром;
р равно 0 или целому числу от 1 до 3;
R1 выбирают из группы, включающей метил и этил;
R2 выбирают из группы, включающей низший алкил, низший алкенил и низший алкиленциклоалкил;
и его фармацевтически приемлемым солям.
Предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения включает соединения формулы (II)
где каждый X независимо выбирают из группы, включающей фтор и хлор;
m равно целому числу 1 или 2;
R2 выбирают из группы, включающей низший алкил, низший алкенил и низший алкиленциклоалкил;
и их фармацевтически приемлемые соли.
Наиболее предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения включает соединения
формулы (III)
-2-
008180
где каждый X независимо означает фтор или хлор;
n равно 0 или 1;
R2 означает -CH2-R', где R' выбирают из группы, включающей водород, метил или -СН=СН2;
и их фармацевтически приемлемые соли.
Другой предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения включает соединения
формулы (IV)
где каждый X независимо означает фтор, хлор или бром;
р равно 0 или целому числу от 1 до 3;
R1 выбирают из группы, включающей метил и этил;
R2 означает низший алкинил;
и их фармацевтически приемлемые соли.
Еще один наиболее предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения включает
соединения формулы (V)
где каждый X независимо выбирают из группы, включающей фтор или хлор;
m равно целому числу 1 или 2;
R2 означает низший алкинил;
и их фармацевтически приемлемые соли.
Наконец, еще один наиболее предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения
включает соединения формулы (VI)
где каждый X независимо означает фтор или хлор;
n равно 0 или 1;
R2 означает низший алкинил;
и их фармацевтически приемлемые соли.
В любой из формул (IV), (V) или (VI) заместитель R2 предпочтительно означает пропаргил.
N-[2-N',N'-Диэтиламино-5-аминосульфонилфенилпиримидин-4-ил]паракарбомилоксифенилаланиновые соединения, входящие в объем притязаний по настоящему изобретению, включают соединения,
которые приведены далее в табл. 1.
-3-
008180
Таблица 1
Конкретные соединения, входящие в объем притязаний по настоящему изобретению, включают
следующие. В настоящем описании эти соединения названы как производные пропионовой кислоты,
-4-
008180
однако, указанные соединение могли бы быть названы как производные N-[2-N',N'-диэтиламино-5-аминосульфонилфенилпиримидин-4-ил]паракарбамоилоксифенилаланина.
2-{2-Диэтиламино-5-[(4-хлорбензолсульфонил)метиламино]пиримидин-4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовая кислота;
2-{2-диэтиламино-5-[(4-фторбензолсульфонил)метиламино]пиримидин-4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовая кислота;
2-{2-диэтиламино-5-[(3,4-дифторбензолсульфонил)метиламино]пиримидин-4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовая кислота;
2-{2-диэтиламино-5-[(3,4-дихлорбензолсульфонил)метиламино]пиримидин-4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовая кислота;
2-{2-диэтиламино-5-[(бензолсульфонил)метиламино]пиримидин-4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовая кислота;
2-{2-диэтиламино-5-[(2-фторбензолсульфонил)метиламино]пиримидин-4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовая кислота;
2-{2-диэтиламино-5-[(3-фторбензолсульфонил)метиламино]пиримидин-4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовая кислота;
2-{2-диэтиламино-5-[(4-фторбензолсульфонил)изопропиламино]пиримидин-4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовая кислота;
2-{2-диэтиламино-5-[(4-фторбензолсульфонил)этиламино]пиримидин-4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовая кислота;
2-{2-диэтиламино-5-[(3,4-дифторбензолсульфонил)изопропиламино]пиримидин-4-иламино}-3-(4диметилкарбамоилоксифенил)пропионовая кислота;
2-{2-диэтиламино-5-[(4-хлорбензолсульфонил)изопропиламино]пиримидин-4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовая кислота;
2-{2-диэтиламино-5-[(3,4-фторбензолсульфонил)этиламино]пиримидин-4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовая кислота;
2-{2-диэтиламино-5-[(4-хлорбензолсульфонил)этиламино]пиримидин-4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовая кислота;
2-{2-диэтиламино-5-[(4-фторбензолсульфонил)циклопропилметиламино]пиримидин-4-иламино}-3(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовая кислота;
2-{2-диэтиламино-5-[(3,5-дифторбензолсульфонил)метиламино]пиримидин-4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовая кислота;
2-{2-диэтиламино-5-[(3,5-дифторбензолсульфонил)этиламино]пиримидин-4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовая кислота;
2-{2-диэтиламино-5-[(2,4-дифторбензолсульфонил)метиламино]пиримидин-4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовая кислота;
2-{2-диэтиламино-5-[(2,4-дифторбензолсульфонил)этиламино]пиримидин-4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовая кислота;
2-{2-диэтиламино-5-[(3,5-дихлорбензолсульфонил)метиламино]пиримидин-4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовая кислота;
2-{2-диэтиламино-5-[(3,5-дихлорбензолсульфонил)этиламино]пиримидин-4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовая кислота;
2-{2-диэтиламино-5-[(4-фторбензолсульфонил)-н-пропиламино]пиримидин-4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовая кислота;
2-{2-диэтиламино-5-[(4-фторбензолсульфонил)аллиламино]пиримидин-4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовая кислота;
2-{2-диэтиламино-5-[(4-фторбензолсульфонил)изобутиламино]пиримидин-4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовая кислота;
2-{2-диэтиламино-5-[(4-фторбензолсульфонил)-н-бутиламино]пиримидин-4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовая кислота;
2-{2-диэтиламино-5-[(2,6-дифторбензолсульфонил)метиламино]пиримидин-4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовая кислота;
2-{2-диэтиламино-5-[(2,3-дифторбензолсульфонил)этиламино]пиримидин-4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовая кислота;
2-{2-диэтиламино-5-[(4-фторбензолсульфонил)пропаргиламино]пиримидин-4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовая кислота;
2-{2-диэтиламино-5-[(2,4-дифторбензолсульфонил)пропаргиламино]пиримидин-4-иламино}-3-(4диметилкарбамоилоксифенил)пропионовая кислота;
2-{2-диэтиламино-5-[(4-фторбензолсульфонил)-(2-трисфторэтил)амино]пиримидин-4-иламино}-3(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовая кислота;
и их фармацевтически приемлемые соли.
Другим аспектом настоящего изобретения являются фармацевтические композиции, содержащие
-5-
008180
фармацевтически приемлемый носитель и терапевтически эффективное количество указанных в настоящем описании соединений.
Одним из аспектов настоящего изобретения, связанных со способами, является способ лечения у
пациента заболевания, опосредованного, по крайней мере, частично α4-интегрином, преимущественно
VLA-4, при этом способ включает введение пациенту композиции, содержащей фармацевтически приемлемый носитель и терапевтически эффективное количество соединения по настоящему изобретению.
Соединения и фармацевтические композиции по настоящему изобретению полезны при лечении
болезненных состояний, опосредованных, по крайней мере, частично α4-интегринами, где α4-интегрином
преимущественно является VLA-4, или адгезией лейкоцитов. Подобные болезненные состояния включают, например, астму, болезнь Альцгеймера, атеросклероз, вызванную СПИД деменцию, диабет (в том
числе острый юношеский диабет), воспаление кишечника (включая язвенный колит и болезнь Крона),
рассеянный склероз, ревматоидный артрит, трансплантацию тканей, метастаз опухоли, менингит, энцефалит, удар и другие травмы головного мозга, нефрит, ретинит, атопический дерматит, псориаз, ишемию
миокарда и опосредованное лейкоцитами острое поражение легкого, такое как поражение, наблюдаемое
при респираторном дистресс-синдроме у взрослых.
Другие болезненные состояния включают, однако, ими не ограничиваются, воспалительные состояния, такие как узловатая эритема, аллергический конъюнктивит, ретробульбарный неврит, увеит,
аллергический ринит, анкилозирующий спондилоартрит, псориатический артрит, васкулит, болезнь Рейтера, системная красная волчанка, прогрессирующий системный склероз, полимиозит, дерматомиозит,
некротический неинфекционный гранулематоз, аортит, саркоидоз, лимфоцитопения, темпоральный артериит, перикардит, миокардит, застойная сердечная недостаточность, нодозный полиартериит, аллергический синдром, аллергия, гиперэозинофилия, системный легочный васкулит с преимущественным поражением сосудов малого круга кровообращения (синдром Churg-Strauss), хроническая легочная непроходимость, аллергический пневмонит, хронический активный гепатит, интерстициальный цистит, аутоиммунное расстройство эндокринной системы, первичный билиарный цирроз печени, аутоиммунная гипопластическая анемия, хронический персистирующий гепатит и тиреоидит.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения опосредованным α4-интегрином болезненным состоянием является воспалительное заболевание.
Как указано выше, настоящее изобретение относится к ингибирующим адгезию лейкоцитов соединениям,
в частности адгезию лейкоцитов, опосредованную, по крайней мере, частично α4-интегринами, преимущественно VLA-4. Тем не менее, перед более подробным описанием изобретения должен быть определен ряд терминов.
Если специально не оговаривается, следующие термины, используемые в описании изобретения и
формуле изобретения, имеют указанное ниже значение.
По тексту настоящего описания "низший алкил" относится к одновалентным алкильным группам,
содержащим от 1 до 5 атомов углерода, и включает алкильные группы как с прямой, так и разветвленной
цепью. Этот термин поясняется примерами таких групп, как метил, этил, изопропил, н-пропил, н-бутил, изобутил, втор-бутил, трет-бутил, н-пентил и т.п. "Низший алкил" необязательно может содержать в
качестве заместителя галоген, такой как хлор, фтор, бром и т.п.
Термин "низший алкилен" относится к двухвалентным алкиленовым группам, содержащим от 1 до
4 атомов углерода, и включает алкиленовые группы, как с прямой, так и разветвленной цепью. Этот термин поясняется примерами таких групп, как метилен, этилен, н-пропилен, изопропилен (-СН2СН(СН3)- и
-СН(СН3)СН2-) и т.п.
Термин "низший алкинил" относится к алкинильной группе, предпочтительно содержащей от 2 до 6
атомов углерода и имеющей по крайней мере одно место или предпочтительно единственное место алкинильной ненасыщенности (т.е. -С≡С). Примерами для приведенных терминов являются такие группы,
как ацетил (-С≡СН), пропаргил (-СН2-С≡СН) , 3-бутинил (-СН2СН2С≡СН) и т.п.
Термин "низший циклоалкил" относится к циклическим алкильным группам, содержащим от 3 до 6
атомов углерода и имеющим одно циклическое кольцо, включающее в качестве примера циклопропил,
циклобутил, циклопентил и циклогексил.
Термин "низший алкиленциклоалкил" относится к группе, содержащей низший алкилен-низший
циклоалкил, как определено в настоящем описании. Примерами подобных групп являются метиленциклопропил (-СН2-циклопропил), этиленциклопропил и т.п.
"Фармацевтически приемлемый носитель" означает носитель, который применим для получения
фармацевтической композиции и обычно является безопасным, нетоксичным и не является ни биологически, ни каким-либо другим образом нежелательным, и включает носитель, который приемлем для ветеринарии, а также для фармацевтического применения при лечении людей. "Фармацевтически приемлемый носитель", используемый в настоящем описании и формуле изобретения, включает как один, так
и несколько подобных носителей.
"Лечение" заболевания включает следующее:
(1) профилактика заболевания, т.е. действие, направленное на то, чтобы у млекопитающего, которое может
быть подвержено заболеванию или предрасположено к заболеванию, но которое еще не испытывает симптомы
-6-
008180
заболевания или у которого не проявляются симптомы заболевания, не развились симптомы этого заболевания,
(2) подавление заболевания, т.е. прекращение заболевания или ослабление развития заболевания
или его клинических симптомов, или
(3) ослабление заболевания, т.е. действие, направленное на то, чтобы вызвать регресс заболевания
или его клинических симптомов.
"Терапевтически эффективное количество" означает количество соединения, которое после введения млекопитающему с целью лечения заболевания является достаточным для оказания подобного лечения заболевания. "Терапевтически эффективное количество" варьирует в зависимости от соединения,
заболевания и его тяжести, а также возраста, массы и т.д. млекопитающего, подвергаемого лечению.
"Фармацевтически приемлемая соль" относится к фармацевтически приемлемым солям соединения
формулы (I), при этом указанные соли получают из различных органических и неорганических противоионов, хорошо известных в данной области и содержащих, лишь в качестве примера, ионы натрия, калия,
кальция, магния, аммония, тетраалкиламмония и т.п.; и в том случае, когда молекула содержит основную
функцию, они включают соли органических и неорганических кислот, такие как хлорид, бромид, тартрат, мезилат, ацетат, малеат, оксалат и т.п.
Интегрины представляют собой семейство гомологичных трансмембранных связующих белков, которые являются основными рецепторами на клетках животных при связывании большинства белков внеклеточного матрикса, таких как коллаген, фибронектин и ламинин. Интегрины представляют собой гетеродимеры, состоящие из α-цепи и β-цепи. В настоящее время идентифицировано 20 различных интегринов,
составленных из 9 различных α-субъединиц и 14 различных β-субъединиц. Термин "α4-интегрины" относится к классу гетеродимерных, связанных с ферментом рецепторов на поверхности клетки, которые содержат α4-субъединицу в паре с одной из β-субъединиц. VLA-4 является примером α4-интегрина и представляет собой гетеродимер α4-субъединицы и β1-субъединицы, и его также обозначают как α4β1-интегрин.
Соединения по настоящему изобретению могут быть получены из легкодоступных исходных веществ с помощью способов и методик, которые приведены ниже в примерах. Эти способы и методики
приводят конкретное описание проведения реакций для получения N-[2-N',N'-диэтиламино-5-аминосульфонилфенилпиримидин-4-ил]паракарбомилоксифенилаланиновых соединений. Соединения, входящие в
объем притязаний по настоящему изобретению, но не приведенные в представленных примерах и способах, легко получают путем соответствующего замещения исходных веществ, которые либо коммерчески
доступны, либо хорошо известны в данной области.
Другие методики и условия проведения реакций при получении соединений по настоящему изобретению описаны в приведенных ниже примерах. Кроме того, другие методики получения соединений,
полезных в определенных аспектах настоящего изобретения, указаны в патенте США 6492372, описание
которого включено в настоящее описание во всей своей полноте посредством ссылки.
При использовании в фармации соединения по настоящему изобретению обычно вводят в форме
фармацевтических композиций. Указанные композиции могут вводиться различным путем, в том числе
перорально, ректально, трансдермально, подкожно, внутривенно, внутримышечно и интраназально. Указанные соединения эффективны как при введении в виде инъекции, так и перорально. Такие композиции
получают по способам, хорошо известным из области фармации, и они содержат по крайней мере одно
активное соединение.
Настоящее изобретение включает также фармацевтические композиции, которые содержат в качестве активного ингредиента одно или несколько указанных выше соединений формул (I)-(VI) вместе с
фармацевтически приемлемыми носителями. При составлении композиций по настоящему изобретению
активные ингредиенты обычно смешивают с эксципиентом, разводят эксципиентом или заключают
внутрь такого носителя, который может иметь форму капсулы, саше, пакетика или другого контейнера.
Применяемый эксципиент, как правило, является эксципиентом, подходящим для введения человеку или
млекопитающим. Если эксципиентом служит разбавитель, то он может быть твердым, полутвердым или
жидким веществом, которое играет роль средства доставки, носителя или среды для активного ингредиента. Так, композиции могут быть в форме таблеток, пилюль, порошков, лепешек, саше, крахмальных
облаток, эликсиров, суспензий, эмульсий, растворов, сиропов, аэрозолей (в виде твердой или жидкой
среды), мазей, содержащих, например, вплоть до 10 мас.% активного ингредиента, мягких и твердых желатиновых капсул, суппозиториев, стерильных растворов для инъекции и стерильно упакованных порошков.
При приготовлении составов может потребоваться измельчить активное соединение, с целью получения соответствующего размера частиц активного соединения, перед его объединением с другими ингредиентами. Если активное соединение является практически нерастворимым, то его обычно измельчают до частиц размером менее 200 меш США. Если активное соединение хорошо растворяется в воде, то
размер частиц путем измельчения доводят до размера приблизительно 40 меш США, обеспечивающего
однородное распределение соединения в композиции.
Некоторые примеры подходящих эксципиентов включают лактозу, декстрозу, сахарозу, сорбит,
маннит, крахмалы, камедь, фосфат кальция, альгинаты, смолу трагаканта, желатин, силикат кальция,
микрокристаллическую целлюлозу, поливинилпирролидон, целлюлозу, воду, сироп и метилцеллюлозу.
-7-
008180
Составы могут дополнительно включать лубриканты, такие как тальк, стеарат магния и минеральное
масло; смачивающие агенты; эмульгирующие и суспендирующие агенты; консерванты, такие как метили пропилгидроксибензоаты; подслащиватели и отдушки. С помощью методик, известных из данной области, композиции по настоящему изобретению могут быть составлены для получения быстрого, пролонгированного или отложенного высвобождения активных ингредиентов после введения пациенту.
Композиции преимущественно готовят в виде единичной дозировочной формы, при этом каждая
доза содержит приблизительно от 5 до приблизительно 100 мг, обычно приблизительно от 10 до приблизительно 30 мг, активного ингредиента. Термин "единичные дозировочные формы" относится к физически дискретным единицам, которые могут применяться в качестве однократной дозы для людей и млекопитающих, при этом каждая единица содержит определенное количество активного вещества, рассчитанного таким образом, чтобы получить требуемый терапевтический эффект, вместе с подходящим фармацевтическим эксципиентом.
Активное соединение эффективно в широком диапазоне доз и обычно вводится в терапевтически
эффективном количестве. Следует, однако, понимать, что вводимое количество соединения обычно определяет врач в зависимости от соответствующих обстоятельств, в том числе состояния, лечение которого проводят, выбранного пути введения, конкретного вводимого соединения, возраста, массы и реакции
индивидуального пациента, тяжести симптомов у пациента и т.п.
Для получения твердых композиций, таких как таблетки, основной активный ингредиент смешивают с фармацевтическим эксципиентом с образованием твердой предварительной композиции, содержащей гомогенную смесь соединения по настоящему изобретению. Когда указанные предварительные
композиции называют гомогенными, то это означает, что активный ингредиент равномерно распределен
в композиции, так что композицию можно легко разделить на одинаково эффективные дозированные
формы, такие как таблетки, пилюли и капсулы. Твердые составы затем делят на единичные дозированные формы, тип которых указан выше, содержащие, например, от 0,1 до приблизительно 500 мг активного ингредиента по настоящему изобретению.
Таблетки или пилюли по настоящему изобретению могут иметь покрытие или же быть сформованы
каким-либо другим способом с тем, чтобы можно было получить дозированную форму, которая предоставляет преимущества пролонгированного действия. Например, таблетка или пилюля может содержать
внутренний дозированный и внешний дозированный компонент, при этом последний может играть роль
конверта для внутреннего слоя. Два компонента могут быть разделены энтеросолюбильным компонентом, который служит для того, чтобы обеспечить устойчивость внутреннего компонента к разрушению в
желудке и позволить внутреннему компоненту в целости и сохранности попасть в двенадцатиперстную
кишку или отсрочить его высвобождение. Для формирования указанных энтеросолюбильных слоев могут применяться различные вещества, и подобные вещества включают ряд полимерных кислот и смесей
полимерных кислот с такими веществами, как шеллак, цетиловый спирт и ацетат целлюлозы.
Жидкие формы, в которые новые соединения по настоящему изобретению могут добавляться для
введения перорально или в виде инъекции, включают водные растворы, соответствующим образом ароматизированные сиропы, водные или масляные суспензии, ароматизированные эмульсии с пригодными в
пищу маслами, такими как хлопковое масло, кунжутное масло, кокосовое масло или арахисовое масло, а
также эликсиры и подобные фармацевтические носители.
Композиции для ингаляции или инсуффляции включают растворы и суспензии в фармацевтически
приемлемых водных или органических растворителях и их смесях или порошки. Жидкие или твердые
композиции могут содержать указанные выше подходящие фармацевтически приемлемые эксципиенты.
Композиции предпочтительно вводят респираторно через рот или нос с целью достижения местного или
системного эффекта. Композиции в предпочтительно фармацевтически приемлемых растворителях можно распылять с помощью инертных газов. Распыленные растворы можно вдыхать непосредственно из
пульверизатора, или же пульверизатор может быть присоединен к тампону на маске для лица или к дыхательному аппарату, создающему пульсирующее положительное давление. Композиции в форме растворов, суспензий или порошков могут вводиться, предпочтительно через рот или через нос, из устройств, которые подают композицию подходящим образом.
Следующие примеры составов иллюстрируют фармацевтические композиции по настоящему изобретению.
Пример состава 1.
Получают твердую желатиновую капсулу, содержащую следующие ингредиенты.
Ингредиент
Количество, мг/капсула
Активный ингредиент
30,0
Крахмал
305,0
Стеарат магния
5,0
Указанные выше ингредиенты смешивают и заполняют ими твердую желатиновую капсулу в количестве 340 мг.
Пример состава 2.
Получают формулу таблетки, используя следующие ингредиенты.
-8-
008180
Ингредиент
Активный ингредиент
Микрокристаллическая целлюлоза
Коллоидный диоксид кремния
Стеариновая кислота
Количество, мг/таблетка
25,0
200,0
10,0
5,0
Компоненты смешивают и спрессовывают в форме таблеток, каждая из которых имеет массу 240 мг.
Пример состава 3.
Получают сухую композицию для ингаляции в виде порошка, содержащую следующие компоненты.
Ингредиент
Масса, %
Активный ингредиент
5
Лактоза
95
Активную смесь смешивают с лактозой и полученную смесь добавляют к сухому порошку для ингалятора.
Пример состава 4.
Таблетки, каждая из которых содержит 30 мг активного ингредиента, получают следующим образом.
Ингредиент
Количество, мг/таблетка
Активный ингредиент
30,0 мг
Крахмал
45,0 мг
Микрокристаллическая целлюлоза
35,0 мг
Поливинилпирролидон (в виде 10%-ного раствора в воде)
4,0 мг
Натрийкарбоксиметилкрахмал
4,5 мг
Стеарат магния
0,5 мг
Тальк
1,0 мг
Общая масса
120,0 мг
Активный ингредиент, крахмал и целлюлозу пропускают через сита 20 меш США и тщательно
смешивают. Полученные порошки смешивают с раствором поливинилпирролидона и пропускают через
сита 16 меш США. Получаемые гранулы сушат при температуре в интервале от 50 до 60°С и вновь пропускают через сита 16 меш США. Затем к гранулам добавляют натрийкарбоксиметилкрахмал, стеарат
магния и тальк, предварительно пропущенные через сита 30 меш США, и после смешения спрессовывают в машине для таблетирования, получая таблетки, каждая из которых весит 120 мг.
Пример состава 5.
Капсулы, каждая из которых содержит 40 мг лекарственного средства, получают следующим образом.
Ингредиент
Количество, мг/капсула
Активный ингредиент
40,0 мг
Крахмал
109,0 мг
Стеарат магния
1,0 мг
Общая масса
150,0 мг
Активный ингредиент, крахмал и стеарат магния смешивают, пропускают через сита 20 меш США
и полученной смесью в количестве 150 мг заполняют твердые желатиновые капсулы.
Пример состава 6.
Суппозитории, каждый из которых содержит 25 мг активного ингредиента, получают следующим образом.
Ингредиент
Количество
Активный ингредиент
25 мг
Глицериды насыщенной жирной кислоты до
2000 мг
Активный ингредиент пропускают через сита 60 меш США и суспендируют в глицеридах насыщенной жирной кислоты, предварительно расплавленных при минимальном нагреве. Затем смесь выливают в пресс-форму для изготовления суппозиториев с номинальной массой 2,0 г и дают остыть.
Пример состава 7.
Суспензии, каждая из которых содержит 50 мг лекарственного средства в дозе объемом 5,0 мл, получают следующим образом.
Ингредиент
Количество
Активный ингредиент
50,0 мг
Смола ксантана
4,0 мг
Натрийкарбоксиметилцеллюлоза (11%)
Микрокристаллическая целлюлоза (89%)
50,0 мг
Сахароза
1,75 г
Бензоат натрия
10,0 мг
Отдушка и краситель
q.v.
Очищенная вода
5,0 мл
-9-
008180
Лекарственное средство, сахарозу и смолу ксантана смешивают, пропускают через сита 10 меш
США и затем смешивают с предварительно приготовленным раствором микрокристаллической целлюлозы и натрийкарбоксиметилцеллюлозы в воде. Бензоат натрия, отдушку и краситель разводят в некотором количестве воды и добавляют к смеси при перемешивании. Добавляют достаточное количество воды, чтобы получить требуемый объем.
Пример состава 8.
Ингредиент
Количество, мг/капсула
Активный ингредиент
15,0 мг
Крахмал
407,0 мг
Стеарат магния
3,0 мг
Общая масса
425,0 мг
Активный ингредиент, крахмал и стеарат магния смешивают, пропускают через сита 20 меш США
и полученной смесью в количестве 425 мг заполняют твердые желатиновые капсулы.
Пример состава 9.
Состав для внутривенного назначения может быть получен следующим образом.
Ингредиент
Количество
Активный ингредиент
250,0 мг
Изотонический физиологический раствор
1000 мл
Пример состава 10.
Состав для местного введения может быть получен следующим образом.
Ингредиент
Количество
Активный ингредиент
1-10 г
Эмульгирующийся воск
30 г
Жидкий парафин
20 г
Белый мягкий парафин
от 2 до 100 г
Белый мягкий парафин нагревают до расплавления. Добавляют жидкий парафин и эмульгирующийся воск и перемешивают до полного растворения. Добавляют активный ингредиент и перемешивают
до получения однородной дисперсии. Смесь охлаждают до затвердевания.
Другими предпочтительными составами, применяемыми в способах по настоящему изобретению,
являются приспособления для чрескожной доставки ("пэтчи"). Подобные чрескожные пэтчи могут применяться для обеспечения непрерывной или периодической инфузии соединений по настоящему изобретению в контролируемых количествах. Приготовление и применение чрескожных пэтчей для доставки
фармацевтических средств хорошо известно в данной области. См, в частности, патент США 5023252,
опубликованный 11 июня 1991г., включенный в настоящее описание во всей своей полноте посредством
ссылки. Подобные пэтчи могут быть приготовлены для непрерывной или пульсирующей доставки фармацевтических средств или доставки по требованию.
В тех случаях, когда необходимо ввести фармацевтические композиции в мозг, могут применяться
методики прямого или непрямого размещения устройств. Прямые методики обычно включают размещение катетера для доставки лекарства в желудочковую систему реципиента в обход гематоэнцефалического барьера. Одна из таких имплантируемых систем доставки, которые применяют для транспортирования
биологических факторов в конкретные анатомические участки организма, описана в патенте США
5011472, включенном в настоящее описание во всей своей полноте посредством ссылки.
Непрямые методики, которые, в общем случае, являются предпочтительными, обычно включают
приготовление композиции таким образом, чтобы лекарственное средство временно было латентным за счет
превращения гидрофильных лекарственных средств в растворимые в липидах лекарства. Превращение
лекарственного средства в латентное обычно достигается путем блокирования гидроксильных, карбонильных, сульфатных групп и первичных аминогрупп лекарственного средства, при этом лекарственное средство
становится более растворимым в липидах и легче поддается транспортировке через гематоэнцефалический
барьер. Альтернативно, доставку гидрофильных лекарствнных средств можно облегчить внутриартериальной
инфузией гипертонических растворов, которые способны временно открыть гематоэнцефалический барьер.
Соединения по настоящему изобретению in vivo ингибируют опосредованную, по крайней мере,
частично α4-интегринами адгезию лейкоцитов к эндотелиальным клеткам, при этом α4-интегрином предпочтительно является VLA-4. Таким образом, соединения по настоящему изобретению могут применяться при лечении болезней млекопитающих, опосредованные α4-интегринами, при этом α4-интегрином
предпочтительно является VLA-4, или адгезией лейкоцитов. Подобные болезни включают воспалительные заболевания млекопитающих пациентов, такие как астма, болезнь Альцгеймера, атеросклероз, вызванная СПИД деменция, диабет (в том числе острый юношеский диабет), воспаление кишечника (включая язвенный колит и болезнь Крона), рассеянный склероз, ревматоидный артрит, трансплантация тка- 10 -
008180
ней, метастаз опухоли, менингит, энцефалит, удар и другие травмы головного мозга, нефрит, ретинит,
атопический дерматит, псориаз, ишемия миокарда и опосредованное лейкоцитами острое поражение
легкого, такое как поражение, наблюдаемое при респираторном дистресс-синдроме у взрослых.
Количество лекарственного средства, вводимое млекопитающему пациенту, будет варьировать в
зависимости от того, какое лекарственное средство вводят, цели введения, например для профилактики
или для терапии, состояния пациента, пути введения и т.п. При терапевтических применениях композиции вводят пациенту, который уже страдает от заболевания, в количестве, достаточном для излечивания
или, по крайней мере, частичного сдерживания симптомов болезни и ее осложнений. Адекватное для
достижения этой цели количество называют "терапевтически эффективной дозой". Эффективное при
данном применении количество лекарственного средства будет зависеть от состояния болезни, лечение
которой проводят, а также от решения, принимаемого лечащим врачом в зависимости от таких факторов,
как тяжесть воспаления, возраст, масса и общее состояние пациента и т.п.
Композиции, которые вводят пациенту, имеют форму описанных выше фармацевтических композиций. Указанные композиции можно стерилизовать с применением обычных методов стерилизации или
же их можно стерилизовать фильтрацией. Полученные водные растворы могут быть упакованы для использования как таковые или же их предварительно лиофилизуют, при этом лиофилизованный препарат
перед введением смешивают со стерильным водным носителем. рН препаратов соединений обычно составляет от 3 до 11, более предпочтительно от 5 до 9 и наиболее предпочтительно от 7 до 8. Следует понимать, что применение конкретных указанных выше эксципиентов, носителей или стабилизаторов приводит к образованию фармацевтических солей.
Терапевтическая дозировка соединений по настоящему изобретению будет варьировать в зависимости, например, от конкретного применения в процессе лечения, способа введения лекарственного
средства, здоровья и состояния пациента и от решения врача, который назначает лечение. Например, при
внутривенном введении доза обычно составляет приблизительно от 20 до приблизительно 500 мкг на
килограмм массы тела, предпочтительно приблизительно от 100 мкг до приблизительно 300 мкг на килограмм массы тела. Подходящие диапазоны доз для интраназального введения обычно составляют приблизительно от 0,1 пг до 1 мг на килограмм массы тела. Величину эффективной дозы можно экстраполировать
из кривых зависимости от дозы, полученных in vitro для тестовых систем на основе животных моделей.
Приведенные далее синтетические и биологические примеры предлагаются для иллюстрации настоящего изобретения, и их ни в коем случае не следует рассматривать как ограничивающие объем притязаний по настоящему изобретению. Если специально не оговаривается, то температуры приведены в
градусах Цельсия.
Примеры
В приведенных ниже примерах следующие сокращения имеют указанное значение. Если сокращение не определено, то оно имеет общепринятое значение.
AUC
Площадь под кривой
BSA
Бычий сывороточный альбумин
DMAP
4-N,N-Диметиламинопиридин
ДМСО
Диметилсульфоксид
EDC
Гидрохлорид 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимида
EDTA
Этилендиаминтетрауксусная кислота
EtOAc
Этилацетат
EtOH
Этанол
уш.д
Уширенный дублет
уш.с
Уширенный синглет
Д
Дублет
м
Мультиплет
т
Триплет
с
Синглет
FACS
Активируемый флюоресценцией анализатор клеток
FITC
Изотиоцианат флюоресцеина
Fmoc
N-(9-Флуоренилметоксикарбонил)
FmocONSu
Сукцинимид N-(9-флуоренилметоксикарбонила)
HBSS
Сбалансированный физиологический раствор Ханка
Hepes
4-(2-Гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфокислота
HOBT
Гидрат 1-гидроксибензотриазола
IgG Fc
Связующий домен иммуноглобулина
ЖХМС
Жидкостная хроматография/масс-спектрометрия
M
Молярный
Hct
Хематокрит или измерение компактных красных кровяных клеток, полученных
центрифугированием в объеме образца крови
HB
Гемоглобин
- 11 -
008180
MCH
MCHC
MCV
RBC
МеОН
н
NaOEt
NMM
OtBu
PBS++
Phe
Pro
q.s.
Rf
t-BuOH
TFA
ТГФ
ТСХ
TYR
Vt
WBC
Среднее содержание корпускулярного гемоглобина; Hb/RBC
Среднее содержание корпускулярного гемоглобина, выраженное в процентах; Hb/Hct
Средний корпускулярный объем, средний объем эритроцитов, обычно выражаемый
в кубических микронах на одну красную клетку
Эритроциты
Метанол
Нормальная концентрация
Этоксид натрия
N-Метилморфолин
трет-Бутокси
Забуференный фосфатом физиологический раствор
L-Фенилаланин
L-Пролин
Довести до объема
Время удерживания
трет-Бутанол
Трифторуксусная кислота
Тетрагидрофуран
Тонкослойная хроматография
Тирозин
Общий объем
Лейкоциты
Пример 1. Получение 2-{2-диэтиламино-5-[(4-фторбензолсульфонил)метиламино]пиримидин-4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовой кислоты.
Общая часть.
Флэш-хроматографию проводят на приборе Biotage Flash 75L, используя патроны оксида кремния
KP-Sil массой 800 г (32-63 мкМ, 60 Å, 500-550 м2/г). Величины Rf указаны для аналитической тонкослойной хроматографии, которую проводят с использованием толстых пластинок ЕМ Science Silica Gel F(254)
250 мкМ для нормальной фазы и толстых пластинок Watman MKC18F 200 мкМ для обращенной фазы.
Стадия 1. Получение 2,4-дихлор-5-нитропиримидина.
5-Нитроурацил обрабатывают оксихлоридом фосфора и N,N-диметиланилином в соответствии с
методикой, приведенной (Whittaker, J. Chem. Soc. 1951, 1565), и получают указанное в заголовке соединение, которое также можно получить от компании City Chemical (Уэст-Хейвен, Коннектикут).
Стадия 2. Получение трет-бутилового эфира 2-(2-диэтиламино-5-нитропиримидин-4-иламино)-3-(4гидроксифенил)пропионовой кислоты.
К раствору 2-амино-3-(4-гидроксифенил)пропионовой кислоты (30,6 г, 0,129 моль) в ТГФ (250 мл)
при температуре -10°С добавляют 2,4-дихлор-5-нитропиримидин (25 г, 0,129 моль), поддерживая в процессе добавления температуру не выше 5°С. По завершении добавления по каплям добавляют N,N-диизопропилэтиламин (33,7 мл, 0,194 моль). Перемешивают 1 ч при температуре -10°С, медленно добавляют диэтиламин (66,73 мл, 0,645 моль) и затем реакционной смеси в течение ночи дают нагреться до комнатной температуры. Реакционную смесь разбавляют диэтиловым эфиром (500 мл) и органический слой
промывают 0,2н раствором лимонной кислоты (3x150 мл), водой (1x150 мл) и 10%-ным раствором карбоната калия (3x150 мл). Органическую фазу сушат (над Na2SO4), фильтруют и концентрируют в вакууме, получая остаток желтого цвета. Остаток очищают флэш-хроматографией (20% EtOAc/гексан на силикагеле) и получают 37,39 г (67%) указанного в заголовке соединения в виде желтой пены. Rf=0,21
(25% EtOAc/гексан на силикагеле).
Стадия 3. Получение трет-бутилового эфира 2-(2-диэтиламино-5-нитропиримидин-4-иламино)-3-(4диметилкарбамоилоксифенил)пропионовой кислоты.
К раствору трет-бутилового эфира 2-(2-диэтиламино-5-нитропиримидин-4-иламино)-3-(4-гидроксифенил)пропионовой кислоты (31,80 г, 0,074 моль) в СН2Сl2 (600 мл) добавляют DMAP (9,00 г, 0,074 моль).
Через 5 мин по каплям добавляют триэтиламин (10,23 мл, 0,074 моль). По каплям добавляют N,N-диметилкарбамоилхлорид (13,83 мл, 0,110 моль) и реакционную смесь кипятят с обратным холодильником в
течение ночи. Реакционную смесь концентрируют в вакууме и остаток забирают в EtOAc (1 л). Органическую фазу промывают 0,5М раствором лимонной кислоты (3x250 мл), насыщенным раствором NaHCO3
(3x250 мл), насыщенным раствором соли (1x250 мл), сушат (над MgSO4), фильтруют, концентрируют в
вакууме и получают 37,0 г (99%) указанного в заголовке соединения в виде белого твердого вещества.
Стадия 4. Получение трет-бутилового эфира 2-(2-диэтиламино-5-аминопиримидин-4-иламино)-3-(4диметилкарбамоилоксифенил)пропионовой кислоты.
Смесь трет-бутилового эфира 2-(2-диэтиламино-5-нитропиримидин-4-иламино)-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовой кислоты (37,0 г, 0,073 моль) и 10%-ного Pd/C (3,8 г, 10 мас.% Pd) в EtOH
(250 мл) встряхивают в атмосфере водорода при давлении 60 фунт/дюйм2 до тех пор, пока ТСХ (50%
- 12 -
008180
EtOAC/гексан на силикагеле) не покажет 100%-ную конверсию в продукт (48 ч). Затем реакционную
смесь фильтруют через слой целита и концентрируют в вакууме, получая 32,0 г (92%) указанного в заголовке соединения в виде пены фиолетового цвета.
Стадия 5. Получение трет-бутилового эфира 2-{2-диэтиламино-5-[(4-фторбензолсульфонил)амино]
пиримидин-4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовой кислоты.
Раствор трет-бутилового эфира 2-(2-диэтиламино-5-аминопиримидин-4-иламино)-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовой кислоты (32,0 г, 0,067 моль) в пиридине (120 мл) охлаждают до -20°С на
бане сухой лед/ацетонитрил. Смесь перемешивают в течение 30 мин и затем медленно добавляют парафторбензолсульфохлорид (13,18 г, 0,067 моль). Реакционную смесь перемешивают при температуре -20°С
в течение 4,5 ч и затем добавляют 3-диметиламинопропиламин (8,52 мл, 0,067 моль) и смесь оставляют
на ночь нагреваться до комнатной температуры. Реакционную смесь упаривают в вакууме. Остаток растворяют в EtOAc (1 л) и органическую фазу промывают 0,5М раствором лимонной кислоты (3x900 мл),
водой (1x900 мл), насыщенным раствором NaHCO3 (3x900 мл), насыщенным раствором соли (1x900 мл),
сушат (над MgSO4), фильтруют, концентрируют в вакууме с получением коричневого остатка. Остаток
очищают флэш-хроматографией (50% EtOAc/гексан на силикагеле) и получают 33,04 г (77%) указанного
в заголовке соединения в виде желтой пены. Rf=0,54 (3:2 EtOAc/гексан на силикагеле).
Стадия 6. Получение трет-бутилового эфира 2-{2-диэтиламино-5-[(4-фторбензолсульфонил)метиламино]пиримидин-4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовой кислоты.
К раствору трет-бутилового эфира 2-{2-диэтиламино-5-[(4-фторбензолсульфонил)амино]пиримидин-4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовой кислоты (33,04 г, 0,052 моль) в ацетоне
(510 мл) добавляют К2СО3 (8,69 г, 0,063 моль) и смесь перемешивают в течение 10 мин при комнатной
температуре. Медленно добавляют диметилсульфат (5,95 мл, 0,063 моль) и реакционную смесь оставляют на ночь перемешиваться при комнатной температуре. Реакционную смесь концентрируют в вакууме и
остаток забирают в EtOAc (600 мл). Органическую фазу промывают водой (2x400 мл), насыщенным раствором соли (2x400 мл), сушат над MgSO4, фильтруют и концентрируют в вакууме. Остаток очищают
флэш-хроматографией (2:1 гексан/EtOAc на силикагеле) и получают 28,69 г (85%) указанного в заголовке соединения в виде белого твердого вещества.
Стадия 7. Получение гидрохлорида 2-{2-диэтиламино-5-[(4-фторбензолсульфонил)метиламино]пиримидин-4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовой кислоты.
Раствор трет-бутилового эфира 2-{2-диэтиламино-5-[(4-фторбензолсульфонил)метиламино]пиримидин-4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовой кислоты (28,69 г, 0,044 моль) в муравьиной кислоте (500 мл) нагревают до 70°С в течение 2 ч и затем концентрируют в вакууме. Остаток
вновь растворяют в муравьиной кислоте (500 мл), вновь нагревают до 70°С в течение 2 ч и затем концентрируют в вакууме. Остаток вновь растворяют в муравьиной кислоте (500 мл) и вновь нагревают до 70°С в
течение 1 ч. Объем раствора снижают до 90% и добавляют 1,0М раствор НСl (44 мл, 0,044 моль) и дистиллированной воды (490 мл). Полученный гомогенный раствор концентрируют в вакууме, затем добавляют
дистиллированную воду (100 мл) и полученный гомогенный раствор лиофилизуют в течение 14 дней,
получая 26,76 г (96%) указанного в заголовке соединения в виде белого твердого вещества.
Спектр 1Н ЯМР (CD3OD) δ 7,96-7,92 (м, 2Н), 7,45-7,25 (м, 4Н), 7,06-6,95 (м, 3Н), 5,00-4,93 (м, 1Н),
3,55-3,40 (м, 5Н), 3,34-3,20 (м, 2Н), 3,15-3,05 (м, 5Н), 3,07-3,00 (м, 3Н), 1,22 (уш.с, 6Н).
Спектр 13С ЯМР (CD3OD) δ 171,6, 168,3, 154,5, 144,4, 137,9, 135,1, 135,0, 134,1, 125,5, 120,6, 120,3,
39,6, 39,2, 39,1, 15,2.
Масс-спектр m/z 589 (МН+).
Пример 2. Получение 2-{2-диэтиламино-5-[(4-хлорбензолсульфонил)метиламино]пиримидин-4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовой кислоты.
Стадии 1, 2, 3, 4, 6 и 7 проводят так же, как в примере 1. Стадию 5 проводят с использованием 4хлорбензолсульфохлорида вместо 4-фторбензолсульфохлорида.
Спектр 1H ЯМР (CD3OD) δ 7,88-7,85 (м, 2Н), 7,72-7,69 (м, 2Н), 7,39-7,25 (м, 2Н), 7,14-6,92 (м, 3Н),
5,00-4,85 (м, 1Н), 3,60-3,50 (м, 1Н), 3,37-3,28 (м, 6Н), 3,15-3,07 (м, 6Н), 3,01 (уш.с, 3Н), 1,22 (уш.с, 6Н);
Спектр 13С ЯМР (CD3OD) δ 208,6, 145,3, 134,9, 128,8, 124,9, 124,5, 124,4, 116,3, 50,2, 30,4, 30,0, 6,0;
Масс-спектр m/z 605 (МН+).
Пример 3. Получение 2-{2-диэтиламино-5-[(3,4-дифторбензолсульфонил)метиламино]пиримидин4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовой кислоты.
Стадии 1, 2, 3, 4, 6 и 7 проводят так же, как в примере 1. Стадию 5 проводят с использованием 3,4дифторбензолсульфохлорида вместо 4-фторбензолсульфохлорида.
Спектр 1Н ЯМР (CD3OD) δ 7,84-7,77 (м, 1Н), 7,67 (уш.с, 1Н), 7,58-7,53 (м, 1Н), 7,37-7,34 (м, 1Н),
7,22-7,18 (м, 1Н), 7,08-7,02 (м, 3Н), 4,83-4,76 (м, 1Н), 3,55-3,54 (м, 4Н), 3,35-3,33 (м, 1Н), 3,23-3,12 (м,
6Н), 3,03-2,99 (м, 3Н), 1,19 (уш.с, 6Н).
Спектр 13С ЯМР (CD3OD) δ 178,3, 177,8, 163,2, 162,6, 159,3, 159,1, 155,9, 155,7, 154,3, 153,0, 152,5,
152,4, 138,4, 138,1, 134,0, 129,5, 125,3, 122,4, 122,2, 121,7, 121,4, 115,3, 59,3, 46,0, 42,4, 41,9, 40,4, 39,9,
39,2, 39,1, 15,76.
- 13 -
008180
Масс-спектр m/z 607,2 (МН+).
Пример 4. Получение 2-{2-диэтиламино-5-[(3,4-дихлорбензолсульфонил)метиламино]пиримидин4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовой кислоты.
Стадии 1, 2, 3, 4, 6 и 7 проводят так же, как в примере 1. Стадию 5 проводят с использованием 3,4дихлорбензолсульфохлорида вместо 4-фторбензолсульфохлорида.
Спектр 1Н ЯМР (CD3OD) δ 8,00-7,98 (м, 1Н), 7,83-7,74 (м, 2Н), 7,37-7,34 (м, 1Н), 7,21-7,20 (м, 1Н),
7,10-7,02 (м, 3Н), 4,85-4,83 (м, 1Н), 3,55-3,53 (м, 2Н), 3,35-3,33 (м, 1Н), 3,21-3,12 (м, 6Н), 3,04-2,99 (м,
6Н), 1,19 (уш.с, 6Н).
Спектр 13С ЯМР (CD3OD) δ 176,4, 166,2, 161,7, 161,2, 158,0, 157,8, 152,8, 151,5, 150,5, 140,2, 139,8, 139,5,
136,8, 135,8, 133,9, 132,6, 132,0, 129,8, 123,8, 113,7, 113,4, 57,8, 44,6, 40,8, 40,4, 38,7, 38,3, 37,7, 37,5, 14,1.
Масс-спектр m/z 639,1 (МН+).
Пример 5. Получение 2-{2-диэтиламино-5-[(бензолсульфонил)метиламино]пиримидин-4-иламино}3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовой кислоты.
Стадии 1, 2, 3, 4, 6 и 7 проводят так же, как в примере 1. Стадию 5 проводят с использованием бензолсульфохлорида вместо 4-фторбензолсульфохлорида.
Спектр 1Н ЯМР (CD3OD) δ 8,14 (уш.с, 1Н), (7,85-7,84 (м, 1Н), 7,8-7,78 (м, 1Н), 7,69-7,66 (м, 2Н),
7,40-7,37 (м, 1Н), 7,21-7,195 (м, 1Н), 7,04-7,03 (м, 2Н), 7,95-7,90 (м, 1Н), 5,52 (уш.с, 1Н), 3,54-3,53 (м, 2Н),
3,36-3,33 (м, 6Н), 3,13-3,12 (м, 3Н), 3,01-3,00 (м, 3Н), 1,20-1,17 (м, 6Н).
Спектр 13С ЯМР (CD3OD) δ 165,9, 152,8, 136,7, 135,8, 132,6, 131,6, 130,2, 123,8, 44,7, 37,5, 14,0.
Масс-спектр m/z 571,2 (МН+).
Пример 6. Получение 2-{2-диэтиламино-5-[(2-фторбензолсульфонил)метиламинo]пиримидин-4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовой кислоты.
Стадии 1, 2, 3, 4, 6 и 7 проводят так же, как в примере 1. Стадию 5 проводят с использованием 2фторбензолсульфохлорида вместо 4-фторбензолсульфохлорида.
Спектр 1Н ЯМР (CD3OD) δ 8,31 (уш.с, 1Н), 7,94-7,85 (м, 2Н), 7,57-7,44 (м, 3Н), 7,34-7,30 (м, 1Н),
7,15-7,12 (м, 2Н), 5,00-4,85 (1Н), 3,63-3,62 (м, 4Н), 3,50-3,42 (м, 1Н), 3,34-3,30 (м, 4Н), 3,29-3,22 (м, 4Н),
3,11-3,10 (м, 2Н), 1,28 (уш.с, 6Н).
Спектр 13С ЯМР (CD3OD) δ 176,5, 166,4, 163,1, 160,4, 159,7, 157,7, 152,8, 151,5, 150,7, 138,5, 138,3,
136,7, 133,7, 132,5, 132,2, 127,1, 123,7, 119,9, 119,6, 113,4, 57,8, 44,6, 40,6, 39,0, 38,4, 37,7, 37,5, 14,1.
Пример 7. Получение 2-{2-диэтиламино-5-[(3-фторбензолсульфонил)метиламино]пиримидин-4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовой кислоты.
Стадии 1, 2, 3, 4, 6 и 7 проводят так же, как в примере 1. Стадию 5 проводят с использованием 3фторбензолсульфохлорида вместо 4-фторбензолсульфохлорида.
Спектр 1Н ЯМР (CD3OD) δ 8,15-8,12 (уш.с, 1Н), 7,72-7,68 (м, 1Н), 7,63-7,60 (м, 1Н), 7,53-7,52 (м,
1Н), 7,38-7,35 (м, 1Н), 7,21-7,20 (м, 1Н), 7,10-6,99 (м, 3Н), 4,87-4,86 (м, 1Н), 3,54-3,53 (м, 4Н), 3,35-3,34
(м, 3Н), 3,15-3,12 (м, 4Н), 3,05-3,00 (м, 4Н), 1,20 (уш.с, 6Н).
Спектр 13С ЯМР (CD3OD) δ 166,1, 153,1, 136,9, 134,1, 132,8, 126,5, 124,1, 123,2, 122,9, 117,7, 117,4,
103,4, 45,0, 38,0, 14,3.
Масс-спектр m/z 589,2 (МН+).
Пример 8. Получение 2-{2-диэтиламино-5-[(4-фторбензолсульфонил)изопропиламино]пиримидин4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовой кислоты.
Стадии 1, 2 и 3 проводят так же, как в примере 1. Стадии 4 и 6 осуществляют в один прием в соответствии с приведенной ниже методикой. Далее, стадии 5 и 7 проводят так же, как в примере 1.
Спектр 1Н ЯМР (CD3OD) δ 8,20-8,16 (м, 1Н), 7,95-7,84 (м, 2Н), 7,36-7,25 (м, 3Н), 7,24-7,15 (м, 3Н),
7,07-6,98 (м, 3Н), 5,07-5,05 (м, 1Н), 4,90-4,86 (м, 1Н), 4,65-4,62 (м, 1Н), 4,49-4,41 (м, 1Н), 3,63-3,56 (м,
3Н), 3,38-3,31 (м, 2Н), 3,27-3,11 (м, 2Н), 3,00-2,99 (м, 3Н), 1,27-1,21 (м, 6Н), 1,05-0,99 (м, 6Н).
Спектр 13С ЯМР (CD3OD) δ 175,8, 175,5, 169,6, 166,3, 165,9, 163,5, 163,4, 157,7, 153,0, 152,9, 152,3,
138,1, 136,4, 136,1, 133,1, 133,0, 133,0, 132,9, 132,7, 132,3, 123,8, 118,8, 118,7, 118,5, 118,4, 107,5, 57,6,
57,2, 54,7, 44,7, 38,7, 38,1, 37,6, 37,5, 23,0, 22,9, 22,2, 22,0, 14,1, 14,0.
Альтернативная одностадийная методика получения трет-бутилового эфира 2-(2-диэтиламино-5изопропиламинопиримидин-4-иламино)-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовой кислоты.
Смесь трет-бутилового эфира 2-(2-диэтиламино-5-нитропиримидин-4-иламино)-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовой кислоты (5,0 г, 0,010 моль), ледяной уксусной кислоты (10 капель), ацетона (2,19 мл, 0,030 моль) и оксида платины (0,250 г, 5 мас.%) в EtOH (15 мл) гидрируют в атмосфере водорода при давлении 45 фунт/дюйм2 до тех пор, пока ТСХ (50% EtOAC/гексан) не покажет 100%-ное
превращение в продукт (20 ч). Затем реакционную смесь фильтруют через целит и концентрируют в вакууме, получая остаток коричневого цвета. Остаток очищают флэш-хроматографией (4:1 EtOAc/гексан)
и получают 3,54 г (70%) продукта в виде розового пены.
Пример 9. Получение 2-{2-диэтиламино-5-[(4-фторбензолсульфонил)этиламино]пиримидин-4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовой кислоты.
Стадии 1, 2, 3, 4, 5 и 7 проводят так же, как в примере 1. Стадию 6 проводят, используя этилиодид
- 14 -
008180
вместо диметилсульфата.
Спектр 1Н ЯМР (CDCl3) δ 0,89 (т, J=7,2, 1,8H), 1,06 (т, J=7,1, 1,2Н), 1,10-1,30 (м, 6Н), 2,97 (с, 3Н),
3,05 (с, 3Н), 3,10-3,90 (м, 8Н), 4,82 (кв, J=5,4, 0,6Н), 4,91 (кв, J=6,1, 0,4Н), 6,80-7,45 (м, 8Н), 7,77 (м, 2Н),
12,44 (уш.с, 1Н).
Масс-спектр m/z 603,3 (МН+).
Пример 10. Получение 2-{2-диэтиламино-5-[(3,4-дифторбензолсульфонил)изопропиламино]пиримидин-4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовой кислоты.
Стадии 1, 2, 3, 4, 6 и 7 проводят так же, как в примере 8. Стадию 5 проводят с использованием 3,4дифторбензолсульфохлорида вместо 4-фторбензолсульфохлорида.
Спектр 1Н ЯМР (CD3OD) δ 8,20-8,19 (м, 1Н), 7,84-7,78 (м, 1Н), 7,70-7,64 (м, 1Н), 7,54-7,48 (м, 1Н),
7,39-7,31 (м, 1Н), 7,20-7,17 (м, 1Н), 7,05-6,96 (м, 2Н), 4,91-4,89 (м, 1Н), 4,70-4,68 (м, 1Н), 4,48-4,41 (м,
2Н), 3,60-3,58 (м, 3Н), 3,34-3,33 (м, 1Н), 3,27-3,20 (м, 1Н), 3,09-3,08 (м, 2Н), 2,98-2,97 (м, 2Н), 1,28-1,19
(м, 6Н), 1,06-0,98 (м, 6Н), 0,83-0,81 (м, 1Н).
Спектр 13С ЯМР (CD3OD) δ 177,6, 177,2, 167,9, 164,9, 164,8, 159,2, 159,1, 155,7, 154,5, 154,4, 152,4,
152,3, 140,4, 140,3, 137,8, 134,3, 133,9, 129,3, 129,2, 125,4, 122,6, 122,5, 122,4, 122,2, 121,5, 121,2, 109,1,
59,5, 59,1, 56,7, 56,6, 46,4, 46,3, 39,6, 39,3, 39,2, 24,7, 24,5, 23,9, 23,6, 15,7, 15,6.
Пример 11. Получение 2-{2-диэтиламино-5-[(4-хлорбензолсульфонил)изопропиламино]пиримидин4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовой кислоты.
Стадии 1, 2, 3, 4, 6 и 7 проводят так же, как в примере 8. Стадию 5 проводят с использованием 4хлорбензолсульфохлорида вместо 4-фторбензолсульфохлорида.
Спектр 1Н ЯМР (CD3OD) δ 8,18-8,17 (м, 1Н), 7,85-7,78 (м, 1Н), 7,62-7,58 (м, 1Н), 7,38-7,35 (м, 1Н),
7,34-7,24 (м, 1Н), 7,17-7,16 (м, 1Н), 7,10-7,05 (м, 2Н), 7,04-6,98 (м, 2Н), 4,98-4,87 (м, 1Н), 4,73-4,68 (м,
1Н), 4,55-4,38 (м, 2Н), 3,70-3,52 (м, 3Н), 3,40-3,30 (м, 1Н), 3,28-3,18 (м, 1Н), 3,17-3,08 (м, 2Н), 3,05-2,98
(м, 2Н), 1,25-1,20 (м, 6Н), 1,04-0,96 (м, 6Н), 0,80-0,77 (м, 1Н).
Спектр 13С ЯМР (CD3OD) δ 175,7, 175,5, 166,2, 165,8, 169,6, 163,5, 163,4, 157,6, 152,9, 152,8, 138,0,
136,3, 136,1, 133,1, 133,0, 132,9, 132,7, 132,2, 123,8, 118,8, 118,6, 118,5, 118,5, 118,3, 107,5, 57,6, 57,2, 54,7,
44,6, 38,6, 38,1, 37,6, 37,5, 22,9, 22,8, 22,2, 21,9, 14,1, 13,9.
Пример 12. Получение 2-{2-диэтиламино-5-[(3,4-дифторбензолсульфонил)этиламино]пиримидин-4иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовой кислоты.
Стадии 1, 2, 3, 4, 6 и 7 проводят так же, как в примере 9. Стадию 5 проводят с использованием 3,4дифторбензолсульфохлорида вместо 4-фторбензолсульфохлорида.
Спектр 1Н ЯМР (CD3OD) δ 8,15-8,14 (м, 1Н), 7,80-7,75 (м, 1Н), 7,73-7,62 (м, 1Н), 7,60-7,49 (м, 1Н),
7,30-7,18 (м, 1Н), 7,16-7,00 (м, 2Н), 5,58-5,50 (м, 1Н), 4,90-4,83 (м, 1Н), 5,78-5,70 (м, 1Н), 3,85-3,75 (м,
1Н), 3,65-3,54 (м, 3Н), 3,40-3,23 (м, 5Н), 3,18-3,10 (м, 3Н), 3,05-2,98 (м, 3Н), 1,25-1,15 (м, 3Н), 1,18-1,05 (т,
1,5Н), 1,02-1,00 (т, 1,5Н).
Спектр 13С ЯМР (CD3OD) δ 165,8, 152,7, 145,7, 136,4, 136,3, 132,5, 132,2, 127,5, 123,6, 120,7, 120,4,
81,4, 57,0, 44,3, 38,5, 38,1, 37,4, 14,9, 14,6, 14,1, 14,0;
Масс-спектр m/z 621,5 (МН+).
Пример 13. Получение 2-{2-диэтиламино-5-[(4-хлорбензолсульфонил)этиламино]пиримидин-4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовой кислоты.
Стадии 1, 2, 3, 4, 6 и 7 проводят так же, как в примере 9. Стадию 5 проводят с использованием 4хлорбензолсульфохлорида вместо 4-фторбензолсульфохлорида.
Спектр 1Н ЯМР (CD3OD) δ 8,15-8,14 (м, 1Н), 7,84-7,79 (м, 1Н), 7,67-7,61 (м, 1Н), 7,37-7,33 (м, 1Н),
7,22-7,18 (м, 1Н), 7,14-7,13 (м, 1Н), 7,06-7,00 (м, 3Н), 4,80-4,75 (м, 1Н), 4,18-4,10 (м, 1Н), 3,65-3,30 (м,
3Н), 3,28-3,20 (м, 3Н), 3,18-3,08 (м, 2Н), 3,03-2,98 (м, 2Н), 2,05-2,04 (м, 1Н), 1,30-1,16 (м, 9Н), 1,10-1,08 (т,
1,5Н), 0,99-0,95 (т, 1,5Н).
Спектр 13С ЯМР (CD3OD) δ 176,2, 176,1, 166,7, 162,7, 162,3, 157,6, 152,9, 142,0, 138,8, 136,5, 132,8,
132,5, 132,0, 131,8, 123,8, 111,7, 111,4, 57,9, 57,8, 44,9, 38,9, 38,3, 37,8, 37,7, 15,1, 14,9, 14,3, 14,2.
Масс-спектр m/z 619,4 (МН+).
Пример 14. Получение 2-{2-диэтиламино-5-[(4-фторбензолсульфонил)циклопропилметиламино]пиримидин-4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовой кислоты.
Стадии 1, 2, 3, 4, 5 и 7 проводят так же, как в примере 1. Стадию 6 проводят, используя бромметилциклопропан и карбонат цезия вместо диметилсульфата и карбоната калия.
Спектр 1Н ЯМР (CDCl3) δ -0,2-0,2 (м, 2,4Н), 0,2-0,45 (м, 1,6Н), 0,54 (м, 0,6Н), 0,85 (м, 0,4Н), 1,001,40 (м, 6Н), 2,80-3,80 (м, 14Н), 4,79 (кв, J=5,5, 0,6H), 4,91 (кв, J=6,3, 0,4H), 6,70-7,40 (м, 8Н), 7,77 (м, 2Н),
10,26 (уш.с, 1Н).
Масс-спектр m/z 629,2 (МН+).
Пример 15. Получение 2-{2-диэтиламино-5-[(3,5-дифторбензолсульфонил)метиламино]пиримидин4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовой кислоты.
Стадии 1, 2, 3, 4, 6 и 7 проводят так же, как в примере 1. Стадию 5 проводят с использованием 3,5дифторбензолсульфохлорида вместо 4-фторбензолсульфохлорида.
- 15 -
008180
Спектр 1Н ЯМР (CD3OD) δ 7,68-7,67 (м, 1Н), 7,67-7,56 (м, 2Н), 7,42-7,40 (м, 2Н), 7,31-7,30 (м, 1Н),
7,26-7,23 (м, 2Н), 5,20-4,90 (м, 1Н), 4,35-4,33 (м, 1Н), 3,78-3,74 (м, 4Н), 3,57-3,54 (2Н), 3,38-3,33 (м, 2Н),
3,26-3,21 (м, 2Н), 2,41-2,39 (м, 2Н), 2,26-2,25 (м, 2Н), 1,50-1,38 (м, 6Н).
Спектр 13С ЯМР (CD3OD) δ 162,5, 162,3, 159,2, 159,0, 148,0, 146,1, 132,2, 127,8, 127,7, 127,6, 118,9,
109,1, 109,0, 108,7, 108,6, 106,2, 105,8, 52,5, 39,6, 34,1, 32,9, 9,5.
Пример 16. Получение 2-{2-диэтиламино-5-[(3,5-дифторбензолсульфонил)этиламино]пиримидин-4иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовой кислоты.
Стадии 1, 2, 3, 4, 5 и 7 проводят так же, как в примере 15. Стадию 6 проводят, используя этилиодид
вместо диметилсульфата.
Спектр 1Н ЯМР (CD3OD) δ 7,45-7,43 (м, 1Н), 7,42-7,18 (м, 2Н), 7,21-7,16 (м, 2Н), 7,07-7,06 (м, 1Н),
7,04-6,97 (м, 2Н), 5,51 (уш.с, 1Н), 4,86-4,82 (м, 1Н), 4,72-4,66 (м, 1Н), 3,84-3,77 (м, 1Н), 3,59-3,50 (м, 3Н),
3,34-3,31 (м, 2Н), 3,12-3,10 (м, 3Н), 2,99-2,96 (м, 3Н), 1,22-1,14 (м, 9Н), 1,10-1,05 (т, 1,5Н), 0,97-0,95 (т, 1,5Н).
Спектр 13С ЯМР (CD3OD) δ 159,9, 150,9, 150,1, 134,0, 130,0, 129,7, 121,2, 107,9, 86,7, 42,0, 41,9, 36,3,
35,2, 35,1, 12,8, 12,5, 11,9, 11,8.
Пример 17. Получение 2-{2-диэтиламино-5-[(2,4-дифторбензолсульфонил)метиламино]пиримидин4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовой кислоты.
Стадии 1, 2, 3, 4, 6 и 7 проводят так же, как в примере 1. Стадию 5 проводят с использованием 2,4дифторбензолсульфохлорида вместо 4-фторбензолсульфохлорида.
Спектр 1Н ЯМР (CD3OD) δ 8,16-8,11 (м, 1Н), 7,59-7,56 (м, 2Н), 7,48-7,45 (м, 2Н), 7,26-7,24 (м, 3Н),
5,21-5,16 (м, 1Н), 3,79-3,77 (м, 4Н), 3,57-3,54 (м, 3Н), 3,48-3,46 (м, 2Н), 3,44-3,34 (м, 3Н), 3,22-3,21 (м,
3Н), 1,45-1,44 (м, 6Н).
Спектр 13С ЯМР (CDCl3) δ 5 180,2, 170,3, 166,6, 150,3, 129,0, 128,9, 128,7, 125,9, 125,4, 117,5, 117,4,
116,5, 114,8, 107,7, 107,4, 95,5, 90,8, 68,0, 65,1, 55,7, 50,8, 37,6, 36,4, 31,9, 31,7, 31,6, 13,2, 9,4, 8,3, 7,8.
Пример 18. Получение 2-{2-диэтиламино-5-[(2,4-дифторбензолсульфонил)этиламино]пиримидин-4иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовой кислоты.
Стадии 1, 2, 3, 4, 5 и 7 проводят так же, как в примере 17. Стадию 6 проводят, используя этилиодид
вместо диметилсульфата.
Спектр 1Н ЯМР (CD3OD) δ 8,15 (уш.с, 1Н), 7,91-7,76 (м, 1Н), 7,32-7,30 (м, 2Н), 7,20-7,19 (м, 2Н),
7,04-7,00 (м, 2Н), 4,84-4,83 (м, 1Н), 4,74-4,67 (м, 1Н), 4,14-4,07 (м, 1Н), 3,92-3,82 (м, 1Н), 3,51-3,49 (м,
3Н), 3,34-3,31 (м, 3Н), 3,12-2,99 (м, 2Н), 2,98-2,97 (м, 2Н), 2,03-2,02 (м, 1Н), 1,26-1,17 (м, 6Н), 1,10-1,06 (т,
1,5Н), 1,03-0,98 (т, 1,5Н).
Спектр 13С ЯМР (CD3OD) δ 173,6, 173,3, 171,4, 167,7, 164,3, 161,2, 159,9, 159,3, 157,1, 156,7, 155,2,
152,4, 151,0, 150,3, 134,0, 133,3, 133,1, 132,9, 130,0, 123,2, 122,9, 122,8, 121,3, 121,2, 112,0, 111,8, 111,6,
111,5, 107,7, 107,2, 106,0, 105,9, 105,6, 105,2, 60,0, 54,8, 42,0, 36,5, 35,9, 35,3, 35,1, 19,3, 13,0, 12,9, 12,7,
11,9, 11,8.
Пример 19. Получение 2-{2-диэтиламино-5-[(3,5-дихлорбензолсульфонил)метиламино]пиримидин4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовой кислоты.
Стадии 1, 2, 3, 4, 6 и 7 проводят так же, как в примере 1. Стадию 5 проводят с использованием 3,5дихлорбензолсульфохлорида вместо 4-фторбензолсульфохлорида.
Спектр 1Н ЯМР (CD3OD) δ 7,84-7,82 (м, 1Н), 7,76-7,75 (м, 3Н), 7,34-7,32 (м, 1Н), 7,19-7,10 (м, 1Н),
7,03-7,00 (м, 2Н), 5,50 (уш.с, 1Н), 4,83-4,82 (м, 1Н), 4,74-7,73 (м, 1Н), 3,55-3,38 (м, 4Н), 3,34-3,32 (м, 2Н),
3,15-3,11 (м, 4Н), 3,02-2,99 (м, 3Н), 1,18-1,15 (м, 6Н).
Спектр 13С ЯМР (CD3OD) δ 157,1, 155,2, 150,1, 149,7, 140,1, 135,9, 134,3, 132,9, 130,0, 129,9, 126,0,
121,2, 110,7, 55,2, 54,8, 42,0, 38,5, 38,1, 36,5, 35,9, 35,2, 35,1, 11,9.
Масс-спектр m/z 639,1 (МН+).
Пример 20. Получение 2-{2-диэтиламино-5-[(3,5-дихлорбензолсульфонил)этиламино]пиримидин-4иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовой кислоты.
Стадии 1, 2, 3, 4, 5 и 7 проводят так же, как в примере 19. Стадию 6 проводят, используя этилиодид
вместо диметилсульфата.
Спектр 1Н ЯМР (CD3OD) δ 8,15 (уш.с, 1Н), 7,84-7,84-7,79 (м, 1Н), 7,76-7,74 (м, 2Н), 7,33-7,30 (м,
1Н), 7,22-7,11 (м, 2Н), 7,04-6,98 (м, 1Н), 5,51 (уш.с, 1Н), 4,86-4,82 (м, 1Н), 4,72-4,67 (м, 1Н), 3,77-3,75 (м,
1Н), 3,60-3,50 (м, 3Н), 3,34-3,29 (м, 2Н), 3,27-3,22 (м, 2Н), 3,12-3,11 (м, 2Н), 2,99-2,98 (м, 2Н), 1,23-1,14
(м, 6Н), 1,10-1,05 (т, 1,5Н), 0,99-0,94 (т, 1,5Н).
Спектр 13С ЯМР (CD3OD) δ 173,6, 173,4, 163,7, 159,9, 159,3, 157,3, 156,8, 155,2, 155,1, 152,1, 150,8,
150,2, 141,4, 141,2, 135,9, 134,0, 132,7, 130,0, 129,7, 125,8, 125,7, 121,3, 121,2, 107,9, 107,4, 54,8, 54,7, 42,0,
36,4, 35,8, 35,3, 35,1, 12,8, 12,5, 11,9, 11,8.
Масс-спектр m/z 653,2 (МН+).
Пример 21. Получение 2-{2-диэтиламино-5-[(4-фторбензолсульфонил)-н-пропиламино]пиримидин4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовой кислоты.
Стадии 1, 2, 3, 4, 5 и 7 проводят так же, как в примере 1. Стадию 6 проводят, используя 1-пропилиодид вместо диметилсульфата.
- 16 -
008180
Спектр 1Н ЯМР (CDCl3) δ 0,75 (м, 3Н), 1,00-1,50 (м, 8Н), 3,00 (с, 3Н), 3,08 (с, 3Н), 3,20-3,70 (м, 8Н),
4,79 (кв, J=6,3, 0,6Н), 4,91 (кв, J=6,6, 0,4H), 5,73 (уш.с, 0,6Н), 5,92 (уш.с, 0,4Н), 6,90-7,45 (м, 7Н), 7,76 (м, 2Н).
Масс-спектр m/z 617,2 (МН+).
Пример 22. Получение 2-{2-диэтиламино-5-[(4-фторбензолсульфонил)аллиламино]пиримидин-4иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовой кислоты.
Стадии 1, 2, 3, 4, 5 и 7 проводят так же, как в примере 1.
Стадию 6 проводят, используя аллилбромид вместо диметилсульфата.
Спектр 1Н ЯМР (CDCl3) δ 1,20 (м, 6Н), 2,98 (с, 3Н), 3,06 (с, 3Н), 3,10-4,30 (м, 8Н), 4,75- 4,95 (м, 1Н),
5,07 (м, 2Н), 5,48 (м, 0,6Н), 5,67 (м, 0,4Н), 6,90-7,45 (м, 8Н), 7,76 (м, 2Н), 11,07 (уш.с, 1Н).
Масс-спектр m/z 615,2 (МН+).
Пример 23. Получение 2-{2-диэтиламино-5-[(4-фторбензолсульфонил)изобутиламино]пиримидин4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовой кислоты.
Стадии 1, 2, 3, 4, 5 и 7 проводят так же, как в примере 1. Стадию 6 проводят, используя изобутилиодид вместо диметилсульфата.
Масс-спектр m/z 631,2 (МН+).
Пример 24. Получение 2-{2-диэтиламино-5-[(4-фторбензолсульфонил)-н-бутиламино]пиримидин-4иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовой кислоты.
Стадии 1, 2, 3, 4, 5 и 7 проводят так же, как в примере 1. Стадию 6 проводят, используя 1-бутилиодид вместо диметилсульфата.
Спектр 1Н ЯМР (CDCl3) δ 0,82 (кв, J=7,1, 3Н), 1,05-1,40 (м, 10Н), 3,01 (с, 3Н), 3,10 (с, 3Н), 3,15-3,80
(м, 8Н), 4,75 (кв, J=6,3, 0,6Н), 4,91 (кв, J=5,9, 0,4H), 5,79 (д, J=5,4, 0,6H), 5,91 (д, J=6,6, 0,4Н), 7,00-7,40 (м,
7Н), 7,77 (м, 2Н).
Пример 25. Получение 2-{2-диэтиламино-5-[(2,5-дифторбензолсульфонил)метиламино]пиримидин4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовой кислоты.
Стадии 1, 2, 3, 4, 6 и 7 проводят так же, как в примере 1.
Стадию 5 проводят с использованием 2,6-дифторбензолсульфохлорида вместо 4-фторбензолсульфохлорида.
Спектр 1Н ЯМР (CD3OD) δ 8,38-8,37 (м, 1Н), 7,99-7,95 (м, 1Н), 7,55-7,54 (м, 2Н), 7,50-7,42 (м, 2Н),
7,27-7,22 (м, 2Н), 5,08-5,06 (м, 1Н), 3,76-3,74 (м, 4Н), 3,59-3,54 (м, 3Н), 3,49-3,42 (м, 4Н), 3,36-3,34 (м,
2Н), 3,23-3,21 (м, 2Н), 1,40 (уш.с, 6Н).
Спектр 13С ЯМР (CD3OD) δ 161,4, 159,2, 155,8, 153,1, 148,1, 147,1, 133,6, 132,0, 127,8, 119,0, 111,1,
110,8, 110,7, 108,5, 105,8, 94,8, 86,4, 66,7, 54,0, 52,8, 39,7, 35,8, 34,2, 33,7, 32,9, 32,8, 9,4.
Пример 26. Получение 2-{2-диэтиламино-5-[(2,3-дифторбензолсульфонил)этиламино]пиримидин-4иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовой кислоты.
Стадии 1, 2, 3, 4, 6 и 7 проводят так же, как в примере 1. Стадию 5 проводят с использованием 2,3дифторбензолсульфохлорида вместо 4-фторбензолсульфохлорида. 2,3-Дифторбензолсульфохлорид получают по приведенной ниже методике.
Спектр 1Н ЯМР (CD3OD) δ 8,32 (уш.с, 1Н), 7,90-7,80 (м, 2Н), 7,59-7,48 (м, 3Н), 7,27-7,23 (м, 2Н),
5,09-5,08 (м, 1Н), 3,77-3,70 (м, 4Н), 3,60-3,51 (м, 3Н), 3,50-3,42 (м, 2Н), 3,39-3,31n (м, 3Н), 3,32-3,18 (м,
2Н), 1,43-1,41 (м, 6Н).
Спектр 13С ЯМР (CD3OD) δ 170,4, 160,8, 158,1, 156,1, 153,0, 151,6, 150,5, 148,9, 148,2, 147,3, 147,2,
143,9, 143,5, 142,6, 141,1, 140,9, 131,8, 127,7, 125,1, 123,8, 120,8, 120,6, 119,2, 40,5, 35,7, 33,4, 32,9, 32,7, 9,0.
Получение 2,3-дифторбензолсульфохлорида.
Следующую методику осуществляют в двух колбах. В первой колбе 2,3-дифторанилин (2,0 г, 0,015 моль)
растворяют в концентрированной НСl (15,9 мл) и полученный раствор охлаждают до -5°С на бане лед/NaCl.
Порциями при перемешивании добавляют раствор нитрита натрия (1,18 г, 0,017 моль) в дистиллированной воде (13,6 мл), поддерживая температуру ниже 0°С, и затем смесь перемешивают в течение 10 мин.
Во второй колбе тионилхлорид (5,08 мл, 0,069 моль) по каплям добавляют к дистиллированной воде
(30,6 мл), которую предварительно охлаждают до -5°С на бане лед/NaCl. Полученному раствору дают
нагреться до комнатной температуры, затем добавляют CuCl (0,08 г, 0,77 ммоль) и реакционную смесь
вновь охлаждают до -5°С. При продолжении охлаждения и при перемешивании содержимое первой колбы добавляют порциями в 2 мл к содержимому второй колбы и полученную смесь перемешивают в течение 30 мин, при этом образуется осадок. Осадок отделяют фильтрованием, промывают холодной водой и
выдерживают в вакууме, получая 3,25 г (98%) продукта в виде белого твердого вещества.
Пример 27. Получение 2-{2-диэтиламино-5-[(4-фторбензолсульфонил)пропаргиламино]пиримидин4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовой кислоты.
Стадии 1, 2, 3, 4, 5 и 7 проводят так же, как в примере 1. Стадию 6 проводят, используя пропаргилбромид вместо диметилсульфата.
Спектр 1Н ЯМР (CDCl3) δ 1,15 (м, 6Н), 2,27 (д, J=2,1, 1H), 2,97 (с, 3Н), 3,06 (с, 3Н), 3,10-3,70 (м, 6Н),
3,75 (дд, J=17,7, 2,0, 0,6Н), 3,95 (дд, J=18,1, 2,0, 0,4Н), 4,51 (дд, J=19,5, 2,2, 0,6Н), 4,54 (дд, J=18,1, 2,2,
0,4Н), 4,79 (кв, J=5,9, 0,6Н), 4,88 (кв, J=6,6, 0,4H), 6,42 (уш.д, 0,4Н), 6,65 (уш.с, 0,6Н), 6,85-7,30 (м, 6Н),
- 17 -
008180
7,52 (с, 0,6Н), 7,56 (с, 0,4Н), 7,85 (м, 2Н), 8,20 (уш.с, 1Н).
Масс-спектр m/z 613,2 (МН+).
Пример 28. Получение 2-{2-диэтиламино-5-[(2,4-дифторбензолсульфонил)пропаргиламино]пиримидин-4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовой кислоты.
Стадии 1, 2, 3, 4, 5 и 7 проводят так же, как в примере 17. Стадию 6 проводят, используя пропаргилбромид вместо диметилсульфата.
Спектр 1Н ЯМР (CDCl3) δ 1,16 (кв, J=7,5, 6H), 2,27 (м, 1Н), 2,99 (с, 3Н), 3,09 (с, 3Н), 3,10-3,70 (м,
6Н), 4,04 (дд, J=17,7, 2,4, 0,6Н), 4,24 (дд, J=17,9, 2,2, 0,4Н), 4,47 (м, 1Н), 4,81 (кв, J=5,9, 0,6Н), 4,89 (кв,
J=6,3, 0,4H), 6,27 (д, J=7,5, 0,4Н), 6,41 (д, J=5,7, 0,6Н), 6,90-7,10 (м, 4Н), 7,16 (д, J=8,3, 1Н), 7,28 (д, J=8,3,
1Н), 7,55 (уш.с, 1Н), 7,66 (с, 0,6Н), 7,67 (с, 0,4Н), 7,81 (м, 1Н).
Пример 29. Получение 2-{2-диэтиламино-5-[(4-фторбензолсульфонил)-(2,2,2-трифторэтил)амино]
пиримидин-4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовой кислоты.
Стадии 1, 2, 3, 4, 5 и 7 проводят так же, как в примере 1. Стадию 6 проводят, используя 2,2,2-трифторэтилтрифлат и карбонат цезия вместо диметилсульфата и карбоната калия.
Спектр 1Н ЯМР (CDCl3) δ 1,14 (м, 6Н), 2,98 (с, 3Н), 3,06 (с, 3Н), 3,10-4,20 (м, 8Н), 4,80 (кв, J=5,9,
0,6Н), 4,87 (кв, J=6,2, 0,4Н), 6,09 (д, J=5,9, 0,4H), 6,18 (уш.д, 0,6Н), 6,80-7,50 (м, 7Н), 7,55 (уш.с, 1Н), 7,77
(м, 2Н).
Масс-спектр m/z 657,2 (МН+).
Пример А. Анализ адгезии α4β1: адгезия клеток Jurkat™ к фибронектину плазмы человека.
Методика.
96-луночные планшеты (планшеты Costar 3590 EIA) в течение ночи при температуре 4°С покрывают фибронектином человека (Gibco/BRL, номер по каталогу 33016-023) с концентрацией 10 мкг/мл. Затем лунки блокируют с помощью раствора бычьего сывороточного альбумина (BSA; 0,3%) в физиологическом растворе. Клетки Jurkat™ (поддерживают в логарифмической фазе роста) метят кальцеином AM
в соответствии с рекомендациями производителя и суспендируют в концентрации 2х106 клеток/мл в смеси Hepes/физиологический раствор/BSA. Затем на клетки в течение 30 мин воздействуют испытуемыми и
контрольными соединениями и затем переносят в индивидуальные лунки покрытого фибронектином
планшета. Дают им возможность прилипнуть в течение 35 мин при температуре 37°С. Затем лунки промывают осторожным отсасыванием и внесением свежего физиологического раствора с помощью пипетки. Флюоресценцию, вызываемую оставшимися прилипшими клетками, количественно оценивают с помощью флюоресцентного планшет-ридера EX 485/EM 530.
Клеточную культуру получают, разделяя сначала стационарную фазу клеток Jurkat™ в соотношении 1:10 в первый день и в соотношении 1:2 на второй день, с целью проведения анализа на третий день.
Клетки, которые разделяли в соотношении 1:10 в первый день, разделяют в соотношении 1:4 на третий
день, с целью проведения анализа на четвертый день.
Исследуемые планшеты получают путем приготовления сначала рабочего раствора фибронектина
человека от компании Gibco/BRL (номер по каталогу 33016-023) в PBS++ с концентрацией 10 мкг/мл.
Далее планшеты Costar 3590 EIA покрывают количеством 50 мкл на лунку в течение 2 ч при комнатной температуре (можно также оставить на ночь при температуре 4°С). Наконец, планшеты отсасывают и блокируют буферным раствором Hepes/физиологический раствор, 100 мкл/лунка, в течение 1 ч
при комнатной температуре, и затем трижды промывают 150 мкл PBS++.
Разведенные растворы соединений получают путем проведения последовательных разведений растворов соединений в соотношении 1:3 по следующей методике. Для каждого планшета (4 соединения на
планшет) 600 мкл вносят в 4 пробирки для титрования Bio-Rad, которые установлены в держателе. В
каждую соответствующую трубку добавляют достаточное количество соединения, чтобы получить 2Х
концентрацию с помощью методов, хорошо известных в данной области. Используя гибкие планшеты
Falcon, в ряды с В по G добавляют 100 мкл буферного раствора Hepes/физиологический раствор или сыворотки человека. Используют пипетки объемом 180 мкл для одновременного пипетирования, имеющих
четыре насадки, которые установлены на одинаковом расстоянии друг от друга. Каждый набор пробирок
смешивают 5 раз и для каждого разведения 180 мкл 2Х раствора соединения помещают в первую колонку в ряду В, оставляя ряд А пустым. 180 мкл добавляют в другие лунки в ряду А. Серию разведений на
планшете проводят путем переноса 50 мкл в следующее разведение и смешивают 5 раз, сменяя насадки
после каждого разведения. Разведения останавливаются на ряду F. В ряде G соединение отсутствует.
Раствор 21/6 антитела с концентрацией 20 мкг/мл в буферном растворе Hepes/физиологический раствор или сыворотке человека служит в качестве позитивного контроля, и его сохраняют в кювете для
реагентов, чтобы добавлять в суспензию клеток на планшете.
Окрашивание клеток осуществляют, отбирая вначале логарифмическую фазу клеток Jurkat™ центрифугированием в пробирках емкостью 50 мл (1100 об./мин в течение 5 мин). Клетки вновь суспендируют в 50 мл PBS++, центрифугируют и снова суспендируют в 20 мл PBS++. Клетки окрашивают, добавляя
20 мкл кальцеина AM в течение 30 мин при комнатной температуре. Объем доводят до 50 мл с помощью
буфера Hepes/физиологический раствор, клетки подсчитывают, центрифугируют и вновь суспендируют в
- 18 -
008180
количестве 2х106 клеток/мл в буфере Hepes/физиологический раствор или в сыворотке человека.
Соединения инкубируют, используя следующую методику. На новом гибком планшете в ряды с В
до Н добавляют 65 мкл окрашенных клеток. После подготовки планшета в соответствующие ряды добавляют 65 мкл соединений 2Х и смешивают 3Х. В ряд Н добавляют 65 мкл антитело 2Х-21/6 и смешивают 3Х. Наконец, планшет инкубируют при комнатной температуре в течение 30 мин.
Адгезию фибронектина после приведенной ниже процедуры обработки измеряют с использованием
флюоресцентного планшет-ридера EX 485/EM 530. После инкубирования клетки смешивают 3Х и 100 мкл
переносят на покрытые фибронектином планшеты и инкубируют при температуре 37°С в течение 35 мин.
Каждый планшет промывают ряд за рядом, при комнатной температуре осторожно добавляя пипеткой по
100 мкл PBS++ по стенке лунки и поворачивая планшеты на 90° для проведения отсоса. Процедуру повторяют в общей сложности для трех промывок. После промывки в каждую лунку по стенке с помощью
пипетки помещают по 100 мкл.
Значение IC50 рассчитывают для каждого соединения, как в присутствии сыворотки человека, так и
в отсутствие сыворотки человека. IС50 означает концентрацию, при которой рост и активность ингибируется на 50%. Полученные данные приведены в следующих таблицах.
Адгезия клеток к фибронектину плазмы человека (без сыворотки человека)
- 19 -
008180
Адгезия клеток к фибронектину плазмы человека (с сывороткой человека)
Пример В. Анализ насыщения in vitro для определения связывания соединений-кандидатов с α4β1-интегрином.
Ниже приводится in vitro анализ для определения уровней в плазме, необходимых для того, чтобы
соединение было активным на модели экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита (ЕАЕ), который описан в следующем примере, или на других in vivo моделях.
Клетки линии Jurkat в логарифмической фазе роста промывают и вновь суспендируют в нормальной
животной плазме, содержащей 20 мкг/мл антитела 15/7 (Yednock et al., J. Biol. Chem. (1995), 270 (48): 28740).
Клетки линии Jurkat разводят вдвое либо образцами нормальной плазмы, содержащими известное
количество соединения-кандидата в различных интервалах концентраций от 66 до 0,01 мкМ, используя
стандартное последовательное разведение по 12 точкам для стандартной кривой, либо образцами плазмы, полученными из периферической крови животных, которым вводили соединения-кандидаты.
Затем клетки инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре, дважды промывают забуференным фосфатом солевым раствором, содержащим 2% сыворотки плода коровы и по 1 мМ каждого
хлорида кальция и хлорида мания (среда для анализа), с целью удаления антитела 15/7.
Затем клетки подвергают воздействию связанным фикоэритрином IgG Fc козла F(аb')2 против мыши (Immunotech, Уэстбрук, ME), который был адсорбирован для устранения любого неспецифического
- 20 -
008180
перекрестного взаимодействия путем совместной инкубации с 5%-ной сывороткой, полученной от испытуемых животных, в соотношении 1:200 и инкубируют в темноте при температуре 4°С в течение 30 мин.
Клетки дважды промывают средой для анализа и вновь суспендируют в той же среде. Их исследуют
по стандартному аналитическому методу с помощью активируемого флюоресценцией анализатора клеток, который описан Yednock et al., J. Biol. Chem. 1995, 270: 28740.
Полученные данные затем наносят на график зависимости флюоресценции от дозы, т.е. в виде нормальной ответной реакции на дозы. Уровни дозы, которые приводят к образованию плато на кривой, соответствуют уровням, необходимым для достижения эффективности на in vivo модели.
Этот анализ также используют для определения уровней в плазме, необходимых для насыщения
мест связывания других интегринов, таких как α9β1-интегрин, который представляет собой интегрин,
наиболее родственный α4β1-интегрину (Palmer et al., 1993, J. Cell Bio., 123: 1289). Такое связывание подтверждают in vivo на пригодность для воспалительных состояний, опосредованных α9β1-интегрином,
включая, например, гиперчувствительность дыхательных путей и закупорку дыхательных путей, которая
происходит при хронической астме, пролиферации клеток гладких мышц при атеросклерозе, закупорку
сосудов после ангиопластики, фиброз и клубочковое рубцевание в результате заболевания почек, стеноз
аорты, гипертрофию синовиальных мембран при ревматоидном артрите и воспаление и рубцевание, наблюдаемые в процессе развития язвенного колита и болезни Крона.
Соответственно, приведенный выше анализ, вместо клеток Jurkat, можно провести с клетками клеточной линии толстой кишки человека SW 480 (Американская коллекция типовых культур, № CCL228),
трансфекцированных с помощью кДНК, кодирующей α9-интегрин (Yokosaki et al., 1994, J. Biol. Chem.,
269: 26691) вместо клеток Jurkat, с целью определения связывания α9β1-интегрина. В качестве контроля
можно использовать клетки SW 480, экспрессирующие другие субъединицы α и β1.
Таким образом, другим аспектом настоящего изобретения является способ лечения болезни у пациента млекопитающего, опосредованного α9β1, при этом способ заключается в введении указанному пациенту
терапевтически эффективного количества соединения по настоящему изобретению. Указанные соединения
преимущественно вводят в виде фармацевтической композиции, приведенной выше в настоящем описании.
Эффективная дневная доза будет зависеть от возраста, массы и состояния пациента, и эти факторы легко
могут быть установлены лечащим врачом. Тем не менее, в предпочтительном варианте осуществления
настоящего изобретения соединения вводят в количестве приблизительно от 20 до 500 мкг/кг в день.
Пример С. Кассетная дозировка и анализ сыворотки для определения биодоступности.
Пероральную биодоступность устанавливают путем введения крысам кассетной дозы, т.е. смеси
6 соединений на дозировочный раствор. Кассета содержит 5 тестируемых образцов и стандартное соединение, при этом общая доза составляет 10 мг/кг. Каждое соединение/тестируемый образец превращают с
натриевую соль с помощью эквимолярного количества 1н раствора NaOH и растворяют в воде в количестве 2 мг/мл. Кассету готовят, смешивая равные объемы каждого из 6 растворов. Кассетный дозировочный раствор хорошо смешивают и затем доводят рН до 7,5-9. Дозировочный раствор получают за день
до проведения исследования и перемешивают в течение ночи при комнатной температуре.
Для проведения этого анализа используют самцов крыс Sprague Dawley (SD) в возрасте 6-8 недель, полученных от Charles River Laboratories. Крыс выдерживают на карантине, по крайней мере, в течение 1 дня и постоянно
снабжают пищей и водой. В ночь перед введением кассеты крысам не дают пищу в течение приблизительно 16 ч.
Для каждой кассеты выбирают четырех SD крыс. Каждой крысе перорально вводят однократную
дозу дозировочного раствора. Регистрируют дозировочный объем (5 мл/кг) и время и крыс кормят в течение 2 ч после введения дозы.
Отбирают образцы крови с помощью сердечной пункции через следующие временные интервалы:
4 ч, 8 ч и 12 ч. Непосредственно перед отбором проб крови крыс анестезируют в течение 10-20 с с помощью газообразного углекислого газа. Через 12 ч отбирают образцы, крыс безболезненно умерщвляют
асфиксией углекислым газом и затем проводят шейное смещение.
Образцы крови перед использованием хранят в покрытых гепарином пробирках при температуре ниже
комнатной (4°С). Образцы крови центрифугируют (10000 об./мин в течение 5 мин), плазму отделяют и хранят в
холодильнике при температуре -20°С, пока не потребуется проведение анализа на содержание лекарства. Уровни лекарства в плазме анализируют с использованием следующего протокола для прямого осаждения плазмы.
Образцы плазмы in vivo готовят на 96-луночном планшете емкостью 1,5 мл путем последовательного добавления 100 мкл исследуемой плазмы и 150 мкл метанола и затем перемешивают при встряхивании в течение 10-20 с. Добавляют 150 мкл раствора внутреннего стандарта в ацетонитриле с концентрацией 0,05 нг/мкл и перемешивают при встряхивании в течение 30 с.
Образцы для получения стандартной кривой готовят на 96-луночном планшете емкостью 1,5 мл путем
последовательного добавления 100 мкл контрольной плазмы мыши, 150 мкл метанола и перемешивания при
встряхивании в течение 10-20 с. Добавляют 150 мкл раствора внутреннего стандарта в ацетонитриле с концентрацией 0,05 нг/мкл и перемешивают при встряхивании в течение 30 с. В образцы вносят небольшие количества 0-200 нг (10 концентраций) исследуемых соединений в 50%-ном метаноле и получают стандартную кривую
в интервале концентраций 0,5-2000 нг/мл. Образцы снова перемешивают при встряхивании в течение 30 с.
- 21 -
008180
Далее образцы вращают в течение 20-30 мин со скоростью 3000 об./мин в микроцентрифуге Эппендорфа и затем 80-90% надосадочной жидкости переносят в чистый 96-луночный планшет.
Органический растворитель выпаривают до тех пор, пока образцы не станут сухими (в атмосфере
азота при температуре 40°С/30-40 мин (ZymarkTurbovap)).
Затем остаток растворяют в 200-600 л подвижной фазы (50% СН3ОН/0,1% TFA). ЖХ/МС/МС проводят с использованием тройного квадрупольного масс-спектрометра PE-Sciex API-3000 (SN0749707)
компании Perkin-Elmer, снабженного автосамплером Series200 и насосом 10А компании Shimadzu. Сбор
данных осуществляют с помощью программы PE-Sciex Analyst (v1.1) и анализ и количественную оценку
проводят с помощью программы PE-Sciex Analyst (v1.1). Образец с объемом 5-50 мкл инжектируют в
колонку ThermoHypersil DASH-18 с обращенной фазой (Keystone 2,0x20 мм, 5 мкм, PN: 8823025-701) и
используют подвижную фазу 25% СН3ОН, 0,1% TFA-100% СН3ОН, 0,1% TFA. Время проведения анализа составляет около 8 мин при скорости подачи подвижной фазы приблизительно 300 мкл/мин.
Площадь под кривой (AUC) рассчитывают по линейному методу трапеции от времени t=0 до времени исследования последнего образца tx (см. Handbook of Basic Pharmacokinetics, Wolfgang A. Ritschel
and Gregory L. Kearns, 5th ed, 1999).
AUC0→tx=S((Cn+Cn+1)/2))⋅(tn+1-tn) [(мкг/мл)ч]
В случае примера кассетного дозирования, для образцов после 4, 8 и 12 ч дозировки площадь под
кривой рассчитывают от значения t=0 до значения t=12 ч.
Значения AUC0→12 ч рассчитывают для каждого индивидуального животного, и средние значения
0→12 ч
представлены ниже в таблице.
АUC
- 22 -
008180
Пример D. Модели астмы.
Воспалительные состояния, опосредованные α4β1-интегринами, включают, например, приток эозинофилов, гиперчувствительность дыхательных путей и закупорку дыхательных путей, которая наблюдается
при хронической астме. Далее описываются модели астмы у животных, которые используют для изучения
in vivo воздействия соединений по настоящему изобретению, с целью применения при лечении астмы.
Модель астмы у крыс.
В соответствии с методикой, приведенной в документах Chapman et al., Am. J. Resp. Crit. Care Med.,
153: 4, A219 (1996) и Chapman et al., Am. J. Resp. Crit. Care Med., 155: 4, A881 (1997), оба из которых
включены в данное описание во всей своей полноте посредством ссылки, овальбумин (ОА, 10 мкг/мл)
смешивают с гидроксидом алюминия (10 мкг/мл) и вводят в виде подкожной инъекции крысам Brown
Norway в день 0. Инъекции овальбумина вместе со вспомогательным соединением повторяют на 7-й и
14-й день. На 21-й день сенсибилизированных животных размещают в пластиковых трубках и подвергают (в течение 60 мин) воздействию аэрозоля овальбумина (10 мкг/кг) с помощью системы, обеспечивающей попадание препарата только через нос. Через 72 ч животных умерщвляют, используя пентобарбитал
(250 мг/кг, внутривенно). Легкие промывают через трахеальную канюлю, используя 3 аликвоты (4 мл)
раствора Ханка (HBSSx10, 100 мл; 100 мМ EDTA, 100 мл; HEPES 1M, 25 мл; доводят до объема 1 л водой); извлеченные клетки объединяют и общий объем выделенной жидкости доводят до 12 мл добавлением раствора Ханка. Подсчитывают общее количество клеток (клеточный микросчетчик Sysmex F-500,
ТОА Medical Electronics Otd., Япония) и берут мазки путем разведения выделенной жидкости (приблизительно 106 клеток/мл) и отбора аликвоты пипеткой (100 мкл) в центрифугу (Cytospin, Шендон, Великобритания). Мазки высушивают на воздухе, фиксируют в течение 5 с с помощью раствора малахитового
зеленого в метаноле (2 мг/мл) и, с целью дифференцировать эозинофилы, нейтрофилы, макрофаги и
лимфоциты, окрашивают эозином G (5 с) (Diff-Quick, Browne Ltd., Великобритания). Общее количество,
рассчитанное по данным оптической микроскопии (х100) при погружении в масло, составляет 500 клеток
на мазок. Соединения по настоящему изобретению готовят в виде суспензии с 0,5% карбоксиметилцеллюлозы и 2% Tween 80 и вводят перорально крысам, которых сенсибилизируют аллергеном, овальбумином. В данной модели считаются активными те соединения по настоящему изобретению, которые ингибируют индуцированное аллергеном накопление лейкоцитов в дыхательных путях у активно сенсибилизированных крыс Brown Norway.
Модель астмы у мышей.
Соединения по настоящему изобретению оценивают также на модели острого воспаления легких у
мышей в соответствии с методикой, приведенной Kung et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 13: 360-365
(1995) и Schneider et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 20: 448-457 (1999), каждый из которых включен в
данное описание во всей своей полноте посредством ссылки. Женские особи мышей Black/6 (в возрасте
8-12 недель) сенсибилизируют в первый день внутрибрюшинной инъекцией 0,2 мл смеси овальбумина/квасцы, содержащей 20 мкг овальбумина (Grade 4, Sigma) и 2 мг квасцов для инъекций (Pierce). На 14-й
день вводят усиленную дозу. На 28-й и 29-й день мышам в течение 20 мин вводят провокационную пробу 1% овальбумина в виде аэрозоля (0,9% в физиологическом растворе). Мышей безболезненно умерщвляют и собирают образцы бронхоальвеолярных смывов (3 мл) на 30-й день, через 48 ч после введения
первой пробы. Количество эозинофилов оценивают по методу окрашивания с помощью FAC/FITC. Соединения по настоящему изобретению готовят в виде суспензии с 0,5% карбоксиметилцеллюлозы и 2%
Tween 80 и вводят перорально мышам, которых сенсибилизируют аллергеном, овальбумином. На данной
модели считаются активными те соединения по настоящему изобретению, которые ингибируют индуцированное аллергеном накопление лейкоцитов в дыхательных путях у активно сенсибилизированных
мышей C57BL/6.
Модель астмы у овец.
На этой модели используют методику, приведенную Abraham et al., J. Clin. Invest., 93: 776-787
(1994) и Abraham et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med., 156: 696-703 (1997), каждый из которых включен в
данное описание во всей своей полноте посредством ссылки. Соединения по настоящему изобретению
оценивают с помощью внутривенного (водный раствор соли), перорального (2% Tween 80, 0,5% карбоксиметилцеллюлозы) и аэрозольного введения овцам, которые обладают повышенной восприимчивостью
к антигену Ascaris suum. Активными в этой модели считаются те соединения, которые снижают раннюю
индуцированную антигеном бронхиальную ответную реакцию и/или блокируют ответную реакцию дыхательных путей в поздней фазе, например обладают защитным действием против индуцированной антигеном поздней ответной реакции и повышенной восприимчивости дыхательных путей.
Для изучения воздействия на дыхательные пути соединений-кандидатов используют аллергических
овец, у которых выявлена возможность развития как ранних, так и поздних бронхиальных ответных реакций на ингаляции антигена Ascaris suum. После местной анестезии носовых проходов 2%-ным лидокаином через одну ноздрю в нижней части пищевода размещают баллонный катетер. Затем животным
через вторую ноздрю, используя в качестве направляющего волоконооптический бронхоскоп, вводят
снабженную манжетой эндотрахеальную трубку и животных инкубируют.
Плевральное давление оценивают по методике Абрахама (1994). Аэрозоли (см. составы, приведен- 23 -
008180
ные ниже) генерируют с помощью сменного медицинского пульверизатора, создающего аэрозоль со
средним массовым аэродинамическим диаметром частиц, равным 3,2 мкм, который определяют каскадным импактором Андерсена. Пульверизатор подсоединяют к дозиметрической системе, содержащей
электромагнитный клапан и источник сжатого воздуха (20 фунт/дюйм2). Выход пульверизатора направляют в пластмассовый Т-образный образец для испытаний, один из концов которого подсоединен к дыхательному каналу поршневого респиратора. Электромагнитный клапан открывают на 1 с в начале дыхательного цикла респиратора. Аэрозоли поступают в количестве VT 500 мл со скоростью 20 вдохов в минуту. В качестве контроля применяют лишь 0,5%-ный раствор бикарбоната натрия.
Для исследования бронхиальной ответной реакции используют кумулятивные кривые зависимости
ответной реакции от концентрации карбахола, которые строят по методу Абрахама (1994). Биопсии из
бронхов берут перед и в процессе проведения лечения и через 24 ч после введения антигена. Биопсии
берут, используя методику Абрахама (1994).
In vitro изучение адгезии альвеолярных макрофагов также проводят по методике Абрахама (1994) и
определяют процент прилипших клеток.
Получение аэрозоля.
Раствор соединения-кандидата в растворе 0,5% бикарбонат натрия/физиологический раствор
(мас./об.) с концентрацией 30,0 мг/мл готовят, используя следующую методику.
А. Приготовление маточного раствора 0,5% бикарбонат натрия/физиологический раствор: 100,0 мл.
Методика.
1. Помещают 0,5 г бикарбоната натрия в мерную колбу емкостью 100 мл.
2. Добавляют приблизительно 90,0 мл физиологического раствора и подвергают ультразвуковой
обработке до полного растворения соли.
3. Добавляют необходимое количество физиологического раствора до объема 100,0 мл и тщательно
перемешивают.
В. Приготовление раствора соединения-кандидата с концентрацией 30,0 мг/мл: 10,0 мл.
Методика.
1. Помещают 0,300 г соединения-кандидата в мерную колбу емкостью 10,0 мл.
2. Добавляют приблизительно 9,7 мл маточного раствора 0,5% бикарбонат натрия/физиологический
раствор.
3. Обрабатывают ультразвуком до полного растворения.
4. Добавляют необходимое количество маточного раствора 0,5% бикарбонат натрия/физиологический раствор до объема 10,0 мл и тщательно перемешивают.
Пример Е. 10-дневные исследования на токсичность на мышах С57В6.
10-дневные исследования проводят с целью изучения токсичности соединений по настоящему изобретению по отношению к самкам мышей С57В6. Соединения вводят через желудочный зонд с пятью
уровнями дозировки, 0 (контрольный образец с носителем), 10, 30, 100, 300 и 1000 мг/кг, при этом для
каждого уровня дозировки берут 5 мышей. Объем дозы для всех уровней дозировки составляет 10 мл/кг.
Растворы или суспензии доз готовят в 2%-ном Tween 80 и 0,5%-ной карбоксиметилцеллюлозе, при этом
новые растворы или суспензии доз готовят каждые 2-3 дня. Наблюдения за животными включают измерение массы тела (на 1, 2, 3, 5, 7, 8 и 11 дни изучения), ежедневные клинические наблюдения за животными в клетке (1-2/день) и проведение набора периодических (-1, 2 и 9 дни изучения) функциональных
исследований.
- 24 -
008180
По завершении берут образцы крови сердечной пункцией с целью изучения клинической патологии
(гематологии и клинической химии) и определения уровней лекарства. Образцы крови с EDTA анализируют для определение общего содержания лейкоцитов, содержания эритроцитов, содержания гемоглобина, гематокритного числа, индексов эритроцитов (MCV, МСН, МСНС), содержания тромбоцитов и
дифференциального подсчета лейкоцитов с разделением на пять субпопуляций (нейтрофилы, лимфоциты, моноциты, эозинофилы и базофилы). Образцы плазмы с гепарином анализируют на содержание аланин-трансминазы, аспартат-трансминазы, алкалинфосфатазы, на общее содержание билирубина, альбумина, белка, кальция, глюкозы, мочевого азота, креатинина, холестерина и триглицеридов.
После отбора крови тельца животных вскрывают и взвешивают органы (печень, селезенку, почки,
сердце и вилочковую железу). Берут образцы тканей слюнных желез, вилочковой железы, сердца, легкого, печени, почки, надпочечников, желудка, двенадцатиперстной кишки, подвздошной кишки, толстой
кишки и маточника/яичников и фиксируют их формалином. Из тканей, полученных от контрольных животных, которым вводили носитель, и животных, которым назначали дозы 300 и 1000 мг/кг, готовят образцы для окрашенных пластинок Н&Е и оценивают на наличие гистопатологических повреждений.
Данные по изменению массы тела, абсолютные и относительные массы органов и результаты клинической патологии, с целью получения статистически значимых различий в сравнении с контрольными
образцами, взятыми от животных, получавших носитель, анализируют с помощью множественной сравнительной пробы Даннета, используя программное обеспечение фирмы Prism. Результаты набора функциональных тестов, с целью определения различий, анализируют, используя пробу Даннета, точную
пробу Фишера, и изменение эффекта в зависимости от дозы анализируют с помощью корреляционного
теста Кохрана-Мантеля-Хенсцеля и программного обеспечения фирмы SAS.
В указанной модели активны соединения по настоящему изобретению, которые готовят в виде
обычных составов для перорального введения.
Пример F. Модель адъювант-индуцированного артрита у крыс.
Адъювант-индуцированный артрит на животных моделях используют при изучении ревматоидного
артрита, который индуцируют путем инъекции М. tuberculosis крысам Lewis в основание хвоста. В интервале между 10 и 15 днями после инъекции у животных развивается острый прогрессирующий артрит.
В общем случае, соединения испытывают на их способность изменять распухание задней лапы и
повреждения костей, вызванные адъювант-индуцированным отеком у крыс. Для количественной оценки
подавления распухания задней лапы, возникающего в результате адъювант-индуцированного артрита,
определяют две фазы воспаления: (1) первичное и вторичное воспаление лапы, в которую делают инъекцию, и (2) вторичное воспаление лапы, в которую не делают инъекцию, обычно начинающее развиваться
приблизительно на 11-й день после индуцирования воспаления лапы, в которую делают инъекцию. Снижение последнего типа воспаления является указанием иммуносупрессивной активности. Например,
Chang, Arth. Rheum., 20, 1135-1141 (1977).
Использование животной модели ревматоидного артрита, такой как адъювант-индуцированный
артрит, помогает изучить процессы в клетках, протекающие на ранних стадиях болезни. Экспрессия
CD44 макрофагами и лимфоцитами усиливается в начале развития адъювантного артрита, в то время как
экспрессия LFA-1 усиливается позднее по мере развития болезни. Понимание взаимодействий между
адгезией молекул и эндотелием на первых стадиях адъювантного артрита может привести к значительным успехам в развитии методов, применяемых при лечении ревматоидного артрита.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1.
N-[2-N',N'-Диэтиламино-5-аминосульфонилфенилпиримидин-4-ил]паракарбамоилоксифенилаланиновое соединение формулы (I)
где каждый X независимо означает фтор, хлор или бром;
р равно 0 или целому числу от 1 до 3;
R1 выбирают из группы, включающей метил и этил;
R2 выбирают из группы, включающей С1-С5алкил, аллил и (C1-С4)алкилен-(С3-С6)циклоалкил;
и его фармацевтически приемлемые соли.
2. N-[2-N',N'-Диэтиламино-5-аминосульфонилфенилпиримидин-4-ил]паракарбомоилоксифенилала- 25 -
008180
ниновое соединение формулы (II)
где каждый X независимо выбирают из группы, включающей фтор и хлор;
m равно целому числу 1 или 2;
R2 выбирают из группы, включающей С1-С5алкил, аллил и (C1-С4)алкилен-(С3-С6)циклоалкил;
и его фармацевтически приемлемые соли.
3. N-[2-N',N'-Диэтиламино-5-аминосульфонилфенилпиримидин-4-ил]паракарбомоилоксифенилаланиновое соединение формулы (III)
где каждый X независимо означает фтор или хлор;
n равно 0 или 1;
R2 означает -СН2-R', где R' выбирают из группы, включающей водород, метил или -СН=СН2;
и его фармацевтически приемлемые соли.
4. Соединение по любому из пп.1, 2 или 3, где R2 означает СН3.
5. Соединение по п.3, где X означает F или Сl и n равно 0.
6. Соединение, выбранное из группы, включающей
2-{2-диэтиламино-5-[(4-хлорбензолсульфонил)метиламино]пиримидин-4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовую кислоту;
2-{2-диэтиламино-5-[(4-фторбензолсульфонил)метиламино]пиримидин-4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовую кислоту;
2-{2-диэтиламино-5-[(3,4-дифторбензолсульфонил)метиламино]пиримидин-4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовую кислоту;
2-{2-диэтиламино-5-[(3,4-дихлорбензолсульфонил)метиламино]пиримидин-4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовую кислоту;
2-{2-диэтиламино-5-[(бензолсульфонил)метиламино]пиримидин-4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовую кислоту;
2-{2-диэтиламино-5-[(2-фторбензолсульфонил)метиламино]пиримидин-4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовую кислоту;
2-{2-диэтиламино-5-[(3-фторбензолсульфонил)метиламино]пиримидин-4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовую кислоту;
2-{2-диэтиламино-5-[(4-фторбензолсульфонил)изопропиламино]пиримидин-4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовую кислоту;
2-{2-диэтиламино-5-[(4-фторбензолсульфонил)этиламино]пиримидин-4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовую кислоту;
2-{2-диэтиламино-5-[(3,4-дифторбензолсульфонил)изопропиламино]пиримидин-4-иламино}-3-(4диметилкарбамоилоксифенил)пропионовую кислоту;
2-{2-диэтиламино-5-[(4-хлорбензолсульфонил)изопропиламино]пиримидин-4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовую кислоту;
2-{2-диэтиламино-5-[(3,4-дифторбензолсульфонил)этиламино]пиримидин-4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовую кислоту;
2-{2-диэтиламино-5-[(4-хлорбензолсульфонил)этиламино]пиримидин-4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовую кислоту;
- 26 -
008180
2-{2-диэтиламино-5-[(4-фторбензолсульфонил)циклопропилметиламино]пиримидин-4-иламино}-3(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовую кислоту;
2-{2-диэтиламино-5-[(3,5-дифторбензолсульфонил)метиламино]пиримидин-4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовую кислоту;
2-{2-диэтиламино-5-[(3,5-дифторбензолсульфонил)этиламино]пиримидин-4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовую кислоту;
2-{2-диэтиламино-5-[(2,4-дифторбензолсульфонил)метиламино]пиримидин-4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовую кислоту;
2-{2-диэтиламино-5-[(2,4-дифторбензолсульфонил)этиламино]пиримидин-4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовую кислоту;
2-{2-диэтиламино-5-[(3,5-дихлорбензолсульфонил)метиламино]пиримидин-4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовую кислоту;
2-{2-диэтиламино-5-[(3,5-дихлорбензолсульфонил)этиламино]пиримидин-4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовую кислоту;
2-{2-диэтиламино-5-[(4-фторбензолсульфонил)-н-пропиламино]пиримидин-4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовую кислоту;
2-{2-диэтиламино-5-[(4-фторбензолсульфонил)аллиламино]пиримидин-4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовую кислоту;
2-{2-диэтиламино-5-[(4-фторбензолсульфонил)изобутиламино]пиримидин-4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовую кислоту;
2-{2-диэтиламино-5-[(4-фторбензолсульфонил)-н-бутиламино]пиримидин-4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовую кислоту;
2-{2-диэтиламино-5-[(2,5-дифторбензолсульфонил)метиламино]пиримидин-4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовую кислоту;
2-{2-диэтиламино-5-[(2,3-дифторбензолсульфонил)этиламино]пиримидин-4-иламино}-3-(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовую кислоту;
2-{2-диэтиламино-5-[(4-фторбензолсульфонил)-(2-трисфторэтил)амино]пиримидин-4-иламино}-3(4-диметилкарбамоилоксифенил)пропионовую кислоту;
и их фармацевтически приемлемые соли.
7. Фармацевтическая композиция, обладающая противовоспалительным действием, содержащая
фармацевтически приемлемый носитель и эффективное количество соединения по любому из пп.1-3, 5
или 6.
8. Способ ингибирования клеточной адгезии, опосредованной α-интегринами, включающий введение пациенту фармацевтической композиции, содержащей фармацевтически приемлемый носитель и
терапевтически эффективное количество соединения по любому из пп.1-3, 5 или 6.
9. N-[2-N',N'-Диэтиламино-5-аминосульфонилфенилпиримидин-4-ил]паракарбомоилоксифенилаланиновое соединение формулы (IV)
где каждый X независимо означает фтор, хлор или бром;
р равно 0 или целому числу от 1 до 3;
R1 выбирают из группы, включающей метил и этил;
R2 означает С2-С6алкинил;
и его фармацевтически приемлемые соли.
10. N-[2-N',N'-Диэтиламино-5-аминосульфонилфенилпиримидин-4-ил]паракарбомоилоксифенилаланиновое соединение формулы (V)
- 27 -
008180
где каждый X независимо выбирают из группы, включающей фтор и хлор;
m равно целому числу 1 или 2;
R2 означает С2-С6алкинил;
и его фармацевтически приемлемые соли.
11. N-[2-N',N'-Диэтиламино-5-аминосульфонилфенилпиримидин-4-ил]паракарбомоилоксифенилаланиновое соединение формулы (VI)
где каждый X независимо означает фтор или хлор;
n равно 0 или 1;
R2 означает С2-С6алкинил;
и его фармацевтически приемлемые соли.
12. Соединение по любому одному из пп.9, 10 или 11, где R2 означает пропаргил.
13. Соединение по п.11, где X означает F или Сl и n равно 0.
14. Соединение, выбранное из группы, включающей
2-{2-диэтиламино-5-[(4-фторбензолсульфонил)пропаргиламино]пиримидин-4-иламино}-3-(4диметилкарбамоилоксифенил)пропионовую кислоту;
2-{2-диэтиламино-5-[(2,4-дифторбензолсульфонил)пропаргиламино]пиримидин-4-иламино}-3-(4диметилкарбамоилоксифенил)пропионовую кислоту;
и их фармацевтически приемлемые соли.
15. Фармацевтическая композиция, обладающая противовоспалительным действием, содержащая
фармацевтически приемлемый носитель и эффективное количество соединения по любому из пп.9-11, 13
или 14.
16. Способ ингибирования клеточной адгезии, опосредованной α-интегринами, включающий введение пациенту фармацевтической композиции, содержащей фармацевтически приемлемый носитель и
терапевтически эффективное количество соединения по любому из пп.9-11, 13 или 14.
17. Способ по п.16, где клеточная адгезия, опосредованная α-интегринами, вызвана ревматоидным
артритом.
Евразийская патентная организация, ЕАПВ
Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2/6
- 28 -