aftoref for web

Íà ïðàâàõ ðóêîïèñè
ËßÍÃÓÇÎÂÀ
Ìàðèÿ Ñåðãååâíà
ÐÎËÜ ÌÀÐÊ- È PI3K-ÇÀÂÈÑÈÌÛÕ ÑÈÃÍÀËÜÍÛÕ
ÊÀÑÊÀÄÎÂ
 ÐÅÃÓËßÖÈÈ ÏÐÎËÈÔÅÐÀÖÈÈ
ÝÌÁÐÈÎÍÀËÜÍÛÕ ÑÒÂÎËÎÂÛÕ ÊËÅÒÎÊ ÌÛØÈ
03.00.25
ãèñòîëîãèÿ, öèòîëîãèÿ, êëåòî÷íàÿ áèîëîãèÿ
ÀÂÒÎÐÅÔÅÐÀÒ
äèññåðòàöèè íà ñîèñêàíèå ó÷åíîé ñòåïåíè
êàíäèäàòà áèîëîãè÷åñêèõ íàóê
Ñàíêò-Ïåòåðáóðã
2007
Ðàáîòà âûïîëíåíà â Èíñòèòóòå öèòîëîãèè ÐÀÍ,
Ñàíêò-Ïåòåðáóðã
Íàó÷íûé ðóêîâîäèòåëü:
äîêòîð áèîëîãè÷åñêèõ íàóê
ïðîôåññîð Ïîñïåëîâ Âàëåðèé Àíàòîëüåâè÷
Èíñòèòóò öèòîëîãèè ÐÀÍ, Ñàíêò-Ïåòåðáóðã
Îôèöèàëüíûå îïïîíåíòû: äîêòîð áèîëîãè÷åñêèõ íàóê
Êîðíèëîâà Åëåíà Ñåðãååâíà
Èíñòèòóò öèòîëîãèè ÐÀÍ, Ñàíêò-Ïåòåðáóðã
äîêòîð áèîëîãè÷åñêèõ íàóê
Ïàòêèí Åâãåíèé Ëüâîâè÷
ÃÓ ÍÈÈ ýêñïåðèìåíòàëüíîé ìåäèöèíû ÐÀÌÍ
Âåäóùàÿ îðãàíèçàöèÿ:
Ñàíêò-Ïåòåðáóðãñêèé
ãîñóäàðñòâåííûé óíèâåðñèòåò; áèîëîãî-ïî÷âåííûé ôàêóëüòåò
Çàùèòà ñîñòîèòñÿ "25" ìàÿ 2007 ãîäà â 13 ÷àñ íà çàñåäàíèè
Äèññåðòàöèîííîãî ñîâåòà Ä.002.230.01 ïðè Èíñòèòóòå öèòîëîãèè
ÐÀÍ ïî àäðåñó: 194064, Ñàíêò-Ïåòåðáóðã, Òèõîðåöêèé ïð., ä. 4.
www.cytspb.rssi.ru
email: [email protected]
Ñ äèññåðòàöèåé ìîæíî îçíàêîìèòüñÿ â áèáëèîòåêå Èíñòèòóòà
öèòîëîãèè ÐÀÍ
Àâòîðåôåðàò ðàçîñëàí "
" àïðåëÿ 2007 ãîäà.
Ó÷åíûé ñåêðåòàðü
äèññåðòàöèîííîãî ñîâåòà,
êàíäèäàò áèîëîãè÷åñêèõ íàóê
Êàìèíñêàÿ Å.Â.
ÎÁÙÀß ÕÀÐÀÊÒÅÐÈÑÒÈÊÀ ÐÀÁÎÒÛ
Àêòóàëüíîñòü ïðîáëåìû
Îäíî èç óíèêàëüíûõ ñâîéñòâ ýìáðèîíàëüíûõ ñòâîëîâûõ
êëåòîê (ÝÑÊ) ìûøè - ñïîñîáíîñòü ê àâòîíîìíîé ïðîëèôåðàöèè.
 îòëè÷èå îò ñîìàòè÷åñêèõ êëåòîê îðãàíèçìà ìëåêîïèòàþùåãî,
íàïðèìåð, ôèáðîáëàñòîâ, ÝÑÊ ìîãóò ïðîëèôåðèðîâàòü â
îòñóòñòâèå âíåøíèõ ìèòîãåííûõ ñèãíàëîâ (Schratt et al., 2001). Ýòî
ñâîéñòâî äåëàåò èõ ñõîæèìè ñî çëîêà÷åñòâåííî
òðàíñôîðìèðîâàííûìè êëåòêàìè. Îäíàêî äåðåãóëÿöèÿ
ïðîëèôåðàöèè îïóõîëåâûõ êëåòîê âûçâàíà ìóòàöèÿìè â
ïðîòîîíêîãåíàõ è îïóõîëåâûõ ñóïðåññîðàõ, â òî âðåìÿ êàê ÝÑÊ
ÿâëÿþòñÿ íîðìàëüíûìè êëåòêàìè, íå íåñóùèìè ìóòàöèé, â
êîòîðûõ êîíòðîëü çà öåëîñòíîñòüþ ãåíîìà îñóùåñòâëÿåòñÿ î÷åíü
ñòðîãî, òàê êàê îíè ïðîèñõîäÿò èç êëåòîê âíóòðåííåé êëåòî÷íîé
ìàññû áëàñòîöèñòû, äàþùåé íà÷àëî âñåì êëåòêàì çàðîäûøà è
âïîñëåäñòâèè âçðîñëîìó îðãàíèçìó. Î÷åâèäíî, íåñïîñîáíîñòü ÝÑÊ
îñòàíàâëèâàòüñÿ â êëåòî÷íîì öèêëå îáóñëîâëåíà
ôóíêöèîíèðîâàíèåì â íèõ îñîáîé ïðîãðàììû ïðîëèôåðàöèè.
Ñêîðåå âñåãî, àâòîíîìíîñòü äåëåíèÿ ÝÑÊ îò âíåøíèõ
ñèãíàëîâ òåñíî ñâÿçàíà ñ òåì, ÷òî ýòè êëåòêè ïðîëèôåðèðóþò î÷åíü
áûñòðî, òàê æå êàê è èõ àíàëîã in vivo - êëåòêè âíóòðåííåé
êëåòî÷íîé ìàññû áëàñòîöèñòû. Ïðè ðàçâèòèè çàðîäûøà ìûøè â
ïåðèîä ñ 4.5 ïî 7.0 dpc (days post coitum) ðàçìåð âíóòðåííåé
êëåòî÷íîé ìàññû áëàñòîöèñòû óâåëè÷èâàåòñÿ îò 20-25 êëåòîê äî
ïðèìåðíî 4000 êëåòîê. Òàêèì îáðàçîì, â áëàñòîöèñòå íà
äîèïëàíòàöèîííîé ñòàäèè ïðîèñõîäèò âñïûøêà ïðîëèôåðàòèâíîé
àêòèâíîñòè, ìîëåêóëÿðíûå îñíîâû êîòîðîé âî ìíîãîì åù¸ íå ÿñíû.
Äåòàëüíîå èçó÷åíèå ðåãóëÿöèè ïðîëèôåðàöèè ÝÑÊ ñïîñîáñòâóåò
ïîíèìàíèþ ñîáûòèé ðàííåãî ýìáðèîíàëüíîãî ðàçâèòèÿ
ìëåêîïèòàþùèõ.
Ïðåäûäóùèå èññëåäîâàíèÿ ìîëåêóë-ðåãóëÿòîðîâ
ïðîëèôåðàöèè â ÝÑÊ ìûøè ïîêàçàëè, ÷òî â ýòèõ êëåòêàõ áåëîê Rb
ãèïåðôîñôîðèëèðîâàí, à òðàíñêðèïöèîííûé ôàêòîð E2F1 è
êîìïëåêñû cdk2/öèêëèí Å, cdk2/öèêëèí À àêòèâíû ïîñòîÿííî,
íåçàâèñèìî îò ñòàäèè êëåòî÷íîãî öèêëà (Stead et al., 2002; Savatier
et al., 1994). Â êëåòêàõ äðóãèõ òèïîâ, íàïðèìåð, â ôèáðîáëàñòàõ,
ýòè ðåãóëÿòîðû êëåòî÷íîãî öèêëà àêòèâèðóþòñÿ òîëüêî ïåðåä
íà÷àëîì ôàçû ñèíòåçà ÄÍÊ â ðåçóëüòàòå ìèòîãåííîé ñòèìóëÿöèè
êëåòîê ðîñòîâûìè ôàêòîðàìè íà ðàííåé ñòàäèè ôàçû G1. Â ÝÑÊ
-3-
ìûøè ôàçà G1 î÷åíü êîðîòêà, è ïåðèîä ÷óâñòâèòåëüíîñòè ê
ìèòîãåííûì ñèãíàëàì èç âíå â íåé, ïî-âèäèìîìó, ðåäóöèðîâàí.
Âåðîÿòíî, ïðîëèôåðàöèþ ÝÑÊ ìûøè ñòèìóëèðóåò íåçàâèñèìàÿ
îò âíåøíèõ ñèãíàëîâ ìèòîãåííàÿ àêòèâíîñòü, êîòîðàÿ ïîñòîÿííî
ïîääåðæèâàåò öèêëèí-çàâèñèìûå êèíàçû è òðàíñêðèïöèîííûé
ôàêòîð E2F1 â àêòèâíîì ñîñòîÿíèè. Êàêèå ñèãíàëüíûå ìîëåêóëû
è êàñêàäû îáåñïå÷èâàþò ýòó àêòèâíîñòü ïîêà åùå íåèçâåñòíî. Íà
êëåòêàõ äðóãèõ òèïîâ ïîêàçàíî, ÷òî ìèòîãåííûé ñèãíàë îò
ðîñòîâûõ ôàêòîðîâ ê ðåãóëÿòîðàì êëåòî÷íîãî öèêëà ïåðåäàþò
MAP-Erk êèíàçíûé êàñêàä è PI3K-çàâèñèìûé êàñêàä (Jones,
Kazlauskas, 2001). Â ñâÿçè ñ ýòèì äàííûå ñèãíàëüíûå ïóòè
ïðåäñòàâëÿþòñÿ âåðîÿòíûìè êàíäèäàòàìè íà ðîëü èñòî÷íèêîâ
âíóòðåííåé ìèòîãåííîé àêòèâíîñòè â ÝÑÊ ìûøè.
Öåëè è çàäà÷è èññëåäîâàíèÿ
Öåëüþ íàñòîÿùåé ðàáîòû áûëî èçó÷åíèå âêëàäà
àêòèâíîñòåé MAPK è PI3K-çàâèñèìûõ êàñêàäîâ â ðåãóëÿöèþ
ïåðåõîäà G1/S â ìèòîòè÷åñêîì öèêëå ýìáðèîíàëüíûõ ñòâîëîâûõ
êëåòîê ìûøè.
 ñîîòâåòñòâèè ñ ýòèì áûëè ñôîðìóëèðîâàíû ñëåäóþùèå
çàäà÷è:
1) âûÿñíèòü, çàâèñèò ëè àêòèâíîñòü Erk- è PI3K-çàâèñèìûõ
êàñêàäîâ â ýìáðèîíàëüíûõ ñòâîëîâûõ êëåòîê ìûøè îò ñûâîðîòêè;
2) ñ ïîìîùüþ ôàðìàêîëîãè÷åñêèõ èíãèáèòîðîâ âûÿñíèòü â êàêîé
ñòåïåíè àêòèâíîñòü MAPK è PI3K-çàâèñèìûõ êàñêàäîâ ÿâëÿåòñÿ
íåîáõîäèìîé äëÿ ïðîëèôåðàöèè ýìáðèîíàëüíûõ ñòâîëîâûõ êëåòîê
ìûøè;
3) èññëåäîâàòü, êàê óäàëåíèå ðîñòîâûõ ôàêòîðîâ è èíãèáèðîâàíèå
PI3-êèíàçû âëèÿåò íà àêòèâíîñòü ðåãóëÿòîðîâ êëåòî÷íîãî öèêëà â
ýìáðèîíàëüíûõ ñòâîëîâûõ êëåòêàõ ìûøè;
4) èçó÷èòü âûæèâàåìîñòü è ðîñò ïîïóëÿöèè ýìáðèîíàëüíûõ
ñòâîëîâûõ êëåòîê ìûøè ïðè ñûâîðîòî÷íîì ãîëîäàíèè è
èíãèáèðîâàíèè àêòèâíîñòè PI3K-çàâèñèìîãî ñèãíàëüíîãî ïóòè.
Îñíîâíûå ïîëîæåíèÿ, âûíîñèìûå íà çàùèòó
Ýìáðèîíàëüíûå ñòâîëîâûå êëåòêè ìûøè ñïîñîáíû
ïðîëèôåðèðîâàòü ïðè ïîíèæåííîé àêòèâíîñòè ìèòîãåíàêòèâèðóåìûõ ñèãíàëüíûõ êàñêàäîâ, êîòîðàÿ äîñòèãàåòñÿ
ñûâîðîòî÷íûì ãîëîäàíèåì èëè îáðàáîòêîé êëåòîê
-4-
ôàðìàêîëîãè÷åñêèìè èíãèáèòîðàìè êèíàç.  îòñóòñòâèå ðîñòîâûõ
ôàêòîðîâ ïîçèòèâíûå ðåãóëÿòîðû ïðîëèôåðàöèè - êèíàçà cdk2 è
òðàíñêðèïöèîííûé ôàêòîð E2F1 - â ýìáðèîíàëüíûõ ñòâîëîâûõ
êëåòêàõ ìûøè îñòàþòñÿ àêòèâíû.
Ôàðìàêîëîãè÷åñêèé èíãèáèòîð PI3K LY294002 âûçûâàåò
íàêîïëåíèå ýìáðèîíàëüíûõ ñòâîëîâûõ êëåòîê ìûøè â ôàçå G1
êëåòî÷íîãî öèêëà, êîòîðîå ñîïðîâîæäàåòñÿ p27kip-íåçàâèñèìûì
ñíèæåíèåì óðîâíÿ àêòèâíîñòè êèíàçû cdk2 è òðàíñêðèïöèîííîãî
ôàêòîðà E2F1. Ïðèñóòñòâèå ðîñòîâûõ ôàêòîðîâ îñëàáëÿåò ýôôåêò
LY294002 íà ðàñïðåäåëåíèå ÝÑÊ ìûøè ïî ôàçàì êëåòî÷íîãî
öèêëà.
Íàó÷íàÿ íîâèçíà ðàáîòû
Âïåðâûå áûëî ïîêàçàíî, ÷òî ôàðìàêîëîãè÷åñêèå
èíãèáèòîðû ÌÀÐÊ êàñêàäîâ (Erk, JNK, p38) íå ïðåïÿòñòâóþò
ïðîëèôåðàöèè ÝÑÊ ìûøè.
Âïåðâûå áûëî ïîêàçàíî, ÷òî ñûâîðîòî÷íîå ãîëîäàíèå íå
âûçûâàåò ñíèæåíèÿ àêòèâíîñòè öèêëèí/êèíàçíûõ êîìïëåêñîâ â
ÝÑÊ ìûøè.
Âïåðâûå áûëî ïîêàçàíî, ÷òî â ÝÑÊ ìûøè îáðàáîòêà
èíãèáèòîðîì PI3K LY294002 ïðèâîäèò ê ñóùåñòâííîìó cíèæåíèþ
àêòèâíîñòè êîìïëåêñîâ öèêëèí Å/cdk2 è òðàíñêðèïöèîííîãî
ôàêòîðà E2F1 ïî p27kip-íåçàâèñèìîìó ìåõàíèçìó.
Âïåðâûå äëÿ ÝÑÊ ìûøè îïèñàíà çàâèñèìîñòü
àíòèïðîëèôåðàòèâíîãî ýôôåêòà èíãèáèòîðîâ êèíàç PI3K
(LY294002) è cdk2 (ðîñêîâèòèíà) îò ïðèñóòñòâèÿ ñûâîðîòêè â ñðåäå
êóëüòèâèðîâàíèÿ.
Òåîðåòè÷åñêîå è ïðàêòè÷åñêîå çíà÷åíèå ðàáîòû
Ïîëó÷åííûå â íàñòîÿùåì èññëåäîâàíèè äàííûå âíîñÿò
âêëàä â ïîíèìàíèå ìåõàíèçìîâ ïðîëèôåðàöèè ýìáðèîíàëüíûõ
ñòâîëîâûõ êëåòîê ìûøè. Âûÿñíåíî, ÷òî ðåãóëÿöèÿ ïåðåõîäà G1/S
â ÝÑÊ ìûøè îñóùåñòâëÿåòñÿ êàê àâòîíîìíûìè ñèãíàëàìè,
íåçàâèñèìûìè îò ñûâîðîòêè, òàê è ðîñòîâûìè ôàêòîðàìè
ñûâîðîòêè. Ïîëó÷åííàÿ â äàííîé ðàáîòå ñóáëèíèÿ ÝÑÊ ìûøè,
íåñóùàÿ ãåí ëþöèôåðàçû ïîä E2F1-÷óâñòâèòåëüíûì ïðîìîòîðîì
ìîæåò áûòü èñïîëüçîâàíà â äàëüíåéøèõ èññëåäîâàíèÿõ
ïðîëèôåðàöèè ÝÑÊ ìûøè.
Ìàòåðèàëû äèññåðòàöèè ìîãóò áûòü èñïîëüçîâàíû â
-5-
êà÷åñòâå èëëþñòðàòèâíûõ ìàòåðèàëîâ â ó÷åáíûõ ëåêöèîííûõ
êóðñàõ ïî êëåòî÷íîé áèîëîãèè.
Àïðîáàöèÿ ðàáîòû
Ïî òåìå äèññåðòàöèè îïóáëèêîâàíî 3 ñòàòüè è ñäåëàíî 4
ñîîáùåíèÿ íà ìåæäóíàðîäíûõ êîíôåðåíöèÿõ. Îñíîâíûå
ïîëîæåíèÿ äèññåðòàöèè áûëè äîëîæåíû è îáñóæäàëèñü íà íàó÷íûõ
ñåìèíàðàõ Èíñòèòóòà öèòîëîãèè ÐÀÍ.
Ôèíàíñîâàÿ ïîääåðæêà ðàáîòû
Ðàáîòà âûïîëíåíà ïðè ñîäåéñòâèè Ðîññèéñêîãî Ôîíäà
Ôóíäàìåíòàëüíûõ èññëåäîâàíèé (ïðîåêòû 03-04-49377 è 06-0449058); ïðîãðàììû Ïðåçèäèóìà ÐÀÍ “Ìîëåêóëÿðíàÿ è êëåòî÷íàÿ
áèîëîãèÿ”; ãðàíòà NATO 979190.
Îáú¸ì è ñòðóêòóðà äèññåðòàöèè
Äèññåðòàöèÿ ñîñòîèò èç ââåäåíèÿ, îáçîðà ëèòåðàòóðû,
îïèñàíèÿ ìàòåðèàëîâ è ìåòîäîâ, ðåçóëüòàòîâ, îáñóæäåíèÿ,
çàêëþ÷åíèÿ, âûâîäîâ è ñïèñêà öèòèðóåìîé ëèòåðàòóðû. Ìàòåðèàëû
äèññåðòàöèè èçëîæåíû íà 120 ñòðàíèöàõ ìàøèíîïèñíîãî òåêñòà è
èëëþñòðèðîâàíû 34 ðèñóíêàìè.
ÌÀÒÅÐÈÀË È ÌÅÒÎÄÈÊÀ
Êëåòî÷íûå ëèíèè, èõ êóëüòèâèðîâàíèå è îáðàáîòêà.  ðàáîòå
èñïîëüçîâàëèñü ÝÑÊ ìûøè ëèíèé IOUD2 è E 14.1. Ëèíèÿ IOUD2
áûëà ëþáåçíî ïðåäîñòàâëåíà Ï.Ñàâàòüåðîì (Ëèîí, Ôðàíöèÿ),
ëèíèÿ E 14.1 - À.Íîðäõàéìîì (Òþáèíãåí, Ãåðìàíèÿ). Êëåòêè
êóëüòèâèðîâàëè â ñðåäå DMEM (Gibco BRL, ÑØÀ) ñ äîáàâëåíèåì
10 % FCS (PAA, Àâñòðèÿ) è ôàêòîðà LIF (Sigma, ÑØÀ) â
êîíöåíòðàöèè 25 åä/ìë íà ïëàñòèêîâûõ ÷àøêàõ Ïåòðè (Corning,
ÑØÀ), ïîêðûòûõ 0.2 %-íûì ðàñòâîðîì æåëàòèíà. Ñûâîðîòî÷íîå
ãîëîäàíèå ïðîâîäèëè, êóëüòèâèðóÿ êëåòêè â ñðåäå, ñîäåðæàùåé 0.1
% FCS áåç ôàêòîðà LIF. Èñïîëüçîâàëè èíãèáèòîðû êèíàç: PD98059
(50 ìêÌ), SB203580 (20 ìêÌ), SP600125 (10ìêÌ), ðîñêîâèòèí
(10ìêÌ), LY294002 (40 ìêÌ) (Calbiochem, Ãåðìàíèÿ).
Äëÿ èíäóêöèè äèôôåðåíöèðîâêè êëåòêè ðàññåâàëè â ñðåäå,
íå ñîäåðæàùåé LIF, íà ñëåäóþùèé äåíü äîáàâëÿëè 1 ìêÌ
ðåòèíîåâîé êèñëîòû (All-trans retinoic acid, Sigma, ÑØÀ), è
êóëüòèâèðîâàëè 2 ñóò. Ïîñëå ýòîãî êëåòêè êóëüòèâèðîâàëè åùå 1
-6-
ñóò â ÷èñòîé (áåç ðåòèíîåâîé êèñëîòû) ñðåäå.
Ïîäñ÷åò êëåòîê. Êëåòêè âûñåâàëè â êîëè÷åñòâå 50 òûñ.
òðåõñàíòèìåòðîâûå ÷àøêè; êàæäóþ òî÷êó - â òð¸õ ïîâòîðíîñòÿõ.
Íà ñëåäóþùèé äåíü óñëîâèÿ êóëüòèâèðâîàíèÿ ìåíÿëè â
ñîîòâåòñòâèè ñ ýêïåðèìåíòîì. ×åðåç ñóòêè ïðîâîäèëè ïîäñ÷åò
êëåòîê â êàìåðå Ãîðÿåâà.
Îöåíêà æèçíåñïîñîáíîñòè ïîïóëÿöèé (ÌÒÒ-òåñò). Îöåíêó
æèçíåñïîñîáíîñòè ïîïóëÿöèè ïðîèçâîäèëè êîëîðèìåòðè÷åñêèì
ìåòîäîì ñ èñïîëüçîâàíèåì ìåòèëòèàçîëèëäèôåíèëòåòðàçîëèóìà
áðîìèäà (ÌÒÒ) (Sigma, ÑØÀ). Ìåòîä îñíîâàí íà òîì, ÷òî
ìèòîõîíäðèàëüíûå îêñèäîðåäóêòàçû (ïðåèìóùåñòâåííî
äåãèäðîãåíàçû) ñïîñîáíû âîññòàíàâëèâàòü æåëòûé ÌÒÒ äî
ïóðïóðíîãî ôîðìàçàíà, êîëè÷åñòâî êîòîðîãî çàòåì èçìåðÿþò
ñïåêòðîôîòîìåòðè÷åñêè. Ïîñêîëüêó ýòà ðåàêöèÿ ïðîèñõîäèò òîëüêî
â æèâûõ êëåòêàõ ñ àêòèâíûìè ìèòîõîíäðèàëüíûìè ôåðìåíòàìè,
êîëè÷åñòâî ôîðìàçàíà êîððåëèðóåò ñ ÷èñëîì æèâûõ êëåòîê â
ïîïóëÿöèè.  íàøèõ îïûòàõ êëåòêè ðàññåâàëè íà 96-ëóíî÷íóþ
ïëàòó, íà ñëåäóþùèé äåíü ìåíÿëè ñðåäó è äîáàâëÿëè LY294002 íà
1 ñóò. Ïîñëå ýòîãî ñðåäó óäàëÿëè, ê êëåòêàì äîáàâëÿëè 0.5 ìã/ìë
ÌÒÒ, ðàñòâîðåííîãî â PBS, è èíêóáèðîâàëè â òå÷åíèå 1 ÷ ïðè 37°Ñ
â àòìîñôåðå 7.5 % CO2. Îáðàçîâàâøèéñÿ îñàäîê ôîðìàçàíà
ðàñòâîðÿëè, äîáàâëÿÿ â ëóíêó ðàâíûé îáúåì 0.04 Ì HCl â
èçîïðîïàíîëå è òùàòåëüíî ïèïåòèðóÿ. Çàòåì èçìåðÿëè îïòè÷åñêóþ
ïëîòíîñòü îáðàçöîâ ïðè äëèíå âîëíû 570 íì îòíîñèòåëüíî ÷èñòîãî
ðàñòâîðà ÌÒÒ ñ äîáàâëåííûì â íåãî 0.04 Ì HCl â èçîïðîïàíîëå.
Ïðîòî÷íàÿ öèòîôëóîðèìåòðèÿ ÄÍÊ. Ðàñòóùóþ â ìîíîñëîå
êóëüòóðó êëåòîê ñíèìàëè ñ ÷àøåê ðàñòâîðîì Âåðñåíà,
öåíòðèôóãèðîâàëè 5 ìèí ïðè 1000 g, ðåñóñïåíäèðîâàëè â áóôåðå,
ñîäåðæàùåì 0.25Ì ñàõàðîçû è 40 mM öèòðàòà íàòðèÿ. Ïîñëå ýòîãî
ê ïðîáàì äîáàâëÿëè ëèçèðóþùèé áóôåð (0.5 % NP-40, 0.5 mM
ÝÄÒÀ, PBS), ñîäåðæàùèé 200 ìêã/ìë ÐÍÊàçû è 20 ìêã/ìë
èîäèñòîãî ïðîïèäèÿ, è èíêóáèðîâàëè 10 ìèíóò. Ïðîáû ïîäâåðãàëè
àíàëèçó íà ñîäåðæàíèå ÄÍÊ íà ïðîòî÷íîì öèòîìåòðå (Beckman
Coulter, ÑØÀ).
Ýëåêòðîôîðåç è èììóíîáëîòòèíã. Êëåòêè ïðîìûâàëè ôîñôàòíîñîëåâûì áóôåðîì (PBS), çàòåì ëèçèðîâàëè â áóôåðå PBS,
ñîäåðæàùåì 1 % NP-40, 0.5 % äåçîêñèõîëàòà íàòðèÿ, 0.1 % SDS,
èíãèáèòîðû ïðîòåàç è ôîñôàòàç ñ ïîñëåäóþùèì
öåíòðèôóãèðîâàíèåì. Êîëè÷åñòâî áåëêà â ïðîáàõ èçìåðÿëè ïî
-7-
ìåòîäó Áðýäôîðä, íà ôîðåç íàíîñèëè ðàâíîå êîëè÷åñòâî áåëêà â
êàæäîé ïðîáå. Ïîñëå äèñê-ýëåêòðîôîðåçà â ÏÀÀÃ â
äåíàòóðèðóþùèõ óñëîâèÿõ ïðîâîäèëè ïîëóñóõîé ýëåêòðîïåðåíîñ
áåëêîâ íà íèòðîöåëëþëîçíóþ èëè PVDF ìåìáðàíó (Amersham,
Âåëèêîáðèòàíèÿ). Äëÿ îêðàøèâàíèÿ àíòèòåëàìè ìåìáðàíó
èíêóáèðîâàëè ñíà÷àëà â áóôåðå PBS, ñîäåðæàùåì 0.05 % Tween20, 5 % îáåçæèðåííîãî ìîëîêà, à çàòåì â PBS, ñîäåðæàùåì 0.05 %
Tween-20, 1 % BSA, è ñîîòâåòñòâóþùèå ïåðâûå àíòèòåëà. Â
êà÷åñòâå ïåðâûõ àíòèòåë èñïîëüçîâàëè àíòèòåëà ê
ôîñôîðèëèðîâàííîìó ïî Ser-473 áåëêó PKB/Akt (êàò. ¹ 9271), ê
ðàñùåïëåííîé ôîðìå êàñïàçû 3 (êàò. ¹ 9661) (Cell Signaling, ÑØÀ),
ê ôîñôîðèëèðîâàííîé (sc-7383) è òîòàëüíîé (sc-94) ôîðìå êèíàçû
Erk, öèêëèíó D1 (sc-717), öèêëèíó A (sc-751) è öèêëèíó E (sc-418),
ê cdk2 (sc-163), ê èíãèáèòîðó öèêëèí-êèíàçíûõ êîìïëåêñîâ p27kip
(sc-1641) (Santa Cruz Biotechnologies, ÑØÀ), áåëêó GAPDH (5G4,
HyTest, Ôèíëÿíäèÿ).  êà÷åñòâå âòîðûõ àíòèòåë èñïîëüçîâàëè
àíòèòåëà êîçëà ïðîòèâ èììóíîãëîáóëèíîâ êðîëèêà èëè àíòèòåëà
êðîëèêà ïðîòèâ èììóíîãëîáóëèíîâ ìûøè, êîíúþãèðîâàííûå ñ
ïåðîêñèäàçîé õðåíà. Áåëêè âûÿâëÿëè ìåòîäîì óñèëåííîé
õåìèëþìèíèñöåíöèè (ECL, Amersham, Âåëèêîáðèòàíèÿ).
Ëþöèôåðàçíàÿ àêòèâíîñòü. Äëÿ èçó÷åíèÿ äèíàìèêè
òðàíñêðèïöèîííîé àêòèâíîñòè ôàêòîðîâ E2F1 êëåòêè ëèíèè
IUOD2 áûëè êîòðàíñôåöèðîâàíû ïëàçìèäàìè E2F1-luc, íåñóùåé
ãåí ëþöèôåðàçû ïîä E2F1-÷óâñòâèòåëüíûì ïðîìîòîðîì, è pBabepuro, êîäèðóþùåé ãåí óñòîé÷èâîñòè ê ïóðîìèöèíó. Òðàíñôåêöèþ
ïðîâîäèëè ñ ïîìîùüþ ðåàãåíòà Ëèïîôåêòàìèí-2000 â
ñîîòâåòñòâèè ñ ðåêîìåíäàöèÿìè ïðîèçâîäèòåëÿ (Gibco, BRL).
Ïîëó÷åííûå â ðåçóëüòàòå ñåëåêöèè â ïðèñóòñòâèè ïóðîìèöèíà
êëîíû áûëè ñîáðàíû â ïîïóëÿöèþ è èñïîëüçîâàëèñü äëÿ àíàëèçà.
Òðàíñàêòèâàöèþ E2F1-luc îöåíèâàëè ïî ñòåïåíè ðàñùåïëåíèÿ
ñóáñòðàòà ëþöèôåðèíà ñ ïîìîùüþ ëþìèíîìåòðà TD-20/20 Turner
Design. Ðåçóëüòàòû íîðìèðîâàíû ïî êîëè÷åñòâó áåëêà.
In vitro aíàëèç àêòèâíîñòè êèíàç ïðîâîäèëè, èñïîëüçóÿ â êà÷åñòâå
ñóáñòðàòà äëÿ ôîñôîðèëèðîâàíèÿ ãèñòîí H1. Êëåòî÷íûå ëèçàòû
ïîëó÷àëè, èíêóáèðóÿ êëåòêè 45 ìèí íà ëüäó â ëèçèðóþùåì áóôåðå
(10 ìÌ Tris-HCl pH 7.4, 150 ìÌ NaCl, 0.5 % NP-40, 1 % Òðèòîíà
X-100, èíãèáèòîðû ïðîòåàç è ôîñôàòàç) ñ ïîñëåäóþùèì
öåíòðèôóãèðîâàíèåì. Äëÿ èììóíîïðåöèïèòàöèè èíêóáèðîâàëè
500 - 1000 ìêã áåëêà ñ 5 ìêë àíòèòåë ê öèêëèíó Å (sc-418) èëè cdk2
-8-
(sc-163) (Santa Cruz) â òå÷åíèå 2-4 ÷ ïðè 4îÑ, çàòåì ïîëó÷åííûå
êîìïëåêñû îñàæäàëè, èíêóáèðóÿ ñ ïðîòåèí À-ñåôàðîçîé 30-60 ìèí
ïðè 4 îÑ ñ ïîñëåäóþùèì öåíòðèôóãèðîâàíèåì. Îñàäîê
èñïîëüçîâàëè â êèíàçíîé ðåàêöèè, ïðîâîäèìîé â áóôåðå
ñîäåðæàùåì 20 ìÌ HEPES pH 7.9, 20 ìM MgCl2, 2 ìM MnCl2, 1
ìM äèòèîòðåèòîëà, 25 ìêÌ íåìå÷åíîãî ÀÒÔ, 74 êÁê [ã-32P]ÀÒÔ è
1 ìêã ãèñòîíà Í1. Ðåàêöèþ ïðîâîäèëè 20 ìèí ïðè 30 îÑ è
îñòàíàâëèâàëè äîáàâëåíèåì áóôåðà Ëýìëè äëÿ íàíåñåíèÿ ïðîá.
Ïðîáû êèïÿòèëè 5 ìèí, ïîñëå ýëåêòðîôîðåçà ãåëü ñóøèëè è
ýêñïîíèðîâàëè ïåðåä ðåíòãåíîâñêîé ïëåíêîé.
Îöåíêà àññîöèèðîâàííîé ñî ñòàðåíèåì àêòèâíîñòè áåòàãàëàêòîçèäàçû. Êëåòêè ïðîìûâàëè áóôåðîì PBS, ôèêñèðîâàëè
ïðè êîìíàòíîé òåìïåðàòóðå â PBS, ñîäåäðæàùåì 0.5 %
ãëóòàðàëüäåãèäà è 2 % ôîðìàëüäåãèäà â òå÷åíèå 5 ìèí, çàòåì
ïðîìûâàëè PBS, pH = 7.2, ñîäåðæàùåì 1.0 ìM MgCl 2, è
èíêóáèðîâàëè â îêðàøèâàþùåì ðàñòâîðå íà 370Ñ â òå÷åíèå íî÷è.
Îêðàøèâàþùèé ðàñòâîð âêëþ÷àåò â ñåáÿ 1 ìã/ìë X-gal, 0.12 ìÌ
K3Fe(CN)6, 0.12 ìÌ K4Fe(CN)6, 1.0 ìÌ MgCl2, ðàñòâîðåííûõ â PBS
pH = 6.0.
ÐÅÇÓËÜÒÀÒÛ È ÎÁÑÓÆÄÅÍÈÅ
1. Àíàëèç ðàñïðåäåëåíèÿ ÝÑÊ ìûøè ïî ôàçàì êëåòî÷íîãî
öèêëà â óñëîâèÿõ èíàêòèâàöèè ñèãíàëüíûõ êàñêàäîâ,
çàâèñèìûõ îò MAP-êèíàç è PI3-êèíàçû.
ÝÑÊ ìûøè ïðîëèôåðèðóþò ñ âûñîêîé ñêîðîñòüþ (âðåìÿ
óäâîåíèÿ ïîïóëÿöèè ñîñòàâëÿåò 10 - 12 ÷àñîâ), î÷åíü áûñòðî
ïðîõîäÿò ôàçó G1 è, â îòëè÷èå îò ôèáðîáëàñòîâ, íå âûõîäÿò èç
êëåòî÷íîãî öèêëà â ôàçó ïîêîÿ G0 ïðè óäàëåíèè ðîñòîâûõ ôàêòîðîâ
èç ñðåäû êóëüòèâèðîâàíèÿ (Schratt et al., 2001). Ìîëåêóëÿðíûå
ìåõàíèçìû, îáóñëîâëèâàþùèå àâòîíîìíîñòü ïðîëèôåðàöèè ÝÑÊ
ìûøè îò ðîñòîâûõ ôàêòîðîâ, ïîêà åù¸ ìàëî èçó÷åíû. Âåðîÿòíî,
ýòèõ êëåòêàõ ñèãíàëüíûå êàñêàäû, íåîáõîäèìûå äëÿ ïåðåõîäà G1/
S, íå íóæäàþòñÿ â ñòèìóëÿöèè ýêçîãåííûìè ôàêòîðàìè, â
ðåçóëüòàòå ÷åãî ÝÑÊ ïîñòîÿííî êîììèòèðîâàíû ê ïðîëèôåðàöèè.
Èç èññëåäîâàíèé íà ôèáðîáëàñòàõ èçâåñòíî, ÷òî äëÿ
èíèöèàöèè ïðîäâèæåíèÿ ïî ôàçå G1 è ïåðåõîäà â ôàçó ñèíòåçà
ÄÍÊ êëåòêå íåîáõîäèìà ïîñëåäîâàòåëüíàÿ àêòèâàöèÿ ðîñòîâûìè
ôàêòîðàìè ñèãíàëüíûõ êàñêàäîâ, îïîñðåäîâàííûõ êèíàçàìè Erk è
PI3K (Jones et al., 1999; Jones, Kazlauskas, 2001). Â ñâÿçè ñ ýòèì
-9-
Ðèñ. 1. Âëèÿíèå ñûâîðîòêè íà óðîâåíü
ôîñôîðèëèðîâàíèÿ êèíàç Erk è PKB/Akt â
ÝÑÊ ìûøè. 10 % FCS - íîðìàëüíûå óñëîâèÿ
êóëüòèâèðîâàíèÿ, 0.1 % FCS –
ñûâîðîòî÷íîå ãîëîäàíèå â òå÷åíèå ñóòîê,
0.1 % +FCS – ñòèìóëÿöèÿ 15 % ñûâîðîòêè
â òå÷åíèå 15 ìèí ïîñëå ñûâîðîò÷íîãî
ãîëîäàíèÿ.
FCS
10% 0.1% 0.1% + FCS
pErk
Erk
pPKB
GAPDH
èíòåðåñíî áûëî âûÿñíèòü, ÷óâñòâèòåëüíû ëè äàííûå êàñêàäû ê
ñîäåðæàíèþ ñûâîðîòêè â ñðåäå êóëüòèâèðîâàíèÿ â ÝÑÊ ìûøè.
Ïðîâåäåííûé Âåñòåðí-áëîò àíàëèç ñîäåðæàíèÿ
ôîñôîðèëèðîâàííûõ (òî åñòü, àêòèâíûõ) ôîðì êèíàç Erk è PKB/
Akt (êîòîðûå ÿâëÿþòñÿ êëþ÷åâûìè çâåíüÿìè Erk- è PI3Kçàâèñèìûõ êàñêàäîâ ñîîòâåòñòâåííî) ïîêàçàë, ÷òî ïðè íèçêîì
ñîäåðæàíèè ñûâîðîòêè (0.1 %) êîëè÷åñòâî ôîñôîðèëèðîâàííûõ
êèíàç Erk è PKB/Akt ñíèæàåòñÿ, à ïîñëåäóþùàÿ ñûâîðîòî÷íàÿ
ñòèìóëÿöèÿ çíà÷èòåëüíî àêòèâèðóåò êàê Erk-, òàê è PI3K-çàâèñèìûå
êàñêàäû â ÝÑÊ ìûøè. Ñëåäóåò îòìåòèòü, ÷òî ïðè ñûâîðîòî÷íîì
ãîëîäàíèè ôîñôîðèëèðîâàííûå ôîðìû êèíàç íå èñ÷åçàþò
ïîëíîñòüþ (ðèñ.1).
Äëÿ òîãî ÷òîáû âûÿñíèòü ó÷àñòèå PI3K-çàâèñèìîãî è MAPêèíàçíûõ êàñêàäîâ â ðåãóëÿöèè ïðîëèôåðàöèè ÝÑÊ, êëåòêè
êóëüòèâèðîâàëè â òå÷åíèå ñóòîê ñ èíãèáèòîðàìè êëþ÷åâûõ êèíàç
ýòèõ êàñêàäîâ, à çàòåì ìåòîäîì ïðîòî÷íîé öèòîôëóîðèìåòðèè
ïðîâîäèëè àíàëèç êëåòî÷íîãî öèêëà. Áûëè èñïîëüçîâàíû
èíãèáèòîðû êèíàç PI3K (LY294002), MEK1/Erk (PD98059), p38
(SB203580) è JNK (SP600125). Íà ðèñóíêå 2 âèäíî, ÷òî, â òî âðåìÿ
êàê èíãèáèòîðû MAP-êèíàç è ñûâîðîòî÷íîå ãîëîäàíèå íå âëèÿëè
íà ðàñïðåäåëåíèå ÝÑÊ ïî ôàçàì êëåòî÷íîãî öèêëà, èíãèáèòîð PI3G1
S
G2
G1/S
ñîîòíîøåíèå
Êîíòðîëü
21%
69 %
10%
0.3
PD98059
21 %
65 %
14 %
0.3
SB203580
20 %
68 %
12 %
0.3
SP600125
19 %
62 %
19 %
0.3
LY294002
32 %
54 %
14 %
0.6
Ãîëîäàíèå
19 %
67 %
14 %
0.3
-10-
Ðèñ. 2. Ðàñïðåäåëåíèå
ÝÑÊ
ïî
ôàçàì
êëåòî÷íîãî öèêëà
ïîñëå 24 ÷ èíêóáàöèè
ñ èíãèáèòîðàìè MAP
êèíàç
MEK1/Erk
(PD98059),
p38
(SB203580),
JNK
(SP600125), PI3K
(LY294002)
è
ñûâîðîòî÷íîãî
ãîëîäàíèÿ.
êèíàçû LY294002 âûçâàë çàìåòíîå ñíèæåíèå ñîäåðæàíèÿ êëåòîê
â ôàçå S è íàêîïëåíèå â ôàçå G1, óâåëè÷èâàÿ ñîîòíîøåíèå ôàç G1/
S ñ 0.3 äî 0.6.
 ìèòîòè÷åñêîì öèêëå ÝÑÊ ìûøè ôàçà G1 çíà÷èòåëüíî
êîðî÷å, ÷åì ó ôèáðîáëàñòîâ. Âåðîÿòíî, ó íèõ ðåäóöèðîâàíà ïåðâàÿ
÷àñòü ôàçû G1 è, ñîîòâåòñòâåííî, îòñóòñòâóåò çàâèñèìîñòü
ïðîëèôåðàöèè îò ðîñòîâûõ ôàêòîðîâ ñûâîðîòêè è àêòèâíîñòè
MEK/Erk êàñêàäà. Íåîáõîäèìîñòü æå àêòèâíîñòè PI3Kçàâèñèìîãî êàñêàäà äëÿ G1/S ïåðåõîäà â ÝÑÊ, âîçìîæíî,
ñîõðàíÿåòñÿ. Ýòî ïðåäïîëîæåíèå ïîäêðåïëÿåòñÿ äàííûìè î
ñóùåñòâîâàíèè ÝÑÊ-ñïåöèôè÷íîãî êîíñòèòóòèâíî-àêòèâíîãî
áåëêà Eras, êîòîðûé èç âñåõ âîçìîæíûõ ìèøåíåé àêòèâèðóåò
ïðåèìóùåñòâåííî èìåííî PI3K è ïîëîæèòåëüíî ðåãóëèðóåò
ñêîðîñòü ïðîëèôåðàöèè; à òàêæå äàííûìè î òîì, ÷òî ÝÑÊ, â
êîòîðûõ àêòèâíîñòü PI3K-çàâèñèìîãî êàñêàäà óñèëåíà â ðåçóëüòàòå
äåëåöèè ãåíà ôîñôàòàçû PTEN ðàñòóò ãîðàçäî áûñòðåå, ÷åì ÝÑÊ
äèêîãî òèïà (Takahashi et al., 2003; Sun et al., 1999).
2. Àíàëèç ðàñïðåäåëåíèÿ ÝÑÊ ìûøè ïî ôàçàì êëåòî÷íîãî
öèêëà ïðè ñî÷åòàíèè ñûâîðîòî÷íîãî ãîëîäàíèÿ è èíàêòèâàöèè
PI3K-çàâèñèìîãî ñèãíàëüíîãî êàñêàäà.
Áûëî îáíàðóæåíî, ÷òî ïðè îáðàáîòêå ÝÑÊ ìûøè
èíãèáèòîðîì PI3-êèíàçû LY294002 â óñëîâèÿõ ñûâîðîòî÷íîãî
ãîëîäàíèÿ àíòèïðîëèôåðàòèâíûé ýôôåêò èíãèáèòîðà çíà÷èòåëüíî
óñèëèâàåòñÿ: áîëåå ïîëîâèíû ïîïóëÿöèè íàêàïëèâàåòñÿ â ôàçå G1,
ñîäåðæàíèå êëåòîê â ôàçå S ñíèæàåòñÿ äî 27 % (ðèñ. 3À).
Êèíàçà PKB/Akt - êëþ÷åâîé ó÷àñòíèê PI3K-çàâèñèìîãî
êàñêàäà, ïî óðîâíþ ôîñôîðèëèðîâàíèÿ PKB/Akt ìîæíî ñóäèòü îá
àêòèâíîñòè äàííîãî ñèãíàëüíîãî ïóòè. Íà ðèñóíêå 3Á âèäíî, ÷òî
êàê â íîðìàëüíûõ óñëîâèÿõ, òàê è ïðè ñûâîðîòî÷íîì ãîëîäàíèè
îáðàáîòêà ÝÑÊ LY294002 ïðèâîäèò ê çíà÷èòåëüíîé èíàêòèâàöèè
â íèõ ñèãíàëüíîãî ïóòè PI3K-PKB/Akt.Òî åñòü, íàáëþäàåìîå íà
ðèñ. 3À ðàçëè÷èå àíòèïðîëèôåðàòèâíîãî ýôôåêòà LY294002 â
íîðìàëüíûõ è áåññûâîðîòî÷íûõ óñëîâèÿõ îáóñëîâëåíî íå
ðàçíèöåé â ñòåïåíè èíàêòèâàöèè PI3-êèíàçû, à ñêîðåå íàëè÷èåì
èëè îòñóòñòâèåì äîïîëíèòåëüíûõ ìèòîãåííûõ ñèãíàëîâ îò
êîìïîíåíòîâ ñûâîðîòêè.
-11-
LY294002
êîíòðîëü
А
10 % FCS
G1: 16 %
G2-M: 16 %
S: 68 %
G1: 27 %
G2-M: 14 %
S: 59 %
êîíòðîëü
G1: 19 %
G2-M: 14 %
S: 67 %
Б
LY294002
0,1 % FCS
G1: 58 %
G2-M: 15 %
S: 27 %
10% FCS 0,1% FCS
-- LY -- LY êîíòð
pPKB/Akt
Ðèñ.
3.
Âëèÿíèå
ïðèñóòñòâèÿ ñûâîðîòêè â
ñðåäå êóëüòèâèðîâàíèÿ
íà äåéñòâèå LY294002.
À - Ðàñïðåäåëåíèå ïî
ôàçàì êëåòî÷íîãî öèêëà
ÝÑÊ, îáðàáîòàííûõ
LY294002 â íîðìàëüíûõ
óñëîâèÿõ
è
ïðè
ñ û âî ð îòî÷ í îì
ãîëîäàíèè.
Á
–
óðîâåíü
ô î ñ ô î ðë è ð è ð î âà í è ÿ
êèíàçû PKB/Akt â
êëåòêàõ, îáðàáîòàííûõ
LY294002 â íîðìàëüíûõ
óñëîâèÿõ
è
ïðè
ñ û âî ð îòî÷ í îì
ãîëîäàíèè.
GAPDH
3.Âëèÿíèå ñûâîðîòî÷íîãî ãîëîäàíèÿ è îáðàáîòêè LY294002 íà
ñîäåðæàíèå è àêòèâíîñòü áåëêîâ, ðåãóëèðóþùèõ G1/S ïåðåõîä
â ÝÑÊ ìûøè.
Äëÿ ïåðåõîäà èç ôàçû G1 â ôàçó S êëåòêàì íåîáõîäèìà
àêòèâíîñòü òðàíñêðèïöèîííîãî ôàêòîðà E2F1.  íà÷àëå ôàçû G1
ôàêòîðû E2F1 íàõîäÿòñÿ â êîìïëåêñàõ ñ áåëêàìè ñåìåéñòâà Rb,
îñòàâàÿñü íåàêòèâíûìè. Âî âðåìÿ ôàçû G1 ïðîèñõîäèò
ìíîæåñòâåííîå (ãèïåð-) ôîñôîðèëèðîâàíèå áåëêîâ Rb
êîìïëåêñàìè öèêëèí D/cdk4,6, öèêëèí Å/cdk2. Â ðåçóëüòàòå
ôàêòîðû E2F1 âûñâîáîæäàþòñÿ, è ñòàíîâÿòñÿ ñïîñîáíû
àêòèâèðîâàòü òðàíñêðèïöèþ ãåíîâ, íåîáõîäèìûõ äëÿ ñèíòåçà ÄÍÊ.
Ïðè ñûâîðîòî÷íîì ãîëîäàíèè â ôèáðîáëàñòàõ öèêëèí-êèíàçíûå
êîìïëåêñû è ôàêòîð E2F1 îñòàþòñÿ íåàêòèâíûìè, âñëåäñòâèå ýòîãî
êëåòêè âûõîäÿò èç öèêëèðîâàíèÿ â ôàçó ïîêîÿ G0.
 ÝÑÊ ìûøè ñûâîðîòî÷íîå ãîëîäàíèå íå ñíèæàåò
àêòèâíîñòè cdk2- è öèêëèí Å-ñîäåðæàùèõ êîìïëåêñîâ, â òî âðåìÿ
êàê LY294002 ïðèâîäèò ê ñóùåñòâåííîìó ñíèæåíèþ èõ êèíàçíîé
àêòèâíîñòè (ðèñ. 4À). Î÷åâèäíî, ÷òî ñíèæåíèå àêòèâíîñòè
ïðîèñõîäèò èç-çà óìåíüøåíèÿ îáùåãî ÷èñëà êîìïëåêñîâ cdk2/
-12-
öèêëèí Å â LY294002-îáðàáîòàííûõ êëåòêàõ. Íà ðèñóíêå 4Á âèäíî,
÷òî êîëè÷åñòâî áåëêîâ-êîìïîíåíòîâ ýòèõ êîìïëåêñîâ - öèêëèíîâ
Å, À, è cdk2 ïîñëå îáðàáîòêè LY294002 óìåíüøàåòñÿ. Êðîìå òîãî,
â ðåçóëüòàòå îáðàáîòêè LY294002 ñíèæàåòñÿ ñîäåðæàíèå öèêëèíà
D1, íî êîëè÷åñòâî êèíàçû cdk4 íå èçìåíÿåòñÿ (ðèñ. 4Á). Èçâåñòíî,
÷òî â ôèáðîáëàñòàõ àíòèïðîëèôåðàòèâíûé ýôôåêò èíãèáèòîðîâ
PI3-êèíàçû îïîñðåäîâàí áåëêîì p27kip - èíãèáèòîðîì öèêëèíêèíàçíûõ êîìïëåêñîâ, êîëè÷åñòâî êîòîðîãî âîçðàñòàåò ïðè
èíàêòèâàöèè PI3Ê (Collado et al., 2000). Â ÝÑÊ, îáðàáîòàííûõ
LY294002, ïàäåíèå àêòèâíîñòè öèêëèí-êèíàçíûõ êîìïëåêñîâ è
îñòàíîâêà â ôàçå G1 íå ñîïðîâîæäàþòñÿ íàêîïëåíèåì p27kip, è
ïðîèñõîäÿò, ïî-âèäèìîìó, ïî p27kip -íåçàâèñèìîìó ìåõàíèçìó (ðèñ.
4Á).
Èçâåñòíî, ÷òî â ÝÑÊ áåëîê Rb íàõîäèòñÿ ïîñòîÿííî â
ãèïåðôîñôîðèëèðîâàííîé ôîðìå, è ôàêòîð E2F1 àêòèâåí
FCS
À
Á
10 %
0.1 %
— LY — LY
FCS
HH1
IP: cyE
HH1
IP: cdk2
10 % 0.1 %
— LY — LY
FCS
cdk4
10 % 0.1 %
— LY — LY êîíòð
p27
cdk2
GAPDH
cyA
cyD1
GAPDH
cyE
GAPDH
Ðèñ. 4. Âëèÿíèå LY294002 è ñûâîðîòî÷íîãî ãîëîäàíèÿ íà ýêñïðåññèþ è
àêòèâíîñòü ìîëåêóë, ðåãóëèðóþùèõ ïåðåõîä G1/S. À – in vitro àíàëèç
àêòèâíîñòè êèíàç,àññîöèèðîâàííûõ ñ öèêëèíîì Å è cdk2. Á –
èììóíîáëîòèíã áåëêîâ cdk4, cdk2, öèêëèí À, öèêëèí D1, öèêëèí Å, p27,
â êà÷åñòâå êîíòðîëÿ íàãðóçêè – GAPDH.
-13-
Àêòèâíîñòü
ëþöèôåðàçû, îòí.åä.
25
20
15
10
5
0
10 %
0.1 %
êîíòðîëü
10 %
0.1 % FCS
LY294002
Ðèñ.
5
Àêòèâíîñòü
òðàíñêðèïöèîííîãî
ôàêòîðà E2F1 â êëåòêàõ,
îáðàáîòàííûõ LY294002 â
íîðìàëüíûõ óñëîâèÿõ è
ïðè
ïîíèæåííîì
ñîäåðæàíèè ñûâîðîòêè.
ïîñòîÿííî, íåçàâèñèìî îò ôàçû êëåòî÷íîãî öèêëà (Savatier et al.,
1994; Stead et al., 2002). Ýòî, ïî-âèäèìîìó, ÿâëÿåòñÿ îñíîâîé
àâòîíîìíîñòè ïðîëèôåðàöèè ÝÑÊ îò âíåøíèõ ñèãíàëîâ. Äëÿ
àíàëèçà E2F1-çàâèñèìîé òðàíñêðèïöèè â êëåòêàõ,
êóëüòèâèðîâàííûõ â óñëîâèÿõ ñûâîðîòî÷íîãî ãîëîäàíèÿ èëè â
ïðèñóòñòâèè LY294002, íàìè áûëà ñîçäàíà ñóáëèíèÿ ÝÑÊ,
òðàíñôåöèðîâàííàÿ ðåïîðòåðíîé ïëàçìèäîé, êîäèðóþùåé ãåí
ëþöèôåðàçû ïîä E2F1-ðåãóëèðóåìûì ïðîìîòîðîì. Íà ðèñóíêå 5
âèäíî, ÷òî â ðåçóëüòàòå îáðàáîòêè êëåòîê LY294002
òðàíñêðèïöèîííàÿ àêòèâíîñòü ôàêòîðà E2F1 ñóùåñòâåííî
ñíèæàåòñÿ, îñîáåííî â óñëîâèÿõ ñûâîðîòî÷íîãî ãîëîäàíèÿ. Ýòî
ñîãëàñóåòñÿ
ñ
äàííûìè
ïðîòî÷íîé
öèòîìåòðèè,
ñâèäåòåëüñâóþùèìè î ìàêñèìàëüíîì ïîäàâëåíèè ïðîëèôåðàöèè
â ñëó÷àå ñî÷åòàíèÿ îáðàáîòêè êëåòîê LY294002 ñ ñûâîðîòî÷íûì
ãîëîäàíèåì (ðèñ. 3À) Ñûâîðîòî÷íîå ãîëîäàíèå ñàìî ïî ñåáå òàêæå
ïðèâîäèò ê íåêîòîðîìó ñíèæåíèþ àêòèâíîñòè E2F1, êîòîðîå,
âåðîÿòíî, íåäîñòàòî÷íî äëÿ ïðåäîòâðàùåíèÿ ïåðåõîäà G1/S
ïåðåõîäà, òàê êàê â áåññûâîðîòî÷íîé ñðåäå ÝÑÊ ïðîäîëæàþò
ïðîëèôåðèðîâàòü íà âûñîêîì óðîâíå (ðèñ. 2, 3).
А
Á
0,8
0,7
0,6
10% FCS
0,5
0,4
0.1% FCS
— LY — LY
0,3
0,2
Ðàñùåïëåííàÿ êàñïàçà 3
0,1
0
êîíòðîëü LY294002
10 % FCS
êîíòðîëü LY294002
0.1 % FCS
Ðèñ. 6. Âëèÿíèå LY294002 íà ðîñò ïîïóëÿöèè è ãèáåëü ÝÑÊ. À – ÌÒÒòåñò, îòðàæàþùèé ÷èñëåííîñòü ïîïóëÿöèé ÝÑÊ, êóëüòèâèðóåìûõ â
óñëîâèÿõ ñûâîðîòî÷íîãî ãîëîäàíèÿ è â ïðèñóòñòâèè 40 ìêÌ LY294002.
Á – èììóíîáëîò íà àêòèâíóþ ôîðìó êàñïàçû 3.
-14-
4. Àíàëèç âëèÿíèÿ èíãèáèòîðà PI3K LY294002 íà ÷èñëåííîñòü
ïîïóëÿöèè ÝÑÊ, âûæèâàíèå è ñòàðåíèå êëåòîê.
Ðîëü PI3K-çàâèñèìîãî êàñêàäà êàê íåîáõîäèìîãî äëÿ
âûæèâàíèÿ èçâåñòíà äëÿ êëåòîê ðàçíûõ òèïîâ (Downward, 2004).
Äëÿ îöåíêè æèçíåñïîñîáíîñòè ÝÑÊ, îáðàáîòàííûõ èíãèáèòîðîì
PI3-êèíàçû, áûë ïðèìåíåí ÌÒÒ-òåñò, âûÿâëÿþùèé æèâûå êëåòêè
ïî àêòèâíîñòè ìèòîõîíäðèàëüíûõ ôåðìåíòîâ. Ïîëó÷åííûå äàííûå
ïðåäñòàâëåíû íà ðèñóíêå 6À. Îáðàáîòêà ÝÑÊ LY294002 ñîêðàùàåò
÷èñëî æèâûõ êëåòîê áîëåå ÷åì â äâà ðàçà ïî ñðàâíåíèþ ñ
êîíòðîëüíîé, íåîáðàáîòàííîé èíãèáèòîðîì ïîïóëÿöèåé. Òàêèì
îáðàçîì, æèçíåñïîñîáíîñòü ïîïóëÿöèè ÝÑÊ â ðåçóëüòàòå
îáðàáîòêè LY294002 ñíèæàåòñÿ, ïðè÷åì íåãàòèâíûé ýôôåêò
ïðîÿâëÿåòñÿ êàê â íîðìàëüíûõ, òàê è â áåññûâîðîòî÷íûõ óñëîâèÿõ
êóëüòèâèðîâàíèÿ, íî â ïðèñóòñòâèè ñûâîðîòêè ýôôåêò èíãèáèòîðà
âûðàæåí ñëàáåå. Ñëåäóåò îòìåòèòü, ÷òî ñûâîðîòî÷íîå ãîëîäàíèå
ñàìî ïî ñåáå ïðèâîäèò ê ñîêðàùåíèþ ÷èñëåííîñòè ïîïóëÿöèè ÝÑÊ
(ðèñ.6À).
Íàáëþäàåìîå ñîêðàùåíèå ÷èñëåííîñòè ïîïóëÿöèè âûçâàíî
ñêîðåå âñåãî äâóìÿ ïðè÷èíàìè: çàòðóäíåíèåì ïåðåõîäà G1/S (ðèñ.
2 è 3À) è èíäóêöèåé àïîïòîòè÷åñêîé ãèáåëè êëåòîê (ðèñ. 6Á). Îá
èíäóêöèè àïîïòîçà â ÝÑÊ ñóäèëè ïî íàêîïëåíèþ â êëåòêàõ
ðàñùåïë¸ííîé (àêòèâíîé) ôîðìû êàñïàçû 3.
Çàìåäëåíèå è îñòàíîâêà ïðîëèôåðàöèè - îäèí èç ïðèçíàêîâ
ñòàðåíèÿ êëåòîê (Campisi, 2001). Â ñâÿçè ñ ýòèì ìû ïðîâåðèëè, íå
Ôàçîâûé
êîíòðàñò
Ïðîõîäÿùèé ñâåò
10 % FCS
Êîíòðîëü
0.1 % FCS
+ LY294002
Äèôôåðåíöèðîâàííûå
êëåòêè
Ðèñ. 7. Âûÿâëåíèå àññîöèèðîâàííîé ñî ñòàðåíèåì êëåòîê àêòèâíîñòè
áåòà-ãàëàêòîçèäàçû. Êîíòðîëü – íåäèôôåðåíöèðîâàííûå ÝÑÊ,
êóëüòèâèðîâàííûå â íîðìàëüíûõ óñëîâèÿõ, 0.1 FCS+LY294002 – ÝÑÊ,
îáðàáîòàííûå LY294002 â óñëîâèÿõ ñûâîðîòî÷íîãî ãîëîäàíèÿ.
Äèôôåðåíöèðîâàííûå â òå÷åíèå 1 ìåñÿöà êëåòêè èñïîëüçîâàíû â
êà÷åñòâå ïîëîæèòåëüíîãî êîíòðîëÿ.
-15-
A
S
G2
G1/S
ñîîòí.
10%
18 %
70 %
12 %
0.3
10% +Rosc
26 %
64 %
10 %
0.4
0,1%
22 %
63 %
15 %
0.3
0,1% +Rosc
39 %
38 %
23 %
1.0
0,1%
+Rosc+IGF1
35 %
45 %
18 %
0.8
ðîñêîâ.
êîíòðîëü
Àêòèâíîñòü ëþöèôåðàçû, îòí.åä.
Á
G1
Ðèñ. 8. Âëèÿíèå
ðîñêîâèòèíà íà
ðàñïðåäåëåíèå
ÝÑÊ ïî ôàçàì
êëåòî÷íîãî öèêëà
(À) è àêòèâíîñòü
òðàíñêðèïöèîííîãî
ôàêòîðà E2F1 (Á).
25
20
15
10
5
0
êîíòðîëü
10 % FCS
ðîñêîâ.
0.1 % FCS
âûçûâàåò ëè ñòàðåíèÿ îáðàáîòêà êëåòîê LY294002 â óñëîâèÿõ
ñûâîðîòî÷íîãî ãîëîäàíèÿ. Áûë ïðîâåäåí àíàëèç àññîöèèðîâàííîé
ñî ñòàðåíèåì àêòèâíîñòè áåòà-ãàëàêòîçèäàçû (senescence-associated beta-galactosidase activity, SA-beta-Gal). Ðåçóëüòàòû
ïðåäñòàâëåíû íà ðèñóíêå 7. Âèäíî, ÷òî â ÝÑÊ, îáðàáîòàííûõ
LY294002 â óñëîâèÿõ íèçêîé ñûâîðîòêè, äåìîíñòðèðóþùèõ
ñóùåñòâåííîå íàêîïëåíèå â ôàçå G1, öèòîïëàçìàòè÷åñêîé
àêòèâíîñòè áåòà-ãàëàêòîçèäàçû íå íàáëþäàåòñÿ. Êðîìå òîãî, âèäíî,
÷òî ýòè êëåòêè âûãëÿäÿò àïîïòîòèðóþùèìè.  êà÷åñòâå
ïîëîæèòåëüíîãî êîíòðîëÿ äëÿ SA-beta-Gal áûëè èñïîëüçîâàíû
ÝÑÊ, äèôôåðåíöèðîâàííûå ñ ïîìîùüþ ðåòèíîåâîé êèñëîòû â
òå÷åíèå ìåñÿöà.
5. Èíàêòèâàöèÿ cdk2 â óñëîâèÿõ ñûâîðîòî÷íîãî ãîëîäàíèÿ
âûçûâàåò íàêîïëåíèå ÝÑÊ ìûøè â ôàçå G1
Ïîñêîëüêó â ÝÑÊ, îáðàáîòàííûõ LY294002, íàêîïëåíèå
êëåòîê â ôàçå G1 êîððåëèðóåò ñî ñíèæåíèåì êîëè÷åñòâà è
àêòèâíîñòè êèíàçû cdk2 (ðèñ. 4), áûëî ïðîâåðåíî, ÿâëÿåòñÿ ëè
èíàêòèâàöèÿ cdk2 ïðè÷èíîé îñòàíîâêè êëåòîê â ôàçå G1. Äëÿ ýòîãî
áûëî ïðîàíàëèçèðîâàíî ðàñïðåäåëåíèå ïî ôàçàì êëåòî÷íîãî öèêëà
ÝÑÊ, îáðàáîòàííûõ ñïåöèôè÷åñêèì èíãèáèòîðîì êèíàç cdk2 è
cdc2 ðîñêîâèòèíîì (ðèñ. 8À). Îêàçàëîñü, ÷òî â ïðèñóòñòâèè
ñûâîðîòêè ðîñêîâèòèí âûçûâàåò íåáîëüøèå èçìåíåíèÿ â
-16-
100
80
60
40
20
0
S
10
%
+L FC
Y S
–
FGF Forskolin IGF
LIF
EGF
FC
1%
0,
10
%
FC
S
× è ñ ë î êë å òî ê , %
A
Á
0,1 % FCS +LY
G2
G1/S
ñîîòíîøåíèå
70 %
11%
0.3
45 %
12 %
0.9
21 %
72 %
7%
0.3
0.1% +LY
51 %
35 %
14 %
1.4
0.1% +LY+LIF
49 %
35 %
16 %
1.4
0.1% +LY+IGF
50 %
34 %
16 %
1.5
G1
S
10%
19 %
10% +LY
43 %
0.1%
Ðèñ.
9.
Âëèÿíèå
îòäåëüíûõ ôàêòîðîâ íà
ýôôåêò LY294002.
A –
÷èñëåííîñòü
ïîïóëÿöèé
ÝÑÊ,
îáðàáîòàííûõ 20 ìêÌ
LY294002 24 ÷ â
ïðèñóòñòâèè ðàçëè÷íûõ
ôàêòîðîâ.
Á – ðàñïðåäåëåíèå ÝÑÊ
ïî ôàçàì êëåòî÷íîãî
öèêëà ïðè îáðàáîòêå
LY294002 â ïðèñóòñòâèè
IGF è LIF.
ðàñïðåäåëåíèè ÝÑÊ ïî ôàçàì öèêëà; îäíàêî â óñëîâèÿõ
ñûâîðîòî÷íîãî ãîëîäàíèÿ îí ñíèæàåò ñîäåðæàíèå êëåòîê â ôàçå S
äî 38 % ïî ñðàâíåíèþ ñ 70 % â êîíòðîëå, à ñîäåðæàíèå êëåòîê â
ôàçàõ G1 è G2 âîçðàñòàåò äî 39 % è 23 % ñîîòâåòñòâåííî.
Èçìåíåíèÿ òðàíñêðèïöèîííîé àêòèâíîñòè E2F1 ïðè
îáðàáîòêå ðîñêîâèòèíîì ñîîòâåòñòâóþò èçìåíåíèÿì â
ðàñïðåäåëåíèè êëåòîê ïî ôàçàì êëåòî÷íîãî öèêëà: çíà÷èòåëüíîå
ñíèæåíèå àêòèâíîñòè íàáëþäàåòñÿ â êëåòêàõ, îáðàáîòàííûõ
ðîñêîâèòèíîì â óñëîâèÿõ ñûâîðîòî÷íîãî ãîëîäàíèÿ (ðèñ. 8Á).
Âåðîÿòíî, â ÝÑÊ ìûøè ïåðåõîä G1/S ðåãóëèðóåòñÿ êàê êèíàçîé
cdk2, òàê è cdk2-íåçàâèñèìûìè ìåõàíèçìàìè, êîòîðûå ìîãóò áûòü
àêòèâèðîâàíû ðîñòîâûìè ôàêòîðàìè ñûâîðîòêè. Ïîýòîìó
çàìåòíîãî ñíèæåíèÿ êîëè÷åñòâà êëåòîê â ôàçå S ìîæíî äîáèòüñÿ
òîëüêî îäíîâðåìåííûì óäàëåíèåì ñûâîðîòêè è èíàêòèâàöèåé cdk2
ñ ïîìîùüþ ðîñêîâèòèíà.
Ðîñòîâîé ôàêòîð IGF1, êàê èçâåñòíî, àêòèâèðóåò PI3Kçàâèñèìûé êàñêàä. IGF-1 íåñêîëüêî ñãëàæèâàåò íåãàòèâíîå âëèÿíèå
ðîñêîâèòèíà íà G1/S ïåðåõîä ÝÑÊ ìûøè, íî âñ¸-òàêè íå òàê
ýôôåêòèâíî, êàê ñûâîðîòêà (ðèñ. 8À). Ýòî ïîçâîëÿåò ïðåäïîëîæèòü,
÷òî ñòèìóëèðóþùåå G1/S ïåðåõîä ÝÑÊ ìûøè äåéñòâèå PI3K
êàñêàäà îïîñðåäîâàíî cdk2-ñîäåðæàùèìè êîìïëåêñàìè.
-17-
6. Ðîñòîâûå ôàêòîðû îñëàáëÿþò íåãàòèâíûé ýôôåêò
LY294002 íà ÷èñëåííîñòü ïîïóëÿöèè ÝÑÊ ìûøè.
Ïîñêîëüêó ïðè îáðàáîòêå ÝÑÊ LY294002 íàèáîëåå ñèëüíîå
ñîêðàùåíèå ÷èñëåííîñòè ïîïóëÿöèè (ðèñ.6À) è ñíèæåíèå äîëè
ôàçû S (ðèñ. 3À) ïîèñõîäèò â óñëîâèÿõ ñûâîðîòî÷íîãî ãîëîäàíèÿ,
ìîæíî ïðåäïîëîæèòü, ÷òî ñûâîðîòêà ñíàáæàåò ÝÑÊ ìèòîãåííûìè
èëè àíòèàïîïòîòè÷åñêèìè ñèãíàëàìè, óñòîé÷èâûìè ê äåéñòâèþ
äàííîãî àãåíòà.
×òîáû âûÿñíèòü, êàêèå èìåííî ôàêòîðû ñûâîðîòêè
ñïîñîáñòâóþò âûæèâàíèþ ïîïóëÿöèè ÝÑÊ â ïðèñóòñòâèè
LY294002, ìû ñðàâíèëè ÷èñëî êëåòîê â êîíòðîëüíûõ ïîïóëÿöèÿõ
(LY294002 â ñðåäå ñ 0.1 % FCS èëè ñ 10% FCS) è â ïîïóëÿöèÿõ,
îáðàáîòàííûõ LY294002 â óñëîâèÿõ ñûâîðîòî÷íîãî ãîëîäàíèÿ ñ
äîáàâëåíèåì îäíîãî èç ñëåäóþùèõ ôàêòîðîâ: EGF, IGF-1, FGF,
LIF, ôîðñêîëèí (ðèñ. 9À). ×èñëî êëåòîê áûëî âûøå â òîì ñëó÷àå,
êîãäà âìåñòå ñ LY294002 â ñðåäó äîáàâëÿëè ðîñòîâûå ôàêòîðû.
Ñàìûé ñèëüíûé “ñïàñàþùèé” ýôôåêò ïðîäåìîíñòðèðîâàëè
ôàêòîðû LIF è IGF-1. Òåì íå ìåíåå, ïðèñóòñòâèå 10 % ñûâîðîòêè
áîëåå ýôôåêòèâíî ñïàñàëî êëåòêè îò äåéñòâèÿ LY294002, ÷åì
îòäåëüíûå ðîñòîâûå ôàêòîðû. Àíàëèç êëåòî÷íîãî öèêëà ïîêàçàë,
÷òî ðàñïðåäåëåíèå êëåòîê, îáðàáîòàííûõ LY294002 â ïðèñóòñòâèè
è â îòñóòñòâèè LIF è IGF-1 íå îòëè÷àþòñÿ (ðèñ 9Á). Ñëåäîâàòåëüíî,
äàííûå ôàêòîðû ñíàáæàþò êëåòêó ñêîðåå íå ìèòîãåííûìè
ñòèìóëàìè, à ñèãíàëàìè ê âûæèâàíèþ.
ÇÀÊËÞ×ÅÍÈÅ
Ïîëó÷åííûå äàííûå ïðèâîäÿò íàñ ê çàêëþ÷åíèþ, ÷òî
ïðîëèôåðàöèÿ ÝÑÊ ìûøè ìîæåò áûòü ñòèìóëèðîâàíà íåñêîëüêèìè
íåçàâèñèìûìè äðóã îò äðóãà ñèãíàëüíûìè ïóòÿìè. Âî-ïåðâûõ,
ÝÑÊ ìûøè ñïîñîáíû ïðîëèôåðèðîâàòü â îòñóòñòâèå ðîñòîâûõ
ôàêòîðîâ â ñðåäå êóëüòèâèðîâàíèÿ, ÷òî ñâèäåòåëüñòâóåò î
ñóùåñòâîâàíèè ýíäîãåííîé ìèòîãåííîé àêòèâíîñòè. Íàøè
èññëåäîâàíèÿ ïîêàçàëè, ÷òî ýòó ìèòîãåííóþ àêòèâíîñòü ìîæíî
ïîäàâèòü èíãèáèòîðîì PI3K LY294002 èëè èíãèáèòîðîì cdk2
ðîñêîâèòèíîì. Ñëåäóåò îòìåòèòü, ÷òî ïîäàâëåíèå ïðîëèôåðàöèè
LY294002
ñîïðîâîæäàåòñÿ
ñíèæåíèåì
àêòèâíî ñòè
òðàíñêðèïöèîííûõ ôàêòîðîâ E2F1 è cdk2-ñîäåðæàùèõ êîïìëåêñîâ.
Âî-âòîðûõ, íåñìîòðÿ íà ñïîñîáíîñòü ÝÑÊ ê ïðîëèôåðèðàöèè â
îòñòóòñòâèå ðîñòîâûõ ôàêòîðîâ, ñûâîðîòêà, òåì íå ìåíåå, ìîæåò
-18-
ñòèìóëèðîâàòü ïðîëèôåðàöèþ ÝÑÊ, î ÷åì ñâèäåòåëüñòâóåò
óâåëè÷åíèå äîëè êëåòîê â ôàçå S ïðè äîáàâëåíèè ñûâîðîòêè
êëåòêàì, îáðàáîòàííûì LY294002 èëè ðîñêîâèòèíîì.
Ïîñêîëüêó ïîëó÷åííûå äàííûå ñâèäåòåëüñòâóþò î òîì, ÷òî
ïðè ñûâîðîòî÷íîì ãîëîäàíèè â ÝÑÊ ìûøè ñîäåðæàíèå è
àêòèâíîñòü áåëêîâ, ïîëîæèòåëüíî ðåãóëèðóþùèõ ïðîëèôåðàöèþ
(öèêëèí D1, cdk2, E2F1), îñòàþòñÿ íà âûñîêîì óðîâíå, à
íåãàòèâíûé ðåãóëÿòîð ïðîëèôåðàöèè, p27 kip, íàîáîðîò, íå
íàêàïëèâàåòñÿ, ìîæíî çàêëþ÷èòü, ÷òî â ÝÑÊ íå ôóíêöèîíèðóåò
ñòàâøàÿ êëàññè÷åñêîé äëÿ êëåòîê äðóãèõ òèïîâ öåïü ïåðåäà÷è
ñèãíàëà “ðîñòîâûå ôàêòîðû - ðåãóëÿòîðû êëåòî÷íîãî öèêëà”.
Èíòåðåñíî, ÷òî àêòèâíîñòü cèãíàëüíûõ êàñêàäîâ Erk è PI3K â ÝÑÊ
ìûøè çàâèñèò îò ïðèñóòñòâèÿ ñûâîðîòêè â ñðåäå êóëüòèâèðîâàíèÿ,
à çíà÷èò, óïîìÿíóòàÿ öåïü ðàçîìêíóòà “íèæå ïî òå÷åíèþ” ñèãíàëà.
Íà êàêîì çâåíå öåïè âîçíèêàåò àâòîíîìíîñòü ìèòîòè÷åñêîãî
ñèãíàëà â ÝÑÊ, è êàê ïðîèñõîäèò âîññòàíàâëåíèå çàâèñèìîñòè
ïðîëèôåðàöèè îò ðî ñòîâûõ ôàêòîðîâ â ðåçóëüòàòå
äèôôåðåíöèðîâêè êëåòîê - âîïðîñ, êîòîðûé äîëæåí ñàòü ïðåäìåòîì
èññëåäîâàíèé â áëèæàéøåå âðåìÿ.
Êàê îòñóòñòâèå ðîñòîâûõ ôàêòîðîâ, òàê è èíãèáèòîð PI3K
LY294002 âûçûâàþò àïîïòîç ÝÑÊ ìûøè. Ïî-âèäèìîìó, ñûâîðîòêà
ñíàáæàåò ÝÑÊ ñèãíàëàìè ê âûæèâàíèþ, êîòîðûå îïîñðåäîâàíû â
÷àñòíîñòè, PI3K-çàâèñèìûì êàñêàäîì. Ýòî ïðåäïîëîæåíèå òàêæå
òðåáóåò áîëåå äåòàëüíîãî èçó÷åíèÿ.
ÂÛÂÎÄÛ
1.
Óäàëåíèå ðîñòîâûõ ôàêòîðîâ èç ñðåäû êóëüòèâèðîâàíèÿ
ñíèæàåò àêòèâíîñòü Erk- è PI3K-çàâèñèìûõ êàñêàäîâ â
ýìáðèîíàëüíûõ ñòâîëîâûõ êëåòêàõ ìûøè, íî íå âûçûâàåò
îñòàíîâêè ïðîëèôåðàöèè; ïðè ýòîì â êëåòêàõ íå ïðîèñõîäèò
ñíèæåíèÿ àêòèâíîñòè êîìïëåêñîâ öèêëèí Å/cdk2.
2.
Èíãèáèðîâàíèå àêòèâíîñòåé MAPK-êàñêàäîâ (Erk, JNK,
p38) íå ïðèâîäèò ê èçìåíåíèþ ðàñïðåäåëåíèÿ ýìáðèîíàëüíûõ
ñòâîëîâûõ êëåòîê ìûøè ïî ôàçàì êëåòî÷íîãî öèêëà, â òî âðåìÿ
êàê èíãèáèòîð PI3-êèíàçû LY294002 âûçûâàåò íàêîïëåíèå êëåòîê
â ôàçå G1 è ñíèæåíèå äîëè êëåòîê â ôàçå ñèíòåçà ÄÍÊ.
Àíòèïðîëèôåðàòèâíûé ýôôåêò èíãèáèòîðà óñèëèâàåòñÿ â óñëîâèÿõ
ñûâîðîòî÷íîãî ãîëîäàíèÿ.
3.
Èíãèáèòîð PI3-êèíàçû LY294002 âûçûâàåò â
-19-
ýìáðèîíàëüíûõ ñòâîëîâûõ êëåòêàõ ìûøè ñíèæåíèå àêòèâíîñòè
òðàíñêðèïöèîííîãî ôàêòîðà E2F1, à òàêæå àêòèâíîñòè êîìïëåêñîâ
öèêëèí Å/cdk2, ÷òî, îäíàêî, íå ñîïðîâîæäàåòñÿ íàêîïëåíèåì
èíãèáèòîðà öèêëèí-êèíàçíûõ êîìïëåêñîâ p27kip.
4.
Êàê ñûâîðîòî÷íîå ãîëîäàíèå, òàê è îáðàáîòêà èíãèáèòîðîì
PI3-êèíàçû LY294002 âûçûâàþò àïîïòîòè÷åñêóþ ãèáåëü è
íåãàòèâíî âëèÿþò íà ðîñò ïîïóëÿöèè ýìáðèîíàëüíûõ ñòâîëîâûõ
êëåòêàõ ìûøè.
ÑÏÈÑÎÊ ÐÀÁÎÒ, ÎÏÓÁËÈÊÎÂÀÍÍÛÕ ÏÎ ÒÅÌÅ
ÄÈÑÑÅÐÒÀÖÈÈ
1.
Ëÿíãóçîâà Ì.Ñ., ×óéêèí È.À., Ïîñïåëîâ Â.À. 2004.
Íåîáõîäèìîñòü àêòèâàöèè PI3-êèíàçû äëÿ ïðîëèôåðàöèè êëåòîê
ýìáðèîíàëüíîé êàðöèíîìû ìûøè ëèíèè F9. Öèòîëîãèÿ. 46 (1):2634.
Ëÿíãóçîâà Ì.Ñ., ×óéêèí È.À., Íîðäõàéì À., Ïîñïåëîâ Â.À.
2.
2006. Ôàðìàêîëîãè÷åñêèå èíãèáèòîðû PI3-êèíàçû âîðòìàííèí è
LY294002 îêàçûâàþò ðàçëè÷íîå äåéñòâèå íà ïðîëèôåðàöèþ
ýìáðèîíàëüíûõ ñòâîëîâûõ êëåòîê ìûøè. Öèòîëîãèÿ. 48 (7):560568.
3.
Lianguzova M.S., Chuykin I.A., Nordheim A., Pospelov V.A.
2007. Phosphoinositide 3-Kinase inhibitor LY294002 but not serum
withdrawal suppresses proliferation of murine embryonic stem cells.
Cell Biol Int. 31:330-337.
4.
Liangouzova M. S., Tchuikin I. A., Pospelov V. A. Proliferation
of early embryonic cells depends on PI3 kinase activity but not MAP
kinases activity. 14th European Student Conference at Charite (Áåðëèí,
Ãåðìàíèÿ, 4-9 íîÿáðÿ 2003 ã.). Abstract book. 405.
5.
Ïîñïåëîâ Â.À., Ëÿíãóçîâà Ì.Ñ., ×óéêèí È.À., Ìàëàøè÷åâà
À.Á. Ìåõàíèçìû àâòîíîìíîé ïðîëèôåðàöèè ýìáðèîíàëüíûõ
ñòâîëîâûõ êëåòîê ìûøè. Ìåæäóíàðîäíûé ñèìïîçèóì "Ñòâîëîâûå
êëåòêè, ðåãåíåðàöèÿ, êëåòî÷íàÿ òåðàïèÿ" (Ñàíêò-Ïåòåðáóðã, 25- 27
îêòÿáðÿ 2004 ã.).
6.
Ëÿíãóçîâà Ì.Ñ., ×óéêèí È.À., Ïîñïåëîâ Â.À. Âëèÿíèå
èíãèáèòîðà PI3 Êèíàçû LY294002 íà ðåãóëÿöèþ ïåðåõîäà G1/S â
ýìáðèîíàëüíûõ ñòâîëîâûõ êëåòêàõ ìûøè. VI Ìåæäóíàðîäíàÿ
êîíôåðåíöèÿ "Ìîëåêóëÿðíàÿ ãåíåòèêà ñîìàòè÷åñêèõ êëåòîê"
(Çâåíèãîðîä, Ìîñêâà, 12-16 äåêàáðÿ 2005 ã.). Ñáîðíèê òåçèñîâ
êîíôåðåíöèè, 98-99.
7.
Lianguzova M.S., Nordheim A., Pospelov V.A. Influence of PI3-20-
kinase inhibitor LY294002 and serum deprivation on the proliferation
of murine embryonic stem cells. FEBS/EMBO Workshop "Spatial and
Temporal Regulation of Signaling" (Îñëî, Íîðâåãèÿ, 21-24 ñåíòÿáðÿ
2006 ã.).
ÑÏÈÑÎÊ ÖÈÒÈÐÎÂÀÍÍÎÉ ËÈÒÅÐÀÒÓÐÛ
Campisi J. 2001. From cells to organisms: can we learn about aging
from cells in culture? Exp Gerontol. 36:607-618.
Collado M, Medema RH, Garcia-Cao I, Dubuisson ML, Barradas M,
Glassford J, Rivas C, Burgering BM, Serrano M, Lam EW. 2000. Inhibition of the phosphoinositide 3-kinase pathway induces a senescencelike arrest mediated by p27Kip1. J Biol Chem. 275:21960-21968.
Downward J. 2004. PI 3-kinase, Akt and cell survival. Seminars in
Cell & Dev Biol. 15:177-182.
Jones SM, Klinghoffer R, Prestwich GD, Toker A, Kazlauskas A.
1999. PDGF induces an early and a late wave of PI 3-kinase activity,
and only the late wave is required for progression through G1. Curr
Biol. 9:512-521.
Jones SM, Kazlauskas A. 2001. Growth factor-dependent signaling
and cell cycle progression. FEBS Lett. 490:110-116.
Savatier P, Huang S, Szekely L, Wiman KG, Samarut J. 1994. Contrasting patterns of retinoblastoma protein expression in mouse embryonic stem cells and embryonic fibroblasts. Oncogene. 9:809-818.
Schratt G, Weinhold B, Lundberg AS, Schuck S, Berger J, Schwarz
H, Weinberg RA, Ruther U, Nordheim A. 2001. Serum response factor
is required for immediate-early gene activation yet is dispensable for
proliferation of embryonic stem cells. MolCell Biol. 21:2933-2943.
Stead E, White J, Faast R, Conn S, Goldstone S, Rathjen J, Dhingra
U, Rathjen P, Walker D, Dalton S. 2002. Pluripotent cell division cycles
are driven by ectopic Cdk2, cyclin A/E and E2F activities. Oncogene.
21:8320-8333.
Sun H, Lesche R, Li DM, Liliental J, Zhang H, Gao J, Gavrilova N,
Mueller B, Liu X, Wu H. 1999. PTEN modulates cell cycle progression and cell survival by regulating phosphatidylinositol 3,4,5,trisphosphate and Akt/protein kinase B signaling pathway. PNAS.
96:6199-6204.
Takahashi K, Mitsui K, Yamanaka S. 2003. Role of ERas in promoting tumour-like properties in mouse embryonic stem cells. Nature.
423(6939):541-545.
-21-