На правах рукописи ГУЩИН Владимир Алексеевич
advertisement
На правах рукописи ГУЩИН Владимир Алексеевич ОСОБЕННОСТИ ВНУТРИКЛЕТОЧНОГО ТРАНСПОРТА МАЛЫХ НЕСТРУКТУРНЫХ БЕЛКОВ ВИРУСОВ РАСТЕНИЙ, ОПРЕДЕЛЯЮЩИХ ВИРУЛЕНТНОСТЬ И ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ С ХОЗЯИНОМ 03.01.03 – Молекулярная биология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание степени кандидата биологических наук Москва 2013 Работа выполнена на кафедре вирусологии биологического факультета и в отделе биохимии вирусов растений НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова». Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Морозов Сергей Юрьевич Официальные оппоненты: Завриев Сергей Кириакович, доктор биологических наук, профессор, чл.-корр. РАСХН, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН), заведующий лабораторией. Лазаревич Наталия Леонидовна, доктор биологических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение «Российский онкологический научный центр имени Н.Н.Блохина» Российской академии медицинских наук, заведующая лабораторией. Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи" Министерства здравоохранения Российской Федерации Защита состоится «28» февраля 2013 г. в 11.00 часов на заседании Совета Д 501.001.76 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова» по адресу: 119234, Москва, Ленинские Горы, д.1, стр. 12, МГУ, Биологический факультет, ауд. 389. С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке МГУ имени М.В.Ломоносова (Фундаментальная библиотека, Ломоносовский проспект, 27, отдел диссертаций). Автореферат разослан « ___» января 2013 года. Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук Крашенинников И.А. 1 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы Изучение вирусных белков, определяющих патогенность и взаимодействие с хозяином, является важной задачей современной молекулярной вирусологии. Согласно данным последнего десятилетия, полученным с применением высокопроизводительных методов секвенирования нуклеиновых кислот, выделенных из материала различных образцов окружающей среды, разнообразие вирусов гораздо шире, чем предполагалось ранее (Roossinck et al., 2010; Roossinck, 2011a, c, d; Culley, 2011; Mokili et al., 2012). Значительная часть обнаруженных таким путем вирусов при инфекции не вызывает симптомов болезней или ухудшения состояния организма хозяина, а порой придает дополнительные свойства. Таким образом, восприятие вируса как объекта, приносящего исключительно вред, трансформируется, а вопрос изучения факторов, приводящих к появлению и усилению патогенности, становится еще актуальнее. Всестороннее изучение феномена «патогенности» создает потенциал, который можно будет использовать для предотвращения или уменьшения последствия вирусного заражения, повышая, таким образом, качество жизни человека, экологию, а также улучшая рентабельность сельскохозяйственных производств. Одним из основных направлений, несомненно, является изучение патогенности вирусов на молекулярном уровне. Известно, что вирусы, помимо факторов, необходимых для репликации и сборки вириона, кодируют белки, которые для них не являются жизненно необходимыми. Между тем, данные белки могут значительно влиять на патогенность вируса (Yelina et al., 2005; Lukhovitskaya at al., 2005a, b; Lukhovitskaya at al., 2009). Известно, что некоторые из этих белков являются супрессорами посттранскрипционного умолкания генов (ПТУГ), тогда как функция других на сегодняшний день не вполне понятна. Одним из таких является белок ОРТ6 (открытая рамка трансляции 6) вируса табачной мозаики (ВТМ), рассматриваемый в настоящей работе. Ген этого белка перекрывается с открытыми рамками трансляции транспортного белка (ТБ) и белка оболочки (БО) и, предположительно, кодирует полипептид массой 4-5 кДа (Morozov et al., 1993). Похожие по размеру и последовательности ОРТ6 можно обнаружить у всех представителей субгруппы тобамовирусов 1а (Ikeda et al., 1993; Morozov et al., 1993). Ранее в нашей лаборатории было показано, что ОРТ6 вируса томатной мозаики (ВТоМ) штамма L (LОРТ6) способен к образованию стабильного комплекса с фактором элонгации трансляции eEF1A in vitro (Morozov et al., 1993; Fedorkin et al., 1995). Кроме того известно, что мутация гена ОРТ6 ВТМ штамма U1 (U1-ОРТ6) ведет к уменьшению патогенности ВТМ, 2 тогда как его экспрессия в составе геномов вируса погремковости табака (ВПТ) и Х – вируса картофеля (ХВК) усиливает патогенез этих вирусов (Canto et al., 2004). Несмотря на то, что L-ОРТ6 и U1-ОРТ6 занимают похожие позиции в геномах родственных вирусов, а также имеют умеренно сходные аминокислотные последовательности (Morozov et al., 1993), на сегодняшний день неясно, насколько сходные свойства они проявляют in vivo и каковы их функции. Цель и задачи исследования: Целью данной работы является сравнительный анализ малых неструктурных белков L-ОРТ6 и U1-ОРТ6. Для достижения поставленной цели решались следующие основные научные задачи: 1. Изучение способности данных белков определять характер вирусной инфекции. Создание конструкций на основе инфекционных копий ВТоМ и ВПТ, экспрессирующих различные варианты ОРТ6. Изучение симптомов, вызываемых созданными вариантами вирусов на различных растениях-хозяевах. 2. Картирование детерминанты патогенности в составе последовательности L- и U1-ОРТ6 с использованием точечного мутагенеза и гибридных последовательностей, содержащих Nи C-конец от разных ОРТ6. 3. Изучение внутриклеточной локализации белков L- и U1-ОРТ6 в клетках эпидермиса листа N. benthamiana с использованием метода временной экспрессии ОРТ6 в одной рамке трансляции с GFP. 4. Поиск последовательностей, ответственных за внутриклеточную локализацию L- и U1ОРТ6, с использованием точечного мутагенеза и гибридных последовательностей, содержащих N- и C-конец от разных ОРТ6. 5. Исследование взаимодействия между L-ОРТ6 и eEF1A in vitro. 6. Изучение способности связывания нуклеиновых кислот белком L-ОРТ6 in vitro. Научная новизна и практическая ценность работы В работе впервые проведена сравнительная характеристика белков L- и U1-ОРТ6. Во-первых, показано, что белок L-ОРТ6, в отличие от белка U1-ОРТ6, не усиливает патогенез ВТоМ. Во-вторых, L-ОРТ6, экспрессированый в составе вируса погремковости табака (ВПТ), лишь слегка усиливает патогенность вируса, тогда как U1-ОРТ6 вызывает некроз стебля и гибель растения. С использованием точечных мутантов, а также гибридных вариантов последовательности ОРТ6 с N-и C-концами от L- или U1-ОРТ6, определены детерминанты патогенности обоих белков в С-концевом районе. В-третьих, изучена субклеточная локализация белков, которая, как оказалось, также является различной. Белок U1-ОРТ6 первоначально обнаруживается в ядрышке и ядре, но в 3 дальнейшем перемещается в митохондрии, тогда как L-ОРТ6 находится в ассоциации с мембранами эндоплазматического ретикулума (ЭПР) все время наблюдения. В работе проведено картирование последовательностей, ответственных за различия во внутриклеточной локализации этих белков. В работе впервые представлены эксперименты по связыванию белком L-ОРТ6 нуклеиновых кислот. Показано, что мутация Ile>11>Thr в составе аминокислотной последовательности L-ОРТ6, блокирующая образование комплекса с фактором элонгации трансляции eEF1A, нарушает также кооперативность связывания белка с нуклеиновыми кислотами. Результаты данной работы могут быть использованы в практике научных исследований в области вирусологии и молекулярной биологии, а также при чтении курсов лекций по вирусологии на биологических факультетах. Апробация работы Диссертация была апробирована на совместном заседании кафедры вирусологии Биологического факультета и отдела биохимии вирусов растений НИИ физикохимической биологии имени А.Н. Белозерского МГУ имени М.В. Ломоносова. Результаты работы были доложены на семинарах кафедры вирусологии, на международных конференциях: «Информационные технологии в медицине, биологии и экологии» 2010, 2011, 2012 гг. (г. Ялта, Украина), а также на ежегодной конференции для аспирантов института Джеймса Хаттона 2011 г. (г. Данди, Шотландия). Публикации По материалам диссертации опубликованы 6 печатных работ. Из них статьей в реферируемых журналах – 2, материалов международных конференций - 4. Структура работы Диссертация состоит из глав: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение», «Выводы» и «Список литературы». Диссертация изложена на _____ страницах, содержит ___ рисунок и включает следующие разделы: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение результатов», «Выводы» и «Список цитируемой литературы» ( _____ цитируемая работа). СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Мутация инициаторного кодона ОРТ6 не влияет на патогенность ВТоМ Ранее было показано, что мутация стартового кодона ОРТ6 ВТМ в составе инфекционной копии ведет к снижению патогенности вируса (Canto et al., 2004). В настоящей работе в инфекционную копию ВТоМ (Kubota at al., 2003) была внесена 4 аналогичная мутация AUG > ACG, разрушающая стартовый кодон, но оставляющая без изменения аминокислотную последовательность ТБ, находящуюся в другой рамке трансляции. Кэпированные транскрипты полученной конструкции ВТоМ[-ОРТ6], а также дикого типа ВТоМ инокулировали в два нижних листа растений N. benthamiana различного возраста (2-10 недель). В обоих случаях инокулированные растения погибали через 7-10 дней после инфекции (д.п.и.) (Рис. 1А,В). Для проверки наличия мутации в нужном положении тотальная РНК из верхних листьев растений, зараженных обоими вариантами, подвергалась обратной транскрипции с вирус-специфичным праймером. После чего интересующая область, содержащая мутацию, амплифицировалась с соответствующими праймерами и секвенировалась. При этом не было обнаружено реверсий мутации к дикому типу. Также не было обнаружено мутаций в других положениях секвенированного фрагмента. Таким образом, влияния ОРТ6 на патогенность ВТоМ на N. benthamiana установлено не было. Этот результат был перепроверен на других растениях-хозяевах. Симптомы, вызываемые вирусом дикого типа и мутанта в системных листьях, были сходными и развивались с одинаковой скоростью на растениях N. clevelandii (изменение формы листовой пластинки) (Рис. 1С), N. tabacum cv. Samsun nn (мозаика) и томата (изменение формы листа и мозаика) (данные не показаны). В дополнение к визуальной оценке и контролю с помощью ПЦР и секвенирования, образцы РНК из N. benthamiana и N. clevelandii зараженных растений были использованы для Нозерн-блот анализа с использованием ВТоМ-специфичной пробы (Рис. 1D). Образцы отбирались со всех листьев с интервалом 2-3 дня в течение 3-х недель или до гибели растения (в случае с N. benthamiana). В результате этих экспериментов было показано отсутствие разницы в накоплении вирус-специфичной РНК в растениях, зараженных ВТоМ и ВТоМ[-ОРТ6], что сочетается с результатами, полученными на ВТМ (Canto at al., 2004). Кроме того, для определения возможного влияния мутации ОРТ6 на межклеточный транспорт ВТоМ проводилась оценка размера некрозов, вызываемых ВТоМ и ВТоМ[ОРТ6] на соседних половинах одного и того же листа некротических хозяев N. tabacum cv. Xanthi NN и N. tabacum cv. Samsun NN. Статистически достоверной разницы в размерах некрозов, нормированных на лист, обнаружено не было (данные не показаны). Таким образом, ОРТ6 не проявлял видимого влияния на патогенность ВТоМ, распространение вируса и накопление вирусной РНК на всех протестированных растениях-хозяевах. 5 Рис. 1. Анализ симптоматики и накопления вируса в растениях, зараженных ВТоМ и ВТоМ[-ОРТ6]. Растения N. benthamiana на 6й и 12й д.п.и. (А и В, соответственно) и растения N. clevelandii на 10 д.п.и. (С). Левое растение на каждой картинке было заражено ВТоМ и правое ВТоМ[-ОРТ6]. (D) Нозерн-блот анализ образцов тотальной РНК N. benthamiana, меченных ВТоМ-специфичной пробой. С - контроль (РНК образец из незараженного растения). Числа сверху обозначают позицию листа выше инокулированного. В качестве контроля нанесения использовано окрашивание тотальной РНК бромистым этидием и приведено под каждой панелью. 6 Влияние белков L- и U1-ОРТ6 и их гибридов на патогенез ВПТ Ранее было показано, что U1-ОРТ6 усиливает патогенность неродственных вирусов, таких как ХВК и ВПТ (Canto et al., 2004). Для того чтобы изучить способность LОРТ6 усиливать патогенез ВПТ, а также сравнить с эффектом U1-ОРТ6 (Canto et al., 2004), был сконструирован вектор ВПТ[L-ОРТ6], экспрессирующий L-ОРТ6 в составе РНК 2 ВПТ. Растения N. benthamiana инокулировались соответствующим кэпированным транскриптом РНК 2 и немодифицированным кэпированным транскриптом РНК1 ВПТ. В качестве контроля использовался вариант РНК 2, несущей ген GFP вместо ОРТ6, что приводило к слабым симптомам, выражающимся в небольшом изменении формы верхних листьев, зараженных системно (Рис. 2A,B). Кроме того, экспрессию GFP этого контроля наблюдали под ультрафиолетовой лампой со 2-го д.п.и. в инокулированных листьях и после 4-го д.п.и. в системно зараженных листьях (данные не показаны). На растениях, зараженных ВПТ[L-ОРТ6] и ВПТ[U1-ОРТ6], кроме деформации системных листьев, наблюдался некроз (Рис. 2С,D), который был слабее в случае ВПТ[L-ОРТ6]. Кроме того, на растениях зараженных ВПТ[U1-ОРТ6] проявлялся сильный некроз стебля, который приводил к отмиранию апикальной части растения через 6 д.п.и. В случае с ВПТ[L-ОРТ6] такого эффекта не наблюдалось и на более поздних стадиях. Таким образом, оба варианта ОРТ6 были способны усиливать патогенность ВПТ, хотя в разной степени. Сравнение аминокислотных последовательностей L-ОРТ6 и U1-ОРТ6 показывает умеренный уровень сходства в N-концевой и центральной областях (Рис. 3), тогда как в Сконцевой части обнаруживаются наибольшие различия. С-концевая часть U1-ОРТ6 на 6 аминокислот длиннее, и в то же время, является менее гидрофобной (Kyte & Doolittle 1982). Чтобы проверить связаны ли различия в аминокислотной последовательности Сконцевой части ОРТ6 ВТоМ и ВТМ с их биологическим эффектом были сконструированы рекомбинантные варианты ОРТ6, у которых N- и С-концевые части происходили от разных ОРТ6 (Рис. 3). Полученные рекомбинантные ОРТ6 были клонированы в составе РНК 2 ВПТ, как и дикие типы. Таким образом, ВПТ[U1::L-ОРТ6] включал в своем составе N-концевую часть от U1-ОРТ6 и С-концевую от L-ОРТ6, тогда как ВПТ[L::U1- ОРТ6], наоборот, N-концевой район от L-ОРТ6 и С-концевую область от U1-ОРТ6. Инокуляция растений транскриптами этих конструкций с РНК 1 ВПТ показала, что ВПТ[U1::L-ОРТ6] вызывал симптомы, сходные с ВПТ[L-ОРТ6] (Рис. 2F), тогда как растения, зараженные ВПТ[L::U1-ОРТ6], имели симптомы, сходные с ВПТ[U1-ОРТ6] и выражающиеся в отмирании апикальной части растения (Рис. 2Е). 7 Рис. 2. Влияние L- и U1-ОРТ6 белков и их гибридов на патогенез ВПТ на растениях N. benthamiana. (А) - Незараженные растения, (B) – растения, зараженные ВПТ[GFP], (С) – ВПТ[L-ОРТ6], (D) – ВПТ[U1ОРТ6], (E) – ВПТ[L::U1-ОРТ6], (F) – ВПТ[U1::L-ОРТ6], (G) – ВПТ[L-ОРТ6-HYDR] и (H) – ВПТ[U1-ОРТ6RK]. Все фотографии сделаны на 6 д.п.и. 8 Таким образом, присутствие С-концевой части от U1-ОРТ6 было сопряжено с более суровыми симптомами, такими как скручивание листьев и некроз стебля, сопровождающееся отмиранием апикальной части зараженного растения, тогда как Сконцевая часть от L-ОРТ6 коррелировала с более мягкими симптомами. Для оценки накопления вирусной РНК был проведен Нозерн-блот анализ с РНК2 ВПТ-специфичной пробой. Связи между степенью проявления симптомов и количеством вирусной РНК не обнаружилось (данные не показаны). Эти данные свидетельствуют о том, что патогенность U1-ОРТ6 ассоциирована с С-концевой частью белка, которая длиннее и менее гидрофобная, чем соответствующая часть у L-ОРТ6. Рис. 3. Схема генома тобамовирусов и варианты ОРТ6, используемые в работе. (А) Отмечено положение открытых рамок трансляции РНК-зависимой РНК-полимеразы (РЗРП), транспортного белка (МР), белка оболочки (СР), а также ОРТ6 (ORF6). (В) Выравнивание последовательностей L- и U1-ОРТ6. Идентичные аминокислоты отмечены звездочками, тогда как похожие – знаком плюс. Приведены гибридные последовательности ОРТ6, а также мутантные последовательности, используемые в работе. Для дальнейшей характеристики детерминант патогенности в аминокислотной последовательности ОРТ6 были сделаны конструкции ВПТ[L-ОРТ6-HYDR], с заменами гидрофобных остатков L-ОРТ6 в С-концевой части на менее гидрофобные и ВПТ[U1ОРТ6-RK], в которой положительно заряженные остатки аргинина в N-концевой части U1-ОРТ6 были мутированы на нейтральные (Рис. 3). Не было обнаружено влияния мутации положительно заряженных остатков в N-концевой части U1-ОРТ6, что согласуется с данными о значении именно С-концевой части белка как детерминанты патогенности (Рис. 2H). ВПТ[L-ОРТ6-HYDR] вызывал мягкие симптомы, схожие с ВПТ[GFP] (Рис. 2G), что свидетельствует о том, что не повышенная гидрофильность U19 ОРТ6 сама по себе определяет патогенные свойства, но специфические аминокислотные остатки в этой области играют роль в определении этого фенотипа, а также то, что детерминанта патогенности L-ОРТ6 также находится в С-концевом районе белка. Субклеточная локализация L- и U1-ОРТ6 и их гибридов. Для анализа субклеточной локализации гены L- и U1-ОРТ6 были слиты в одной рамке трансляции с YFP в составе бинарного вектора. Данные конструкции, в дальнейшем, использовались для экспрессии белков посредством агробактериальной трансформации клеток эпидермиса листа N. benthamiana. Наблюдения проводили с использованием сканирующего конфокального микроскопа. Для визуализации субклеточных структур использовались трансгенные растения, экспрессирующие красный или зеленый флуоресцентные белки (mRFP или GFP), слитые в одной рамке трансляции с белками маркерами различных компартментов: ядерный маркер H2B-mRFP, гистон H2B (Martin et al., 2009), маркер ядрышка AtFib2-mRFP, фибрилларин (Goodin et al., 2007), маркер аппарата Гольджи ST-mRFP, N-концевая последовательность фермента сиалилтрансферазы крысы, маркер плазмодесм (ПД) MP-GFP, ТБ ВТМ, и маркер ЭПР ERGFP, где GFP находится в одной рамке с ЭПР-направляющим сигналом на N-конце и ЭПР-удерживающим сигналом на С-конце (HDEL). Кроме того, в качестве контроля использовался свободный YFP, который локализовался в цитоплазме и ядре, но не в ядрышке (Рис. 4). Было обнаружено, что U1-ОРТ6-YFP, на 1-2 д.п.и., локализуется преимущественно в ядрышке, концентрируясь на его периферии (Рис. 4А). Позднее, на 3-4 д.п.и., сигнал наблюдался в основном в цитоплазматических тельцах 0,8-1 мкм неизвестной природы (Рис. 4В). Небольшая часть цитоплазматических телец начинала появляться на 1-2 д.п.и., в то время как большая часть сигнала концентрировалась в ядрышке. Позднее, увеличение количества популяции цитоплазматических телец было сопряжено с уменьшением сигнала в ядре и ядрышке, вплоть до его полного исчезновения. Цитоплазматические тела не ко-локализовались с маркером аппарата Гольджи (данные не показаны). Для того чтобы понять природу цитоплазматических телец аминокислотная последовательность U1-ОРТ6 была проанализирована с использованием программ TargetP и WOLF PSort. Обе программы предсказывали локализацию U1-ОРТ6-YFP в митохондриях с высокой вероятностью. Чтобы подтвердить эти данные, конструкция U1-ОРТ6-YFP была экспрессирована в клетках эпидермиса листа с последующей их обработкой прижизненным красителем митохондрий MitoTracker Red перед просмотром. Как и ожидалось, наблюдалась полная ко-локализация U1-ОРТ6-YFP с маркером митохондрий (Рис. 4С). 10 Рис. 4. Субклеточная локализация белков U1- и L-ОРТ6 и их гибридов, слитых в одной рамке трансляции с YFP в клетках эпидермиса листа трансгенных растений N. benthamiana, экспрессирующих маркер ядрышка фибрилларин (AtFib2), слитый с mRFP (А,D,F), или ядерный маркер H2B, слитый с mRFP (B,E,G). (А) Локализация U1-ОРТ6 на 1–2 д.п.и., (В) - U1-ОРТ6 на 3–4 д.п.и., (С) - U1-ОРТ6 ко-инфильтрированный с маркером митохондрий MitoTracker Red на 3 д.п.и., (D) - свободный YFP на 1–4 д.п.и., (E) - L-ОРТ6 на 1–4 д.п.и., (F) - L::U1-ОРТ6 на 1–4 д.п.и. и (G) - U1::L-ОРТ6 на 1–4 д.п.и.. Кроме микрофотографий, показывающих клетку целиком (слева), приведены микрофотографии одиночных оптических срезов тонких структур ядра (справа). Голубые тельца – автофлуоресцирующие хлоропласты. Масштабная линейка соответствует, 20 мкм (на микрофотографиях, показывающих клетку целиком); 5 мкм (на одиночных оптических срезах). 11 Рис. 5. Субклеточная локализация U1-ОРТ6, слитого в одной рамке трансляции с YFP, в растениях N. benthamianaм на 3 д.п.и. (А,С) – нетрансгенных и (B,D) – трансгенных растениях N. benthamiana, экспрессирующих маркер плазмодесм MP-GFP. Плазмолиз был индуцирован инфильтрацией листа 0,75М раствором сорбитола для отделения плазматической мембраны (PM) от клеточной стенки (CW) (С,D). Все микрофотографии, показывающие часть клетки, являются единичным оптическим срезом кроме (А) слева. Голубые тельца – автофлуоресцирующие хлоропласты. Масштабная линейка соответствует 20 мкм (на микрофотографиях, показывающих клетку целиком); 5 мкм (на одиночных оптических срезах, показывающих периферию). 12 В предыдущем исследовании было показано, что U1-ОРТ6-YFP локализуется в точках на периферии и что эти точки ко-локализуются с плазмодесмами (Canto et al., 2004). В настоящем исследовании эти данные были опровергнуты. Используя технику сканирования по Z, с последующим наложением слоёв, было показано, что U1-ОРТ6-YFP локализуется по всей периферии клетки (Рис. 5А, слева), тогда как одиночные оптические срезы действительно давали похожую на ПД-подобную локализацию (Рис. 5А, справа), как у Canto et al. (2004). Для получения дополнительного подтверждения отсутствия колокализации с ПД были использованы два подхода. В первом подходе использовались трансгенные растения, экспрессирующие маркер плазмодесм MP-GFP (Рис. 5B). Во втором подходе использовалась техника плазмолиза клеток эпидермиса листа с помощью 0.75 М сорбитола, с целью отделения плазмалеммы от клеточной стенки (Рис. 5С). Также была применена техника, объединяющая оба подхода (Рис.5D). Эти эксперименты показали, что U1-ОРТ6-YFP ассоциируется с цитоплазматической фракцией, отходящей вместе с плазмалеммой, но не клеточной стенкой (Рис. 5C,D). Таким образом, можно заключить, что U1-ОРТ6-YFP локализуется в митохондриях, а не плазмодесмах. В отличие, от U1-ОРТ6, L-ОРТ6 локализовался в цитоплазме в ассоциации с полигональной сетью ЭПР и ядерной оболочкой (Рис. 4E), так как наблюдалась колокализация с маркером ЭПР (Рис. 6). Стоит также отметить, что эта локализация не менялась в течение всего времени наблюдения (на 1-4 д.п.и.). Рис. 6. Субклеточная локализация L-ОРТ6, слитого в одной рамке трансляции с YFP, в трансгенных растениях N. benthamiana, экспрессирующих маркер ЭПР (ER-GFP). Представлен одиночный оптический срез. Масштабная линейка соответствует 5 мкм. Так как было показано, что С-концевая часть ОРТ6 определяет патогенные свойства, то в ходе дальнейшего исследования была проанализирована субклеточная локализация гибридных рекомбинантных молекул U1::L-ОРТ6 и L::U1-ОРТ6, описанных 13 выше. Также как и варианты молекул дикого типа, гены гибридных молекул были слиты в одной рамке трансляции с YFP в составе бинарного вектора, и в дальнейшем, использовались в экспериментах по агроинфильтрации на трансгенных растениях, экспрессирующих маркер ядра mRFP-H2B или ядрышка AtFib2-mRFP. Было обнаружено, что L::U1-ОРТ6-YFP локализуется преимущественно в ядрышке, а также диффузно в нуклеоплазме и цитоплазме, в то время как никаких признаков локализации в митохондриях обнаружено не было (Рис. 4F). Такая локализация наблюдалась в течение всего времени эксперимента (1-4 д.п.и.). Напротив, U1::L-ОРТ6 гибрид ассоциировался с мембранами ЭПР, но не ядром или ядрышком (Рис. 4G). Такое распределение также наблюдалось на протяжении 1-4 д.п.и. Таким образом, для митохондриальной локализации нужна либо полная последовательность U1-ОРТ6 (N-концевая и С-концевая), либо, в случае с U1::L-ОРТ6, N-концевой сигнал митохондриальной локализации подавляется активностью ЭПР-направляющего сигнала в С-концевой части L-ОРТ6. Детерминанты субклеточной локализации L- и U1-ОРТ6 Как уже отмечалось ранее, анализ аминокислотной последовательности L-ОРТ6 показал, что С-концевая область является более гидрофобной, чем у U1-ОРТ6 (Рис. 3). Кроме того, присутствие С-конца L-ОРТ6 в составе гибрида U1::L-ОРТ6 давало локализацию идентичную локализации L-ОРТ6, в ассоциации с ЭПР и не менялась со временем наблюдения. Для проверки гипотезы о том, что С-концевая часть L-ОРТ6 ответственна за локализацию белка в ЭПР, была использована конструкция L-ОРТ6HYDR с заменами в С-конце (Рис. 3), уже использованная ранее в экспериментах по заражению ВПТ, но в данном случае слитая в одной рамке трансляции с N-конца YFP в составе бинарного вектора. Конструкция была экспрессирована посредством агроинфильтрации в клетках эпидермиса листа N. benthamiana, после чего наблюдения проводили на конфокальном лазерном сканирующем микроскопе. На 1-2 д.п.и. L-ОРТ6HYDR локализовался преимущественно на периферии ядрышка (Рис. 7А), напоминая дикий тип U1-ОРТ6-YFP (Рис. 4А). На 3-4 д.п.и. появлялась флуоресценция других структур ядра, в частности в виде различимых точек в ядрышке, сложенных в кольцо. Такая локализация напоминает расположение плотного фибриллярного компонента ядрышек растений, который содержит структуры, известные в литературе как “Christmas tree” (Chen et.al., 2002; Raska, 2003) (Рис. 7В). Также, в течение всего времени наблюдения, часть сигнала наблюдалась в цитоплазме клетки. Таким образом, С-концевая часть L-ОРТ6 влияет на способность белка ассоциироваться с ЭПР. Кроме того, эти данные свидетельствуют о том, что U1- и L-ОРТ6 содержат сигналы ядерной/ядрышковой 14 локализации (NLS/NoLS), которые, как правило, представляют собой кластеры положительно заряженных аминокислот, направляющих белок в ядро или ядрышко (Musinova et al., 2011). Однако в случае с L-ОРТ6, С-концевой гидрофобный сегмент, повидимому, перенаправляет транспорт из ядра/ядрышка в ЭПР (в случае если L-ОРТ6 курсирует между ядром и ЭПР), или плотно фиксирует белок в ассоциации с ЭПР сразу после трансляции. Тем не менее, вне зависимости от конкретного механизма, мутация гидрофобной части ведет к локализации в ядре/ядрышке, вместо ассоциации с ЭПР. Для поиска NoLS в составе L-ОРТ6 были использованы два подхода. В первом был проведен мутагенез L-ОРТ6-HYDR. Так как сигналы ядерной/ядрышковой локализации представлены в основном положительно заряженными аминокислотами (Hiscox, 2007; Taliansky et al., 2010), был сконструирован мутант L-ОРТ6-HYDR-RK, несущий в дополнение к мутации в гидрофобном С-концевом районе мутацию в кластере из пяти положительно заряженных аминокислот в N-концевой области, потенциально вовлеченной в транспорт в ядро/ядрышко (Рис. 3). В качестве контроля мутация RK была также включена в последовательность дикого типа L-ОРТ6 в составе конструкции LОРТ6-RK (Рис. 3). Локализация этих мутантов была изучена в системе транзиентной экспрессии с помощью агротрансформации растений, несущих маркер ядра mRFP-H2B. Как и предполагалось, двойной мутант L-ОРТ6-HYDR-RK терял ядерную/ядрышковую локализацию и локализовался диффузно в цитоплазме (Рис. 7С). Контрольный мутант LОРТ6-RK локализовался в цитоплазме в ассоциации с ЭПР (Рис. 7D), как и дикий тип LОРТ6. Эти результаты показывают, что N-концевая часть, содержащая кластер положительно заряженных аминокислот, необходима для локализации в ядре/ядрышке, но, тем не менее, не обязательна для локализации L-ОРТ6 в составе ЭПР. Во втором подходе L-ОРТ6-HYDR, локализующийся в ядрышке, был использован для получения четырех фрагментов (FR), слитых в одной рамке трансляции с YFP в составе бинарного вектора (Рис. 3). Эти фрагменты содержали: FR1 - десять N-концевых аминокислот, включающих кластер положительно заряженных аминокислот; FR2 – следующие за N-концом 10 аминокислот, включая мотив, ответственный за связывание EF1A (Morozov et al., 1993); FR3 - состоящий из десяти центральных аминокислот, между мотивом связывания EF1A и С-концом; а также FR4, представляющий собой С-концевые девять аминокислот, содержащих мутированный гидрофобный кластер (Рис. 3). 15 Рис. 7. Связь ядрышковой локализации L- и U1-ОРТ6 с кластером положительно заряженных аминокислот в N-конце. Слитые в одной рамке трансляции с YFP различные варианты ОРТ6 были экспрессированы посредством агроинфильтрации в растениях N. benthamiana, экспрессирующих маркеры ядрышка AtFib2-mRFP (А, В, Е) или маркер ядра H2B-mRFP (С, D). Используемые варианты ОРТ6: (А) - LОРТ6-HYDR на 1-2 д.п.и., (B) - L-ОРТ6-HYDR на 3-4 д.п.и., (С) - L-ОРТ6-HYDR-RK, (D) - L-ОРТ6-RK, (Е) U1-RK. Все микрофотографии, показывающие часть клетки, являются единичным оптическим срезом. Голубые тельца – автофлуоресцирующие хлоропласты. Масштабная линейка, 20 мкм (на микрофотографиях, показывающих клетку целиком); 5 мкм (на одиночных оптических срезах). 16 В качестве контроля использовался свободный YFP. Локализация изучалась на трансгенных растениях, экспрессирующих маркер ядра (H2B-mRFP) и ядрышка (AtFib2mRFP) (Рис. 8). Только фрагмент, содержащий N-концевые 10 аминокислот, был способен направлять YFP в область ядрышка (Рис. 8А,В). Тогда как все остальные фрагменты локализовались подобно свободному YFP (контроль) (Рис. 8С,D,E,F). Таким образом, Nконцевой фрагмент MKPRRRSRIL содержит сигнал ядрышковой локализации. Стоит отметить, что интенсивность сигнала в ядрышке у N-концевого фрагмента, слитого с YFP, была гораздо слабее, чем у L-ОРТ6-HYDR (7А) или U1-ОРТ6 (Рис. 4А). Этот эффект может объясняться тем, что MKPRRRSRIL содержит неполный NoLS. Другим объяснением могло бы быть то, что полноразмерные ОРТ6 (в составе L-ОРТ6-HYDR или U1-ОРТ6) содержат дополнительные последовательности, стабилизирующие ядрышковую локализацию через взаимодействия с другими компонентами ядрышка или дополнительно способствующие импорту в ядрышко. Рис.8. Поиск сигнала ядрышковой локализации в составе последовательности белка L-ОРТ6. Четыре фрагмента L-ОРТ6-HYDR, слитых с N-концом YFP, наблюдали на 2 д.п.и.. N-концевой фрагмент FR1 MKPRRRSRIL был ко-экспрессирован с ядрышковым маркером фибрилларином, слитым с mRFP (A) и ядерным маркером H2B, слитым с mRFP (В). Внутренние фрагменты FR2 MILIRIKYVLL (С) и FR3 MLNHFSIAIC (D), C-концевой фрагмент FR4 MISASATRTG (Е), а также свободный YFP (F) были коэкспрессированы с ядерным маркером H2B, слитым с mRFP. Микрофотографии представляют собой одиночные оптические срезы. Масштабная линейка соответствует 5 мкм. 17 Для того чтобы проанализировать наличие подобного сигнала ядрышковой локализации в составе N-конца U1-ОРТ6, был получен мутант, содержащий соответствующие замены U1-ОРТ6-RK (Рис. 3), слитый в одной рамке трансляции с YFP в составе бинарного вектора. Экспрессия этого мутанта в клетках эпидермиса листа посредством агроинфильтрации показала, что мутант не способен проникать в область ядрышка (Рис. 7Е) и локализуется в ядре подобно свободному YFP. Таким образом, LОРТ6 и U1-ОРТ6 содержат NoLS в N-концевой области. С помощью программных предсказаний было показано, что митохондриальная локализация у мутанта U1-ОРТ6-RK сохраняется, что также было видно по наличию телец в цитоплазме соответствующих по фенотипу тельцам, образуемым U1-ОРТ6. (Рис. 4В). Изучение взаимодействия между L-ОРТ6 и еEF1A in vitro Фактор элонгации трансляции еEF1A играет существенную роль в жизненном цикле ВТМ (Yamaji et al., 2010). ЕEF1A взаимодействует с тРНК-подобной структурой (Litvak et al., 1973; Mans et al., 1991) и двумя псевдоузлами в 3' нетранслируемой области (3'-НТО) РНК ВТМ (Zeenko et al., 2002), а также взаимодействует с метилтрансферазным доменом РНК-зависимой РНК-полимеразы (Yamaji et al., 2006) и белком ОРТ6 (Morozov et al., 1993; Fedorkin et al., 1995). Для изучения взаимодействия между eEF1A и L-ОРТ6 в данной работе использовалась описанная ранее экспериментальная система (Morozov et al., 1993) с некоторыми модификациями. Полученные in vitro некэпированные транскрипты гена ОРТ6 и его мутантов транслировали in vitro в лизате ретикулоцитов кролика (ЛРК) в присутствии лейцина, меченного [14С]. Поскольку ранее было показано, что N- и C-концевые районы ОРТ6 не влияют на образование комплекса с eEF1A (Morozov et al., 1993), с целью выравнивания количества остатков лейцина ген ОРТ6 был слит с искусственной последовательностью, добавляющей к N-концу всех использованных в данной работе вариантов ОРТ6 пептид MALSRLLDLLGSTSRS, содержащий пять дополнительных остатков лейцина. После разделения продуктов трансляции в ДСН-ПААГ комплекс, образованный меченым белком, кодируемым ОРТ6, и эндогенным eEF1A, присутствующим в ЛРК, детектировался в геле как полоса с молекулярной массой около 54 кДа, тогда как несвязанный продукт трансляции ОРТ6 двигался в геле как полоса с молекулярной массой 4 кДа, как и в оригинальных работах (Morozov et al., 1993; Fedorkin et al., 1995). Изображения гелей анализировались с помощью программы Gel-Pro Analyzer (Media Cybernetics). Доля белка ОРТ6, находящегося в составе комплекса, от общего количества ОРТ6 рассчитывалась на основе интенсивности полос в геле с учетом эффективности трансляции каждой пробы. Статистическая обработка проводилась по данным дважды повторенных экспериментов. 18 Рис. 9. Последовательности L-ОРТ6, а также мутантов, использованные в работе. Дефисы обозначают аминокислотные остатки, идентичные L-ОРТ6. Рис. 10. Образование комплекса eEF1A/ОРТ6 в системе трансляции in vitro. Полученные in vitro некэпированные транскрипты (0,1 мкг), кодирующие белок ОРТ6 или его мутанты, транслировали в лизате ретикулоцитов кролика. Продукты реакции разделяли в 8-20% градиентном ДСН-ПААГ. Радиоавтограф ПААГ с продуктами трансляции ОРТ6-L, ОРТ6-L-SICIE и ОРТ6-L-I11T показан слева. Положение в геле комплекса eEF1A/ОРТ6 показано белой стрелкой; положение несвязанного ОРТ6 - черной стрелкой. Справа показано положение в геле маркеров молекулярной массы, указанной в кДа. Статистический анализ результатов связывания различных вариантов ОРТ6 и eEF1A приведен справа. Показан процент продукта трансляции ОРТ6, находящегося в составе комплекса с eEF1A. Сравнение эффективности образования комплекса с eEF1A, проведенное для белка дикого типа L-ОРТ6 и мутанта L-ОРТ6-SICIE (Рис. 9), для которого ранее было показано существенное снижение эффективности связывания eEF1A (Morozov et al., 1993), выявило, что последовательность, богатая лейцином, находящаяся на N-конце белка ОРТ6 и его мутантов, использованных в настоящей работе, не оказывает существенного влияния на способность к взаимодействию с eEF1A (Рис. 10). Также был проанализирован мутант L-ОРТ6-I11T (Рис. 10). Было обнаружено, что мутанты SICIE и I11T имеют достоверно сниженную способность к образованию комплекса по сравнению с белком дикого типа LОРТ6 (Рис. 10). Эти данные согласуются с ранее опубликованными результатами (Morozov et al., 1993). Важно, что точечная мутация I11T, для которой на основании сравнения эффектов нескольких множественных мутантов было сделано предсказание о том, что она может быть достаточна для нарушения взаимодействия с eEF1A (Morozov et al., 1993) действительно эффективно блокирует образование комплекса (Рис. 10). Аминокислотная замена I11T в L-ОРТ6 препятствует образованию комплекса с eEF1A и кооперативному связыванию нуклеиновых кислот. Способность связывать РНК свойственна многим белкам РНК-содержащих вирусов растений, принимающих участие в репликации, инкапсидации и транспорте 19 вирусного генома, а также в супрессии РНК-интерференции. Поскольку N-концевая область L-ОРТ6 включает кластер положительно заряженных остатков, которые потенциально могли бы определять взаимодействие белка с нуклеиновыми кислотами, были проведены эксперименты по выявлению такого рода взаимодействий. Белок L-ОРТ6 дикого типа и его мутант L-ОРТ6-IT, слитые с последовательностью из шести гистидиловых остатков, были экспрессированы в E.coli и очищены на Ni-NTA-агарозе (Рис. 11). Анализ способности L-ОРТ6 и L-ОРТ6-I11T взаимодействовать с различными типами нуклеиновых кислот проводили методом сдвига в геле. В соответствии с описанной ранее методикой (Rakitina et al., 2011). Рекомбинантные белки инкубировали с РНК или ДНК в буфере для связывания (20 мМ Tris-HCl, pH 7.5, 1 мМ DTT, 3 мМ MgCl2, 50 мМ NaCl), а затем пробы разделяли в агарозном геле, содержащем бромистый этидий. Изображения гелей, полученные в ультрафиолетовом свете, анализировали с помощью программы Gel-Pro Analyzer. Рис. 11. Сравнительный анализ способности рекомбинантных белков ОРТ6-L и ОРТ6-L-I11T связывать тРНК и 3’-НТО ВТМ. А. - Белки ОРТ6-L и ОРТ6-L-I11T, выделенные на Ni-NTA-агарозе. После разделения в 20% ДСН-ПААГ белки окрашивали Coomassie G250. B. - Анализ РНК-связывания методом сдвига в агарозном геле. Каждая проба содержала тРНК и транскрипт, соответствующий 3’-НТО ВТМ, к которым добавляли увеличивающиеся количества ОРТ6-L и ОРТ6-L-I11T. Над дорожками геля указано молярное соотношение РНК:белок в каждой пробе. Положение в геле несвязанных тРНК и транскрипта 3’-НТО ВТМ показаны черной и белой стрелками, соответственно. Серая стрелка указывает положение комплекса, не способного мигрировать в геле и находящегося в лунках. Данные, полученные в экспериментах по сдвигу в геле, проведенные с различными типами нуклеиновых кислот, показывают, что белок L-ОРТ6 дикого типа способен связывать одноцепочечные РНК, а также двуцепочечные РНК и ДНК (Рис. 11 и данные не показаны). Образование комплексов, не способных мигрировать в геле, наблюдаемое в этих экспериментах (Рис. 11), является характерным признаком кооперативного взаимодействия белков и нуклеиновых кислот (Rakitina et al., 2011). Эти данные указывают на возможность гомотипических взаимодействий молекул белка L-ОРТ6. При 20 этом в опытах по конкурентному связыванию было обнаружено, что наблюдается предпочтение в связывании белком L-ОРТ6 3'-НТО РНК ВТМ по отношению к тРНК (Рис. 3), что указывает на возможность прямого взаимодействия белка L-ОРТ6 с той областью геномной РНК ВТМ, для которой ранее было выявлено взаимодействие с eEF1A (Litvak et al., 1973; Mans et al., 1991; Zeenko et al., 2002). Интересно, что мутант L-ОРТ6-I11T связывает РНК примерно с той же эффективностью, что и белок дикого типа, но не образует комплексов, неспособных мигрировать в геле (Рис. 11), что говорит об утере кооперативности связывания РНК. Таким образом, можно заключить, что мутация I11T расположена в области белка L-ОРТ6, которая участвует в образовании комплекса с еEF1A и влияет на кооперативность связывания нуклеиновых кислот. Заключение Данные, представленные в этой работе, свидетельствуют о том, что, не взирая на факт наличия схожих последовательностей и подобных позиций в геномах близкородственных вирусов, белки L- и U1-ОРТ6, имеют немало отличительных черт. Например, разные свойства наблюдаются в способности влиять на патогенность вируса в составе генома тобамовируса и ВПТ. В целом, в изученных экспериментальных системах L-ОРТ6 проявляет себя как более слабый фактор патогенности, несмотря на то, что, повидимому, у обоих белков детерминантой патогенности является С-конец. При изучении локализации также выясняется, что эти белки оккупируют разные субклеточные компартменты. Белок U1-ОРТ6 имеет динамичную локализацию, перемещаясь из ядрышка в митохондрии, тогда как L-ОРТ6 стабильно ассоциируется с мембранами ЭПР. При этом оба белка содержат функциональный сигнал ядрышковой локализации (NoLS) в составе N-конца, который, по всей видимости, в случае с L-ОРТ6 и U1::L-ОРТ6 перенаправляется С-концом, в мембраны ЭПР. В настоящей работе все варианты ОРТ6, приводящие к некрозу стебля в системе ВПТ, локализовались в ядре/ядрышке. На сегодняшний день немало известно о функциях ядра и ядерных компонентов, в том числе ядрышка растений в микроРНК/киРНК регуляции экспрессии генов или «сайленсинга» (Taliansky et al., 2010; Shaw and Brown, 2012). Для вирусов эта система является одним из барьеров, для преодоления которого вирусы кодируют разнообразные белки супрессоры сайленсинга (Csorba et al., 2009). Для ряда супрессоров сайленсинга показана ядерная/ядрышковая локализация. Так для белка потивируса VPg было показано взаимодействие с компонентом ядрышка фибрилларином и необходимость ядерной/ядрышковой локализации для супрессии сайленсинга (Rajamaki and Valkonen, 2009). В свою очередь, хорошо изученный супрессор сайленсинга вируса мозаики огурца 2b в ядрышке взаимодействует с AGO1, являющимся коровым компонентом комплекса 21 RISC. В системе in vitro было показано, что связывание AGO1 белком 2b достаточно для ингибирования его функции (Gonza´lez et al., 2010; Duan et al., 2012). Стоит отметить, что высокий уровень экспрессии белка 2b в составе генома неродственного вируса также приводил к некрозу стебля, вызывающему гибель растения (Brigneti et al., 1998). В экспериментах Canto at al. (2004) не было обнаружено способности супрессировать сайленсинг белком U1-ORT6. Подобные результаты были получены на LОРТ6 (Н. И. Луховицкая, неопубликованные данные). Тем не менее, не исключено, что специфические взаимодействия с системой супрессии сайленсинга в будущем будут обнаружены, например, на специфических растениях хозяевах. Так, например, известно, что некоторые клостеровирусы имеют три различных гена, кодирующих супрессоры, работающие при инфекции различных растений, позволяя вирусу расширять круг хозяев (Tatineni et al., 2011). Если ОРТ6 действительно вовлечен во взаимодействия с системой супрессии сайленсинга, то способность связывать нуклеиновые кислоты может быть необходима для взаимодействия с предшественниками коротких РНК или самими короткими РНК для их последующей изоляции и предотвращения взаимодействия с другими белками. Также, возможно, что ОРТ6 не влияет на систему сайленсинга, а его способность взаимодействовать с eEF1A и с 3'-НТО РНК ВТМ, проявляется в модулировании функциональной активности eEF1A при его взаимодействии с 3'-НТО РНК ВТМ, роль которого для инфекции ВТМ на сегодняшний день также мало изучена. Показано, что взаимодействие между еEF1A и элементом вторичной структуры в 3’-концевой области геномной РНК вируса Западного Нила способствует синтезу цепей вирусной РНК отрицательной полярности, что определяет эффективность репликации вирусного генома (Davis at al., 2007). Достаточно хорошо изучена роль еEF1A в репликации вируса карликовой кустистости томатов. Показано, что еEF1A напрямую взаимодействует с белком p33 и вирусной РНК, способствуя сборке репликативного комплекса, компонентом которого является р33, и привлечению геномных РНК в репликативный комплекс, что стимулирует инициацию репликации и приводит к повышению уровня синтеза вирусной РНК отрицательной полярности (Li at al., 2010; Sasvari at al., 2011). Не исключено, что функция ОРТ6 может быть связана с влиянием на другие клеточные процессы и системы. Более того, учитывая данные полученные в этой работе, не исключено, что L- и U1-ОРТ6 имеют совершенно разные функции. Дальнейшие исследования необходимы для установления функции ОРТ6 в жизненном цикле тобамовирусов, а также необходимости 22 ядерной/ядрышковой, митохондриальной локализации и ассоциации с мембранами ЭПР, а также связывания нуклеиновых кислот и взаимодействия с фактором элонгации трансляции eEF1A. Выводы 1. Показано, что белок U1-ОРТ6 вируса табачной мозаики, но не белок L-ОРТ6 вируса томатной мозаики, значительно усиливает патогенность рекомбинантного вируса погремковости табака в растениях Nicotiana benthamiana. 2. С-концевой район U1-ОРТ6 и L-ОРТ6 определяет влияние белка на патогенность вируса. 3. Белок U1-ОРТ6 на ранних этапах экспрессии в клетке локализуется в ядрышке, а затем перемещается в митохондрии, тогда как белок L-ОРТ6 обнаруживается в эндоплазматическом ретикулуме, не меняя субклеточной локализации. 4. Белки U1-ОРТ6 и L-ОРТ6 несут сигнал ядрышковой локализации в N-концевом районе. С-концевой район L-ОРТ6 необходим для взаимодействия белка с мембранами эндоплазматического ретикулума. 5. Показано, что единичная замена в составе аминокислотной последовательности белка L-ОРТ6, блокирующая образование комплекса с фактором элонгации трансляции eEF1A, нарушает также нуклеиновыми кислотами. 23 кооперативность связывания белка с Публикации Gushchin V.A., Lukhovitskaya N.I., Andreev D.E., Wright K.M., Taliansky M.E., Solovyev A.G., Morozov S.Y. and MacFarlane S.A. Dynamic localization of two tobamovirus ORF6 proteins involves distinct organellar compartments.// J. Gen. Virol. 2013. V.94. P. 230-240. Гущин В.А., Андреев Д.Е., Тальянский М.Э. МакФарлэйн С.Э., Соловьев А.Г. и Морозов С.Ю. Аминокислотная замена в белке ОРТ6 вируса табачной мозаики препятствует образованию комплекса c eEF1A и кооперативному связыванию нуклеиновых кислот in vitro. // Доклады Академии Наук. 2013. Т.448. № 1. С. 1-5. Gushchin V.A., Solovyev A.G. and Morozov S.Y. Plant virus modulator of host defence.// XX International conference New Information Technology in Medicine, Pharmacology, Biology and Ecology. Ukraine. Jalta. 2012. P. 114-116. Gushchin V.A., Kaplan I.B., Solovyev A.G. and Morozov S.Y. Interactions of tobacco mosaic virus protein encoded by ORF6 with plant cell components.// XIX International conference New Information Technology in Medicine, Pharmacology, Biology and Ecology. Ukraine. Jalta. 2011. P. 234-235. Gushchin V.A. Functional studies of tobacco mosaic virus ORF6-encoded protein.// The James Hutton Institute - Dundee site postgraduate student competition. Scotland. Dundee. Invergowrie. 2011. P. 20 Morozov S.Y., Solovyev A.G. and Gushchin V.A. Intracellular transport of small cystein-rich proteins, modulators of plant virus virulence.// XVIII International conference New Information Technology in Medicine, Pharmacology, Biology and Ecology. Ukraine. Jalta. 2010. P. 117–118. 24
