Показатели пролиферации и апоптоза в патогенезе и

Оригинальные исследования
4, 2007
УДК 616.33-06:[616.98:579.835.12]-092
Показатели пролиферации и апоптоза
в патогенезе и прогнозировании
течения заболеваний желудка,
ассоциированных с H. pylori
А.М. Осадчук1, Н.Ю. Коган1, И.М. Кветной2
(1Самарский военно-медицинский институт,
2НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта РАМН, Санкт-Петербург)
Обследовано 120 больных с заболеваниями желудка, ассоциированными с Helicobacter
pylori (H. pylori). Все пациенты разделены на 4 равные группы: с хроническим атрофическим
гастритом (ХАГ), аденоматозными полипами, язвенной болезнью желудка (ЯБЖ) и раком
желудка (РЖ). Группу сравнения составили 12 практически здоровых лиц.
Установлено, что ЯБЖ, ХАГ, аденоматозные полипы и РЖ являются последовательными
стадиями нарушения клеточного обновления эпителиоцитов слизистой оболочки желудка,
проявляющегося прогрессирующим отставанием их апоптозной активности от процесса
пролиферации, что находит отражение в возрастании экспрессии Ki-67 и Bcl-2. Успешно проведенная эрадикационная терапия улучшает показатели клеточного обновления. При этом
отношение апоптоза к пролиферации эпителиоцитов имеет тенденцию к нормализации, что
предполагает возможность обратного развития атрофических, метапластических и диспластических изменений слизистой оболочки толстой кишки у больных с заболеваниями желудка,
ассоциированными с H. pylori.
Ключевые слова: язвенная болезнь желудка, хронический атрофический гастрит, аденоматозные полипы, рак желудка, Ki-67, Bcl-2, апоптоз, H. pylori.
К
заболеваниям, ассоциированным с Helicobacter
pylori, традиционно от­
носят хронический гастрит,
язвенную болезнь желудка и
двенадцатиперстной кишки, рак
желудка. При этом воспаление
слизистой оболочки желудка
(СОЖ), вызванное H. pylori,
сопровождается
нарушением
клеточного обновления (увеличением пролиферативного потенциала и апоптоза) [3, 5, 6]. От
характера нарушений параметров
клеточного обновления (соотношения апоптоза и пролиферативной активности эпителиоцитов
СОЖ) зависит развитие различных заболеваний желудка, ассоциированных с H. pylori.
В настоящее время не остается сомнений в возможности
20
прогрессирования хронического
геликобактерного гастрита с формированием тотального гастрита
с атрофией слизистой оболочки
как антрального, так и фундального отделов, а также развитием
диспластических, метапластических изменений СОЖ и рака
желудка [7, 9]. У больных с
геликобактериозом РЖ возникает в 2–9 раз чаще, чем у неинфицированных [1, 5]. Однако
остается дискутабельным вопрос
о том, являются различия в процессах апоптоза и пролиферации
результатом воздействия определенных штаммов H. pylori
или следствием своеобразного
иммунного ответа макроорганизма и возможно ли их улучшение
или нормализация после достижения эрадикации [3, 4].
Важнейшее значение в прогрессировании нарушений клеточного гомеостаза эпителиоцитов СОЖ при геликобактерной
инфекции принадлежит Ki-67,
антиапоптозной молекуле Bcl-2 и
апоптозу [2, 5]. Однако характер и степень изменений этих
показателей на пути прогрессирования хронического геликобактерного гастрита изучены
недостаточно. Не известен уровень их изменений при аденоматозных полипах желудка, возникших на фоне атрофических
изменений СОЖ, связанных с
геликобактериозом [8].
Сведения, касающиеся соотношения пролиферации и апоптоза при заболеваниях же­лудка, ассоциированных с H. py­
lori, носят противоречивый
Оригинальные исследования
4, 2007
характер. Дискутабельна возможность обратного развития
предраковых состояний и изменений под влиянием успешно
выполненной эрадикационной
терапии. Весьма разноречивы
данные относительно проведения эрадикации у больных с
дистальным РЖ, перенесших
субтотальную резекцию желудка
[10]. В свою очередь, решение
указанных вопросов позволило
бы адекватно прогнозировать
степень риска возникновения
предраковых состояний, рецидивов РЖ после радикальной
терапии, улучшить раннюю
диагностику рассматриваемых
заболеваний и, следовательно,
оптимизировать лечение.
Цель исследования: определить параметры клеточного
обновления СОЖ при заболеваниях, ассоциированных с
H. pylori, и на их основе дополнить ранние диагностические
критерии
прогрессирования
структурных изменений СОЖ
у пациентов с хроническим
атрофическим гастритом, аденоматозными полипами, язвенной
болезнью и раком желудка до и
после проведения эрадикационной терапии.
Материал и методы
исследования
Обследовано 120 больных с
заболеваниями желудка, ассоциированными с H. pylori. Все
пациенты разделены на 4 равные группы в зависимости от
нозологической формы (ЯБЖ,
ХАГ, аденоматозные полипы
и РЖ). В группу сравнения
вошли 12 практически здоровых лиц. Обследования проводились в динамике по единой
программе, включавшей клинические методы, фиброгастродуоденоскопию (ФГДС), общее
морфологическое и цитологическое, иммуногистохимическое
исследования, гистиобактериоскопию. Эффективность эрадикационной терапии оценивали
спустя 2 мес после стихания
воспалительных процессов в
желудке или после гастрэктомии по поводу РЖ.
Материал для цитологического и гистологического исследований забирали из антрального
и фундального отделов желудка, фиксировали в 10% забуференном нейтральном формалине, по Лилли, в течение 24 ч
с последующей промывкой в
проточной воде в течение суток.
Затем обезвоживали и заливали
в парафин. Для обзорного гистологического изучения депарафинированные серийные срезы
толщиной 5–7 мкм окрашивали гематоксилином и эозином.
Парафиновые срезы толщиной
4–6 мкм помещали на предметные стекла, покрытые пленкой
из поли-L-лизина (Sigma).
Для выявления апоптозных ядер исследуемый материал импрегнировали по Мозеру
(1995).
Иммуногистохимическое исследование проводили с ис­
поль­зованием моноклональных
мышиных антител к маркеру пролиферирующих клеток
– Ki-67 (1:100, Novocastra) и
к антиапоптозному белку Вcl-2
(1:100, Novocastra). В качестве
вторых антител использовали
универсальный набор, содержащий
биотинилированные
антимышиные иммуноглобулины. Для визуализации окрасок
применяли комплекс авидина
с биотинилированной пероксидазой (ABC-kit) с последующим проявлением пероксидазы
хрена диаминобензидином (все
реагенты от Novocastra).
Морфологические изображения, поступающие через оптическую систему микроскопа
Nikon Eclipse 400 (увеличение
×320: объектив 40, окуляр 10,
фильтр 0,8), регистрировались
цифровой цветной видеокамерой Nikon DXM1200, вмонтированной в тубус микроскопа,
и передавались в компьютер.
Количество Ki-67 (NKi-67)- и Bcl-2
(NBcl-2)-иммунопозитивных ядер
клеток автоматически подсчитывалось в 10 рандомизированных
полях зрения. При указанном
увеличении цифровые данные
пересчитывались на 1 мм2 с
помощью пакета прикладных
морфометрических программ
«Видеотест-Морфология 4.0».
Гибель клеток в форме апо­
птоза определяли по индексу
апоптоза (IАПТ) по формуле:
IАПТ (%) = N (число апоптозных
ядер, окрашенных по методу
Мозера)/N (общее число ядер)
×100. Нами введен показатель
Ki-67/IАПТ, наилучшим образом
характеризующий
состояние
клеточного гомеостаза в СОЖ.
Статистическую обработку
результатов исследования проводили с помощью программы
«Excel» на персональном компьютере IBM Pentium 4.
Результаты
исследования
и их обсуждение
В ходе иммуногистохимического исследования установлено, что в норме эпителиоциты желудка проявляют низкий
потенциал пролиферативной и
антиапоптозной активности. При
этом NKi-67 составляет 1,3±0,25,
а NBcl-2 – 1,1±0,6. IАПТ соответствует пролиферативной активности эпителиоцитов и составляет 0,34±0,02 (см. таблицу).
При всех формах заболеваний желудка, ассоциированных
с H. pylori, происходит многократное увеличение вектора
пролиферативной и антиапоптозной активности эпителиоцитов СОЖ и относительно низкое возрастание IАПТ. Различные
пропорции между активностью
пролиферации и апоптозом обусловливали развитие соответствующей формы геликобактериоза [2]. Возникновение ЯБЖ
ознаменовывалось наименьшим
нарушением клеточного гомеостаза и, как следствие, более
редкой встречаемостью тотального поражения слизистой оболочки атрофическим процессом, меньшей степенью метапластических и диспластических изменений СОЖ на фоне
относительно высокого индекса
21
Оригинальные исследования
4, 2007
Показатели клеточного обновления при различных заболеваниях желудка,
ассоциированных с H. pylori до проведения эрадикационной терапии и спустя 2 мес
Группа обследованных
Количество эпителиоцитов на 1 мм2 слизистой оболочки желудка,
иммунопозитивных к Ki-67, Bcl-2, индекс апоптоза и NKi-67/IАПТ, x±mx
NKi-67
Практически здоровые (n=12)
ЯБЖ (n=30)
ХАГ (n=30)
ХАГ + аденоматозные полипы
(n=30)
РЖ (n=30)
NBcl-2
NKi-67/IАПТ
IАПТ
1,30±0,25
63,20±2,40*
48,80±2,38**
1,10±0,60
9,30±0,56*
7,80±0,49**
3,95±0,85
36,80±1,80*
60,10±4,07**
0,34±0,02
1,73±0,05*
0,83±0,04**
71,40±4,20***
45,05±3,24**
134,00±3,90****
103,90±2,80**
197,90±5,50*****
133,90±3,10**
16,00±0,94***
12,33±0,78**
34,20±2,19****
28,13±1,42**
53,50±2,72*****
46,10±3,70**
125,00±8,80***
104,40±8,34**
269,70±15,50****
220,90±11,90**
337,10±17,70*****
349,10±36,30**
0,57±0,02***
0,44±0,02**
0,58±0,02
0,48±0,02**
0,63±0,02*****
0,50±0,03**
Примечание. Группы обследованных расположены по степени нарастания риска возникновения РЖ. В числителе приведены показатели клеточного обновления до проведения эрадикационной терапии, в знаменателе – спустя 2 мес после ее
назначения.
*р<0,05 – различие со здоровыми, **р<0,05 – с соответствующим показателем в периоде обострения, ***р<0,05 – с соответствующим показателем при ЯБЖ и ХАГ, ****р<0,05 – с соответствующим показателем при ХАГ и аденоматозных
полипах, *****р<0,05 – с соответствующим показателем при аденоматозных полипах и РЖ.
22
апоптоза и частым сохранением
секреторной функции желудка.
Формирование ХАГ происходило в результате более значимого,
чем при ЯБЖ, увеличения разницы между степенью пролиферативных процессов, выраженной через NKi-67 и IАПТ, обусловленной увеличением продукции
антиапоптозной молекулы Bcl-2
(рис. 1, 2). При ХАГ значительно чаще по сравнению с ЯБЖ
развивались морфологические
признаки нарушенного клеточного гомеостаза, доминировали
распространенные формы атрофии, кишечной метаплазии и
дисплазии СОЖ. При этом степень их выраженности в среднем превосходила таковую при
ЯБЖ.
Собственные данные свидетельствуют о том, что при еще
большем возрастании разницы
между NKi-67 и IАПТ у больных ХАГ создаются условия для
возникновения аденоматозных
полипов и РЖ. Проведенные
через 2 мес после эрадикационной терапии иммуногистохимические исследования показали
значимое улучшение показателей клеточного обновления у
пациентов всех обследованных
групп. Резко снижался пролиферативный потенциал эпителиоцитов СОЖ на фоне относительно
небольшого сокращения IАПТ. Во
всех группах отмечалось и достоверное снижение антиапоптозной активности эпителиоцитов
СОЖ, выраженное через NBcl-2.
Рис. 1. Гистологическая картина
слизистой оболочки антрального
отдела желудка при хроническом
атрофическом гастрите. Иммуно­
гистохимическая реакция с антителами к Ki-67. Увеличение ×240
Рис. 2. Гистологическая картина
слизистой оболочки антрального
отдела желудка при хроническом
атрофическом гастрите. Иммуно­
гистохимическая реакция с антителами к Bcl-2. Увеличение ×240
Улучшение показателей клеточного гомеостаза при успешно выполненной эрадикации
H. pylori объясняется падением активности воспалительного
процесса в СОЖ и, как следствие, уменьшением альтеративных процессов, поскольку скорость пролиферации находится
в прямой зависимости от степени повреждения клеток. При
снижении пролиферативного
потенциала уменьшается число
клеток с поврежденным геномом, а также функционально и
структурно незрелых клеток, в
результате чего происходит естественное снижение апоптоза.
Получены достоверные данные о снижении экспрессии
антиапоптозной молекулы Bcl-2
во всех группах больных через
2 мес после эрадикационной
терапии, что способствовало нормализации апоптоза. При этом
степень тяжести, объем атрофии
и кишечной метаплазии не изменялись. Частота встречаемости
дисплазий I и II степени уменьшалась, что, вероятно, связано
с их воспалительным характером. Сокращение количества
иммунопозитивных к Bcl-2 клеток у пациентов с заболеваниями желудка, ассоциированными
с H. pylori, после выполнения
эрадикационной терапии под-
Оригинальные исследования
4, 2007
черкивает потенциальную обратимость атрофии, метаплазии и
диспластических изменений за
более длительный, чем 2 мес,
период.
У больных РЖ после радикального хирургического лечения и проведенной эрадикации
отмечалось хотя и достоверное,
но менее значимое уменьшение показателей Ki-67, Bcl-2
и IАПТ. Сохраняющиеся после
радикальной терапии и эрадикации высокие цифры показателей пролиферации у этой категории больных, превышающие
подобные значения у лиц с ХАГ
в 2,5–3 раза, дают основание
высказать мнение об участии в
канцерогенезе не только местных регулирующих онкогенных
факторов, таких как H. pylori,
но и других повреждающих
механизмов, ассоциированных
с генетическими дефектами на
уровне организма [11, 12].
Собственные
наблюдения
свидетельствуют об определенном участии H. pylori в формировании аденоматозных полипов, что необходимо учитывать
при решении вопроса о тактике
ведения подобных больных.
Список литературы
1. Аруин Л.И. Из 100 инфицированных Helicobacter pylori рак
желудка возникает у двоих. Кто
они? // Эксперим. клин. гастроэнтерол. – 2004. – № 1 (внеочередной вып.). – С. 12–18.
2. Аруин Л.И., Капуллер Л.Л.,
Исаков В.А. Морфологическая
диагностика болезней желудка и
кишечника. – М.: Триада-Х, 1998.
– 496 с.
3. Исаков В.А., Домарадский И.В.
Хеликобактериоз. – М.: «ИД Мед­
практика», 2003. – 412 с.
4. Кононов А.В. Гетерогенность воспалительного ответа в популяции при
Helicobacter pylori-инфекции //
Педиатрия. – 2002. – № 2 (приложение). – С. 124–130.
5. Маев И.В., Зайратьянц О.В.,
Кучерявый Ю.А. Кишечная метаплазия слизистой оболочки желудка в практике гастроэнтеролога:
Выводы
1. Язвенная болезнь желудка, хронический атрофический
мультифокальный гастрит, хронический атрофический мультифокальный гастрит с наличием
аденоматозных полипов и рак
желудка кишечного типа являются стадиями нарушения клеточного обновления слизистой
оболочки желудка, связанного с
персистенцией H. pylori.
2. Клеточное
обновление
при всех изученных H. pyloriассоциированных заболеваниях желудка характеризуется
прогрессирующим отставанием
апоптоза эпителиоцитов слизистой оболочки от скорости пролиферативных процессов.
3. В прогнозировании возникновения и течения H. pyloriассоциированных заболеваний
ведущее место принадлежит
Ki-67, отражающему степень
активности пролиферативных
процессов, Bcl-2, характеризующему выраженность антиапоптозной активности, отношению показателя пролиферации
к апоптозу эпителиоцитов слизистой оболочки (NKi-67/IАПТ),
современный взгляд на проблему // Рос. журн. гастроэнтерол.,
гепатол., колопроктол. – 2006.
– Т. 16, № 4. – С. 38–47.
6. Нургалиева Б.К., Хамидуллина Г.А., Ивашкин В.Т., Бондаренко О.Ю. Регуляция пролиферации и апо­птоза при H. pylori-ассоциированном гастрите и язвенной
болезни // Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. –
2005. – Т. 15, № 6. – С. 29–34.
7. Correa P. Human gastric carcino­
genesis: a multistep and multi­
factorial process // Cancer Res. –
1992. – Vol. 52. – P. 6735–6740.
8. Ljubicic N., Kujundzic M., Roic G.
et al. Benign epithelial gastric
polyps frequency, location, and
age and sex distribution // Coll.
Anthropol. – 2002. – Vol. 26, N 1.
– P. 55–60.
9. Penta R., De Falco M., Iaquinto G.,
De Luca A. Helicobacter pylori
and gastric epithelial cells: from
степени атрофии фундального
отдела желудка и pH желудочного сока.
4. Адекватно
проведенная
эрадикационная терапия достоверно улучшает показатели клеточного обновления при всех
формах H. pylori-ассоциированных заболеваниях, что сопровождается уменьшением отношения пролиферации к апоптозу, а
также снижением частоты и степени тяжести диспластических
изменений уже через 2 мес после
проведенного лечения. При этом
вероятность прогрессирования
H. pylori-ассоциированных заболеваний значительно снижается.
5. Значимое улучшение показателей клеточного обновления
эпителиоцитов слизистой оболочки желудка при всех изученных формах H. pylori-ассоциированных заболеваний после
адекватно проведенной эрадикационной терапии не сопровождалось полным восстановлением клеточного гомеостаза. При
этом отношение пролиферации
к апоптозу было многократно
сдвинуто в сторону пролиферации, что обусловливает сохранение атрофических изменений.
gastritis to cancer // J. Exp. Clin.
Cancer Res. – 2005. – Vol. 24, N 3.
– Р. 337–345.
10. Sung J.J., Lin S.R., Ching J.Y. et
al. Atrophy and intestinal metaplasia
one year after cure of H. pylori
infection: a prospective, randomized
study // Gastroenterology. – 2000.
– Vol. 119. – P. 7–14.
11. Zhang Z., Yuan Y., Gao H.
et al. Apoptosis, proliferation and
p53 gene expression of H. pylori
associated gastric epithelial lesions
// World J. Gastroenterol. – 2001.
– Vol. 7, N 6. – P. 779–782.
12. Zhuang X., Lin S., Zheng J.
et al. The prognostic research of
expression and relationship between
Helicobacter pylori of c-met
onco­gene correlation with gastric
mucosal proliferation // Zhonghua
Nei Ke Za Zhi. – 2001. – Vol. 40,
N 6. – P. 381–384.
23