Показатели пролиферации и апоптоза в патогенезе и
реклама
Оригинальные исследования 4, 2007 УДК 616.33-06:[616.98:579.835.12]-092 Показатели пролиферации и апоптоза в патогенезе и прогнозировании течения заболеваний желудка, ассоциированных с H. pylori А.М. Осадчук1, Н.Ю. Коган1, И.М. Кветной2 (1Самарский военно-медицинский институт, 2НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта РАМН, Санкт-Петербург) Обследовано 120 больных с заболеваниями желудка, ассоциированными с Helicobacter pylori (H. pylori). Все пациенты разделены на 4 равные группы: с хроническим атрофическим гастритом (ХАГ), аденоматозными полипами, язвенной болезнью желудка (ЯБЖ) и раком желудка (РЖ). Группу сравнения составили 12 практически здоровых лиц. Установлено, что ЯБЖ, ХАГ, аденоматозные полипы и РЖ являются последовательными стадиями нарушения клеточного обновления эпителиоцитов слизистой оболочки желудка, проявляющегося прогрессирующим отставанием их апоптозной активности от процесса пролиферации, что находит отражение в возрастании экспрессии Ki-67 и Bcl-2. Успешно проведенная эрадикационная терапия улучшает показатели клеточного обновления. При этом отношение апоптоза к пролиферации эпителиоцитов имеет тенденцию к нормализации, что предполагает возможность обратного развития атрофических, метапластических и диспластических изменений слизистой оболочки толстой кишки у больных с заболеваниями желудка, ассоциированными с H. pylori. Ключевые слова: язвенная болезнь желудка, хронический атрофический гастрит, аденоматозные полипы, рак желудка, Ki-67, Bcl-2, апоптоз, H. pylori. К заболеваниям, ассоциированным с Helicobacter pylori, традиционно от­ носят хронический гастрит, язвенную болезнь желудка и двенадцатиперстной кишки, рак желудка. При этом воспаление слизистой оболочки желудка (СОЖ), вызванное H. pylori, сопровождается нарушением клеточного обновления (увеличением пролиферативного потенциала и апоптоза) [3, 5, 6]. От характера нарушений параметров клеточного обновления (соотношения апоптоза и пролиферативной активности эпителиоцитов СОЖ) зависит развитие различных заболеваний желудка, ассоциированных с H. pylori. В настоящее время не остается сомнений в возможности 20 прогрессирования хронического геликобактерного гастрита с формированием тотального гастрита с атрофией слизистой оболочки как антрального, так и фундального отделов, а также развитием диспластических, метапластических изменений СОЖ и рака желудка [7, 9]. У больных с геликобактериозом РЖ возникает в 2–9 раз чаще, чем у неинфицированных [1, 5]. Однако остается дискутабельным вопрос о том, являются различия в процессах апоптоза и пролиферации результатом воздействия определенных штаммов H. pylori или следствием своеобразного иммунного ответа макроорганизма и возможно ли их улучшение или нормализация после достижения эрадикации [3, 4]. Важнейшее значение в прогрессировании нарушений клеточного гомеостаза эпителиоцитов СОЖ при геликобактерной инфекции принадлежит Ki-67, антиапоптозной молекуле Bcl-2 и апоптозу [2, 5]. Однако характер и степень изменений этих показателей на пути прогрессирования хронического геликобактерного гастрита изучены недостаточно. Не известен уровень их изменений при аденоматозных полипах желудка, возникших на фоне атрофических изменений СОЖ, связанных с геликобактериозом [8]. Сведения, касающиеся соотношения пролиферации и апоптоза при заболеваниях же­лудка, ассоциированных с H. py­ lori, носят противоречивый Оригинальные исследования 4, 2007 характер. Дискутабельна возможность обратного развития предраковых состояний и изменений под влиянием успешно выполненной эрадикационной терапии. Весьма разноречивы данные относительно проведения эрадикации у больных с дистальным РЖ, перенесших субтотальную резекцию желудка [10]. В свою очередь, решение указанных вопросов позволило бы адекватно прогнозировать степень риска возникновения предраковых состояний, рецидивов РЖ после радикальной терапии, улучшить раннюю диагностику рассматриваемых заболеваний и, следовательно, оптимизировать лечение. Цель исследования: определить параметры клеточного обновления СОЖ при заболеваниях, ассоциированных с H. pylori, и на их основе дополнить ранние диагностические критерии прогрессирования структурных изменений СОЖ у пациентов с хроническим атрофическим гастритом, аденоматозными полипами, язвенной болезнью и раком желудка до и после проведения эрадикационной терапии. Материал и методы исследования Обследовано 120 больных с заболеваниями желудка, ассоциированными с H. pylori. Все пациенты разделены на 4 равные группы в зависимости от нозологической формы (ЯБЖ, ХАГ, аденоматозные полипы и РЖ). В группу сравнения вошли 12 практически здоровых лиц. Обследования проводились в динамике по единой программе, включавшей клинические методы, фиброгастродуоденоскопию (ФГДС), общее морфологическое и цитологическое, иммуногистохимическое исследования, гистиобактериоскопию. Эффективность эрадикационной терапии оценивали спустя 2 мес после стихания воспалительных процессов в желудке или после гастрэктомии по поводу РЖ. Материал для цитологического и гистологического исследований забирали из антрального и фундального отделов желудка, фиксировали в 10% забуференном нейтральном формалине, по Лилли, в течение 24 ч с последующей промывкой в проточной воде в течение суток. Затем обезвоживали и заливали в парафин. Для обзорного гистологического изучения депарафинированные серийные срезы толщиной 5–7 мкм окрашивали гематоксилином и эозином. Парафиновые срезы толщиной 4–6 мкм помещали на предметные стекла, покрытые пленкой из поли-L-лизина (Sigma). Для выявления апоптозных ядер исследуемый материал импрегнировали по Мозеру (1995). Иммуногистохимическое исследование проводили с ис­ поль­зованием моноклональных мышиных антител к маркеру пролиферирующих клеток – Ki-67 (1:100, Novocastra) и к антиапоптозному белку Вcl-2 (1:100, Novocastra). В качестве вторых антител использовали универсальный набор, содержащий биотинилированные антимышиные иммуноглобулины. Для визуализации окрасок применяли комплекс авидина с биотинилированной пероксидазой (ABC-kit) с последующим проявлением пероксидазы хрена диаминобензидином (все реагенты от Novocastra). Морфологические изображения, поступающие через оптическую систему микроскопа Nikon Eclipse 400 (увеличение ×320: объектив 40, окуляр 10, фильтр 0,8), регистрировались цифровой цветной видеокамерой Nikon DXM1200, вмонтированной в тубус микроскопа, и передавались в компьютер. Количество Ki-67 (NKi-67)- и Bcl-2 (NBcl-2)-иммунопозитивных ядер клеток автоматически подсчитывалось в 10 рандомизированных полях зрения. При указанном увеличении цифровые данные пересчитывались на 1 мм2 с помощью пакета прикладных морфометрических программ «Видеотест-Морфология 4.0». Гибель клеток в форме апо­ птоза определяли по индексу апоптоза (IАПТ) по формуле: IАПТ (%) = N (число апоптозных ядер, окрашенных по методу Мозера)/N (общее число ядер) ×100. Нами введен показатель Ki-67/IАПТ, наилучшим образом характеризующий состояние клеточного гомеостаза в СОЖ. Статистическую обработку результатов исследования проводили с помощью программы «Excel» на персональном компьютере IBM Pentium 4. Результаты исследования и их обсуждение В ходе иммуногистохимического исследования установлено, что в норме эпителиоциты желудка проявляют низкий потенциал пролиферативной и антиапоптозной активности. При этом NKi-67 составляет 1,3±0,25, а NBcl-2 – 1,1±0,6. IАПТ соответствует пролиферативной активности эпителиоцитов и составляет 0,34±0,02 (см. таблицу). При всех формах заболеваний желудка, ассоциированных с H. pylori, происходит многократное увеличение вектора пролиферативной и антиапоптозной активности эпителиоцитов СОЖ и относительно низкое возрастание IАПТ. Различные пропорции между активностью пролиферации и апоптозом обусловливали развитие соответствующей формы геликобактериоза [2]. Возникновение ЯБЖ ознаменовывалось наименьшим нарушением клеточного гомеостаза и, как следствие, более редкой встречаемостью тотального поражения слизистой оболочки атрофическим процессом, меньшей степенью метапластических и диспластических изменений СОЖ на фоне относительно высокого индекса 21 Оригинальные исследования 4, 2007 Показатели клеточного обновления при различных заболеваниях желудка, ассоциированных с H. pylori до проведения эрадикационной терапии и спустя 2 мес Группа обследованных Количество эпителиоцитов на 1 мм2 слизистой оболочки желудка, иммунопозитивных к Ki-67, Bcl-2, индекс апоптоза и NKi-67/IАПТ, x±mx NKi-67 Практически здоровые (n=12) ЯБЖ (n=30) ХАГ (n=30) ХАГ + аденоматозные полипы (n=30) РЖ (n=30) NBcl-2 NKi-67/IАПТ IАПТ 1,30±0,25 63,20±2,40* 48,80±2,38** 1,10±0,60 9,30±0,56* 7,80±0,49** 3,95±0,85 36,80±1,80* 60,10±4,07** 0,34±0,02 1,73±0,05* 0,83±0,04** 71,40±4,20*** 45,05±3,24** 134,00±3,90**** 103,90±2,80** 197,90±5,50***** 133,90±3,10** 16,00±0,94*** 12,33±0,78** 34,20±2,19**** 28,13±1,42** 53,50±2,72***** 46,10±3,70** 125,00±8,80*** 104,40±8,34** 269,70±15,50**** 220,90±11,90** 337,10±17,70***** 349,10±36,30** 0,57±0,02*** 0,44±0,02** 0,58±0,02 0,48±0,02** 0,63±0,02***** 0,50±0,03** Примечание. Группы обследованных расположены по степени нарастания риска возникновения РЖ. В числителе приведены показатели клеточного обновления до проведения эрадикационной терапии, в знаменателе – спустя 2 мес после ее назначения. *р<0,05 – различие со здоровыми, **р<0,05 – с соответствующим показателем в периоде обострения, ***р<0,05 – с соответствующим показателем при ЯБЖ и ХАГ, ****р<0,05 – с соответствующим показателем при ХАГ и аденоматозных полипах, *****р<0,05 – с соответствующим показателем при аденоматозных полипах и РЖ. 22 апоптоза и частым сохранением секреторной функции желудка. Формирование ХАГ происходило в результате более значимого, чем при ЯБЖ, увеличения разницы между степенью пролиферативных процессов, выраженной через NKi-67 и IАПТ, обусловленной увеличением продукции антиапоптозной молекулы Bcl-2 (рис. 1, 2). При ХАГ значительно чаще по сравнению с ЯБЖ развивались морфологические признаки нарушенного клеточного гомеостаза, доминировали распространенные формы атрофии, кишечной метаплазии и дисплазии СОЖ. При этом степень их выраженности в среднем превосходила таковую при ЯБЖ. Собственные данные свидетельствуют о том, что при еще большем возрастании разницы между NKi-67 и IАПТ у больных ХАГ создаются условия для возникновения аденоматозных полипов и РЖ. Проведенные через 2 мес после эрадикационной терапии иммуногистохимические исследования показали значимое улучшение показателей клеточного обновления у пациентов всех обследованных групп. Резко снижался пролиферативный потенциал эпителиоцитов СОЖ на фоне относительно небольшого сокращения IАПТ. Во всех группах отмечалось и достоверное снижение антиапоптозной активности эпителиоцитов СОЖ, выраженное через NBcl-2. Рис. 1. Гистологическая картина слизистой оболочки антрального отдела желудка при хроническом атрофическом гастрите. Иммуно­ гистохимическая реакция с антителами к Ki-67. Увеличение ×240 Рис. 2. Гистологическая картина слизистой оболочки антрального отдела желудка при хроническом атрофическом гастрите. Иммуно­ гистохимическая реакция с антителами к Bcl-2. Увеличение ×240 Улучшение показателей клеточного гомеостаза при успешно выполненной эрадикации H. pylori объясняется падением активности воспалительного процесса в СОЖ и, как следствие, уменьшением альтеративных процессов, поскольку скорость пролиферации находится в прямой зависимости от степени повреждения клеток. При снижении пролиферативного потенциала уменьшается число клеток с поврежденным геномом, а также функционально и структурно незрелых клеток, в результате чего происходит естественное снижение апоптоза. Получены достоверные данные о снижении экспрессии антиапоптозной молекулы Bcl-2 во всех группах больных через 2 мес после эрадикационной терапии, что способствовало нормализации апоптоза. При этом степень тяжести, объем атрофии и кишечной метаплазии не изменялись. Частота встречаемости дисплазий I и II степени уменьшалась, что, вероятно, связано с их воспалительным характером. Сокращение количества иммунопозитивных к Bcl-2 клеток у пациентов с заболеваниями желудка, ассоциированными с H. pylori, после выполнения эрадикационной терапии под- Оригинальные исследования 4, 2007 черкивает потенциальную обратимость атрофии, метаплазии и диспластических изменений за более длительный, чем 2 мес, период. У больных РЖ после радикального хирургического лечения и проведенной эрадикации отмечалось хотя и достоверное, но менее значимое уменьшение показателей Ki-67, Bcl-2 и IАПТ. Сохраняющиеся после радикальной терапии и эрадикации высокие цифры показателей пролиферации у этой категории больных, превышающие подобные значения у лиц с ХАГ в 2,5–3 раза, дают основание высказать мнение об участии в канцерогенезе не только местных регулирующих онкогенных факторов, таких как H. pylori, но и других повреждающих механизмов, ассоциированных с генетическими дефектами на уровне организма [11, 12]. Собственные наблюдения свидетельствуют об определенном участии H. pylori в формировании аденоматозных полипов, что необходимо учитывать при решении вопроса о тактике ведения подобных больных. Список литературы 1. Аруин Л.И. Из 100 инфицированных Helicobacter pylori рак желудка возникает у двоих. Кто они? // Эксперим. клин. гастроэнтерол. – 2004. – № 1 (внеочередной вып.). – С. 12–18. 2. Аруин Л.И., Капуллер Л.Л., Исаков В.А. Морфологическая диагностика болезней желудка и кишечника. – М.: Триада-Х, 1998. – 496 с. 3. Исаков В.А., Домарадский И.В. Хеликобактериоз. – М.: «ИД Мед­ практика», 2003. – 412 с. 4. Кононов А.В. Гетерогенность воспалительного ответа в популяции при Helicobacter pylori-инфекции // Педиатрия. – 2002. – № 2 (приложение). – С. 124–130. 5. Маев И.В., Зайратьянц О.В., Кучерявый Ю.А. Кишечная метаплазия слизистой оболочки желудка в практике гастроэнтеролога: Выводы 1. Язвенная болезнь желудка, хронический атрофический мультифокальный гастрит, хронический атрофический мультифокальный гастрит с наличием аденоматозных полипов и рак желудка кишечного типа являются стадиями нарушения клеточного обновления слизистой оболочки желудка, связанного с персистенцией H. pylori. 2. Клеточное обновление при всех изученных H. pyloriассоциированных заболеваниях желудка характеризуется прогрессирующим отставанием апоптоза эпителиоцитов слизистой оболочки от скорости пролиферативных процессов. 3. В прогнозировании возникновения и течения H. pyloriассоциированных заболеваний ведущее место принадлежит Ki-67, отражающему степень активности пролиферативных процессов, Bcl-2, характеризующему выраженность антиапоптозной активности, отношению показателя пролиферации к апоптозу эпителиоцитов слизистой оболочки (NKi-67/IАПТ), современный взгляд на проблему // Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. – 2006. – Т. 16, № 4. – С. 38–47. 6. Нургалиева Б.К., Хамидуллина Г.А., Ивашкин В.Т., Бондаренко О.Ю. Регуляция пролиферации и апо­птоза при H. pylori-ассоциированном гастрите и язвенной болезни // Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. – 2005. – Т. 15, № 6. – С. 29–34. 7. Correa P. Human gastric carcino­ genesis: a multistep and multi­ factorial process // Cancer Res. – 1992. – Vol. 52. – P. 6735–6740. 8. Ljubicic N., Kujundzic M., Roic G. et al. Benign epithelial gastric polyps frequency, location, and age and sex distribution // Coll. Anthropol. – 2002. – Vol. 26, N 1. – P. 55–60. 9. Penta R., De Falco M., Iaquinto G., De Luca A. Helicobacter pylori and gastric epithelial cells: from степени атрофии фундального отдела желудка и pH желудочного сока. 4. Адекватно проведенная эрадикационная терапия достоверно улучшает показатели клеточного обновления при всех формах H. pylori-ассоциированных заболеваниях, что сопровождается уменьшением отношения пролиферации к апоптозу, а также снижением частоты и степени тяжести диспластических изменений уже через 2 мес после проведенного лечения. При этом вероятность прогрессирования H. pylori-ассоциированных заболеваний значительно снижается. 5. Значимое улучшение показателей клеточного обновления эпителиоцитов слизистой оболочки желудка при всех изученных формах H. pylori-ассоциированных заболеваний после адекватно проведенной эрадикационной терапии не сопровождалось полным восстановлением клеточного гомеостаза. При этом отношение пролиферации к апоптозу было многократно сдвинуто в сторону пролиферации, что обусловливает сохранение атрофических изменений. gastritis to cancer // J. Exp. Clin. Cancer Res. – 2005. – Vol. 24, N 3. – Р. 337–345. 10. Sung J.J., Lin S.R., Ching J.Y. et al. Atrophy and intestinal metaplasia one year after cure of H. pylori infection: a prospective, randomized study // Gastroenterology. – 2000. – Vol. 119. – P. 7–14. 11. Zhang Z., Yuan Y., Gao H. et al. Apoptosis, proliferation and p53 gene expression of H. pylori associated gastric epithelial lesions // World J. Gastroenterol. – 2001. – Vol. 7, N 6. – P. 779–782. 12. Zhuang X., Lin S., Zheng J. et al. The prognostic research of expression and relationship between Helicobacter pylori of c-met onco­gene correlation with gastric mucosal proliferation // Zhonghua Nei Ke Za Zhi. – 2001. – Vol. 40, N 6. – P. 381–384. 23
