Новые технологии в молекулярной диагностике инфекционных

Новые технологии в молекулярной диагностике
инфекционных, наследственных и
онкологических заболеваний
Филатова Людмила
К.б.н
Менеджер по продукции
Генетические технологии – не роскошь, а средство (
Новые технологии в молекулярной диагностике инфекционных, наследственных и
онкологических заболеваний
Основные направления развития
диагностических технологий, использующих
ПЦР
♦Мультиплексный анализ
♦Миниатюризация
♦Автоматизация
Повышение пропускной способности
Снижение стоимости определения одного параметра/аналита
Новые технологии в молекулярной диагностике инфекционных, наследственных и
онкологических заболеваний
Процедура анализа в молекулярной диагностике
♦Пробоподготовка (выделение ДНК/РНК)
♦Амплификация
♦Детекция
♦Интерпретация результатов
Новые технологии в молекулярной диагностике инфекционных, наследственных и
онкологических заболеваний
Пробоподготовка
Автоматические станции пробоподготовки:
♦Минимизация ручного труда/ошибок оператора
♦Снижение риска перекрёстной и внешней контаминации
♦В зависимости от исходного материала и используемой технологии
выделения возможно существенное сокращение времени работы (20-30
мин)
♦Доступны системы различной производительности для адаптации к
нуждам лаборатории
♦Простая интеграция с ЛИС
Новые технологии в молекулярной диагностике инфекционных, наследственных и
онкологических заболеваний
Пробоподготовка
Автоматические станции пробоподготовки:
iPrep
Bullet
Arrow
Новые технологии в молекулярной диагностике инфекционных, наследственных и
онкологических заболеваний
Система MutaCHIP - мультиплексный анализ на
макрочипах
1. ПЦР (~1.5 часа)
2. Гибридизация (2 часа)
3-4. Автоматические детекция и
интерпретация результатов (1 мин)
Биотинилированные ампликоны
Конъюгат ПХ-СА
ТМБ
Гибридизация
Новые технологии в молекулярной диагностике инфекционных, наследственных и
онкологических заболеваний
Система MutaCHIP - мультиплексный анализ на
макрочипах
1. Дигидропиримидин дегидрогеназа (DPYD)
дезактивирует 5-FU, препарат, применяемый при
онкологических заболеваниях.
2. Некоторые мутации приводят к снижению
активности фермента и увеличивают риск
токсических побочных эффектов. Применение стандартных доз 5-FU к пациентам, гомозиготным по
полиморфизму *2А, может привести к летальному исходу.
3. FDA не рекомендует прописывать 5-FU пациентам с дефицитом активности DPYD.
Новые технологии в молекулярной диагностике инфекционных, наследственных и
онкологических заболеваний
Перечень наборов MutaCHIP
♦ MutaCHIP TAMOX (полиморфизм CYP2D6, подбор дозы
тамоксифена)
♦ MutaCHIP 5-FU (полиморфизм DPYD, подбор дозы 5-FU)
♦ MutaCHIP CYTO (полиморфизм генов лекарственного метаболизма:
CYP2C9, CYP2C19, CYP3A5, CYP2D6, DPYD)
♦ MutaCHIP CF (диагностика муковисцидоза, 47 мутаций)
♦ MutaCHIP FOOD (диагностика предрасположенности к пищевой
непереносимости – гиполактазия, целиакия и т.п.)
♦ MutaCHIP CARDIO (мутации АПФ, полиморфизмы ApoE, FV/II,
МТГФР, CETP
♦MutaCHIP OSTEO (мутации в генах COL1A1, рецепторов эстрогена,
кальцитонина, витамина D3)
Новые технологии в молекулярной диагностике инфекционных, наследственных и
онкологических заболеваний
Автоматический ПЦР-анализатор Наночип 400
1. ПЦР (~1.5 часа)
2-4. Полностью автоматизированные процедуры
гибридизации, детекции и интерпретации результатов (64
образца/6 часов, до 192 )
♦ Чип = микрореактор, через который можно последовательно
прокачивать различные растворы
♦ В одном чипе можно анализировать образцы от разных
пациентов по нескольким (до нескольких десятков)
параметров
♦ Чип многоразового использования (до 10 загрузок в течение
2 мес. после первого использования)
Новые технологии в молекулярной диагностике инфекционных, наследственных и
онкологических заболеваний
Кол-во образцов
Чипы высокой
плотности
Real-time
PCR
Кол-во маркеров
Новые технологии в молекулярной диагностике инфекционных, наследственных и
онкологических заболеваний
Перечень наборов Наночип 400
♦ CF 14 (диагностика муковисцидоза, 14 мутаций); готовится к
выпуску CF 20
♦AJP 11 (диагностика дефицита альфа1-антитрипсина, синдрома
Блума, апластической анемии Фанкони, семейной дизавтономии,
болезни Гоше, муколипидоза IV и т.д., 18 мутаций)
♦ CYP (полиморфизмы генов цитохрома P450: CYP2C9/VKORC1 (14
полиморфизмов), CYP2D6 (18 полиморфизмов), CYP2C19 (7
полиморфизмов)
♦Инфекционные панели (HPV, респираторная, трансплантационная,
гастро- панели, MTB, сепсис, возбудители передающиеся половым
путем)
Новые технологии в молекулярной диагностике инфекционных, наследственных и
онкологических заболеваний
Основные направления развития
диагностических технологий, использующих
ПЦР
♦Мультиплексный анализ
♦Миниатюризация
♦Автоматизация
Новые технологии в молекулярной диагностике инфекционных, наследственных и
онкологических заболеваний
Метод MLPA (мультиплексная амплификация
лигазно-связанных проб)
Необходимое оборудование
♦ Амплификатор и секвенатор.
♦ Получение результата в течение 24 часов.
♦ До 96 образцов исследуются в одном эксперименте.
+
Новые технологии в молекулярной диагностике инфекционных, наследственных и
онкологических заболеваний
Метод MLPA (мультиплексная амплификация лигазносвязанных проб)
Последовательность, комплементарная
ПЦР-праймеру X
1. Денатурация и гибридизация
Комплементарная
последовательность
Последовательность,
комплементарная ПЦРпраймеру Y
ДНК А
2. Лигирование
Вставка
ДНК Б
3. ПЦР
Лигаза
ДНК А
Лигаза
Каждый ампликон имеет уникальную длину 130-480 по
ДНК Б
4. Разделение ампликонов капиллярным электрофорезом
Новые технологии в молекулярной диагностике инфекционных, наследственных и
онкологических заболеваний
Как работает MLPA
♦ Один зонд для MLPA состоит из двух олигонуклеотидов.
♦ Если последовательность, комплементарная зонду, присутствует в
образце, то оба олигонуклеотида гибридизуются друг за другом.
♦ Гибридизованные олигонуклеотиды сшивает лигаза.
♦ Лигированные олигонуклеотиды становятся единым зондом и
амплифицируются в ПЦР. Происходит амплификация не нуклеиновых
кислот образца, а зонда.
♦ ПЦР характеризуется высокой воспроизводимостью, поскольку в
реакции принимает участие только одна пара праймеров для
амплификации всех зондов.
♦ Каждый зонд образует продукт амплификации уникальной длины.
♦ Продукты амплификации (размеры от 130 до 480 нуклеотидов)
анализируют методом капиллярного электрофореза.
♦ Различия в относительных количествах последовательностей ДНК
отражаются на высоте соответствующих пиков в референсном и
исследуемом образцах.
Новые технологии в молекулярной диагностике инфекционных, наследственных и
онкологических заболеваний
Перечень наборов MLPA для
♦ Пренатальной и постнатальной диагностики
♦ Диагностики нейрогенетических заболеваний и врождённого
слабоумия
♦ Диагностики наследственных видов рака
♦ Характеристики опухолей
♦ Фармакогенетики
♦ Наборы для определения статуса метилирования
(эпигенетические заболевания, онкодиагностика)
Новые технологии в молекулярной диагностике инфекционных, наследственных и
онкологических заболеваний
Преимущества MLPA
♦ Можно единовременно анализировать до 50 последовательностей,
полученных из одного образца ДНК.
♦ Для анализа достаточно 20 нг ДНК (3000 клеток/0,5 мл
амниотической жидкости), возможно использование частично
деградировавших образцов.
♦ Различает последовательности, отличающиеся всего одним
нуклеотидом.
♦ Идентичный протокол для различных приложений увеличивает
воспроизводимость и упрощает работу.
♦ Высокая производительность: результаты для 96 образцов (по
макс. 50 параметрам каждый) доступны через 24 часа.
♦ Программное обеспечение секвенатора подразумевает точную,
объективную и воспроизводимую идентификацию продуктов и
автоматическое архивирование данных.
Новые технологии в молекулярной диагностике инфекционных, наследственных и
онкологических заболеваний
Спасибо за внимание!
Новые технологии в молекулярной диагностике инфекционных,
наследственных и онкологических заболеваний