ГК №02.740.11.0091
реклама
МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ГОСУДАРСТВЕННОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ НОВОСИБИРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ УДК 616.36-002+615.014.414; 66.091; 66.093.8; 661.882.2 № госрегистрации 01200905446 Инв.№ УТВЕРЖДАЮ Ректор университета, профессор, доктор химических наук ______________ В.А. Собянин «___»_________ 2011 г. ОТЧЕТ О НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКОЙ РАБОТЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ ЭКЗОГЕННОЙ ДВУЦЕПОЧЕЧНОЙ ДНК ЧЕЛОВЕКА НА АКТИВАЦИЮ И ФОРМИРОВАНИЕ ПРОТИВОРАКОВОГО АДАПТИВНОГО ИММУНИТЕТА И РАЗРАБОТКА ПРИНЦИПИАЛЬНО НОВЫХ ПОДХОДОВ В ИСПОЛЬЗОВАНИИ ПРЕПАРАТА НОВОГО ПОКОЛЕНИЯ ПАНАГЕН по теме: РАЗРАБОТКА СТРАТЕГИИ СОВМЕСТНОГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ЦИТОСТАТИКОВ И ПРЕПАРАТА «ПАНАГЕН», АКТИВИРУЮЩЕГО АДАПТИВНЫЙ ПРОТИВОРАКОВЫЙ ИММУНИТЕТ В ХОДЕ ПРОВЕДЕНИЯ ФАЗЫ II, III КЛИНИЧЕСКИХ ИСПЫТАНИЙ (заключительный) Проректор НГУ по научной работе, чл.-корр РАН ________________ С.В. Нетесов подпись ___ ___________ 2011 г. Руководитель работ проф., д.б.н. ________________ С.Н. Загребельный подпись НОВОСИБИРСК 2011 Список исполнителей Руководитель работ проф., д.б.н. _________________ подпись, дата С.Н. Загребельный (все разделы отчета) проф., к.б.н. _________________ подпись, дата Н.А. Попова (разделы 1, 4) с.н.с., к.б.н. _________________ подпись, дата Л.Г. Овечкина (раздел 1) с.н.с., к.м.н. _________________ подпись, дата В.П. Николин (раздел 1) инженер НГУ инженер НГУ аспирант лаборант-исследователь, аспирант лаборант-исследователь, аспирант Руководитель темы в Институте цитологии и генетики СО РАН, зав. лабораторией, д.б.н. аспирант м.н.с. н.с., к.б.н. н.с., к.б.н. нормоконтролер. _________________ Д.Н. Плетнев (раздел 1) подпись, дата _________________ В.В. Галиев (раздел 1) подпись, дата _________________ А.О. Цырульников (раздел 1) подпись, дата _________________ Е.А. Алямкина (разделы 1, 2, 4) подпись, дата _________________ Е.В. Долгова (разделы 1, 2, 4) подпись, дата _________________ С.С. Богачев (введение, разделы 2, 3, подпись, дата заключение) _________________ подпись, дата _________________ подпись, дата А.В. Прокопенко (разделы 2, 3) _________________ подпись, дата _______________ подпись, дата А.С. Проскурина (разделы 2, 3) _______________ подпись, дата Л.И. Кашникова В.А. Рогачев (разделы 2, 3) К.Е. Орищенко (разделы 2, 3) 2 Реферат Отчет 79 с., 27 рис., 10 табл., 86 источников. Ключевые слова – рак молочной железы, циклофосфан, доксорубицин, экзогенная ДНК, «Панаген», стратегия. Объектом исследования являлись пациенты с раком молочной железы II-IV стадии с назначением на программную полихимотерапию с применением схем циклофосфан+доксорубицин (AC) или циклофосфан+доксорубицин+фторурацил (FAC), участвующих в испытаниях препарата на основе ДНК человека «Панаген», номинированного в качестве лейкостимулирующего средства, применяемого в схемах лечения онкологических заболеваний. Целью настоящего этапа исследования, как завершающего этапа изучения действия экзогенной ДНК на формирование противоракового адаптивного иммунитета, являлась характеристика показателей лейкостимулирующего действия и показателей развития адаптивного иммунитета у пациентов, находящихся в исследовании препарата на основе ДНК человека «Панаген». В настоящем исследовании при проведении II фазы клинических испытаний препарата «Панаген» были объединены в одно целое все элементы знания, полученные на протяжении последних 10 лет и, в частности, данные, полученные в ходе проведения научно-исследовательских работ по ФЦП о влиянии экзогенной двуцепочечной ДНК на активацию дендритных клеток, формирование цитотоксических Т-лимфоцитов и развитие противоракового адаптивного иммунитета. В исследовании была применена новая стратегия лечения онкологических заболеваний, а именно использование сочетания свойств циклофосфана, доксорубицина и препарата ДНК человека в определенной стратегической схеме. Базовым в примененной стратегии было использование основных свойств препаратов, терапевтический эффект которых проявляется в синергизме их действия. Циклофосфан деструктирует опухолевые клетки, доксорубицин повышает иммуногенность раковоклеточного дебриса, а препарат «Панаген» активирует адаптивное звено иммунитета, что приводит к формированию противоракового адаптивного иммунитета. Проведенные исследования продемонстрировали эффективность использования препарата экзогенной ДНК «Панаген» в клинических испытаниях на протяжении трех непрерывных курсов полихимиотерапии по схемам AC или FAC, проводимых по поводу рака молочной железы II-IV стадии. Показана лейкостимулирующая активность препарата. Установлено, что в процессе лечения с использованием препарата «Панаген» (препарат на основе экзогенной ДНК) активируется адаптивное звено иммунитета, 3 формируется пул цитотоксических лимфоцитов, восстанавливается активность натуральных киллеров, угнетенная действием цитостатиков. Рекомендации по внедрению результатов НИР – по завершению II фазы клинических испытаний на базе Иркутского онкологического диспансера будет подготовлена нормативная документация, необходимая для проведения III фазы клинических испытаний и последующей регистрации лекарственной формы препарата. Область применения – онкологические больные. Экономическая эффективность или значимость работы заключается в том, что результаты работы позволили разработать и применить на практике стратегию использования сочетания химиотерапевтических процедур и препарата на основе аллогенной ДНК «Панаген» в схемах лечения онкозаболеваний. Такой подход позволяет использовать лейкостимулирующие и протекторные свойства препарата по ходу следующих одна за другой химиотерапий и одновременно индуцировать противораковый адаптивный иммунитет. В итоге исследований, проведенных в рамках проекта, проведена экспериментальная проверка и выработана стратегия совместного использования препарата «Панаген» в схемах лечения онкологических заболеваний с применением цитостатиков циклофосфана и доксорубицина. Сформулированы и применены рекомендации использования предлагаемой стратегии в клинической практике. Предложенная стратегия применена к протоколу клинических испытаний препарата «Панаген», проводящихся по поводу лечения рака молочной железы с положительным результатом. В ходе экспериментальной работы были получены результаты, позволившие: а) выработать и применить на практике регламент совместного применения цитостатиков циклофосфана и доксорубицина и препарата «Панаген»; б) оценить эффективности предложенной стратегии в сравнении со стандартной терапией циклофосфаном и доксорубицином (схема AC или FAC), принятой в современной онкологической практике в исследовании пациентов, проходящих курс программной полихимиотерапии по поводу рака молочной железы II-IV стадии по критерию содержания в периферической крови маркеров активированного адаптивного иммунитета. Сформированная концепция стратегии использования сочетания препаратов цитостатической группы и препарата «Панаген» в программной химиотерапии при лечении онкозаболеваний была применена на практике на II фазе клинических испытаний, проходящих в Новосибирском онкодиспансере по поводу рака молочной железы. 4 Полученные результаты свидетельствуют о появлении в периферической крови пациентов, принимавших препарат, цитотоксических CD8+ Т-лимфоцитов, составляющих основу противоракового адаптивного иммунитета. Также показано, что в организме пациентов, принимавших препарат «Панаген», сохраняется активным врожденный противораковый иммунитет, что характеризуется специфической активностью натуральных киллеров, детектируемой в МТТ тестах. Все полученные результаты используются в образовательном процессе на Факультете естественных наук и Медицинском факультете НГУ. Предусмотренные календарным планом задания выполнены полностью. 5 Содержание Определения, обозначения и сокращения...................................................................................7 Введение .........................................................................................................................................8 Основная часть.............................................................................................................................16 1 Разработка дополнительного протокола клинических испытаний с использованием полученных данных проверенных экспериментальных схем .............................................16 1.1 Основной протокол. Обзор ...........................................................................................16 1.2 Дополнительный протокол. Развитие противоракового адаптивного иммунитета 19 2 Подготовка и осуществление процедуры по указанному протоколу в ходе фазы II, III клинических испытаний препарата «Панаген» препарата в качестве дополнительных мероприятий к основному заявленному................................................................................23 2.1 Оценка относительного и абсолютного количества миелоидных (CD11c+CD123–) и плазмацитоидных (CD11c–CD123+) ДК в периферической крови больных .............28 2.2 Оценка относительного и абсолютного количества регуляторных Т-лимфоцитов в периферической крови больных, участвующих в исследовании лейкостимулирующего действия препарата Панаген по поводу рака молочной железы II- IV стадии .........................................................................................................................37 2.3 Определение цитокинов в периферической крови здоровых доноров и пациентов, участвующих во второй фазе клинических испытаний препарата Панаген по поводу рака молочной железы II-IV стадий ..................................................................................40 3 Адаптация найденных параметров совместного введения цитостатиков и препарата «Панаген» к использованию на человеке в ходе фазы II, III клинических испытаний препарата в качестве дополнительных мероприятий к основному заявленному, направленному на характеристику лейкостимулирующего действия. ..............................65 4 Внедрение результатов в образовательный процесс ........................................................69 Заключение...................................................................................................................................70 Список использованных источников.........................................................................................72 6 Определения, обозначения и сокращения ДК – дендритные клетки – гетерогенная популяция антиген-презентирующих клеток костномозгового происхождения; ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота; ИЛ – интерлейкины – группа цитокинов, представляющих собой небольшие пептидные информационные молекулы, регулирующие межклеточные и межсистемные взаимодействия и обеспечивающие согласованность действия иммунной, эндокринной и нервной систем в нормальных условиях и в ответ на патологические воздействия; ИФН – интерферон – тип белков, способствующих формированию защитного барьера организма, препятствующего инфицированию организма вирусами и бактериями, а также регулирующих состояние иммунной системы и ингибирующих рост злокачественных клеток; МТТ-тест – тест по оценке цитотоксичности клеток с использованием реагента 3-(4,5диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолиум бромида; РНК – рибонуклеиновая кислота; ФНО-α – фактор некроза опухоли альфа; ХТ – химиотерапия; ЦФ – циклофосфан. 7 Введение Известно, что иммунная система высших эукариот способна к определенному противодействию развитию неотрансформированных новообразований. В начале прошлого века Паулем Эрлихом была выдвинута гипотеза иммунологического надзора, которая в дальнейшем была досконально разработана Макферлайном Бернетом. Суть гипотезы состояла иммунологический в том, надзор что за главная генетическим функция иммунной постоянством системы соматической – это клетки. Злокачественная опухоль – источник чужеродной генетической информации и, следовательно, является объектом защитной реакции. Тем не менее, известно, что опухоли обладают низкой иммуногенностью и индуцируют механизмы, позволяющие опухолевым клеткам избегать иммунной атаки. Это означает, что иммунологические механизмы могут стать инструментом в противоопухолевой защите при преодолении защитных факторов малигнизированных клеток и опухоли в целом. Течение многих злокачественных заболеваний сопряжено с развитием опухоль-ассоциированной иммуносупрессии, на фоне которой опухолевые клетки «ускользают» от иммунного надзора. Иммунорезистентность опухоли связывают с несколькими механизмами, которые реализуются на клеточном и гуморальном уровне, в первую очередь, в микроокружении развивающейся опухолевой ткани. Среди них иммуносупрессорных выделяют: а) медиаторов, сдвиг цитокинового подавляющих баланса в функциональную сторону активность иммунокомпетентных клеток, инфильтрирующих опухоль; б) связанный с этим дисбаланс эффекторных, цитотоксических и регуляторных Т-клеток; в) возникновение молекулярных дефектов в системах клеток, участвующих в распознавании и презентации антигена и передаче сигнала внутрь клетки [1]; г) формирование опухолью защитного барьера с повышенной концентрацией «опухоленосной» ДНК, поддерживающей генетическую стабильность клеток малигнизированной ткани и экспортирующей опухолевые гены в другие части организма [2-5]. Цитокины, продуцируемые микроокружением опухоли, способствуют формированию иммунологической толерантности. Основными цитокинами, определяющими резистентность опухоли к действию иммунной системы, являются трансформирующий фактор роста (TGF-β), интерлейкины 10 и 23 (ИЛ-10, ИЛ-23), сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF). TGF-β – регуляторный пептид, участвующий в поддержании иммунологического гомеостаза. Участие этого цитокина в формировании иммунологической толерантности обусловлено его влиянием на CD4+ и CD8+ лимфоциты и натуральные киллеры. TGF-β сдвигает дифференцировку CD4+ в направлении иммунорегуляторных клеток 8 (CD4+CD25+ Т-регуляторные лимфоциты), подавляет экспрессию перфоринов, гранзима В и Fas-лиганда в CD8+-лимфоцитах, блокирует ИЛ-12-индуцированную экспрессию интерферона гамма (ИФН-γ) натуральными киллерами. ИЛ-10 блокирует продукцию ИЛ12, ко-стимулирующих молекул MHCII на дендритных клетках (ДК), нарушая их созревание, а также синтез цитокинов CD4+-Т-клетками. ИЛ-23 способствует стимуляции ангиогенеза за счет увеличения экспрессии матричной металлопротеиназы 9 типа (MMP9). VEGF – один из основных проангиогенных факторов, подавляет созревание ДК, а также способствует генерации незрелых миелоидных клеток, которые, в свою очередь, подавляют Т-клеточную активность. В микроокружении опухоли происходят изменения в соотношении клеток иммунной системы, способных подавлять развитие опухоли и клеток, супрессирующих такую активность. Отмечается увеличение доли незрелых ДК и супрессорных регуляторных Тлимфоцитов. Зрелые ДК экспрессируют на своей поверхности CD40, CD80, CD83, CD86 и характеризуются высоким уровнем продукции ИЛ-12. Под действием VEGF, ИЛ-6 (ИЛ23), TGF-β, ИЛ-10, COX-2, PGE2, ганглиозидов, секретирующихся в микроокружении опухоли, блокируется дифференцировка и созревание ДК, что делает невозможным формирование адекватного иммунного ответа. Регуляторные Т-клетки подавляют иммунный ответ путем регуляции функций эффекторных клеток. Наиболее значимыми в подавлении иммунного ответа на развивающуюся опухоль являются CD4+CD25+ Трегуляторные лимфоциты. Они образуются из тех же клеток-предшественников, что и Тхелперы, под влиянием избыточных концентраций TGF-β, ИЛ-10, VEGF. Механизм супрессивного действия CD4+CD25+ Т-регуляторных лимфоцитов связан с дополнительной секрецией TGF-β, ИЛ-10, с «конкуренцией» в отношении лигандов ИЛ-2, с индукцией толерантности ДК. Еще одной особенностью иммунных клеток из микроокружения опухоли является наличие значимых молекулярных дефектов в механизмах, формирующих иммунологическую активность этих клеток. В частности, обнаружено снижение уровня экспрессии MHCI и II, CD80, CD86, CD154 на поверхности антигенпрезентирующих клеток из опухоли, а также снижение экспрессии ξ-цепи TCR Т-хелперов. Одним их основных факторов, подавляющих функции лимфоцитов, находящихся в микроокружении опухоли, являются ганглиозиды (GD1a, GD2, GD3, GM1, GM2), экспрессирующиеся на поверхности опухолевых клеток и слущивающиеся в межклеточное пространство. Эти ганглиозиды обладают способностью подавлять функции Т-лимфоцитов, инфильтрующих опухоль. Нарушения эффекторной функции лимфоцитов проявляются в виде снижения уровня экспрессии гранзима В8 и киназ p59fyn 9 и ZAP-70, находящихся в комплексе с TCR, нарушая процессы трансдукции сигнала внутрь клетки. Таким образом, проведенный краткий анализ изменений в эффекторных звеньях иммунной системы, характерных для микроокружения опухоли, раскрывает трудности, связанные с применением иммунологических методов борьбы с малигнизированной тканью. К этому следует добавить один важный момент, связанный с защитой опухолью своего жизненного пространства. Раковая ткань может формировать специфическую защитную среду в своем микроокружении за счет выброса в межклеточное пространство апоптотической или некротической фрагментированной ДНК опухоли. Далее эта ДНК может распространяться по всему организму, и, как показывают последние исследования, принимать участие в развитии отдаленных метастазов (генометастазирование) [5]. Известно, что экзогенная ДНК поглощается различными клетками организма и может депонироваться в ядерном пространстве [6]. Доставленная в межхромосомное пространство ядер эта ДНК может интегрировать в геном или использоваться как экзогенная матрица и изменять основные функции клеток. Если такая ДНК в достаточном количестве интернализируется в клетках иммунной системы, сконцентрированных в микроокружении опухоли, то возможна индукция событий, которая приведет к интеграции экзогенной генетической информации в геном иммунных клеток. Это может привести к драматическому изменению основных иммунных свойств таких клеток, как это показано для микроокружения опухоли. Другим действием опухолевой ДНК, находящейся в большом количестве в микроокружении опухоли, является ее подавление и конкурентные отношения с любой другой ДНК (бактериальная, CpG синтетическая), активирующей противораковую активность иммунных клеток. Эффективность противоопухолевого иммунитета во многом зависит от активности иммунокомпетентных клеток – натуральных киллерных клеток, цитотоксических Тлимфоцитов, макрофагов и ДК. Эти клетки участвуют в запуске, организации и реализации реакций врожденного и адоптивного иммунитета и через различные гуморальные и клеточно-опосредованные механизмы элиминируют раковые клетки. Первой линией противоопухолевой защиты является система неспецифической резистентности, которую составляют натуральные киллерные клетки и активированные макрофаги. Натуральные киллеры составляют 0,6-2,4% общего пула лимфоцитов или 15% от общего количества периферических мононуклеаров. Натуральные киллеры распознают опухолевые клетки иным способом, отличающимся от иммунологического распознавания, 10 поскольку в этих клетках не происходит перестраивания генов T-клеточных рецепторов. Уничтожение опухолевых клеток натуральными киллнрами осуществляется, как и в случае Т-цитотоксических лимфоцитов, за счет образования в клетке-мишени пор порообразующим белком перфорином, освобождающимся из натуральных киллеров при специфическом контакте с опухолевой клеткой, или же за счет связывания молекул Fas и активации мембранозависимого апоптоза. Агрессия натуральных киллеров связана с их врожденной предрасположенностью распознавать измененные клетки своего организма по неизвестному механизму. Предполагается, что если при контакте с какой-то клеткой экспрессированные молекулы CD8 и KIR (killer inhibitory receptor), которые по действию на опухолевую клетку проявляют антагогнистическое действие, не находят достаточное количество своих лигандов – MHC-I (что характерно для неотрансформированных клеток) то натуральные киллеры развивают в отношении этой клетки цитотоксическую атаку и убивают ее. Активированные макрофаги в большом количестве концентрируются в области сформированной опухоли. Противоопухолевая активность макрофагов осуществляется за счет секреции токсичных для опухолевых клеток лизосомальных ферментов и фактора некроза опухоли (ФНО-α). Повышение концентрации ФНО-α в микроокружении опухоли тормозит рост опухолевых сосудов, при этом нормальные сосуды от повышения концентрации ФНО-α не страдают. Секреция ИФН-γ в окружении макрофагов приводит к формированию механизма так называемого кислородного взрыва, в результате которого макрофагом генерируются активные формы кислорода и окись азота NO, которые являются токсичными для близлежащих клеток, в том числе и раковых. В случае несостоятельности механизмов неспецифической защиты, связанной с нарушением экобиосистем жизнедеятельности, генетическими особенностями, возрастом индивида, тяжестью сопутствующей патологии, наличием исходной иммунокомпрометированности, и т.д., в организме включаются механизмы адаптивного иммунитета [1, 7, 8]. Во многом это зависит от уровня экспрессии на опухолевых клетках специфических опухолеассоциированных антигенов, которые распознаются иммунокомпетентными клетками и против которых индуцируются эффекторные реакции, направленные на элиминацию опухолевого клона. В эффективной реализации реакций адаптивного иммунитета большое значение имеют два этапа, связанные, во-первых, с процессингом/презентацией опухолеассоциированных антигенов антигенпрезентирующими клетками (главным образом, ДК), и, во-вторых, со стимуляцией пролиферации и созревания цитотоксических Т-лимфоцитов. В этой связи активированное специфическое звено иммунной системы представляет собой важный 11 фактор в борьбе с малигнизированными клетками. Если на поверхности опухолевых клеток располагаются специфические антигены, то они должны распознаваться иммунокомпетентными клетками и индуцировать эффекторные реакции, направленные на элиминацию опухоли. ДК, будучи профессиональными антигенпрезентирующими клетками, обладают уникальной способностью представлять антигены Т-клеткам и индуцировать эффективный иммунный ответ на различные антигены. При патологии (онкологические заболевания, хронические инфекции) наблюдается снижение количества ДК и угнетение их функциональной активности, что приводит к подавлению иммунного ответа. ДК обеспечивают тесную взаимосвязь реакций врожденного и приобретенного иммунитета. Активация и развитие неспецифического и антиген-специфического иммунного ответа, во многом зависит от эффективности связывания соответствующих рецепторов с определенным типом агонистов. Агонистами для активации врожденного иммунитета являются так называемые PAMP (pathogen associated molecular patterns), которые связываясь с рецептором PRR (pattern-recognition receptor) индуцируют синтез и секрецию цитокинов и костимулирующих молекул. Адаптивный иммунный ответ связан с антигенспецифическими рецепторными комплексами Т- и В-лимфоцитов (TCR и BCR, соответственно). Соматическая перестройка генов TCR и BCR формирует в высшей степени разнообразный репертуар молекул с возможностью опознавать почти все антигенные детерминанты специфическим образом [9, 10]. Факты, полученные в исследованиях последних лет, предполагают, что нуклеиновые кислоты являются индукторами как врожденного, так и адаптивного иммунитета. Наибольший интерес в плане рассматриваемой проблемы противоопухолевой активности иммунной системы представляет собой специфическое взаимодействие рецептора TLR9 и CpG ДНК. Этот рецептор располагается в эндосомальных компартментах в составе эндоплазматического ретикулюма [11-13]. Эффект CpG ДНК на развитие иммунного ответа может быть прямым или опосредоваться через активацию иммунных клеток, конститутивно экспрессирующих TLR9, таких как В-лимфоциты и ДК [14]. При этом ДК становятся компетентными индуцировать развитие CD8+ и CD4+Тлимфоцитов в направлении преимущественной дифференцировки цитотоксических CD8+Т-клеток по сравнению с нормальным Т-генезом [14-17]. TLR9 до настоящего времени является единственным хорошо изученным рецептором, который при взаимодействии с CpG ДНК формирует иммунный ответ [18, 19]. Предполагается, что TRL9 опосредованный путь активации иммунной системы связан как с присутствием неметилированных последовательностей CpG, так и с любой ненормальной структурой 12 олигонуклеотида, содержащего, например, фосфоротиоатный остов. Все лиганды TRL9 являются полимерами с циклическими компонентами гидрофобной природы [18]. В последнее время стало очевидным, что двуцепочечная ДНК различного происхождения и в различной форме и не зависимо от последовательности может участвовать в регуляции обоих типов иммунного ответа. Причем эта регуляция не зависит от активации TLR9 и предполагает наличие альтернативных молекулярных механизмов активации иммунокомпетентных клеток [20-24]. Охарактеризованы различные индукторные формы ДНК и определены эффекторные свойства иммунокомпетентных клеток, индуцированных этой ДНК. Показано, что двуцепочечная ДНК в форме нуклеосом [21, 25], очищенная геномная ДНК млекопитающих, бактерий, вирусов [23, 24], двуцепочечная ДНК, не содержащая CpG мотивы [24, 26], одноцепочечные CpG олигонуклеотиды [27] приводят к созреванию и усилению функциональной активности ДК и макрофагов. Этот процесс характеризуется активацией синтеза костимуляторных молекул (MHC I и II класса, CD40, CD54, CD86, CD83) [21, 23, 26, 28-30], цитокинов (ИФН-α/β, ФНО-α, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-12p40/70) [21, 23, 24], нитрооксида (NO) [30]. До настоящего времени не известно, каким образом происходит такого рода активация, хотя известно, что для этого процесса необходимо функционирование определенного набора специфических генов [26]. Во многих последних исследованиях уделяется большое внимание иммуногенным олигонуклеотидам, содержащим или CpG «островки» или имеющим фосфоротиоатный остов [31]. Имеется много экспериментальных сведений о том, что эти ДНК обладают способностью индуцировать адаптивный иммунный ответ при их введении в организм. Это свойство внимание иммуногенных олигонуклеотидов широко дискутируется в плане их применения в терапии онкологических заболеваний [10, 13, 18, 19, 32]. Основной мишенью для ДНК-стимуляции являются иммунокомпетентные Тлимфоциты, натуральные киллеры, макрофаги и главное – ДК. ДНК, как индуктор иммунокомпетентности ДК, в зависимости от условий может формировать как иммунное противораковое, так и супрессивное направление их активности. Обработанные специфическими олигонуклеотидами ДК влияют на направление дифференцировки наивных CD4+CD25– Т-клеток [33, 34]. Экспериментально показано, что иммуногенные свойства ДНК связаны с ее воздействием на TLR9, которые обнаружены в большом количестве у плазматических ДК и макрофагов [35-37]. Как уже было сказано, Toll-like рецепторы (TLR9) относятся к группе паттерн-распознающих рецепторов, инициирующих врожденный и адаптивный иммунитет. Взаимодействие TLR-9 рецепторов ДК со специфическим лигандом – ДНК, является первым и основным шагом в цепи 13 последовательных событий, приводящих к активации способности ДК индуцировать противораковый биологический эффект. Противораковое действие активированных ДК состоит в индукции и усилении синтеза и секреции главных цитокинов, а также в определении дифференцировки Т-лимфоцитов. Если активирован CD8+ Т-клеточный путь, то ДК эффективно представляют антигены, в том числе и опухолевые Тцитотоксическим лимфоцитам, и стимулируют их пролиферацию. Это действие приводит к формированию адаптивного противоракового иммунного ответа. Недавно было обнаружено явление синергичного регрессирующего действия на опухоль цитостатической олигонуклеотидов [19]. обработки При этом и последующих эффективность инъекций иммуногенных противоракового действия специфических нуклеотидов, если они доставлялись в организм опытных животных вслед за обработкой цитостатиком, значительно возрастала. Главным условием проявления эффекта, как уже было сказано, являлось последовательное разбитое во времени введение вначале цитостатика, а затем иммуногена. Индукция иммунного ответа иммуногенными олигонуклеотидами синергична с большим количеством различных цитостатиков, используемых в химиотерапии (ХТ) онкологических заболеваний, включая циклофосфамид (ЦФ). Предполагается, что одним из механизмов такого синергизма может быть снижение количества супрессирующих адаптивный иммунитет T- регуляторных лимфоцитов и задержка их развития по сравнению с CD8+ Т-лимфоцитами после миелосуперессии, вызванной действием цитостатика. Другое объяснение явления синергизма состоит в том, что обработка цитостатиком изменяет иммуногенность опухолевых антигенов в сторону усиления иммунного ответа на них. Ингибирование Tрегуляторного противоопухолевого Т-клеточного ответа, по-видимому, является одним из основных препятствий для противораковой вакцинации и иммунотерапии [19, 38]. Клиническая практика предполагает, что противораковая эффективность терапии иммуногенными олигонуклеотидами может быть усилена предварительной инактивацией Т-регуляторных лимфоцитов. Известно, что при цитостатической обработке терапевтическими дозами цитостатиков погибают любые типы лимфоцитов, не зависимо от их свойств. Некоторые факты свидетельствуют о том, что Т-регуляторные лимфоциты могут быть более чувствительными к обработке цитостатиками, чем нормальные Т-клетки [39-46]. Это предполагает, что ХТ может селективно в большей степени воздействовать на Т-регуляторные лимфоциты, сохраняя жизнеспособность Т-цитотоксических лимфоцитов, которые и определяют высокий противораковый индекс такой терапии [43, 47, 48]. Микроокружение опухоли ассоциировано с активностью Т-регуляторных лимфоцитов, которые супрессируют иммунное воздействие на опухолевые клетки и защищают опухоль 14 от иммунной регрессии. В этом случае проведенная ХТ не только значительно уменьшает количество Т-регуляторных лимфоцитов, но и элиминирует их защитную функцию [49]. «Раздетая» таким образом опухоль становится восприимчивой к действию индуцированного TLR-9-ДНК терапией врожденного и адаптивного иммунитета. Фактически при щадящей обработке цитостатиком меняется микроокружение опухоли и вовремя активированные ДК становятся в состоянии представлять опухолевые антигены и сформировать Т-цитотоксический ответ против опухоли, которая до этого «ускользала» от иммунного надзора [19]. Удивительный феномен описан в работе [50] и связан с изменением иммуногенности раковых клеток при воздействии определенных цитостатиков. Проанализировав 20 различных цитостатиков на предмет иммуногенности погибших раковых клеток после цитостатической обработки, авторы обнаружили, что цитостатики антрациклинового ряда (доксорубицин, идарубицин, митоксантрон), а также γ-облучение, приводят к формированию в высшей степени иммуногоенного клеточного дебриса. Дальнейший анализ такого явления выявил то факт, что указанные цитостатики индуцируют экспозицию калритикулина на внешней части цитоплазматической мембраны раковой клетки, находящегося до этого на эндоплазматичекоретикулярнолй люмине. Калретикулин представляетм собой Ca2+ связанный лектиновый шаперон. При обработке антрациклины индуцируют практически мгновенную (через несколько минут после добавления цитостатика) экспозицию ретикулярного калретикулина на мембране. Калретикулин является сигналом для фагоцитирующих клеток к поглощению («eat me») везикул на мембране которых находится белок. Преапоптотическая экспозиция калретикулина на поверхности погибающей клетки в высокой степени коррелирует с иммуногенностью постклеточного апоптотического материала. Калретикулин делает клетки иммуногенными в результате следующих обстоятельств. Один из главных моментов стимуляции Т-цитотоксического клеточного ответа – это поглощение незрелыми ДК иммуногенного клеточного материала. Далее происходит созревание ДК (которое по нашим данным стимулируется экзогенной ДНК), в результате чего процессированные антигены опухоли представляются на поверхности ДК в составе MHCI класса молекул. Калретикулин стимулирует ДК к поглощению клеточного дебриса, что делает его иммуногенным. Блокирование калретикулина приводит к потере ДК способности опознавать такой клеточный материал как in vitro, так и in vivo. Однако калретикулин никак не действует на созревание и активацию ДК. Это может сделать экзогенная ДНК в тот момент, когда ДК поглотила иммунногенный дебрис. 15 В наших работах установлено, что фрагментированная геномная ДНК активно захватывается ДК и часть ее интернализуется в межхромосомном компартменте ядра. Оказалось, что экзогенная фрагментированная ДНК активирует ДК, индуцируя их аллостимуляторную активность и созревание в системе ex vivo [51, 52]. Также установлено, что препарат фрагментированной двуцепочечной ДНК обладает выраженной противораковой активностью при его использовании в сочетании с цитостатиком ЦФ в экспериментах с перевиваемыми опухолями мышей в системе in vivo [53]. Сочетание инъекций ЦФ с последующей обработкой фрагментированной ДНК, а также ЦФ и доксорубицина с последующей обработкой фрагментированной ДНК, приводит к ярко выраженному противораковому действию на перевиваемую опухоль [54]. Мы полагаем, что наиболее вероятным путем тормозящего воздействия на развитие солидных опухолей в проведенных экспериментах in vivo является активация определенных звеньев иммунной системы. Хотя нельзя исключить вероятность двойного противоракового действия, основанного как на атаке на опухоль иммунной системы, так и на реверсивном генетическом перерождении раковых клеток в зонах опухоли, доступных для интернализации достаточного для модификации генома раковой клетки количества фрагментов экзогенной ДНК [6]. Основная часть 1 Разработка дополнительного протокола клинических испытаний с использованием полученных данных проверенных экспериментальных схем Для понимания механизмов противоракового действия иммунной системы, а также для того, чтобы ответить на вопрос, связана ли наблюдаемая регрессия экспериментальных опухолей с активацией Т-цитотоксического пути, индуцируемого ДК, то есть развивается ли адаптивный противораковый иммунитет при использовании препарата фрагментированной экзогенной ДНК в сочетании с цитостатиками в противораковой терапии человеческих заболеваний, мы разработали программу исследований и экспериментальный дизайн дополнительного протокола к основному, определенному Фармкомитетом, протоколу клинических испытаний Фазы II препарата Панаген. 1.1 Основной протокол. Обзор Проводимое исследование является двойным слепым, многоцентровым, плацебоконтролируемым, последовательно-рандомизированным исследованием фазы II с 2 группами пациентов. В нем будет принимать участие всего 80 пациентов с раком 16 молочной железы на стадии II с повышенной степенью риска, либо на стадии III или IV (с отдаленными метастазами), которым требуется ХТ. Все пациенты будут последовательно рандомизированы, то есть, не зависимо от времени включения в исследование пациент может попасть в одну из 2 групп. Пациенты будут разделены на 2 группы в соотношении 3 к 1: первая группа 60 человек и вторая группа – 20 человек. По этическим соображениям размер второй группы был выбран минимально возможным для получения достоверных результатов. Пациенты будут проходить стандартную ХТ по схеме: ЦФ 500 мг/м2 в/в 1 день, доксорубицин 50 мг/ м2 в/в 1 день, фторурацил 500 мг/м2 в/в 1 день. В рамках исследования фазы II пациенты пройдут 3 цикла ХТ (по 3 недели на каждый цикл), каждый цикл начинается в день ХТ (день 1). Всего в исследовании примут участие 80 пациентов. Первая группа пациентов из 60 человек будут проходить ХТ по схеме: ЦФ 500 мг/м2 в/в 1 день, доксорубицин 50 мг/м2 в/в 1 день, фторурацил 500 мг/м2 в/в 1 день. На фоне ХТ пациенты данной группы будут принимать препарат Панаген в дозе 30 мг/сутки при дробном равномерном приеме в течение активного периода суток, что будет составлять одна таблетка препарата Панаген шесть раз в день (каждые два часа). Пациенты данной группы прием препарата начинают сразу непосредственно после проведенной ХТ и принимают 3 таблетки в течение 6 часов, то есть по одной таблетке каждые два часа. После этого пациенты прекращают прием препарата, и возобновляют его через 42 часа, то есть через 48 часов после проведенной ХТ (день 3) и продолжают в течение 17 дней до 20 дня после ХТ (включительно). Если следующий курс ХТ откладывается, то пациенты продолжают прием препарата. Закончить прием препарата следует за 1 день до следующего цикла ХТ. Приемлема задержка следующего курса ХТ на 1 неделю. Исследование является плацебо-контролируемым, поэтому в группе из 20 человек, пациенты будут принимать таблетки, не содержащие активного ингредиента. Все пациенты, которые попадут в группу плацебо, получат полное стандартное лечение согласно требованиям Министерства здравоохранения и социального развития РФ. Вторая группа (схема точно такая же, как для первой группы) пациентов из 20 человек будут проходить ХТ по схеме: ЦФ 500 мг/м2 в/в 1 день, доксорубицин 50 мг/м2 в/в 1 день, фторурацил 500 мг/м2 в/в 1 день. На фоне ХТ пациенты данной группы будут принимать плацебо по одной таблетке шесть раз в день, при дробном равномерном приеме в течение активного периода суток (по одной таблетке каждые два часа). Пациенты данной группы прием плацебо начинают сразу непосредственно после проведенной ХТ и принимают 3 таблетки в течение 6 часов, то есть по одной таблетке каждые два часа. После этого пациенты прекращают прием плацебо, и возобновляют прием через 42 часа, то есть через 17 48 часов после проведенной ХТ (день 3) и продолжают в течение 17 дней до 20 дня после ХТ (включительно). Если следующий курс ХТ откладывается, то пациенты продолжают прием плацебо. Закончить прием плацебо следует за 1 день до следующего цикла ХТ. Приемлема задержка следующего курса ХТ на 1 неделю. В цикле ХТ 1 образцы крови для определения абсолютного числа лейкоцитов и нейтрофилов будут собираться за 1-3 дня до ХТ, на 7 (± 1), 14 (± 2), и 21 (± 1) дни после ХТ. Образцы крови для определения количества CD34+ клеток будут собираться за 1-3 дня до ХТ и затем на день 7 (± 1) и день 21 (± 1) после ХТ. В цикле 2 образцы крови для определения абсолютного числа лейкоцитов и нейтрофилов будут собираться на 28 (± 1), 35 (± 2), и 42 (± 1) дни после ХТ. Образцы крови для определения количества CD34+ клеток будут собираться только на день 42 (± 1) после ХТ. В цикле 3 образцы крови для определения абсолютного числа лейкоцитов и нейтрофилов будут собираться на 49 (± 1), 56 (± 2), и 63 (± 1) дни после ХТ. Образцы крови для определения количества CD34+ клеток будут собираться только на день 63 (± 1) после ХТ. Если любой из циклов ХТ откладывается, то образцы крови для проведения анализов дополнительно забираются за 1-3 дня до начала следующего цикла ХТ. В цикле 1 температура тела будет измеряться каждый день, пока пациент не будет готов перейти к следующему циклу (лейкоциты ≥ 3,0×109/л, нейтрофилы ≥ 1,5×109/л, в день 1 следующего цикла). В циклах 2 и 3 измерения проводятся точно также. Анализ безопасности (физикальное обследование, основные показатели жизнедеятельности) будет проводиться в течение 1-3 дней до начала ХТ в каждом цикле и на 14 (± 2) день после проведенной ХТ. Пациенты будут наблюдаться на предмет возникновения нежелательных явлений и прием сопутствующих препаратов в течение исследования. Анализы конца исследования будут проведены на 21 (± 2) день после 3 цикла ХТ. * – Анализ крови на абсолютное количество лейкоцитов и нейтрофилов, общий анализ крови. Биохимический анализы крови проводится за 1-3 дня до начала ХТ и на 21 (± 2) день после ХТ. # – Подсчет количества CD34+ клеток. 18 Все пациенты будут проходить миелосупрессивную ХТ в день 1 каждого цикла по схеме: ЦФ 500 мг/м.кв в/в 1 день. Доксорубицин 50 мг/м.кв. в/в 1 день. Фторурацил 500 мг/м.кв. в/в 1 день. ХТ повторяется каждые 3 недели (если не требуется перерыв). Для начала ХТ в день 1 следующего цикла (день 22 предыдущего цикла) у пациента должно быть лейкоциты ≥ 3,0×109/л, нейтрофилы ≥ 1,5×109/л, а число тромбоцитов ≥ 100×109/л. Приемлема задержка введения дозы ХТ до 1 недели. Продолжение ХТ после завершения 3 циклов остается на усмотрение исследователя. 1.2 Дополнительный протокол. Развитие противоракового адаптивного иммунитета В рамках описанного протокола был разработан дизайн протокола, направленный на анализ активации у пациентов, состоящих в исследовании, противоракового адаптивного иммунитета. Как было отмечено выше, чтобы не противоречить основному протоколу исследования, контрольные точки дополнительного протокола были привязаны к контрольным точкам основного, и из остатков проб крови проводились анализы, регламентированные дополнительным протоколом. В исследовании будут участвовать пациенты с раком молочной железы II-IV стадии. Предположительное количество пациентов 20-30 человек, получающих препарат Панаген, и 10 человек, получающих плацебо. Оперативное удаление балка опухолевой ткани. 3 курса ПХТ (ЦФ 500 мг/м2 в/в 1 день, Доксорубицин 50 мг/м2 в/в 1 день, Фторурацил 500 мг/м2 в/в 1 день). Физический смысл подхода. 1. ХТ включает обязательное использование сочетания доксорубицина и ЦФ (доксорубицин приводит к перемещению калретикулина на цитоплазматическую мембрану, что делает опухолевую клетку видимой для атаки фагоцитирующими клетками, это сигнал «eat me – съешь меня»; ЦФ приводит к деструкции опухолевой клетки и формированию клеточного дебриса; таким образом формируется иммуногенный клеточный дебрис). 2. В тот же самый момент ЦФ дифференцированно угнетает различные популяции Т-лимфоцитов. Так угнетение Т-регуляторных лимфоцитов, создающих противоиммунную защиту опухоли, происходит практически полностью. При этом нарушается супрессивная функция Т-регуляторных лимфоцитов. При этом Т19 цитотоксические лимфоциты гибнут только частично и восстанавливаются под действием препарата ДНК и активности ДК. Это создает промежуток времени, когда опухолевая ткань становится незащищенной цитокиновым градиентом, предохраняющим ее от воздействия иммунной системы. 3. В этот же момент проводится активация созревания и индукция аллосимуляторной активности ДК организма in vivo с использованием препарата экзогенной фрагментированной аллогенной ДНК Панаген. ДК созревают и нагружаются опухолевыми антигенами, которые теперь распознаются ДК. ДК активируют развитие Т-цитотоксического специфического противоракового ответа. 4. Т-цитотоксические лимфоциты лизируют все, что относится к зоне их атаки, в том числе оставшиеся опухолевые клетки. 5. Формируется Т-память против этого неопластического материала. Для анализа берется периферическая кровь в количестве 15 мл в точках, указанных на схеме. Выделяется мононуклеарная фракция, которая анализируется на специфические маркеры и проводятся специфические тесты. 20 Схема ведения эксперимента. Контрольные точки взятия крови. 21 День 1 День за 1-3 дня до ХТ 61 День 41 День 40±1 20±1 XT2 XT1 60±1 XT3 Специфические тесты, позволяющие оценить развитие адаптивного противоракового иммунитета у пациентов, получающих сочетание цитостатических препаратов и препарата Панаген. Оценка иммунного статуса у больных раком молочной железы в динамике проведения ХТ + Панаген. Тесты Принцип метода/оборудование/реактивы Что показывает тест 1. Относительное и абсолютное количество Проточная цитометрия, FACSCalibur, Изменение количества ДК, их миелоидных (CD11c+CD123–) и моноклональные антитела, субпопуляционную принадлежность (но не плазмацитоидных (CD11c–CD123+) ДК в лизирующий/фиксирующий растворы степень зрелости) в динамике терапии 2. Относительное и абсолютное количество Проточная цитометрия, FACSCalibur, Изменение количества регуляторных Т- Т-регуляторных клеток (CD4+CD25+FoxP3+ моноклональные антитела, клеток с супрессорной активностью и или CD4+CD25+CD127–), цитотоксических лизирующий/фиксирующий растворы цитотоксических Т-лимфоцитов, периферической крови больных (CD8+перфорин+) Т-лимфоцитов, наивных а также изменение количества и 21 Т-клеток и Т-клеток памяти соотношения наивных Т-клеток и Т-клеток (CD4+CD45RA/RO и CD8+CD45RA/RO) в памяти в динамике терапии периферической крови больных 3. Цитокин-секреторная активность Иммуноферментный анализ на продукцию Изменение Th1-активности циркулирующих мононуклеарных клеток крови, в ответ на ИФН-γ в 48-часовых супернатантах культур Т-клеток, стимулированных митогеном стимуляцию митогенами (анти-CD3-мАТ) и МНК, стимулированных анти-CD3 или (контроль) или опухолевыми антигенами опухолевыми антигенами (лизат опухолевых опухолевыми антигенами; ламинар/СО2- (развитие специфического клеточного клеток рака молочной железы). инкубатор, ИФА-ридер; культуральная среда, иммунного ответа) в динамике терапии добавки, митоген, пулированный лизат опухолевых клеток, выделенных из 5-7 опухолей рака молочной железы, ИФА тестсистема на ИФН-γ (Вектор-БЭСТ, Новосибирск). 1-ая начальная точка – до начала терапии (за 1-3 дня до 1 ХТ), 2-ая промежуточная точка – за 1 день до начала 2 ХТ; 3-я конечная точка – по завершении курса терапии (по завершении 3-го 21-дневного курса терапии препаратом Панаген). 22 2 Подготовка и осуществление процедуры по указанному протоколу в ходе фазы II, III клинических испытаний препарата «Панаген» препарата в качестве дополнительных мероприятий к основному заявленному В рамках проводимых испытаний нового медицинского препарата на основе ДНК человека Панаген было проведено параллельное исследование, связанное с анализом развития адаптивного противоракового иммунитета у пациентов, участвующих в протоколе. Такая постановка вопроса была связана с многочисленными экспериментальными данными, полученными на протяжении последних 10 лет, которые однозначно свидетельствовали о появлении противораковой активности в организме экспериментальных животных при использовании различных стратегий, компонентом которых являлась экзогенная ДНК человеческого происхождения. Как свидетельствовали многочисленные и повторяющиеся экспериментальные данные, основным объектом воздействия экзогенной ДНК в противораковых стратегиях являлись ДК и индуцируемый ими Th1-путь, при котором формируется пул специфических CD8+ T-цитотоксических лимфоцитов. Одновременно адаптивного с активацией иммунитета в причинных стратегиях звеньев лечения развития противоракового онкологических заболеваний высокодозовой цитостатической терапией происходят изменения в количестве и функциональном состоянии регуляторных Т-лимфоцитов, которые, как считается в современной иммунологии, ответственны за подавление противоракового иммунного ответа. В этой связи в рамках проводимых исследований периферической крови пациентов, находящихся в исследовании, были выделены три направления анализа, которые могли бы дать или однозначно трактуемый ответ по поводу действия препарата Панаген на развитие адаптивного противоракового иммунитета, или указать дальнейший путь экспериментальной работы. Выбор направления анализов также был связан с возможностями, которые дает анализ образцов периферической крови. В этой связи была проведена оценка следующих параметров, отражающих активацию развития противоракового адаптивного иммунитета по ходу трех ХТ, проводимых по поводу рака молочной железы II-IV стадии. - Была проведена оценка относительного и абсолютного количества миелоидных (CD11c+CD123–) и плазмацитоидных (CD11c–CD123+) ДК в периферической крови больных. Изменение количества ДК, их субпопуляционная принадлежность (но не степень зрелости) оценивалось в динамике терапии. 23 - Было оценено относительное и абсолютное количество Т-регуляторных клеток (CD4+CD25+FoxP3+ или CD4+CD25+CD127–), обладающих супрессорной активностью; - Основное внимание (CD8+перфорин+) было Т-лимфоцитов уделено как оценке динамики цитотоксических основных факторов развивающегося противоракового адаптивного иммунитета. - Дополнительно была проведена оценка цитокин-секреторной активности мононуклеарных клеток крови как у здоровых доноров, так и у пациентов, находящихся в протоколе. ДК – это гетерогенная популяция антигенпрезентирующих клеток костномозгового происхождения. Морфологически ДК – крупные клетки (15-20 мкм) круглой, овальной или полигональной формы, экцентрически расположенным ядром, многочисленными разветвленными отростками мембраны. ДК экспрессируют набор поверхностных молекул, характерных для других антигенпредставляющих клеток: рецепторы для компонентов клеточной стенки и нуклеиновых кислот микроорганизмов, в том числе рецепторы к компонентам комплемента и toll-like рецепторы; молекулы MHCII; костимуляторные молекулы CD40, B7 1/2 (CD80, CD86), B7-DC, B7-H1; молекулы межклеточной адгезии (ICAM-1). Основной функцией ДК является презентация антигенов Т-клеткам. ДК также выполняют важные иммунорегуляторные функции, такие как контроль за дифференцировкой Т-лимфоцитов, регуляция активации и супрессии иммунного ответа. Важной особенностью ДК является способность захватывать из окружающей среды различные антигены при помощи фагоцитоза, пиноцитоза и рецептор-опосредованного эндоцитоза. Больше всего ДК находится в тканях, которые соприкасаются с внешней средой, например в толще эпителиального слоя слизистой оболочки кишечника, в подслизистой респираторного, желудочно-кишечного и урогенитального трактов. ДК поглощают антигены, процессируют и представляют на своей поверхности в комплексе с MHC I или MHC II классов. Только в таком виде Т-клетки способны распознать антиген и вслед за этим активироваться и развить иммунный ответ. В зависимости от типа патогена ДК способны направлять дифференцировку наивных Т-хелперов (Th0) в сторону Тхелперов 1 типа, Т-хелперов 2 типа, регуляторных Т-клеток или же Т-хелперов 17. У человека выделяют две субпопуляции ДК – миелоидные и лимфоидные ДК. Миелоидные ДК названы так потому, что происходят из общего миелоидного гемопоэтического предшественника. Локализованы в различных органах и тканях, где захватывают микроорганизмы, чужеродные белки путем фаго- и пиноцитоза, после чего экспрессируют антигенную детерминанту в комплексе с молекулами MHCII. Затем ДК мигрируют в регионарные лимфоузлы, где стимулируют пролиферацию и 24 дифференцировку антигенспецифических Т-лимфоцитов, тем самым инициируя и стимулируя иммунный ответ. Специфическими маркерами миелоидных ДК крови являются молекулы BDCA-1 (CD1c), BDCA-3. Миелоидные ДК не экспрессируют маркеры других клеток иммунной системы, таких как CD14 (моноциты, макрофаги и нейтрофилы), CD3 (Т-лимфоциты), CD19, CD20 (B-лимфоциты), CD56, CD57 (естественные киллеры), CD66b (гранулоциты). Также для миелоидных ДК характерно присутствие молекулы CD85k (ILT3), В ответ на стимуляцию индукторами созревания, миелоидные ДК продуцируют преимущественно цитокины Th1 спектра, включая ИЛ-6, ИЛ-12, ФНО-α и ИФН-γ. Лимфоидные ДК – основная субпопуляция ДК крови. Предшественниками лимфоидных ДК является очень маленькая популяция клеток периферической крови, характеризующаяся отсутствием маркера CD11 и присутствием маркера CD123 (рецептор ИЛ3), которая названа плазмацитоидными ДК. Плазмацитоидные ДК способны продуцировать в 200-1000 раз больше ИФН-α, чем все другие клетки периферической крови. Эти клетки за счет продукции интерферонов первого типа и ИЛ-12 оказывают модулирующее влияние на адаптивный иммунный ответ, стимулируют созревание миелоидных ДК, вследствие чего происходит поляризация Т-клеточного ответа в сторону Th1 варианта [55]. К маркерам плазмацитоидных ДК также относят молекулы BDCA-2, BDCA-4. Основная популяция лимфоидных ДК экспрессируют TRL-9, лигандами которого являются CpG-олигонуклеотиды бактериальная ДНК. Лимфоидные ДК секретируют ИЛ-4 и ИЛ-10, которые переключают дифференцировку нулевых Т-хелперов в Т-хелперы 2 типа [56]. Миелоидные ДК способны активировать CD8+ Т-клетки. Лимфоидные ДК вызывают превращение CD8+ Т-клеток в супрессорные (регуляторные) клетки. Однако, вырабатываемый предшественниками лимфоидных плазмацитоидными ДК ИФН первого типа, способствует созреванию миелоидных ДК, повышает их способность активировать CD8+ Т-клетки. Это означает, что в формировании противоракового адаптивного клеточного иммунитета принимают участие как миелоидные, так и часть лимфоидных – плазмацитоидные ДК. В процессе активации противоопухолевого иммунного ответа формируются два пула лимфоцитов. CD8+ Т-лимфоциты, приводящие к формированию клеточного и гуморального ответа на прогрессирующую малигнизированную ткань. Как было сказано, в формировании CD8+ популяции принимают участие миелоидные ДК и часть лимфоидных ДК (плазмацитоидные ДК). В формировании гуморального ответа 25 принимают участие лимфоидные ДК, основное количество которых циркулирует в периферической крови [55]. При образовании опухолевой ткани в нее мигрируют предшественники ДК и незрелые Т-лимфоциты CD4+ и CD8+ фенотипа. Фактором миграции, по-видимому, являются цитокины ФНО-α или ИЛ-1. Процесс миграции протекает в течение всего времени существования опухоли [57]. Оказываясь в опухоли, незрелые предшественники ДК поглощают различные белковые молекулы, фрагменты клеток из внеклеточного пространства, а также поглощают белки шапероны семейства HSP со встроенными в них антигенными пептидными эпитопами. После поглощения потенциальных антигенов в предшественниках ДК происходят процессы, приводящие к презентации антигенных эпитопов совместно с молекулами гистосовместимости I и II классов. Важно отметить, что презентация происходит как в неактивных, так и в активных ДК. Однако в неактивных ДК этот процесс носит характер постоянного оборота рецепторов со внешней поверхности клетки внутрь и обратно. При активации уход комплексов MHCI и MHCII с поверхности клетки блокируется, и клетка в полной мере осуществляет антигенпрезентирующую функцию [58]. Процесс созревания ДК индуцирует два одновременно происходящих события – усиление презентации антигенов и миграцию клеток из опухоли в региональные лимфатические узлы. Процесс миграции зависит от экспрессии на их поверхности хемокинового рецептора CCR8, который реагирует на градиент хемокина CCL1 (I-308), регулирующие таксис в лимфатические узлы [59]. Пептиды, генерируемые в результате процессинга опухолеассоциированных антигенов, встраиваются преимущественно в молекулы MHCII. Тем не менее, показано, что миелоидные ДК способны презентировать эпитопы из белковых молекул, захваченных из окружающей среды молекулами гистосовместимости I класса, которые в норме презентируют эпитопы белков, синтезированных в самой клетке. Данные феномен называется кросс презентацией. В результате механизма кросс презентации презентация пептидов из опухолевых антигенов осуществляется как в контексте молекул MHCI, так и в комплексе с молекулами MHCII. Одновременно с презентацией антигена происходит выход на поверхность клетки костимулирующих молекул B-7, ICOS и секретируется набор цитокинов. Эти события активируют наивные Т-клетки, стимулируя их развитие в функциональные CD4+ и CD8+ лимфоциты. CD8+ лимфоциты являются основными эффекторами адаптивного иммунитета. CD8+ Т-цитотоксические лимфоциты и CD4+ Th1-клетки вовлекаются в процессы непосредственно в очаге опухолевого роста. Предполагаются два механизма уничтожения опухолевых клеток Т-цитотоксическими лимфоцитами. Это общепринятое действие 26 перфоринов, являющихся основным показателем цитотоксичности CD8+ лимфоцитов. Другой механизм связан с секрецией CD8+ клетками ИФН-γ. Предполагается, что Тцитотоксические лимфоциты, секретируя ИФН-γ, усиливают кросс-презентацию антигенов в эндотелии опухолевой стромы и уничтожают клетки опухоли при помощи активации в них Fas-рецептора [60, 61]. Сформированные Th1-хелперы CD4+ стимулируют обучение Т-цитотоксических лимфоцитов путем активации ДК со своей стороны. Этот процесс осуществляется за счет секретируемого Th1-хелперами ИЛ-12 и ИФН-γ. Вторам механизмом противоопухолевого действия Th1-клеток является индукция гиперчувствительности замедленного типа, заключающаяся в стимуляции макрофагов в опухолевых очагах секретируемым ИФН-γ. Активированные макрофаги начинают агрессивно поглощать опухолевые клетки. Популяция Т-хелперов Th2 обеспечивает формирование гуморального ответа иммунной системы. Лимфоидные (плазмоцитоидные) ДК могут индуцировать образование регуляторных Th2-клеток, необходимых для формирования гуморального иммунного ответа. Начальный этап активации В-клеток происходит на границе Т- и В клеточных зон вторичных лимфоидных органов. Антигенная стимуляция индуцирует их миграцию к Т-клеточным зонам. Здесь В-клетки взаимодействуют с антигенспецифическими Th2-хелперами. В начале лимфоидные (плазмоцитоидные) ДК активируют последние, которые далее распознают антиген, представляемый им Вклетками в комплексе с МНС II класса, и активируют В-клетки путем взаимодействия CD40L/CD40. Дальнейшая дифференцировка В-клеток в антителообразующие плазмоциты происходит в герминативных центрах под влиянием специализированных ДК миелоидного ряда. Таким образом, взаимодействие ДК с цитотоксическими лимфоцитами имеет сложный двунаправленный характер. Их активацию могут осуществлять любые ДК. Благодаря экспрессии ИФН-1, ИЛ-12,-15 и -18 ДК усиливают цитотоксичность натуральных киллеров и продукцию ИФН-γ. Экспрессия CD40L или ФНО-α индуцирует созревание лимфоидных (плазмоцитоидных) ДК. ИФН способствует развитию миелоидных ДК и экспрессии Thl-дифференцировочного сигнала. ДК могут как стимулировать Т-клеточный ответ, так и вызывать иммунологическую толерантность. Представление антигенов цитотоксическим Т-клеткам осуществляется молекулами МНС I и II классов. Источниками антигенных пептидов, представляемых ими, являются белки, синтезируемые в самой ДК, а также экзогенные белки. Наивные CD8+ Т-клетки в ходе иммунного ответа могут превращаться в неполяризованные Т-лимфоциты (CD45), секретирующие только ИЛ-2; в эффекторные цитотоксические Т-клетки, которые 27 продуцируют тот же спектр цитокинов, что и Thl- и Тh2-клетки. Существует дополнительная субпопуляция цитолитических эффекторных CD8+ Т-клеток, секретирующих ИФН-γ, экспрессирующих высокие уровни перфорина и способных к немедленному лизису антигенспецифических клеток-мишеней. И, таким образом, существует глубокая органическая связь между двумя популяциями ДК. Несмотря на то, что миелоидные ДК, содержащие на своей поверхности большое количество MHCII белков, в первую очередь ответственны за формирование пула CD8+ Т-цитотоксических лимфоцитов, плазмацитоидные ДК также имеют прямое отношение к формированию Th1-ответа, регулируя активацию миелоидных ДК. 2.1 Оценка относительного и абсолютного количества миелоидных (CD11c+CD123–) и плазмацитоидных (CD11c–CD123+) ДК в периферической крови больных Поскольку антигенпрезентирующие клетки, такие как и макрофаги и ДК, происходят из моноцитов, стимуляция препаратом Панаген моноцитарного ростка кроветворения является позитивным показателем проведенной терапии. В этой связи оценка представленности и соотношения миелоидных (CD11+CD123–) и плазмацитоидных (CD11–CD123+) ДК в периферической крови пациентов, находящихся в исследовании, будет характеризовать возможные пути активации иммунного ответа. Анализ содержания цитотоксических CD8+перфорин+ лимфоцитов в периферической крови будет прямым показателем развития противоракового адаптивного иммунитета у пациентов, принимающих участие в клинических испытаниях препарата Панаген. В ходе исследования было установлено, что регуляция количества миелоидных и плазмацитоидных ДК отличается как по типу клеток, так и в отношении различных групп пациентов. Как и в случае с анализом стимуляции гемопоэза препаратом Панаген, было обнаружено, что часть пациентов отвечает на действие препарата в данной контрольной точке, а другая часть не отвечает. Хотя в другой контрольной точке список «отвечающих» и «не отвечающих» мог быть другим. В связи с этим был выбран следующий принцип анализа. Сравнивались абсолютные показатели по отношению к нулевой точке в первой и третьей ХТ отдельно. Сравнивались показатели по отношению к контрольной точке 21 день после 1 ХТ, взятой за 100%. При анализе количества плазмацитоидных ДК (CD11–CD123+) в образцах периферической крови (таблица 1) установлено, что из группы в 14 человек отвечают на действие препарата 9 человек по совокупности после 1 и 3 ХТ, что составляет 64% (рисунок 1, таблица 2). 36% пациентов не отвечают на действие препарата Панаген в выбранных контрольных точках (р>0,95). В ходе ХТ у 30% больных наблюдается 28 значительное повышение количества плазмацитоидных ДК в периферической крови к последней контрольной точке 21 день после 3 ХТ (р>0,95) (рисунок 2, таблица 3). Остальные пациенты демонстрируют снижение или стабилизацию этой популяции ДК в образах крови по отношению к показателю после 1 ХТ. Таблица 1 – Процентное содержание CD11–CD123+ плазмацитоидных ДК в периферической крови пациентов, находящихся в исследовании. Антонова Бондаренко Бондарь Войнова Глущенко Говорухина Голохвастова Ефремова Иванилова Ковалева Моисеева Мунд Мурина Пензина Джен Качанова Курбанова 0 – исходный 21 день уровень после 1 ХТ Панаген 0,42 0,57 0,78 0,21 0,68 0,36 0,34 0,12 0,88 0,54 1,56 0,85 0,13 0,12 0,96 0,61 0,34 0,30 2,00 5,26 0,29 0,90 0,16 0,87 0,39 0,60 0,95 0,87 Плацебо 0,23 0,41 0,30 0,24 0,22 0,97 21 день после 3 ХТ 0,16 0,18 1,40 0,75 0,52 0,74 0,80 0,49 0,64 0,84 0,10 0,06 0,48 0,31 0,42 0,53 0,26 29 Рисунок 1 – Условное содержание (%) CD11–CD123+ плазмацитоидных ДК в периферической крови пациентов, находящихся в исследовании, на 21 день после 1 и 3 ХТ относительно исходного уровня. Таблица 2 – Условное содержание (%) CD11–CD123+ плазмацитоидных ДК в периферической крови пациентов, находящихся в исследовании, на 21 день после 1 и 3 ХТ относительно исходного уровня. 21 день после 1 ХТ 21 день после 3 ХТ Панаген – отвечающие Антонова 135,7 Мурина 123,1 Мурина 153,8 Бондарь 205,9 Ковалева 263,0 Войнова 220,6 Моисеева 310,3 Голохвастова 615,4 Мунд 543,8 Иванилова 188,2 среднее 281,3 среднее 270,6 станд.откл. 163,9 станд.откл. 196,3 дов.инт. р=0,95 143,7 дов.инт. р=0,95 172,0 30 Бондаренко Глущенко Говорухина Ефремова Пензина Бондарь Войнова Голохвастова Иванилова среднее станд.откл. дов.инт. р=0,95 Джен Качанова Курбанова среднее станд.откл. дов.инт. р=0,95 Панаген – не отвечающие 26,9 Антонова 61,4 Бондаренко 54,5 Глущенко 63,5 Говорухина 91,6 Ефремова 52,9 Пензина 35,3 Ковалева 92,3 Моисеева 88,2 Мунд 63,0 среднее 23,9 станд.откл. 15,6 дов.инт. р=0,95 Плацебо 178,3 Джен 80,0 Качанова 440,9 Курбанова 233,1 среднее 186,6 станд.откл. 211,1 дов.инт. р=0,95 38,1 23,1 59,1 47,4 51,0 32,6 42,0 34,5 37,5 40,6 10,7 7,0 182,6 176,7 118,2 159,2 35,6 40,3 Рисунок 2 – Условное содержание (%) CD11–CD123+ плазмоцитоидных ДК в периферической крови пациентов, находящихся в исследовании, на 21 день после 3 ХТ относительно уровня после 1 ХТ. ** – отличия от группы «Плацебо» достоверны с вероятностью >0,95. Таблица 3 – Условное содержание (%) CD11–CD123+ плазмоцитоидных ДК в периферической крови пациентов, находящихся в исследовании, на 21 день после 3 ХТ относительно уровня после 1 ХТ. Панаген – отвечающие Панаген – не отвечающие Плацебо Бондарь 388,9 Антонова 28,1 Джен 102,4 Войнова 625,0 Пензина 35,6 Качанова 220,8 Голохвастова 666,7 Бондаренко 85,7 Курбанова 26,8 Иванилова 213,3 Глущенко 96,3 31 среднее станд.откл. дов.инт. р=0,95 Говорухина Ефремова Мурина Ковалева Моисеева Мунд 473,5 среднее 212,2 станд.откл. 208,0 дов.инт. р=0,95 87,1 80,3 80,0 16,0 11,1 6,9 52,7 среднее 36,1 станд.откл. 22,4 дов.инт. р=0,95 116,7 97,8 110,7 Полученные данные предполагают, что в ходе терапии происходит увеличение популяции циркулирующих плазмацитоидных ДК. При этом всплеск появления ДК связан с состоянием индивидуального больного. С индивидуальными особенностями связаны, на наш взгляд, эффект различия в количестве плазмацитоидных ДК к 1 ХТ у одних пациентов и к 3 ХТ у других. 63% больных, получавших Панаген, демонстрируют ответ на действие препарата по совокупности показателей контрольных точек 21 сутки после 1 и 3 ХТ. Анализ изменения популяции миелоидных ДК (CD11+CD123–) в периферической крови не выявил закономерностей, которые позволили бы оценить возможность активации адаптивного иммунитета через эту популяцию антигенпрезентирующих клеток (рисунки 3 и 4, таблицы 4-6). Таблица 4 – Процентное содержание CD11+CD123– миелоидных ДК в периферической крови пациентов, находящихся в исследовании. 0 – исходный 21 день 21 день уровень после 1 ХТ после 3 ХТ Панаген Антонова 0,90 1,43 0,47 Бондаренко 0,93 0,51 0,18 Бондарь 0,68 0,87 0,99 Войнова 0,59 0,37 1,05 Глущенко 1,90 0,78 0,78 Говорухина 1,56 1,11 2,00 Голохвастова 0,42 0,39 1,40 Ефремова 2,40 0,80 0,81 Иванилова 0,42 0,86 0,85 Ковалева 2,00 3,00 0,84 Моисеева 1,71 1,13 0,24 Мунд 0,18 1,20 0,15 Мурина 0,88 0,86 0,75 Пензина 1,05 1,32 0,38 Плацебо Джен 0,32 0,32 1,02 Качанова 0,80 0,35 1,60 Курбанова 0,97 1,46 0,30 32 Рисунок 3 – Условное содержание (%) CD11+CD123– миелоидных ДК в периферической крови пациентов, находящихся в исследовании, на 21 день после 1 и 3 ХТ относительно исходного уровня. Таблица 5 – Условное содержание (%) CD11+CD123– миелоидных ДК в периферической крови пациентов, находящихся в исследовании, на 21 день после 1 и 3 ХТ относительно исходного уровня. 21 день после 1 ХТ 21 день после 3 ХТ Панаген – отвечающие Антонова 158,9 Войнова 178,0 Бондарь 127,9 Бондарь 145,6 Иванилова 204,8 Иванилова 202,4 Ковалева 150,0 Говорухина 128,2 Мунд 666,7 Голохвастова 333,3 Пензина 125,7 среднее 239,0 среднее 197,5 станд.откл. 211,5 станд.откл. 81,2 33 дов.инт. р=0,95 Войнова Бондаренко Глущенко Ефремова Моисеева Мурина Говорухина Голохвастова среднее станд.откл. дов.инт. р=0,95 Джен Качанова Курбанова среднее станд.откл. дов.инт. р=0,95 169,2 дов.инт. р=0,95 Панаген – не отвечающие 62,7 Антонова 54,8 Ковалева 41,1 Мунд 33,3 Пензина 66,1 Бондаренко 97,7 Глущенко 71,2 Ефремова 92,9 Моисеева Мурина 65,0 среднее 22,6 станд.откл. 15,7 дов.инт. р=0,95 Плацебо 100,0 Джен 43,8 Качанова 150,5 Курбанова 98,1 среднее 53,4 станд.откл. 60,4 дов.инт. р=0,95 71,1 52,2 42,0 83,3 36,2 19,4 41,1 33,8 14,0 85,2 45,2 25,0 16,3 318,8 200,0 30,9 183,2 144,6 163,7 Рисунок 4 – Условное содержание (%) CD11+CD123– миелоидных ДК в периферической крови пациентов, находящихся в исследовании, на 21 день после 3 ХТ относительно уровня после 1 ХТ. Таблица 6 – Условное содержание (%) CD11+CD123– миелоидных ДК в периферической крови пациентов, находящихся в исследовании, на 21 день после 3 ХТ относительно уровня после 1 ХТ. Панаген – отвечающие Панаген – не отвечающие Плацебо Бондарь 113,8 Антонова 32,9 Джен 318,8 Войнова 283,8 Бондаренко 35,3 Качанова 457,1 Говорухина 180,2 Глущенко 100,0 Курбанова 20,5 34 Голохвастова 359,0 Ефремова Иванилова Ковалева Моисеева Мурина Мунд Пензина 234,2 среднее 108,7 станд.откл. 106,5 дов.инт. р=0,95 среднее станд.откл. дов.инт. р=0,95 101,3 98,8 28,0 21,2 87,2 12,5 28,8 54,6 среднее 37,1 станд.откл. 23,0 дов.инт. р=0,95 265,5 223,1 252,5 Известно, что ЦФ индуцирует повышение количества ДК с фенотипом CD11+ на 9-16 день после инъекции [62]. ДК, сформировавшиеся в результате действия ЦФ, активируют развитие CD8+ Т-цитотоксических лимфоцитов. В этой связи достаточно проблематично оценивать действие препарата Панаген по появлению в периферической крови определенных популяций ДК и цитотоксических клеток в условиях протокола исследований, поскольку такое появление всегда будет экранироваться действием самого ЦФ. И, если в таких условиях обнаруживается достоверная разница в сравниваемых показателях, то обнаруженное изменение объективно существует в анализируемой системе. Была проведена оценка количества перфорин-содержащих Т-цитотоксических лимфоцитов в периферической крови пациентов, находящихся в исследовании (таблица 7). Проведенный анализ показал, что у 10 из 12 (83%) пациентов, принимавших Панаген, количество Т-цитотоксических лимфоцитов CD8+перфорин+ в первой контрольной точке 21 день после 1 ХТ достоверно больше, чем у группы «Плацебо» (р>0.95) (рисунок 5, таблица 8). Если рассматривать анализируемый признак по совокупности обеих контрольных точек, то у подавляющего числа пациентов, принимавших Панаген, в периферической крови содержании Т-цитотоксических лимфоцитов многократно превышает исходную норму. Таблица 7 – Процентное содержание CD8+перфорин+ цитотоксических лимфоцитов в периферической крови пациентов, находящихся в исследовании. 0 – исходный 21 день 21 день уровень после 1 ХТ после 3 ХТ Панаген Антонова 4 6 8,4 Бондаренко 6 8 Бондарь 10 14,7 16 Войнова 16 6,3 17 Глазунова 9 5 Глущенко 9 9 2,1 Говорухина 7 15 6,3 35 Голохвастова Ефремова Иванилова Ковалева Моисеева Мунд Мурина Пензина Джен Качанова Курбанова 3 14 17 2 17 8,4 15 19 Плацебо 14 18 9 9 17 10,5 4 21 15 5 4 9 8,4 11 12,6 7 20 10,5 10 15 19 10 Рисунок 5 – Условное содержание (%) CD8+перфорин+ цитотоксических лимфоцитов в периферической крови пациентов, находящихся в исследовании, на 21 день после 1 и 3 ХТ относительно исходного уровня. ** – отличия от группы «Плацебо» достоверны с вероятностью >0,95. 36 Таблица 8 – Условное содержание (%) CD8+перфорин+ цитотоксических лимфоцитов в периферической крови пациентов, находящихся в исследовании, на 21 день после 1 и 3 ХТ относительно исходного уровня. 21 день после 1 ХТ 21 день после 3 ХТ Панаген – отвечающие Антонова 150,0 Антонова 210,0 Бондарь 147,0 Бондарь 160,0 Голохвастова 300,0 Голохвастова 420,0 Ковалева 200,0 Ковалева 525,0 Глущенко 100,0 Войнова 106,3 Говорухина 214,3 Мунд 178,6 Ефремова 121,4 Иванилова 117,6 Моисеева 123,5 Бондаренко 133,3 Мунд 178,6 среднее 166,8 среднее 245,4 станд.откл. 59,1 станд.откл. 161,9 дов.инт. р=0,95 36,6 дов.инт. р=0,95 120,0 Панаген – не отвечающие Войнова 39,4 Глущенко 23,3 Мурина 33,3 Говорухина 90,0 Пензина 21,1 Ефремова 50,0 Глазунова 55,6 Моисеева 58,8 Иванилова 61,8 среднее 42,2 среднее 55,5 станд.откл. 16,5 станд.откл. 27,5 дов.инт. р=0,95 14,5 дов.инт. р=0,95 26,9 Плацебо Джен 64,3 Джен Качанова 46,7 Качанова 105,6 Курбанова 122,2 Курбанова 111,1 среднее 77,7 среднее 108,3 станд.откл. 39,5 станд.откл. 3,9 дов.инт. р=0,95 44,7 дов.инт. р=0,95 5,4 Полученные данные свидетельствуют, что в организме пациентов, принимавших Панаген в ходе трех ХТ по поводу рака молочной железы, произошли изменения, характеризующие развитие адаптивного иммунного ответа. Изменения количества Тцитотоксических лимфоцитов, по-видимому, связано с миграцией лимфоцитов к опухолевому очагу. 2.2 Оценка относительного и абсолютного количества регуляторных Т-лимфоцитов в периферической крови больных, участвующих в исследовании 37 лейкостимулирующего действия препарата Панаген по поводу рака молочной железы II- IV стадии Как говорилось в начальных главах настоящего исследования, особое место в индукции устойчивости опухоли к противодействию иммунной системы занимают CD4+CD25+Fox3+ Т-регуляторные лимфоциты. Т-регуляторные клетки с указанным фенотипом играют центральную роль в контроле адаптивного иммунного ответа и периферической толерантности. Высокая концентрация этих клеток выявляется у больных раком молочной железы, колоректальным раком, раком легкого, поджелудочной железы и является неблагоприятным прогнозом. Т-регуляторные лимфоциты формируются из тех же клеток, что и Т-хелперы, под влиянием избыточных концентраций TGF-β, ИЛ-10 и VEGF. Основной механизм супрессивного действия CD4+CD25+Fox3+ клеток связан с секрецией супрессорных цитокинов TGF-β, ИЛ-10, которые угнетают образование ИЛ-2 эффекторными клетками. Также Т-регуляторные лимфоциты могут вызывать элиминацию Т-лимфоцитов через связывание CD95. Одновременно Т-регуляторные лимфоциты секретируют цитокины, индуцирующие толерантность ДК, при этом ДК не экспрессируют костимулирующих молекул и не в состоянии стимулировать наивные Т-лимфоциты. Более того, супрессоры могут индуцировать секрецию ингибирующих цитокинов самими активированнми ДК [1, 63-66]. Таким образом, резкое изменение количества супрессоров CD4+CD25+Fox3+ может свидетельствовать об существенных изменениях в отношениях опухоли и иммунной системы в смысле ее противораковой активности. Ниже приводится анализ количества Т-регуляторных лимфоцитов с фенотипом CD4+CD25+Fox3+ в периферической крови пациентов, находящихся в исследовании препарата Панаген (рисунок 6, таблицы 9 и 10). Таблица 9 – Процентное содержание CD4+CD25+Fox3+ Т-регуляторных лимфоцитов в периферической крови пациентов, находящихся в исследовании. 0 – исходный 21 день 21 день уровень после 1 ХТ после 3 ХТ Панаген Антонова 10 9 11 Бондаренко 13 9 9 Бондарь 6 7 5 Войнова 5 9 8 Глущенко 12 0,54 14 Говорухина 11 2 10 Голохвастова 11 0,12 9 Ефремова 7 12 18 Иванилова 4 7 12 Ковалева 4 8 8 Моисеева 6 1 8 38 Мунд Мурина Пензина Джен Качанова Курбанова 10 11 10 Плацебо 16 7 14 12 14 11 6,2 13 8 14 10 12 10 14 5 Рисунок 6 – Условное содержание (%) CD4+CD25+Fox3+ Т-регуляторных лимфоцитов в периферической крови пациентов, находящихся в исследовании, на 21 день после 1 и 3 ХТ относительно исходного уровня. ** – отличия от группы «Плацебо» и группы пациентов, у которых количество Т-регуляторных лимфоцитов не изменилось, достоверны с вероятностью >0,95. Таблица 10 – Условное содержание (%) CD4+CD25+Fox3+ Т-регуляторных лимфоцитов в периферической крови пациентов, находящихся в исследовании, на 21 день после 1 и 3 ХТ относительно исходного уровня. Панаген Панаген – изменения Плацебо После После После После После После 1 ХТ 3 ХТ 1 ХТ 3 ХТ 1 ХТ 3 ХТ Антонова 90,0 110,0 Глущенко 4,5 116,7 Джен 87,5 62,5 Бондаренко 69,2 69,2 Говорухина 18,2 90,9 Качанова 142,9 200,0 Бондарь 116,7 83,3 Голохвастова 1,1 81,8 Курбанова 85,7 35,7 Войнова 180,0 160,0 Моисеева 16,7 133,3 Ефремова 171,4 257,1 Иванилова 175,0 300,0 Ковалева 200,0 200,0 Мурина 127,3 118,2 Мунд 120,0 62,0 Пензина 110,0 80,0 среднее 136,0 144,0 среднее 10,1 105,7 среднее 105,4 99,4 станд.откл. 43,2 83,3 станд.откл. 8,6 23,6 станд.откл. 32,5 88,1 дов.инт. дов.инт. дов.инт. 26,7 51,6 8,4 23,1 36,8 99,7 р=0,95 р=0,95 р=0,95 39 Как следует из проведенной оценки, наблюдается следующая картина распределения количества Т-регуляторных лимфоцитов у пациентов, находящихся в исследовании. Пациенты разделились на две группы. У большей группы количество Т-регуляторных лимфоцитов в первой и второй контрольных точках сохраняется на исходном уровне, аналогично с группой «Плацебо». Этот является хорошим прогнозом. У 4 пациентов, что составляет 30% от выборки, количество Т-регуляторных лимфоцитов в первой контрольной точке 21 сутки после 1 ХТ упало в 5-100 раз. Ко времени анализа во второй контрольной точке 21 сутки после 3 ХТ количество супрессоров восстановилось до исходного начального уровня. Ни в одной группе не произошло значимого увеличения Трегуляторных лимфоцитов. Можно полагать, что это в первую очередь обусловлено использованием в схеме лечения ЦФ, который, как многократно показано, избирательно ингибирует развитие Т-регуляторных лимфоцитов и разрушает супрессорную функцию этих клеток [44, 46, 49, 67-69]. Тем не менее, результат действия препарата Панаген предполагает, что у части пациентов можно многократно уменьшить количество супрессоров и тем самым сделать опухоль доступной для атаки активированным цитотоксическими Т-клетками. 2.3 Определение цитокинов в периферической крови здоровых доноров и пациентов, участвующих во второй фазе клинических испытаний препарата Панаген по поводу рака молочной железы II-IV стадий Одновременно в ходе выполнения протокола было проведено исследование направленное на определение стимулирующего действия препарата «Панаген» на синтез и секрецию цитокинов мононуклеарной фракцией клеток периферической крови здоровых доноров и пациентов, находящихся в исследовании. Результаты проведенной работы, выполненные на здоровых донорах, свидетельствуют о том, что препарат Панаген является сильным неспецифическим активатором продукции цитокинов ИЛ-6, ФНО-α, ИЛ-8, ИЛ-1β, ИЛ-10 и ИЛ-1РА у здоровых доноров. Анализ полученных данных в ходе проведения клинических испытаний может свидетельствовать об особенностях воздействия препарата Панаген на цитокиновую активацию мононуклеарной фракции клеток периферической крови больных, находящихся в исследовании. Цитокины – это низкомолекулярные белковые регуляторные вещества, которые образуют универсальную сеть медиаторов, характерную как для иммунной системы, так и для клеток других органов и тканей. Под контролем цитокинов протекают все клеточные события: пролиферация, дифференцировка, апоптоз, специализированная функциональная активность клеток. Они регулируют гемопоэз, межклеточные и межсистемные 40 взаимодействия, обеспечивают согласованность эндокринной и нервной систем в норме и в ответ на патологические воздействия. Эффекты каждого цитокина на клетки характеризуются плейотропностью, спектр эффектов разных медиаторов перекрывается и, в основном, конечное функциональное состояние клетки зависит от влияния нескольких цитокинов, действующих синергично. Таким образом, система цитокинов представляет собой универсальную, полиморфную регуляторную сеть медиаторов, предназначенных для контроля процессов, протекающих в клетке, а так же функциональной активности клеточных элементов в кроветворной, иммунной и других гомеостатических системах организма [70]. Контроль и регуляция гемопоэза осуществляется множеством цитокинов, которые способны активировать гемопоэтические клетки (индуцировать их переход из G0 в G1 фазу клеточного цикла), регулировать направленность их дифференцировки в различные ростки кроветворения, стимулировать их пролиферацию и созревание, а также подавлять чрезмерное производство отдельных клеточных типов. Цитокины оказывают регуляторное влияние, как на стволовые гемопоэтические клетки, так и на их зрелых потомков, определяя их функциональную активность. Для лечения злокачественных опухолей широко применяется ХТ. Возможность достижения эффекта ХТ в значительной степени зависит от ее интенсивности. Повышение интенсивности ограничено токсичностью, то есть повреждающим действием цитостатиков на здоровые клетки и ткани. Токсичность многообразна, но одним из наиболее распространенных и опасных ее видов является миелотоксичность или повреждение клеток миелотоксичностью костного мозга. Перспективным подходом для при ХТ является применение препаратов, борьбы с ускоряющих пролиферацию и дифференцировку предшественников гемопоэза, что позволяет сократить период цитопении и снизить риск развития инфекционных осложнений различной локализации и степени тяжести. В настоящее время известно около 30 цитокинов, влияющих на клетки-предшественники гемопоэза различной степени зрелости, принадлежащие к различным росткам кроветворения. Наиболее широкое применение для преодоления миелосупрессии получили такие гемоцитокины как: гранулоцитарный колониестимулирующий фактор и гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (Г-КСФ и ГМ-КСФ). Применение этих факторов за счет их мобилизующего на ККМ действия позволяет быстро увеличить в периферической крови количество форменных элементов, в основной нейтрофилов, и тем самым купировать негативные последствия цитостатической терапии. Однако эти препараты очень дороги и обладают рядом недостатков в связи с их плохой переносимостью 41 примерно у трети пациентов и, кроме этого, действуют избирательно, индуцируя пролиферацию и выброс в кровь в основном клеток нейтрофильного ряда. Происходящая при этом мобилизация CD34+ плюрипотентных клеток костного мозга не является фактором лейкостимуляции, поскольку эти клетки в мобилизованном состоянии не способны пролиферировать. Для пролиферации и нормально функционирования они должны осесть в стромальных нишах. Поэтому разработка препаратов, обладающих непосредственной высокой гемостимулирующей активностью, либо активирующих клетки к продукции гемоцитокинов, является одной из актуальных задач современной медицины. Целью данного исследования было оценить влияние препарата «Панаген» на продукцию цитокинов мононуклеарными клетками цельной крови ex vivo в сравнении с аналогичными уже существующими иммуностимулирующими препаратами (Ридостин, Дезоксил и др.). На первом этапе работы была оценена динамика продукции 14 цитокинов мононуклеарными клетками крови в зависимости от времени инкубации и активации клеток различными препаратами. Проводилось определение спонтанной продукции цитокинов ex vivo, что позволяет оценить активацию клеток крови в организме обследуемого донора, и индуцированной митогеном, или одним из препаратов, продукции – что демонстрирует потенциальную возможность к секреции цитокинов. В данных экспериментах использовали образец крови одного условно здорового добровольца в возрасте ХХ лет. Свежеотобранную периферическую венозную кровь в количестве 20 мл в стерильных условиях смешивали с 80 мл культуральной среды DMEM, содержащей гепарин (2,5 ед/мл), гентамицин (100 мкг/мл) и L-глютамин (0,6 мг/мл). Для проведения экспериментов по спонтанной продукции цитокинов 2 мл полученной разбавленной крови в стерильных условиях переносили во флаконы, которые инкубировали при 37°С в течение разных промежутков времени (1, 3, 6, 24, 72, 168 часов соответственно). После этого клетки крови осаждали на микроцентрифуге при 10000 g в течение 3 мин, супернатант переносили в новую пробирку, замораживали и хранили при 70° С до проведения количественного анализа цитокинов. Одновременно с экспериментами по спонтанной продукции проводили опыты по стимуляции продукции цитокинов различными препаратами. Для этого 2 мл разбавленной крови в стерильных условиях переносили во флакон и добавляли по 10 мкл раствора 2 мл/мл одного из препаратов: Дезоксил – 1% раствор для инъекций (натриевая соль дезоксирибонуклеиновой кислоты выделенная из молок лососевых рыб), Ридостин – смесь натриевых солей двуспиральной рибонуклеиновой кислоты и одноцепочечной РНК, 42 8 мг/амп, производство ЗАО "Вектор-Медика", Реаферон-ЕС - 3млн МЕ/амп, интерферональфа 2 рекомбинантный, лиофилизат для приготовления раствора для инъекций, производство ЗАО "Вектор-Медика", Кольцово, Новосибирск, Панаген субстанция 5 мг/мл, производство ООО «Панаген» и polyinosinic-polycytidylic acid Potassium salt – синтетический аналог двуспиральной РНК, Sigma. Инкубацию и подготовку проб проводили так же как и при анализе спонтанной продукции. Опыты по стимуляции продкуции цитокинов комплексом митогенов (смесь ФГА, Con A, LPS по 4, 4 и 2 мкг/мл соответственно) проводили согласно инструкции из набора «ЦИТОКИН-СТИМУЛБЕСТ». Концентрацию ИФН-γ, ИФН-α, ФНО-α, ИЛ-1β, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-10, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ17, ИЛ-18, VEGF, MCP и рецепторного антагониста ИЛ-1 (ИЛ-1РА) в исследуемых образцах измеряли с помощью “sandwich”-варианта твердофазного иммуноферментного анализа с соответствующими наборами реагентов производства ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирск). Исследование стимуляции различными препаратами целого ряда цитокинов клетками цельной крови одного добровольца показало, что субстанция препарата Панаген стимулирует продукцию ИЛ-8, ИЛ-18, MCP, ИЛ-6, ИЛ-10, ИЛ-1β, ИЛ1-РА, ФНО-α, VEGF и ИФН-γ (рисунки 7-17). Причем стимуляция этих цитокинов, за исключением VEGF, детектировалась уже через 6 часов инкубации. При сравнении уровней стимуляции продукции цитокинов субстанцией препарата Панаген и набором митогенов было установлено, что Панаген более эффективно стимулирует продукцию ИЛ-18 (от 1,6 до 6,3 раз в зависимости от времени инкубации) и ИЛ-1бета (от 1,8 до 4,2 раз). Стимуляция продукции МСР и ИЛ1-РА была примерно одинаковой как в случае митогена, так и в случае Панагена, а синтез ИЛ-8, ИФН-γ, ИЛ-6, ИЛ-10 и ФНО-α более эффективно стимулирует комплекс митогенов. Набор цитокинов, продукцию которых стимулирует препарат Poly I:Poly C, полностью совпадает с таковым для препарата Панаген (рисунки 7-17). Различия заключаются только в уровне стимуляции некоторых цитокинов. Так, Панаген (в точке 24 ч) более эффективно стимулирует продукцию ИЛ-18, ИЛ-1β и ФНО-α, а препарат Poly I:Poly C – ИФН-γ и МСР. Препарат Poly I:Poly C представляет собой калиевую соль синтетического аналога двуспиральной РНК, а субстанция препарата Панаген – это смесь двуцепочечных фрагментов геномной ДНК человека размером 200-6000 п.о. со следовым содержанием белков ядерного матрикса, которая выделена из плацент здоровых рожениц. То есть в состав обоих препаратов входят довольно длинные полимерные отрицательно заряженные молекулы. Поэтому можно предположить, что механизм их действия на активацию 43 синтеза определенного набора цитокинов может быть сходным и ключевыми в этом случае являются структура и заряд молекулы. Аналогом препарата Панаген является препарат Дезоксил, который представляет собой натриевую соль дезоксирибонуклеиновой кислоты, получаемую в результате ферментативного гидролиза ДНК молок лососевых рыб. Однако при добавлении данного препарата к клеткам цельной крови не было обнаружено какого-либо стимулирующего эффекта этого препарата на продукцию цитокинов. Дезоксил не является лекарственным препаратом и не имеет подробного описания его характеристик и свойств. Поэтому несмотря на предполагаемую схожесть Панагена, Poly I:Poly C и Дезоксила отсутствие эффекта последнего может быть связано со способом его производства и обработки ДНК, сильной деградацией ДНК, а так же ее гетерологичностью. Препарат Ридостин (Натрия рибонуклеат) относится к иммуномодулирующим средствам и его активным веществом является смесь натриевых солей двуспиральной рибонуклеиновой кислоты и одноцепочечной РНК. Данный препарат относится к индукторам интерферона и является стимулятором фагоцитоза. При анализе стимуляции продукции цитокинов при помощи Ридостина было установлено, что этот препарат приводит к незначительной стимуляции продукции МСР, ИЛ-6, ИЛ-1Ра и ИЛ-8. Стимуляция наблюдалась в 10 и более раз менее эффективная по сравнению с Панагеном, Poly I:Poly C и комплексом митогенов. Использование Реаферона – рекомбинантного ИФН-α 2а приводило лишь к очень слабой стимуляции продукции ИЛ-6 и ИЛ-1РА. При оценке динамики продукции цитокинов в зависимости от времени инкубации было установлено, что значительный уровень стимуляции продукции цитокинов достигается уже через 6 часов инкубации. Однако пик продукции цитокинов и выход на плато происходит в промежутке 6-24 часа. Инкубация более 24 часов приводила к неоднозначным результатам. Так продукция ИЛ-8, VEGF и МСР увеличивалась, уровень ИЛ-18, ИФН-γ и ФНО-α снижался, а уровень ИЛ-6, ИЛ-10, ИЛ-1β и ИЛ-1РА сохранялся приблизительно на одном и том же уровне. Изменения в продукции некоторых цитокинов при длительной инкубации могут быть связаны с паракринным эффектом. Поэтому наиболее адекватной точкой для оценки спонтанной и активированной продукции цитокинов является 24 ч. Таким образом, в результате проведенного сравнительного анализа можно сделать вывод, что субстанция Панаген способна оказывать значительный стимулирующий эффект на продукцию целого ряда цитокинов (ИЛ-8, ИЛ-18, MCP, ИЛ-6, ИЛ-10, ИЛ-1β, ИЛ1-РА, ФНО-α, и ИФН-γ) мононуклеарами цельной крови. Дальнейшую оценку, как 44 спонтанной, так и стимулированной продукции цитокинов необходимо проводить после инкубации клеток в течение 24 часов. На втором этапе работы проводилась оценка достоверности данных по стимуляции субстанцией препарата Панаген продукции цитокинов мононуклеарными клетками в сравнении с Дезоксилом, Ридостином и комплексом митогенов. Для этого использовали образцы крови семи условно здоровых добровольцев. Свежеотобранную периферическую венозную кровь в количестве 2 мл в стерильных условиях вносили во флакон, содержащий 8 мл культуральной среды DMEM, гепарин (2,5 ед/мл), гентамицин (100 мкг/мл) и L-глютамин (0,6 мг/мл). Для проведения экспериментов по спонтанной продукции цитокинов 2 мл полученной разбавленной крови в стерильных условиях переносили во флакон, который инкубировали при 37°С в течение 24 часов. После этого клетки крови осаждали на микроцентрифуге при 10000 g в течение 3 мин, супернатант переносили в новую пробирку, замораживали и хранили при -70°С до проведения количественного анализа цитокинов. Параллельно проводили эксперименты по стимуляции продукции цитокинов разными препаратами. Для этого во флаконы, содержащие по 1 мл разбавленной крови, добавляли раствор одного из препаратов: субстанция Панагена, раствор Дезоксила, и раствор Ридостина до конечной концентрации 10 мкг/мл, а также комплекс митогенов из набора «цитокин-стимул-бест». Все флаконы, содержащие разбавленную кровь с препаратами, инкубировали, центрифугировали, а затем получали и хранили образцы для последующего количественного анализа, как описано выше. Концентрацию ИФН-γ, ФНО-α, ИЛ-1β, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-10, ИЛ-2, ИЛ-18, VEGF, MCP и рецепторного антагониста ИЛ-1 (ИЛ-1РА) в исследуемых образцах измеряли с помощью “sandwich”-варианта твердофазного иммуноферментного анализа с соответствующими наборами реагентов производства ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирск). Графики, отражающие стимуляцию продукции цитокинов, представлены на рисунках 18-27. Так как полученные экспериментальные данные не удовлетворяют закону нормального распределения, то для сравнения стимулирующего эффекта препаратов на клетки цельной крови были использованы медианы концентраций секретируемых цитокинов с квартильным размахом 25-75 процентиль. Митоген использовался в качестве стандартного индуктора продукции цитокинов для того чтобы оценить потенциальную способность клеток к секреции цитокинов. В результате анализа стимуляции продукции цитокинов мононуклеарными клетками крови разными препаратами было обнаружено, что Панаген значительно активирует продукцию ИЛ-6, ФНО-α, ИЛ-8, ИЛ-1β, ИЛ-10 и ИЛ-1РА, что согласуется с результатами 45 полученными на образце крови одного добровольца, которые описаны выше. Продукцию ИФН-γ Панаген стимулировал в образцах крови всех добровольцев, но на очень низком уровне, а стимуляция секреции ИЛ-18 и МСР была детектирована только в 3 образцах, что скорее всего связано с индивидуальными особенностями. На продукцию VEGF и ИЛ-2 Панаген не оказывал какого-либо существенного влияния. Препарат Ридостин приводил к очень слабой стимуляции продукции ИЛ-8, ИЛ-1РА и МСР, а Дезоксил вызывал стимуляцию на крайне низком уровне ИЛ-18, ИЛ-1РА и МСР и только в некоторых образцах. Таким образом, из проанализированных препаратов (за исключением комплекса митогенов) значимый эффект на продукцию цитокинов оказывала только активная субстанция препарата Панаген, причем в случае ФНО-α, ИЛ-1β, ИЛ-1РА, ИЛ-10, ИЛ-8 и ИЛ-6 её стимулирующий эффект был близким или сравнимым с действием митогена. Это указывает на то, что препарат Панаген обладает выраженными иммуномодулирующими свойствами. ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-1β и ФНО-α относятся к группе провоспалительных цитокинов. ИЛ-6 является плейотропным цитокином с широким диапазоном биологической активности. В иммунной системе его источником являются мононуклеарные фагоциты, Т- и В-клетки, он регулирует иммунный ответ, острофазный ответ, воспаление, онкогенез и гемопоэз. Одной из основных функций ИЛ-6 является регуляция процессов созревания антителопродуцирующих клеток из В-лимфоцитов и самой продукции иммуноглобулинов. ИЛ-6 участвует в активации Т-лимфоцитов, индуцирует синтез многих острофазных белков: фибриногена, альфа1-антихемотрипсина, гаптоглобина, сывороточного амилоида А, С-реактивного белка и др. ИЛ-8 относится к хемокинам и его основными продуцентами являются мононуклеарные фагоциты, полиморфноядерные лейкоциты и другие клетки. Выработка ИЛ-8 повышается в ответ на липополисахарид стенки бактерий (ЛПС), ИЛ-1β, ФНО-α и др. Поэтому определить каким образом Панаген стимулирует продукцию ИЛ-8, напрямую или опосредованно, за счет активации других цитокинов на данный момент определить нельзя. Основная функция ИЛ-8 заключается в привлечении в очаг воспаления нейтрофильных гранулоцитов, макрофагов, эозинофилов и лимфоцитов. Свойства ИЛ-8 вызывать миграцию клеток и способствовать их адгезии определяют его как активного участника острой воспалительной реакции в местах проникновения патогена. Одним из ключевых провоспалительных цитокинов является ИЛ-1β, источником которого в иммунной системе являются макрофаги, гранулярные лимфоциты, В-клетки и другие. Основное действие ИЛ-1β заключается в активации лимфоцитов, стимуляции 46 макрофагов, а так же увеличении адгезии лейкоцитов к эндотелию и синтеза белков острой фазы. Благодаря способности усиливать продукцию ряда колониестимулирующих факторов, ИЛ-1 стимулирует процессы гемопоэза, начиная с уровня стволовых кроветворных клеток. Показано, что введение ИЛ-1 защищает около 90% мышей от летальной дозы облучения. Это позволило рекомендовать его для использования при остром аварийном облучении человека. Имеются данные об использовании ИЛ-1 при трансплантации костного мозга для стимуляции ранних стадий гемопоэза. Еще одним важным провоспалительным цитокином, продукцию которого стимулирует Панаген, является ФНО-α. Этот цитокин обладает противоопухолевой и противовирусной активностью, усиливает выброс нейтрофилов из костного мозга в кровь, активирует гранулоциты макрофаги и другие клетки. ФНО-α влияет на процессы кроветворения, подавляя эритро-, миело- и лимфопоэз, однако, на фоне подавленного кроветворения проявляется стимулирующее действие ФНО-α. Еще одним важным свойством ФНО-α является индукция апоптоза и клеточной смерти. Кроме возможности непосредственно вызывать цитолиз, ФНО также усиливает экспрессию на клеточной поверхности антигенов гистосовместимости ΙΙ класса и опухолеассоциированных антигенов, способствуя тем самым развитию более интенсивного иммунного ответа на опухоль. Из стимулируемых Панагеном цитокинов к противовоспалительным относятся ИЛ10 и ИЛ-1РА (рецепторный антагонист ИЛ-1). Наиболее важным из них является ИЛ-10, который обладает многими противововоспалительными свойствами, включая способность подавлять лихорадку. ИЛ-10 продуцируется Т-клетками (Th2) и может рассматриваться как антагонист ряда других цитокинов (подавление синтеза цитокинов Th1 клетками). Он подавляет продукцию всех провоспалительных цитокинов, интерферона, пролиферативный ответ Т-клеток на антигены и митогены, а также подавляет секрецию активированными моноцитами ИЛ-1β, ФНО-α и ИЛ-6. Но одновременно ИЛ-10 может стимулировать синтез IgE. В результате он способствует развитию гуморальной составляющей иммунного ответа, обусловливая антипаразитарную защиту и аллергическую реактивность организма. ИЛ-1РА также относится к противовоспалительным цитокинам. Он подавляет биологическую активность интелейкинов ИЛ-1α и ИЛ-1β, конкурируя с ними за связывание с рецептором. Таким образом, на основе экспериментальных данных можно сделать вывод, что активная субстанция препарата Панаген относится к неспецифическим иммуномодуляторам, активирующим различные типы мононуклеарных клеток крови (Т- и В-клетки, макрофаги, нейтрофилы, моноциты и др.) к продукции как про-, так и 47 противовоспалительных цитокинов (ИЛ-6, ФНО-α, ИЛ-8, ИЛ-1β, ИЛ-10 и ИЛ-1РА) [7174]. 48 Рисунок 7 – Уровень продукции ИЛ-6 (пг/мл) мононуклеарными клетками, соответствующий разнице стимулированной препаратами и спонтанной продукции. Рисунок 8 – Уровень продукции ФНО-α (пг/мл) мононуклеарными клетками, соответствующий разнице стимулированной препаратами и спонтанной продукции. 49 Рисунок 9 – Уровень продукции ИЛ-8 (пг/мл) мононуклеарными клетками, соответствующий разнице стимулированной препаратами и спонтанной продукции. Рисунок 10 – Уровень продукции ИЛ-1β (пг/мл) мононуклеарными клетками, соответствующий разнице стимулированной препаратами и спонтанной продукции. 50 Рисунок 11 – Уровень продукции ИЛ-10 (пг/мл) мононуклеарными клетками, соответствующий разнице стимулированной препаратами и спонтанной продукции. Рисунок 12 – Уровень продукции ИЛ-1РА (пг/мл) мононуклеарными клетками, соответствующий разнице стимулированной препаратами и спонтанной продукции. 51 Рисунок 13 – Уровень продукции VEGF (пг/мл) мононуклеарными клетками, соответствующий разнице стимулированной препаратами и спонтанной продукции. Рисунок 14 – Уровень продукции ИЛ-2 (пг/мл) мононуклеарными клетками, соответствующий разнице стимулированной препаратами и спонтанной продукции. 52 Рисунок 15 – Уровень продукции ИЛ-18 (пг/мл) мононуклеарными клетками, соответствующий разнице стимулированной препаратами и спонтанной продукции. Рисунок 16 – Уровень продукции ИФН-γ (пг/мл) мононуклеарными клетками, соответствующий разнице стимулированной препаратами и спонтанной продукции. 53 Рисунок 17 – Уровень продукции МСР (пг/мл) мононуклеарными клетками, соответствующий разнице стимулированной препаратами и спонтанной продукции. 54 Рисунок 18 – Динамика продукции ИЛ-8 мононуклеарными клетками крови при стимуляции различными препаратами (Продукция цитокина пг/мл по оси Y соответствует разнице стимулированной препаратом и спонтанной продукции). 55 Рисунок 19 – Динамика продукции ИЛ-18 мононуклеарными клетками крови при стимуляции различными препаратами (Продукция цитокина пг/мл по оси Y соответствует разнице стимулированной препаратом и спонтанной продукции). 56 Рисунок 20 – Динамика продукции VEGF мононуклеарными клетками крови при стимуляции различными препаратами (Продукция цитокина пг/мл по оси Y соответствует разнице стимулированной препаратом и спонтанной продукции). 57 Рисунок 21 – Динамика продукции ИФН-γ мононуклеарными клетками крови при стимуляции различными препаратами (Продукция цитокина пг/мл по оси Y соответствует разнице стимулированной препаратом и спонтанной продукции). 58 Рисунок 22 – Динамика продукции МСР мононуклеарными клетками крови при стимуляции различными препаратами (Продукция цитокина пг/мл по оси Y соответствует разнице стимулированной препаратом и спонтанной продукции). 59 Рисунок 23 – Динамика продукции ИЛ-6 мононуклеарными клетками крови при стимуляции различными препаратами (Продукция цитокина пг/мл по оси Y соответствует разнице стимулированной препаратом и спонтанной продукции). 60 Рисунок 24 – Динамика продукции ИЛ-10 мононуклеарными клетками крови при стимуляции различными препаратами (Продукция цитокина пг/мл по оси Y соответствует разнице стимулированной препаратом и спонтанной продукции). 61 Рисунок 25 – Динамика продукции ИЛ-1бета мононуклеарными клетками крови при стимуляции различными препаратами (Продукция цитокина пг/мл по оси Y соответствует разнице стимулированной препаратом и спонтанной продукции). 62 Рисунок 26 – Динамика продукции ИЛ-1РА мононуклеарными клетками крови при стимуляции различными препаратами (Продукция цитокина пг/мл по оси Y соответствует разнице стимулированной препаратом и спонтанной продукции). 63 Рисунок 27 – Динамика продукции ФНО-α мононуклеарными клетками крови при стимуляции различными препаратами (Продукция цитокина пг/мл по оси Y соответствует разнице стимулированной препаратом и спонтанной продукции). 64 3 Адаптация найденных параметров совместного введения цитостатиков и препарата «Панаген» к использованию на человеке в ходе фазы II, III клинических испытаний препарата в качестве дополнительных мероприятий к основному заявленному, направленному на характеристику лейкостимулирующего действия. Опухоль обладает рядом свойств, позволяющих ей ускользать от иммунных защитных механизмов. Это, во-первых, генетическая пластичность, связанная с постоянно активированной репарационно-рекомбинационной системой опухолевой клетки и возможностью в кратчайший срок перестроить генетическую моду в соответствии с дискриминирующим давлением извне [75]. Во-вторых, опухолевая ткань использует ингибирующие иммунную систему свойства Т-регуляторных лимфоцитов. Различные субпопуляции Т-регуляторных лимфоцитов через прямые межклеточные контакты, а также через продукцию иммуносупрессорных цитокинов (ИЛ-10, TGF-β) формируют специфическое микроокружение опухоли, экранируя ее от повреждающего действия эффекторных клеток иммунной системы. Т-регуляторные лимфоциты оказывают свое супрессорное влияние и на антигенпрезентирующие клетки, которые в результате этого не могут эффективно участвовать в запуске антигенспецифического противоопухолевого иммунного ответа. В-третьих, опухоль, как правило, слабоиммуногенна, что еще в большей степени затрудняет обнаружение переродившейся ткани иммунной системой организма и уничтожение неотрансформированных клеток. Таким образом, если исключить или изменить эти три свойства опухолевой ткани, то создаются предпосылки для обнаружения опухоли иммунной системой и элиминации неотрансформированной ткани по любому из известных механизмов действия иммунной системы [1, 75-77]. В настоящее время большое внимание уделяется стратегии воздействия на опухолевую ткань, включающую действие цитостатического препарата (наиболее используемый препарат ЦФ) и следующую за ним иммунотерапию [41, 49, 69, 78]. Такая стратегия в полной мере соответствует изложенной выше концепции воздействия на опухолевую ткань. Как показали исследования последних лет, ЦФ уменьшает количество и снижает функциональную активность Т-регуляторных лимфоцитов [44, 46, 49, 67-69], что позволяет более эффективно использовать различные иммунотерапевтические подходы, направленные на стимуляцию/усиление противоопухолевых иммунных реакций. С этой целью можно использовать традиционные пептидные вакцины. Однако, в последнее время огромное внимание уделяется ДНК-активаторам иммунной системы – CpG олигонуклеотидам, которые через TLR9 могут активировать антиген- презентирующие клетки (ДК) и, как следствие, индуцировать развитие адаптивного иммунного ответа [14, 18, 22, 34, 79]. 65 В последних работах, характеризующих действие цитостатиков антрациклинового ряда, установлено, что обработка опухолевых клеток, например, доксорубицином приводит к появлению на поверхности цитоплазматической мембраны белка калретикулина. Этот белок является сигналом «eat me» для фагоцитирующих клеток, в том числе, для ДК. Такое свойство доксорубицина существенно повышает иммуногенность опухоли [50]. Таким образом, использование цитостатиков (ЦФ и доксорубицина) в комбинации с иммунотерапевтическими подходами (ДНК-активаторами) позволяет в настоящее время сформировать наиболее эффективную противоопухолевую стратегию. ЦФ оказывает прямое повреждающее действие на опухолевые клетки и одновременно выключает активность Т-регуляторных лимфоцитов. Доксорубицин также разрушает опухоль и одновременно делает опухолевый дебрис иммуногенным. ДНК-активированная иммунная система в промежуток времени, когда регуляторные Т-лимфоциты не активны и опухоль лишена защиты, убивает остаточные неотрансформированные клетки. В проведенных научных экспериментах мы основывались на описанном ранее свойстве двуцепочечной ДНК индуцировать конечное созревание ДК ex vivo, что приводит к усилению их стимуляторной активности в аллогенной смешанной культуре лимфоцитов [51, 52, 80]. Было предположено, что аналогичные свойства двуцепочечной ДНК также может проявлять in vivo на уровне целостного организма. Кроме того, было предположено, что противоопухолевая активность двуцепочечной ДНК, обнаруженная и описанная в работах [53, 81, 82], связана именно с эндогенной активацией ДК и развитием адаптивного иммунного ответа. О том, что в выявленном феномене участвуют именно ДК, но не, например, натуральные киллерные клетки, свидетельствуют следующие эксперименты. Было показано, что дополнительная иммунизация экспериментальных мышей после инъекций ЦФ и препарата ДНК приводит существенному усилению негативного эффекта на рост опухоли [53]. Как известно, натуральные киллеры проявляют неспецифическую цитотоксическую активность по отношению к клеткам, содержащим пониженное количество белков класса MHCI или экспрессирующим на поверхности стресс-индуцированные молекулы MICA и MICB, относящиеся к семейству неканонических молекул гистосовместимости Ic класса, что характерно для опухолевых клеток [83, 84]. До настоящего времени не показано, чтобы натуральные киллеры проявляли и усиливали антигенспецифическую цитотоксичность, связанную с иммунизацией гомогенатом опухоли. В проведенных научных экспериментах была оценена зрелость ДК, выделенных из селезенки и костного мозга, и определена временная динамика их количественного 66 накопления после различных воздействий. Учитывая полученные результаты, была разработана схема совместного применения доксорубицина и ЦФ, формирующих иммуногенный клеточный дебрис, и препарата ДНК. При применении такой схемы наблюдается максимальная степень торможения роста опухоли. При этом проведенный МТТ-тест и анализа поверхностных маркеров мононулеаров из крови экспериментальных мышей свидетельствует о том, что эффект торможения роста опухоли связан как с прямым повреждающим действием цитостатиков, так и с формированием пула цитотоксических клеток. При таком комбинированном воздействии рост опухоли практически прекращается. В работе были использованы высокие дозы ЦФ. В проведенных экспериментах, исследуя синергичное противораковое действие цитостатика и двуцепочечной ДНК, не было обнаружено усиления терапевтического эффекта, связанного с применением низких доз ЦФ. Возможно, это объясняется дифференцированным воздействием ЦФ на популяции ДК, локализованных во вторичных лимфоидных тканях. Известно несколько популяций ДК, среди которых выделяют мигрирующие из тканей ДК, резидентные и плазмацитоидные ДК. ЦФ оказывает селективный цитотоксический эффект на CD8+ резидентные ДК, но не влияет на антигенпрезентирующую и цитокин-секреторную функцию ДК, мигрирующих из кожи, и плазмацитоидные ДК лимфатических узлов и селезенки. Таким образом, лечение ЦФ индуцирует дисбаланс среди субпопуляций ДК за счет селективной делеции лимфоидных резидентных CD8+ ДК, что приводит к ослаблению функциональной активности T-регуляторных лимфоцитов и усилению эффекторных Т-клеточных функций in vivo [85]. Кроме этого показано, что ЦФ как монопрепарат индуцирует увеличение количества незрелых ДК в крови и одновременно усиливает антигенспецифический ответ CD8+ Т-лимфоцитов. Основной источник увеличения количества ДК – это активация их костномозговых предшественников [86]. Можно полагать, что совместное применение ЦФ и ДНК оказывают более сильное индукторное воздействие на сформированный пул ДК, что создает необходимые условия для потенцирования эффекторных реакций цитотоксических Т-лимфоцитов против опухолевых клеток, выявленное нами в МТТ-тесте. Таким образом, в серии выполненных экспериментов показано, что введение экзогенной ДНК на фоне предобработки доксорубицином и ЦФ оказывает противоопухолевый эффект, который, по-видимому, обусловлен активацией ДК. Этот эффект, вероятно, также объясняется подавлением активности T-регуляторных лимфоцитов в микроокружении опухоли [44, 46, 49, 67-69], и ДК-опосредованной активацией цитотоксических Т-лимфоцитов [85, 86]. При этом наиболее важными 67 факторами являются зрелый фенотип ДК, то есть их способность к антигенной презентации, а также само присутствие опухолевого(ых) антигенов, которое достигается обработкой доксорубицином и ЦФ. Мы использовали полученные результаты в разработке стратегии применения препарата на основе ДНК человека Панаген в лечении рака молочной железы. Была выбрана схема AC или FAC, где обязательными цитостатиками являются ЦФ и доксорубицин. Проведенные исследования показали что: 1. Всегда существуют две группы пациентов, одни из которых отвечают на действие препарата Панаген, а другие – нет. Соотношение числа пациентов «отвечающих» и «не отвечающих» в суммарной оценке всех анализируемых параметров составило в среднем 50 на 50%. 2. Анализ изменения популяции миелоидных ДК (CD11+CD123–) в периферической крови не выявил закономерностей, которые позволили бы оценить возможность активации адаптивного иммунитета через эту популяцию антигенпрезентирующих клеток. 3. Полученные данные предполагают, что в ходе терапии происходит увеличение популяции циркулирующих плазмацитоидных ДК. При этом всплеск появления ДК связан с состоянием индивидуального больного. С индивидуальными особенностями связаны эффект различия в количестве плазмацитоидных ДК к 1 ХТ у одних пациентов и к 3 ХТ у других. 63% больных, получавших Панаген, демонстрируют ответ на действие препарата по совокупности показателей контрольных точек 21 сутки после 1 и 3 ХТ. У 30% больных, принимавших Панаген, наблюдается достоверное увеличение количества плазмацитоидных клеток к 3 ХТ. 4. При анализе содержания супрессоров у большей группы количество Tрегуляторных лимфоцитов в первой и второй контрольных точках сохраняется на исходном уровне аналогично с группой «Плацебо». У 4 пациентов, что составляет 30% от выборки, количество T-регуляторных лимфоцитов в первой контрольной точке 21 сутки после 1 ХТ падает в 5-100 раз. Ко времени анализа во второй контрольной точке 21 сутки после 3 ХТ количество супрессоров восстанавливается до исходного начального уровня. Ни в одной группе не произошло увеличения количества T-регуляторных лимфоцитов, что является хорошим прогнозом. 5. У 10 из 12 (83%) пациентов, принимавших Панаген, количество Тцитотоксических лимфоцитов CD8+ перфорин+ в первой контрольной точке 21 68 день после 1 ХТ достоверно больше, чем в группе «Плацебо» (р>0.95). Если рассматривать анализируемый признак по совокупности обеих контрольных точек, то у всех пациентов, принимавших Панаген, в периферической крови содержание Т-цитотоксических лимфоцитов значительно превышает исходную норму. 6. Набор индуцируемых у здоровых доноров цитокинов ИЛ-6, ФНО-α, ИЛ-8, ИЛ1β, ИЛ-10 и ИЛ-1РА важен для оценки препарата как эффективного иммуномодулятора. Делать заключение о воздействии препарата на различные эффекторные звенья иммунной системы на основании полученных результатов можно с достаточной долей обобщения. Это связано с тем, что прямое действие одних цитокинов может быть подавлено действием цитокинов-антагонистов, которые в еще большей степени секретируются иммунокомпетентными клетками, которые активированы цитокинами первичного дейстивия. Проведенные исследования свидетельствуют, что у пациентов, принимавших препарат Панаген, в ходе трех непрерывных ХТ произошла индукция адаптивного иммунитета, что является положительным прогностическим критерием для указанной группы больных. Полученные данные могут являться доказательством противоракового действия препарата Панаген при его использовании в сочетании с цитостатиками ЦФ и доксорубицин в клиническом применении при лечении рака молочной железы II-IV стадии. 4 Внедрение результатов в образовательный процесс Полученные в ходе реализации проекта научные результаты в настоящее время используются в образовательном процессе в Новосибирском государственном университете на Факультете естественных наук и Медицинском факультете. Результаты экспериментальных исследований используются в программе курса лекций «Введение в биологию» для студентов 1 курса Факультета естественных наук и Медицинского факультета по теме «Биологические эффекты экзогенных нуклеиновых кислот» и при чтении курса лекций по иммунологии студентам 3 курса Факультета естественных наук и Медицинского факультета в следующих разделах лекционного курса – «Факторы неспецифической резистентности», «Презентация антигенов», «ДНК-вакцины и вакцины на основе дендритных клеток». В программу семинара по иммуногенетике для студентов 4 курса Факультета естественных наук, специализирующихся по цитологии и генетике, включены следующие темы: 69 дендритные клетки как профессиональные антиген-представляющие клетки; вакцины на основе дендритных клеток для лечения злокачественных новообразований; ДНК-вакцины – новое поколение вакцин; иммунологические эффекты экзогенных нуклеиновых кислот; взаимодействие нуклеиновых кислот с Toll-like рецепторами в реакциях врожденного иммунитета. По этим темам студенты делают под руководством Н.А. Поповой курсовые работы. Заключение Проведенные исследования заключительного этапа были выполнены в реальной клинике, проходящей на базах Иркутского областного и Новосибирского городского онкологических диспансеров по поводу клинических испытаний препарата «Панаген». Препарат «Панаген» является лекарственным средством, созданным в результате многолетних экспериментальных изысканий и объединивший в себе все основные достижения современной молекулярно-биологической и иммунологической науки. В проведенных исследованиях последнего этапа работ по проекту была отработана модель совместного использования трех препаратов – цитостатиков ЦФ и доксорубицина и препарата «Панаген» – в стратегии лечения рака молочной железы II-IV стадии. Был разработан основной регламент терапии тремя препаратами и проанализирована лейкостимулирующая активность препарата «Панаген», выявляемая на протяжении трех последовательных ХТ. Также был разработан дополнительный регламент терапии тремя препаратами и дана теоретическая оценка возможности таким образом не только деструктировать опухоль, но и активировать противораковый адаптивный иммунитет за счет активации антигенпрезентирующих свойств ДК. Результаты проведенной работы показали, что примененный подход улучшает качество жизни пациентов, находящихся в процессе ХТ. Применение препарата «Панаген» достоверно стимулирует гранулоцитарно-макрофагальный и лимфоцитарный ростки кроветворения. Результаты протокола по оценке индукции адаптивного иммунитета свидетельствуют о достоверном увеличении количества CD8+ перфоринсодержащих Т-цитотоксических лимфоцитов по сравнению с плацебо в периферической крови пациентов. Анализ цитотоксической активности мононуклеарной фракции пациентов, находящихся в исследовании, свидетельствует о сохранении на 70 допроцедурном уровне активности натуральных киллеров, которые являются врожденным звеном противоракового иммунитета. Общее заключение по поводу свойств препарата следующее. Препарат оказывает избирательное протектороное и активирующее действие на гемопоэз гранулоцитарномакрофагального и лимфоцитарного ростков кроветворения на протяжении как минимум трех ХТ с применением ЦФ и доксорубицина. Препарат активирует адаптивное звено иммунитета, что характеризуется повышением в крови пациентов цитотоксических CD8+ перфорин-содержащих CD4+CD25+Fox3+ Т-лимфоцитов. регуляторных Препарат лимфоцитов. не Препарат стимулирует является активацию протектором натуральных киллеров, выполняющих функцию первого эшелона противораковой защита. И, таким образом, препарат «Панаген» является препаратом направленного лейкостимулирующего действия, активирующим адаптивный иммунитет. Все полученные результаты используются в образовательном процессе на Факультете естественных наук и Медицинском факультете НГУ. Предусмотренные календарным планом задания выполнены полностью. 71 Список использованных источников 1 Гранов А.М., Молчанов О.Е. Канцерогенез и иммунобиология опухоли. Фундаментальные и клинические аспекты // Вопросы онкологии. – 2008. – Т. 54. – № 4. – С. 401-409. 2 Anker P., Mulcahy H., Chen X.Q., Stroun M. Detection of circulating tumour DNA in the blood (plasma/serum) of cancer patients // Cancer Metastasis Rev. – 1999. V. 18. – N 1. –P. 65– 73. 3 Holmgren L., Szeles A., Rajnavölgyi E., Folkman J., Klein G., Ernberg I., Falk K.I. Horizontal transfer of DNA by the uptake of apoptotic bodies // Blood. – 1999. – V. 93. – N 11. – P. 3956–3963. 4 Anker P. Quantitative aspects of plasma/serum DNA in cancer patients // Ann. N. Y. Acad. Sci. – 2000. – V. 906 – P. 5–7. 5 García-Olmo D., García-Olmo D.C., Ontañón J., Martinez E. Horizontal transfer of DNA and the "genometastasis hypothesis" // Blood. – 2000. – V. 95. – N 2. – P. 724–745. 6 Лихачева А.С., Рогачев В.А., Николин В.П., Попова Н.А., Шилов А.Г., Себелева Т.Е., Стрункин Д.Н., Черных Е.Р., Гельфгат Е.Л., Богачев С.С., Шурдов М.А. Участие экзогенной ДНК в молекулярных процессах, протекающих в соматической клетке // Информационный вестник ВОГиС. – 2008. – Т. 12. – № 3. – C.426–473. 7 Хаитов Р.М., Игнатьева Г.А., Сидорович И.Г. Иммунология: Учебник / М.: Медицина, 2000. – 432 с. 8 Попова Н.А. Иммунология: Учеб. пособие / Новосибирск: Новосиб. гос. ун-т, 2006. – 256 с. 9 Schatz D.G., Oettinger M.A., Schlissel M.S. V(D)J recombination: molecular biology and regulation // Annu. Rev. Immunol. – 1992. – V. 10. –P. 359–383. 10 Medzhitov R. Recognition of microorganisms and activation of the immune response // Nature. – 2007. – V. 449. – N 7164. – P. 819–826. 11 Latz E., Schoenemeyer A., Visintin A., Fitzgerald K.A., Monks B.G., Knetter C.F., Lien E., Nilsen N.J., Espevik T., Golenbock D.T. TLR9 signals after translocating from the ER to CpG DNA in the lysosome // Nat. Immunol. – 2004. – V. 5. – N 2. – P. 190–198. 12 Lee M.S., Kim Y.J. Signaling pathways downstream of pattern-recognition receptors and their cross talk // Annu. Rev. Biochem. – 2007. – V. 76. – P. 447–480. 13 Ракофф-Наум C., Меджитов Р. Роль Toll-подобных рецепторов в репарации тканей и канцерогенезе // Биохимия. – 2008. – Т. 73. – № 5. – С. 690–698. 14 Krieg A.M. Therapeutic potential of Toll-like receptor 9 activation // Nat. Rev. Drug Discov. – 2006. – V. 5. – N 6. – P. 471–484. 72 15 Iwasaki A., Medzhitov R. Toll-like receptor control of the adaptive immune responses // Nat. Immunol. – 2004. – V. 5. – N 10. – P. 987–995. 16 Schlecht G., Garcia S., Escriou N., Freitas A.A., Leclerc C., Dadaglio G. Murine plasmacytoid dendritic cells induce effector/memory CD8+ T-cell responses in vivo after viral stimulation // Blood. – 2004. – V. 104. – N 6. – P. 1808–1815. 17 Honda K., Ohba Y., Yanai H., Negishi H., Mizutani T., Takaoka A., Taya C., Taniguchi T. Spatiotemporal regulation of MyD88-IRF-7 signalling for robust type-I interferon induction // Nature. – 2005. –V. 434. – N 7036. – P. 1035–1040. 18 Ishii K.J., Akira S. Innate immune recognition of, and regulation by, DNA // Trends Immunol. – 2006. – V. 27. – N 11. – P. 525–532. 19 Krieg A.M. Development of TLR9 agonists for cancer therapy // J. Clin. Invest. – 2007. – V. 117. – N 5. – P. 1184–1194. 20 Boulé M.W., Broughton C., Mackay F., Akira S., Marshak-Rothstein A., Rifkin I.R. Tolllike receptor 9-dependent and -independent dendritic cell activation by chromatinimmunoglobulin G complexes // J. Exp. Med. – 2004. – V. 199. – N 12. – P. 1631–1640. 21 Decker P., Singh-Jasuja H., Haager S., Kötter I., Rammensee H.G. Nucleosome, the main autoantigen in systemic lupus erythematosus, induces direct dendritic cell activation via a MyD88-independent pathway: consequences on inflammation // J. Immunol. – 2005. – V. 174. – N 6. – P. 3326–3334. 22 Yasuda K., Ogawa Y., Yamane I., Nishikawa M., Takakura Y. Macrophage activation by a DNA/cationic liposome complex requires endosomal acidification and TLR9-dependent and independent pathways // J. Leukoc. Biol. – 2005. – V. 77. – N 1. – P. 71–79. 23 Martin D.A., Elkon K.B. Intracellular mammalian DNA stimulates myeloid dendritic cells to produce type I interferons predominantly through a toll-like receptor 9-independent pathway // Arthritis Rheum. – 2006. – V. 54. – N 3. – P. 951–962. 24 Shirota H., Ishii K.J., Takakuwa H., Klinman D.M. Contribution of interferon-beta to the immune activation induced by double-stranded DNA // Immunology. – 2006. – V. 118. – N 3. – P. 302–310. 25 Rönnefarth V.M., Erbacher A.I., Lamkemeyer T., Madlung J., Nordheim A., Rammensee H.G., Decker P. TLR2/TLR4-independent neutrophil activation and recruitment upon endocytosis of nucleosomes reveals a new pathway of innate immunity in systemic lupus erythematosus // J. Immunol. – 2006. – V. 177. – N 11. – P. 7740–7749. 26 Suzuki K., Mori A., Ishii K.J., Saito J., Singer D.S., Klinman D.M., Krause P.R., Kohn L.D. Activation of target-tissue immune-recognition molecules by double-stranded polynucleotides // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1999. – V. 96. – N 5. – P. 2285–2290. 73 27 Krieg A.M. CpG motifs: the active ingredient in bacterial extracts? // Nat. Med. – 2003. – V. 9. – N 7. – P. 831–835. 28 Ishii K.J., Suzuki K., Coban C., Takeshita F., Itoh Y., Matoba H., Kohn L.D., Klinman D.M. Genomic DNA released by dying cells induces the maturation of APCs // J. Immunol. – 2001. – V. 167. – N 5. – P. 2602–2607. 29 Zhu F.G., Reich C.F., Pisetsky D.S. Effect of cytofectins on the immune response of murine macrophages to mammalian DNA // Immunology. – 2003. – V. 109. – N 2. – P. 255-262. 30 Jiang W., Reich III C.F., Pisetsky D.S. Mechanisms of activation of the RAW264.7 macrophage cell line by transfected mammalian DNA // Cell. Immunol. – 2004. – V. 229. – N 1. – P. 31–40. 31 Wang H., Rayburn E.R., Wang W., Kandimalla E.R., Agrawal S., Zhang R. Chemotherapy and chemosensitization of non-small cell lung cancer with a novel immunomodulatory oligonucleotide targeting Toll-like receptor 9 // Mol. Cancer Ther. – 2006. V. 5. – N 6. – P. 1585–1592. 32 Олишевский С.В., Козак В.В., Яниш Ю.В., Рыбалко С.Л., Шляховенко В.А. Иммуностимулирующая CpG-ДНК: перспективы клинического применения в онкологии // Онкология. – 2006. – Т. 8. – № 2. – С.209–217. 33 Hartmann G., Krieg A.M. CpG DNA and LPS induce distinct patterns of activation in human monocytes // Gene Ther. – 1999. – V. 6. – N 5. – P. 893–903. 34 Pulendran B. Variegation of the immune response with dendritic cells and pathogen recognition receptors // J. Immunol. – 2005. – V. 174. – N 5. – P. 2457–2465. 35 Otto F., Schmid P., Mackensen A., Wehr U., Seiz A., Braun M., Galanos C., Mertelsmann R., Engelhardt R. Phase II trial of intravenous endotoxin in patients with colorectal and non-small cell lung cancer // Eur. J. Cancer. – 1996. – V. 32A. – N 10. – P. 1712–1718. 36 Liu Y.J. IPC: professional type 1 interferon-producing cells and plasmacytoid dendritic cell precursors // Annu. Rev. Immunol. – 2005. – V. 23. – P. 275–306. 37 Kawai T., Akira S. Innate immune recognition of viral infection // Nat. Immunol. – 2006. – V. 7. – N 2. – P. 131–137. 38 Zou W. Regulatory T cells, tumour immunity and immunotherapy // Nat. Rev. Immunol. – 2006. – V. 6. – N 4. – P. 295–307. 39 Carson W.E. 3rd, Shapiro C.L., Crespin T.R., Thornton L.M., Andersen B.L. Cellular immunity in breast cancer patients completing taxane treatment // Clin. Cancer Res. – 2004. – V. 10. – N 10. – P. 3401–3409. 40 Beyer M., Kochanek M., Darabi K., Popov A., Jensen M., Endl E., Knolle P.A., Thomas R.K., von Bergwelt-Baildon M., Debey S., Hallek M., Schultze J.L. Reduced frequencies and 74 suppressive function of CD4+CD25hi regulatory T cells in patients with chronic lymphocytic leukemia after therapy with fludarabine // Blood. – 2005. – V. 106. – N 6. – P. 2018-2025. 41 Correale P., Cusi M.G., Tsang K.Y., Del Vecchio M.T., Marsili S., Placa M.L., Intrivici C., Aquino A., Micheli L., Nencini C., Ferrari F., Giorgi G., Bonmassar E., Francini G. Chemoimmunotherapy of metastatic colorectal carcinoma with gemcitabine plus FOLFOX 4 followed by subcutaneous granulocyte macrophage colony-stimulating factor and interleukin-2 induces strong immunologic and antitumor activity in metastatic colon cancer patients // J. Clin. Oncol. – 2005. – V. 23. – N 35. – P. 8950–8958. 42 Emens L.A., Jaffee E.M. Leveraging the activity of tumor vaccines with cytotoxic chemotherapy // Cancer Res. – 2005. – V. 65. – N 18. – P. 8059–8064. 43 Ercolini A.M., Ladle B.H., Manning E.A., Pfannenstiel L.W., Armstrong T.D., Machiels J.P., Bieler J.G., Emens L.A., Reilly R.T., Jaffee E.M. Recruitment of latent pools of highavidity CD8(+) T cells to the antitumor immune response // J. Exp. Med. – 2005. – V. 201. – N 10. – P. 1591–1602. 44 Ghiringhelli F., Larmonier N., Schmitt E., Parcellier A., Cathelin D., Garrido C., Chauffert B., Solary E., Bonnotte B., Martin F. CD4+CD25+ regulatory T cells suppress tumor immunity but are sensitive to cyclophosphamide which allows immunotherapy of established tumors to be curative // Eur. J. Immunol. – 2004. – V. 34. – N 2. – P. 336–344. 45 Lake R.A., Robinson B.W. Immunotherapy and chemotherapy--a practical partnership // Nat. Rev. Cancer. – 2005. – V. 5. – N 5. – P. 397–405. 46 Lutsiak M.E., Semnani R.T., De Pascalis R., Kashmiri S.V., Schlom J., Sabzevari H. Inhibition of CD4(+)25+ T regulatory cell function implicated in enhanced immune response by low-dose cyclophosphamide // Blood. – 2005. – V. 105. – N 7. – P. 2862–2868. 47 Machiels J.P., Reilly R.T., Emens L.A., Ercolini A.M., Lei R.Y., Weintraub D., Okoye F.I., Jaffee E.M. Cyclophosphamide, doxorubicin, and paclitaxel enhance the antitumor immune response of granulocyte/macrophage-colony stimulating factor-secreting whole-cell vaccines in HER-2/neu tolerized mice // Cancer Res. – 2001. – V. 61. – N 9. – P. 3689–3697. 48 Chu Y., Wang L.X., Yang G., Ross H.J., Urba W.J., Prell R., Jooss K., Xiong S., Hu H.M. Efficacy of GM-CSF-producing tumor vaccine after docetaxel chemotherapy in mice bearing established Lewis lung carcinoma // J. Immunother. – 2006. – V. 29. – N 4. – P. 367– 380. 49 Taieb J., Chaput N., Schartz N., Roux S., Novault S., Menard C., Ghiringhelli F., Terme M., Carpentier A.F., Darrasse-Jeze G., Lemonnier F., Zitvogel L. Chemoimmunotherapy of tumors: cyclophosphamide synergizes with exosome based vaccines // J. Immunol. – 2006. – V. 176. – N. 5. – P. 2722–2729. 75 50 Obeid M., Panaretakis T., Tesniere A., Joza N., Tufi R., Apetoh L., Ghiringhelli F., Zitvogel L., Kroemer G. Leveraging the immune system during chemotherapy: moving calreticulin to the cell surface converts apoptotic death from "silent" to immunogenic // Cancer Res. – 2007. – V. 67. – N 17. – P. 7941–7944. 51 Alyamkina E.A., Dolgova E.V., Likhacheva A.S., Rogachev V.A., Sebeleva T.E., Nikolin V.P., Popova N.A., Kiseleva E.V., Orishchenko K.E., Sakhno L.V., Gel'fgat E.L., Ostanin A.A., Chernykh E.R., Zagrebelniy S.N., Bogachev S.S., Shurdov M.A. Exogenous allogenic fragmented double-stranded DNA is internalized into human dendritic cells and enhances their allostimulatory activity // Cell. Immunol. – 2010. – V. 262. – P. 120–126. 52 Alyamkina E.A., Leplina O.Y., Sakhno L.V., Chernykh E.R., Ostanin A.A., Efremov Y.R., Shilov A.G., Proskurina A.S., Orishchenko K.E., Dolgova E.V., Rogachev V.A., Nikolin V.P., Popova N.A., Zagrebelniy S.N., Bogachev S.S., Shurdov M.A. Effect of double-stranded DNA on maturation of dendritic cells in vitro // Cell. Immunol. – 2010. – V. 266. – P. 46–51. 53 Alyamkina E.A., Dolgova E.V., Likhacheva A.S., Rogachev V.A., Sebeleva T.E., Nikolin V.P., Popova N.A., Orishchenko K.E., Strunkin D.N., Chernykh E.R., Zagrebelniy S.N., Bogachev S.S., Shurdov M.A. Combined therapy with cyclophosphamide and DNA preparation inhibits the tumor growth in mice // Genet. Vaccines Ther. – 2009. – V. 7. – N 1. – 12. http://www.gvt-journal.com/content/7/1/12. 54 Alyamkina E.A., Nikolin V.P., Popova N.A., Dolgova E.V., Proskurina A.S., Orishchenko K.E., Efremov Y.R., Chernykh E.R., Ostanin A.A., Sidorov S.V., Ponomarenko D.M., Zagrebelniy S.N., Bogachev S.S., Shurdov M.A. A strategy of tumor treatment in mice with doxorubicin-cyclophosphamide combination based on dendritic cell activation by human double-stranded DNA preparation // Genet. Vaccines Ther. – 2010. – V. 8. – N 1. – 7. http://www.gvt-journal.com/content/8/1/7. 55 Паровичникова Е.Н., Гальцева И.В., Воробьев И.А., Савченко В.Г. Характеристика Т-клеточного звена иммунной системы у больных острыми лейкозами // Терапевтический архив. – 2006. – Т. 78. – № 7. – С.18–25. 56 Ueno H., Klechevsky E., Morita R., Aspord C., Cao T., Matsui T., Di Pucchio T., Connolly J., Fay J.W., Pascual V., Palucka A.K., Banchereau J. Dendritic cell subsets in health and disease // Immunol. Rev. – 2007. – V. 219. – P. 118–142. 57 Shurin G.V., Ferris R.L., Tourkova I.L., Perez L., Lokshin A., Balkir L., Collins B., Chatta G.S., Shurin M.R. Loss of new chemokine CXCL14 in tumor tissue is associated with low infiltration by dendritic cells (DC), while restoration of human CXCL14 expression in tumor cells causes attraction of DC both in vitro and in vivo // J. Immunol. – 2005. – V. 174. – N 9. – P. 5490–5498. 76 58 Steinman R.M. The dendritic cell system and its role in immunogenicity // Annu. Rev. Immunol. – 1991 – V. 9. – P. 271–296. 59 Nair S., McLaughlin C., Weizer A., Su Z., Boczkowski D., Dannull J., Vieweg J., Gilboa E. Injection of immature dendritic cells into adjuvant-treated skin obviates the need for ex vivo maturation // J. Immunol. – 2003. – V. 171. – N 11. – P. 6275–6282. 60 Ibe S., Qin Z., Schüler T., Preiss S., Blankenstein T. Tumor rejection by disturbing tumor stroma cell interactions // J. Exp. Med. 2001. – V. 194. – N 11. – P. 1549–1559. 61 Spiotto M.T., Rowley D.A., Schreiber H. Bystander elimination of antigen loss variants in established tumors // Nat. Med. – 2004. – V. 10. – N 3. – P. 294–298. 62 Salem M.L., Díaz-Montero C.M., Al-Khami A.A., El-Naggar S.A., Naga O., Montero A.J., Khafagy A., Cole D.J. Recovery from cyclophosphamide-induced lymphopenia results in expansion of immature dendritic cells which can mediate enhanced prime-boost vaccination antitumor responses in vivo when stimulated with the TLR3 agonist poly(I:C) // J. Immunol. – 2009. – V. 182. – N 4. – P. 2030–2040. 63 Fallarino F., Bianchi R., Orabona C., Vacca C., Belladonna M.L., Fioretti M.C., Serreze D.V., Grohmann U., Puccetti P. CTLA-4-Ig activates forkhead transcription factors and protects dendritic cells from oxidative stress in nonobese diabetic mice // J. Exp. Med. – 2004. – V. 200. – N 8. – P. 1051–1062. 64 Lange C., Dürr M., Doster H., Melms A., Bischof F. Dendritic cell-regulatory T-cell interactions control self-directed immunity // Immunol. Cell Biol. – 2007. – V. 85. – N 8. – P. 575–581. 65 Yamazaki S., Bonito A.J., Spisek R., Dhodapkar M., Inaba K., Steinman R.M. Dendritic cells are specialized accessory cells along with TGF- for the differentiation of Foxp3+ CD4+ regulatory T cells from peripheral Foxp3 precursors // Blood. – 2007. – V. 110. – N 13. – P. 4293–4302. 66 Askenasy N., Kaminitz A., Yarkoni S. Mechanisms of T regulatory cell function // Autoimmun. Rev. – 2008. – V. 7. – N 5. – P. 370–375. 67 Ikezawa Y., Nakazawa M., Tamura C., Takahashi K., Minami M., Ikezawa Z. Cyclophosphamide decreases the number, percentage and the function of CD25+ CD4+ regulatory T cells, which suppress induction of contact hypersensitivity // J. Dermatol. Sci. – 2005. – V. 39. – N 2. – P. 105–112. 68 Motoyoshi Y., Kaminoda K., Saitoh O., Hamasaki K., Nakao K., Ishii N., Nagayama Y., Eguchi K. Different mechanisms for anti-tumor effects of low- and high-dose cyclophosphamide // Oncol. Rep. – 2006. – V. 16. – N 1. – P. 141–146. 77 69 Bopp T., Radsak M., Schmitt E., Schild H. New strategies for the manipulation of adaptive immune responses // Cancer Immunol. Immunother. – 2010. – V. 59. – N 9. – P. 1443– 1448. 70 Сенников С.В., Силков А.Н. Методы определения цитокинов // Цитокины и воспаление. – 2005. – Т. 4. – № 1. – С. 22–27. 71 Кадагидзе З.Д. Цитокины // Практическая онкология. – 2003. – Т. 4. – № 3. – С. 131–139. 72 Мейл Д., Бростофф Дж., Рот Д.Б., Ройтт А. Иммунология / М.: Логосфера, 2007. – 568 с. 73 Рыжикова С.Л., Дружинина Ю.Г., Рябичева Т.Г., Рукавишников М.Ю., Вараксин Н.А. Новый набор реагентов для культивирования и митогенной активации клеток цельной крови // Новости «Вектор-Бест». – 2009. – № 4 – C. 54. 74 Домникова Н.П., Петрусенко Е.Е., Решетников О.В., Рыжикова С.Л., Вараксин Н..А. Уровень сывороточных цитокинов при лимфопролиферативных заболеваниях // Новости «Вектор-Бест». – 2010. – № 2. – C. 56. 75 Бережной А.Е., Гнучев Н.В., Георгиев Г.П., Козлов А.М., Ларин С.С. Молекулярные механизмы взаимодействия опухоли и иммунной системы // Вопросы онкологии. – 2008. – Т. 54. – № 6. – C. 669–683. 76 Хоченков Д.М. Биология дендритных клеток // Биологические мембраны. – 2008. – Т. 25. – № 6. – С. 403–419. 77 Lutsiak M.E., Tagaya Y., Adams A.J., Schlom J., Sabzevari H. Tumor-induced impairment of TCR signaling results in compromised functionality of tumor-infiltrating regulatory T cells // J. Immunol. – 2008. – V. 180. – N 9. – P. 5871–5881. 78 Pratesi G., Petrangolini G., Tortoreto M., Addis A., Belluco S., Rossini A., Selleri S., Rumio C., Menard S., Balsari A. Therapeutic synergism of gemcitabine and CpGoligodeoxynucleotides in an orthotopic human pancreatic carcinoma xenograft // Cancer Res. – 2005. – V. 65. – N 14. – P. 6388–6393. 79 Takeshita F., Ishii K.J. Intracellular DNA sensors in immunity // Curr. Opin. Immunol. – 2008. – V. 20. – N 4. – P. 383–388. 80 Coban C., Koyama S., Takeshita F., Akira S., Ishii K.J. Molecular and cellular mechanisms of DNA vaccines // Hum. Vaccin. – 2008. – V. 4. – N 6. – P. 453–456. 81 Николин В.П., Попова Н.А., Себелева Т.Е., Стрункин Д.Н., Рогачев В.А., Семенов Д.В., Богачев С.С., Якубов Л.А., Шурдов М.А. Влияние экзогенной ДНК на рост экспериментальных опухолей // Вопросы онкологии. – 2006. – Т. 52. – № 1. – С. 66–69. 78 82 Николин В.П., Попова Н.А., Себелева Т.Е., Стрункин Д.Н., Рогачев В.А., Семенов Д.В., Богачев С.С., Якубов Л.А., Шурдов М.А. Влияние экзогенной ДНК на восстановление лейкопоэза и противоопухолевый эффект циклофосфана // Вопросы онкологии. – 2006. – Т. 52. – № 3. – С. 336–340. 83 Groh V., Bahram S., Bauer S., Herman A., Beauchamp M., Spies T. Cell stress-regulated human major histocompatibility complex class I gene expressed in gastrointestinal epithelium // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1996. – V. 93. – N 22. – P. 12445–12450. 84 Girardi M., Oppenheim D.E., Steele C.R., Lewis J.M., Glusac E., Filler R., Hobby P., Sutton B., Tigelaar R.E., Hayday A.C. Regulation of cutaneous malignancy by gammadelta T cells // Science. – 2001. – V. 294. – N 5542. – P. 605–609. 85 Nakahara T., Uchi H., Lesokhin A.M., Avogadri F., Rizzuto G.A., HirschhornCymerman D., Panageas K.S., Merghoub T., Wolchok J.D., Houghton A.N. Cyclophosphamide enhances immunity by modulating the balance of dendritic cell subsets in lymphoid organs // Blood. – 2010. – V. 115. – N 22. – P. 4384–4392. 86 Salem M.L., El-Naggar S.A., Cole D.J. Cyclophosphamide induces bone marrow to yield higher numbers of precursor dendritic cells in vitro capable of functional antigen presentation to T cells in vivo // Cell. Immunol. – 2010. – V. 261. – N 2. – P. 134–143. 79
