Инструкция (0.24Мб)

может свидетельствовать о воспалительном процессе или
венерическом заболевании.
3. Принцип
Количество лейкоцитов и сперматозоидов
Подсчет количества лейкоцитов и сперматозоидов
производится с использованием внутреннего стандарта
(флуоресцентные частицы с известной концентрацией).
Детекция лейкоцитов в образце выполняется по окраске
антителами CD45 (CD45-PE-Dy647).
Жизнеспособность сперматозоидов
Жизнеспособность сперматозоидов оценивают по окраске
иодидом пропидия, который проникает только сквозь
поврежденную мембрану и связывается с ДНК.
Целостность акросомы
Оценка целостности акросомы основана на детекции
интраакросомального белка (ИАБ), который локализован
внутри хромосомы. Если акросома сперматозоида не
повреждена, то ИАБ не обнаруживается. В сперматозоиде с
поврежденной
мембраной
ИАБ
окрашивается
специфическими антителами.
Наличие интраакросомального белка
После пермеабилизации мембраны сперматозоида ИАБ
окрашивают специфическими антителами. В случае, если
сперматозоид не содержит ИАБ, окрашивания не
происходит.
Кат.№ ED7021
SpermFlow™ Kit
(25 тестов)
1. Назначение
ENGLISH
Набор SpermFlow™ Kit предназначен для оценки следующих
параметров семенной жидкости человека методом проточной
цитофлуориметрии:
ƒ Количество сперматозоидов
ƒ Количество лейкоцитов
ƒ Количество живых сперматозоидов
ƒ Целостность акросомы сперматозоида
ƒ Наличие интра-акросомального белка в сперматозоиде
В соответствии с рекомендациями ВОЗ [1] данный анализ
следует дополнить исследованием
подвижности и
морфологии сперматозоидов с помощью микроскопии.
4. Предостережения
Только для исследований, не для диагностики
Не используйте реагенты с истекшим сроком годности.
Не оставляйте реагенты на свету.
Не замораживайте реагенты.
Избегайте контаминации реагентов.
Любое несоответствие предлагаемому протоколу окраски
может привести к неправильному результату.
Антитела содержат азид натрия (NaN3), который в чистом
виде является очень токсичным. Однако, концентрация,
использующаяся в реагенте (15 mM) не является токсичной.
При сливе реагента в канализацию разбавляйте его большим
количеством воды.
Реагент для пермеабилизации содержит этанол и, поэтому,
является воспламеняющимся.
Образцы
сперматозоидов
являются
потенциально
инфицированным материалом и с ними следует обращаться
должным образом. Избегайте контакта образца с кожей,
глазами и слизистыми.
2.
Введение
Около 20% супружеских пар страдают бесплодием, треть из
них по причине мужского бесплодия. Следовательно, анализ
семенной жидкости играет важную роль в базовом
неинвазивном исследовании, которое может подтвердить
или опровергнуть факт бесплодия.
Согласно рекомендациям ВОЗ от 1999 г. [1] исследование
сперматозоидов выполняется на световом микроскопе.
Подобное исследование является субъективным и зависит
от опыта исследователя. Проточная цитофлуориметрия –
более
объективный
метод,
который
позволяет
проанализировать значительно большее количество
сперматозоидов и детектировать клетки по специфическому
окрашиванию [2]. Основные параметры, которые играют
важную
роль
в
способности
сперматозоида
к
оплодотворению
это:
количество
сперматозоидов,
жизнеспособность сперматозоидов, целостность акросомы
сперматозоида и присутствие интраакросомального белка
(ИАБ) в сперматозоиде [3]. Акросома содержит ферменты
(гиалуронидаза, акрозин). Эти ферменты разрушают
внешнюю мембрану яйцеклетки, называемую zona pellucida,
обеспечивая гаплоидному ядру сперматозоида вход в
яйцеклетку. Присутствие лейкоцитов в семенной жидкости
5. Реагенты, поставляемые в наборе
ED7021-1 IAP - FITC – Мышиные моноклональные антитела
против интраакросомального белка (ИАБ, IAP), меченые
FITC, 500 мкл
(флакон с зеленой крышкой ●)
1/5
ЗАО «БиоХимМак Диагностика»
Тел: (495) 647-27-40 Факс: (495)939-09-97
www.biochemmack.ru info@biochemmack.ru
ED7021_EN_CZ_SK_09090
FITC),
сигнал
от
красителя
PE-DY647
обнаруживается на канале для PC5 (FL3 или FL4).
ED7021-2 CD45/PE-DY647 - Мышиные моноклональные
антитела против CD45, меченые PE-DY647, клон MEM-28 [4],
150 мкл
(флакон с синей крышкой●)
ED7021-3 Внутренний стандарт
частицы, 1×106 частиц/мл, 700 мкл
(флакон с желтой крышкой ●)
–
Жизнеспособность сперматозоидов
1. Внесите 100 мкл разбавленной спермы в пробирку.
2. Добавьте 5 мкл иодида пропидия (флакон с красной
крышкой ●)
3. Перемешайте образец и инкубируйте 30 минут при
комнатной температуре.
4. Добавьте 500 мкл ФСБ, перемешайте образец и
анализируйте на проточном цитофлуориметре.
Иодид пропидия детектируется на канале для PC5
(FL3 на приборах Becton Dickinson, FL4 – на
Beckman Coulter).
флуоресцентные
ED7021-4 Иодид пропидия - 150 мкл
(флакон с красной крышкой●)
ED7021-5 Пермеабилизующий реагент- 30 мл
(флакон с черной крышкой ●)
Целостность акросомы
1. Внесите 100 мкл разбавленной спермы в пробирку.
2. Добавьте 1 мл ФСБ.
3. Хорошо перемешайте и центрифугируйте 5 мин. при
150 g.
4. Удалите супернатант и повторите шаги 2 и 3.
5. К осадку клеток добавьте 10 мкл антител к ИАБ
(реагент IAF/FITC, флакон с зеленой крышкой ●)
6. Перемешайте образец и инкубируйте 30 минут при
комнатной температуре.
7. Добавьте 500 мкл ФСБ, перемешайте образец и
анализируйте на проточном цитофлуориметре.
Флуоресценция окрашенных клеток обнаруживается
на канале для FITC (FL1).
6. Необходимые материалы
ƒ Пробирки 5 мл, 12 х 75 мм
ƒ Фосфатно-солевой буфер (ФСБ)
ƒ Автоматические пипетки
ƒ Вортекс
ƒ Световой микроскоп
ƒ Центрифуга
ƒ Проточный цитофлуориметр, оснащенный синим
лазером с длиной волны 488 нм. Флуоресцентные
каналы, необходимые для регистрации флуоресценции
указаны в разделе 8 (Процедура окраски).
7. Условия хранения
Все компоненты набора SpermFlow™ Kit необходимо хранить
в темном месте при 2-8 0С, за исключением
пермеабилизующего реагента, который следует хранить при
комнатной температуре 20-25 0С. Сроки годности реагентов
указаны на флаконах.
Наличие интра-акросомального белка
1. Внесите 100 мкл разбавленной спермы в пробирку.
2. Добавьте 1 мл пермеабилизующего реагента.
(флакон с черной крышкой ●), который следует
хранить при комнатной температуре.
3. Перемешайте образец и инкубируйте 15 минут при
комнатной температуре.
4. Центрифугируйте 5 мин. при 150 g.
5. Добавьте 1 мл ФСБ к осадку клеток, перемешайте
образец и центрифугируйте 5 мин. при 150 g.
6. Удалите супернатант и повторите шаг 5.
7. К осадку клеток добавьте 10 мкл антител к ИАБ
(реагент IAF/FITC, флакон с зеленой крышкой ●).
8. Перемешайте образец и инкубируйте 30 минут при
комнатной температуре.
9. Добавьте 500 мкл ФСБ, перемешайте образец и
анализируйте на проточном цитофлуориметре.
Флуоресценция окрашенных клеток обнаруживается
на канале для FITC (FL1).
8. Процедура окраски
Образцы спермы следует обработать в течение 2 часов
после эякуляции. Подсчитайте количество сперматозоидов в
световом микроскопе. Разведите сперму 1:1 или 1:10 ФСБ в
зависимости от количества сперматозоидов (большее
количество следует разбавлять большим количеством ФСБ).
Подсчет количества сперматозоидов и лейкоцитов.
1. Внесите 25 мкл разбавленной спермы в пробирку.
Добавьте 5 мкл реагента CD45/PE-DY647 (флакон с
синей крышкой ●).
2. Перемешайте образец и инкубируйте в течение 30
минут при комнатной температуре.
3. Добавьте 25 мкл хорошо перемешанного
внутреннего стандарта (флакон с желтой крышкой ●)
4. Добавьте 500 мкл ФСБ, перемешайте образец и
анализируйте на проточном цитофлуориметре.
Частицы детектируются на канале FL1 (аналогично
2/5
ЗАО «БиоХимМак Диагностика»
Тел: (495) 647-27-40 Факс: (495)939-09-97
www.biochemmack.ru info@biochemmack.ru
ED7021_EN_CZ_SK_09090
окрашивание всех сперматозоидов, что подтверждает
наличие интра-акросомального белка.
В патологических образцах эякулята, не обработанных
пермеабилизующим
буфером
(рис.5),
наблюдается
повышенное содержание сперматозоидов с поврежденной
акросомой (>30%), которые дают яркое зеленое
окрашивание антителами против ИАБ.
В патологических образцах эякулята, обработанных
пермеабилизующим буфером (рис.6), наблюдается яркое
окрашивание ИАБ в сперматозоидах, однако, в сравнении с
нормальным образцом, интенсивность окрашивания
неоднородна.
9. Анализ данных
Подсчет количества сперматозоидов и лейкоцитов
Постройте график FITC против FS (см. рис. 1а). Установите
регионы как показано на рис. 1а: А – на все клетки, В – на
сперматозоиды, С – для частиц внутреннего стандарта.
Проанализируйте события региона А на гистограмме по
флуоресценции PE-DY647 (см. рис.1 b). Лейкоциты
экспрессируют CD45, в отличие от сперматозоидов.
Выделите популяцию, экспрессирующую CD45 в регион D –
регион лейкоцитов (рис.1 b). Вычислите количество
лейкоцитов и сперматозоидов по следующей формуле
S=
Рег В
Рег С
х разведение
[106 сперматозоидов/мл]
S=
Рег D
Рег С
х разведение
[106 лейкоцитов/мл]
10. Ожидаемые значения
Нормальные значения (по данным ВОЗ [1])
Количество сперматозоидов в эякуляте: >20x106 /мл
Количество лейкоцитов в эякуляте: <1x106 /мл
Жизнеспособность сперматозоидов: > 75%
Акросома
Целостность
акросомы
сперматозоидов:
поврежденных
Наличие
интра-акросомального
белка:
>
сперматозоидов
S – концентрация сперматозоидов в эякуляте.
L - концентрация лейкоцитов в эякуляте.
Рег В – количество событий в регионе В.
Рег С – количество событий в регионе С.
Рег D – количество событий в регионе D.
<30%
85%
Воспроизводимость (n=6)
Жизнеспособность сперматозоидов
Постройте график FS против SS. Установите регион Е вокруг
популяции сперматозоидов как показано на рис. 2а.
Проанализируйте события из региона Е на гистограмме по
интенсивности флуоресценции PI (рис. 2b). Выделите
позитивные и негативные события в отдельные регионы.
Негативная
популяция
представлена
живыми
сперматозоидами, позитивные по PI события – погибшие
сперматозоиды. Жизнеспособность спермы оценивают как
процент живых сперматозоидов от всей популяции
сперматозоидов.
Параметр
Mean
SD
Количество сперматозоидов
Количество лейкоцитов
Жизнеспособность
Целостность акросомы
Наличие интра-акросомального
белка
56.7×106
1.2×106
59 %
21 %
96 %
4.5×106
0.14×106
1.5 %
1.9 %
1.7 %
CV
(%)
7.9
11.7
2.5
9.0
1.8
11. Литература
[1] WHO laboratory manual for examination of Human semen
and Sperm-Cervival mucus interaction. Cambridge University
press, 4th edition 1999
[2] Gilan L, Evans G, Maxwell WM (2005) Flow cytometric
evaluation of sperm parameters in relation to fertility potential.
Theriogendogy. 63: 445-57
[3] Peknicova J, Chladek D, Hozak P (2005) Monoclonal
antibodies against sperm intra-acrosomal antigens as markers for
male infertility diagnostics and estimation of spermatogenesis.
Am J Reprod Immunol. 53(1): 42-9
[4] Leukocyte Typing IV., Knapp W. et al. (Eds.), Oxford
University Press (1989).
Целостность акросомы и наличие интра-акросомального
белка
Постройте график FS против SS. Установите регион Е на
популяцию сперматозоидов как показано на рис. 2а.
Проанализируйте события из региона Е на гистограмме по
интенсивности флуоресценции FITC (рис. 3-6). Выделите
негативные и позитивные события в соответствующие гейты.
В нормальных образцах эякулята, не обработанных
пермеабилизующим буфером, должно содержаться не более
30% сперматозоидов с поврежденной акросомой (рис.3).
Поврежденные сперматозоиды окрашиваются антителами к
ИАБ и детектируются как события с высокими значениями
флуоресценции в зеленой области спектра (FITC).
В нормальных образцах эякулята, обработанных
пермеабилизующим буфером (рис.4), наблюдается яркое
3/5
ЗАО «БиоХимМак Диагностика»
Тел: (495) 647-27-40 Факс: (495)939-09-97
www.biochemmack.ru info@biochemmack.ru
ED7021_EN_CZ_SK_09090
12. Производитель
EXBIO Praha, a.s.
Nad Safinou II 366
252 42 Vestec, Czech Republic
Tel: +420 261 090 666
Fax: +420 261 090 660
E-mail: orders@exbio.cz
http://www.exbio.cz
Рис.1 Подсчет количества сперматозоидов в эякуляте.
Рис.2 Подсчет количества лейкоцитов в эякуляте.
Рис.2а. Создание региона сперматозоидов.
Рис.2b. Оценка жизнеспособности сперматозоидов.
4/5
ЗАО «БиоХимМак Диагностика»
Тел: (495) 647-27-40 Факс: (495)939-09-97
www.biochemmack.ru info@biochemmack.ru
ED7021_EN_CZ_SK_09090
Рис.3. Нормальный образец эякулята
непермеабилизованный.
Рис.4. Нормальный образец эякулята
пермеабилизованный
Рис.5. Патологический образец эякулята
непермеабилизованный
Рис.6. Патологический образец эякулята
пермеабилизованный.
5/5
ЗАО «БиоХимМак Диагностика»
Тел: (495) 647-27-40 Факс: (495)939-09-97
www.biochemmack.ru info@biochemmack.ru
ED7021_EN_CZ_SK_09090