Проект сайта СТЕХИОМЕТРИЯ И ПАРАМЕТРЫ СВЯЗЫВАНИЯ

Проект сайта
СТЕХИОМЕТРИЯ И ПАРАМЕТРЫ СВЯЗЫВАНИЯ ЛИГАНД – РЕЦЕПТОР
Жизнь клетки основана на взаимодействии различных биологически важных
соединений между собой, таких как белок – белок, белок – ДНК, белок – низкомолекулярное
вещество и т.д. Такие взаимодействия можно описать реакцией лиганда (L) и рецептора (R) с
образованием их комплекса  R L  :
kon

R  L 
R L .
koff
(1)
Скорости прямой и обратной реакции определяются соотношениями:
von  kon   L    R 
(2)
voff  koff   L R 
(3)
Здесь  R  ,
 L и  R L – концентрации рецептора, лиганда и комплекса лиганд–рецептор,
kon и koff – константы скорости прямой и обратной реакций. Размерность kon – M 1 min 1 ,
koff – M 1 . В условиях равновесия von  voff и значит
kon   R    L   koff   R L  .
(4)
Константа диссоциации комплекса определяется как отношение скоростей прямой и
обратной реакций:
Kd 
koff
kon

 L   R .
 L R 
(5)
Величина константы диссоциации численно равна концентрации лиганда, при которой
концентрации свободного и связанного рецептора равны. Чем большое сродство рецептора с
лигандом, тем меньше константа диссоциации и, следовательно, тем меньше концентрация
лиганда, при которой половина молекул рецептора будет связана с лигандом. Очевидно, что
размерность K d это M. Величина обратная константе диссоциации называется константой
связывания:
Kb 
 L R  .
k
1
 on 
K d kooff  L    R 
(6)
Размерность этой величины – М-1.
Рецептор может иметь не одно, а несколько мест связывания лиганда, которые могут
быть идентичны, т.е. принадлежать одной моде связывания лиганда, либо различаться по
2
параметрам связывания и характеристикам, связанного с ними лиганда. В этом случае
характеристикой взаимодействия лиганд–рецептор является число мод связывания (i), т.е.
число различных по своей природе участков рецептора, способных взаимодействовать с
лигандом. Каждая из мод характеризуется числом мест связывания лиганда (ni) и константой
связывания лиганда (Kbi). Параметры связывания несут существенную информация о
механизмах химических и биохимических процессов взаимодействия лиганда с рецептором
и свойствах лиганда и рецептора. Рассмотрим некоторые способы определения параметров
взаимодействия лиганд – рецептор.
В том случае, если масса лиганда значительно меньше массы рецептора, наиболее
прямым методом определения параметров связывания является
метод равновесного
микродиализа, который был специально разработан для этих целей.
системы являются взаимодействие
Примерами такой
флуоресцентного зонда АНС с белками в частично-
свернутом состоянии типа расплавленной глобулы, взаимодействие АНС с нативными
белками, имеющими специфические сайты связывания с этим красителем, например,
взаимодействие АНС с сывороточными альбуминами, взаимодействие сывороточных
альбуминов с различными низкомолекулярными веществами, в том числе с лекарствами,
взаимодействие флуоресцентных зондов (тиофлавина Т, конго красного и др.) с
амилоидными фибриллами. Равновесный микродиализ предполагает размещение растворов
двух взаимодействующих веществ – рецептора и лиганда в двух камерах: рецептора в
концентрации Сp – в камере #1 и лиганда в концентрации С0 – в камере #2, разделенных
мембраной, проницаемой для лиганда и непроницаемой для рецептора (Рис. 1) на время,
Рисунок 1. Принцип эксперимента
по равновесному микродиализу.
достаточное для установления равновесных концентраций свободного и связанного с
рецептором красителя в камере #1 и равновесных концентраций свободного красителя в
камерах #1 и #2. После установления равновесия концентрации свободного лиганда в
3
камерах #1 и #2 ([L]) будут равны Сf. Величина Сf может быть определена на основании
измерения оптической плотности раствора в камере #2. Суммарная концентрация лиганда в
камере #1 будет больше, чем в камере #2 на величину концентрации связанного красителя
 R L  (Сb):
Cb  C0  2C f
(7)
Если все места связывания лиганда рецептором (n) идентичны и независимы друг от друга,
то константа связывания лиганда (Kb) определяется отношением концентрации комплекса
лиганд-рецептор (Cb) к произведению концентраций свободного рецептора [R]  (nCp – Cb)
и свободного красителя (Cf):
Kb 
Cb
.
nC p  Cb  C f
(8)
Это означает, что зависимость концентрации связанного лиганда от концентрации
свободного лиганда является кривой с насыщением:
Cb 
nC p C f
Kd  C f
.
(9)
Это соотношение легко преобразуется в хорошо известное уравнение Скэтчарда:
 Cb

C
 p


 C f  nK b  K b  Cb

C

 p




( 10 )
или уравнение Клотца:
K 1
1
1
.

 d
C b nC p nC p C f
( 11 )
Соотношения (10) и (11) позволяют определять параметры взаимодействия лиганд –
рецептор путем построения линейных зависимостей при выборе соотвтствующей системы
координат, судить о возможности описания экспериментальных данных в рамках модели,
предполагающей существование одной моды связывания. Эти соотношения были
чрезвычайно популярны, когда расчет параметров связывания выполнялся вручную путем
построения соответствующих графиков.
Величины констант связывания Kb и число мест связывания лиганда с рецептором n
может быть определено на основании экспериментально определенной зависимости Cb от C0
(или Cf) с помощью нелинейной регрессии с использованием соответствующих программ,
например, программы GraphPad Prism. Невозможность определить параметры уравнения
означает несоответствие используемой модели экспериментальным данным. В частности, это
может указывать на существование нескольких (i) мод связывания лиганда рецептором,
различающихся величинами констант связывания (Kbi) и числом мест связывания. В этом
4
случае предполагается независимость мест связывания друг от C b   C bi , при том, что Cbi
i
определяются соотношениями, аналогичными соотношению (9). Таким образом, в случае i
мод связывания мы будем иметь:
Cb  
i
ni C p C f
( 12 )
K di  C f
Существование более чем одной моды связывания приведет к нелинейному характеру
зависимости Cb от Cf в координатах Скэтчарда (Рис. 2).
Рисунок 2. Зависимость Скэтчарда для
тиофлавина Т инкорпорированного в
амилоидные фибриллы на основе лизоцима.
Представлены экспериментальные данные –
кружки, и кривая, наилучшим образом,
аппроксимирующая
экспериментальные
данные.
Метод равновесного микродиализа позволяет определять не только параметры
связывания лиганда, но также спектр поглощения лиганда, связанного с рецептором, и
коэффициент его молярной экстинкции. Спектр поглощения связанного красителя
определяется как разность спектров поглощения растворов в камере #1 и #2:
Db     D#1     D#2    .
( 13 )
В случае, если образец в камере #1 обладает значительным светорассеянием (например, при
определении параметров связывания флуоресцентного зонда тиофлавина Т с амилоидными
фибриллами), его вклад в измеряемую величину оптической плотности должен быть
предварительно исключен. В случае одной моды связывания коэффициент молярной
экстинкции и его зависимость от длины волны определяется соотношением:
 b   
Db  
.
Cb  l
( 14 )
В случае двух мод связывания справедливо следующее соотношение:
5
Db    Db1  Db 2   b1  Cb1l   b 2  Cb 2 l ,
( 15 )
Здесь b1() и b2() молярные коэффициенты экстинкции лиганда, связанного с сайтами
моды 1 и 2 при длине волны . Величины
Cb1 и Cb2 определяют с использованием
соотношения (12) для каждого значения C0 (каждого раствора полученного методом
равновесного микродиализа) и определенных для каждой из мод констант связывания и
числа мест связывания. Таким образом, мы имеем большой набор величин Db(), Cb1, и Cb2 ,
на основании которого величины b1() и b2() могут быть определены методом
множественной линейной регрессии (например, используя, например, программу GraphPad
Prism). Такие расчеты могут быть выполнены для каждой длины волны поглощения света
лигандом, что даст возможность построить спектры поглощения молекул лиганда, связанных
с каждой из мод связывания, в единицах молярной экстинкции (Рис. 3).
Рисунок 3 Спектр поглощения тиофлавина Т (ThТ),
инкорпорированного в амилоидные фибриллы на основе
лизоцима. Кривые 2 и 1 – спектры поглощения раствора ThТ в
камере #1 (наложение спектров поглощения свободного ThТ в
водном растворе, связанного с фибриллами ThТ и светорассеяния,
обусловленного присутствием фибрилл, после установления
равновесия) и в камере #2 (свободный ThТ в водном растворе).
Кривая 3 представляет собой оптическую плотность, которая
определяется светорассеянием фибрилл. Кривая 4 – суммарный
спектр поглощения свободного и связанного с фибриллами
красителя после исключения вклада светорассеяния фибрилл. На
вставке показан метод вычитания рассеяния. Кривая 5 – спектр
поглощения ThТ, инкорпорированного в амилоидные фибриллы.
Кривая 6 – спектр поглощения свободного красителя в
концентрации равной концентрации связанного красителя.
В том случае, если в качестве лиганда используется флуоресцентный краситель,
который практически не флуоресцирует в свободном состоянии, но образует интенсивно
флуоресцирующий комплекс при взаимодействии с рецептором, представляется крайне
заманчивым использовать регистрацию флуоресценции красителя для определения
параметров связывания. Примерами таких красителей являются тиофлавин Т и другие
красителя принадлежащие к классу так называемых молекулярных роторов, АНС, и др.
Практически все работы по определению параметров связывания тиофлавина Т с
амилоидными фибриллами, или АНС с сывороточными альбуминами основаны на
измерении интенсивности флуоресценции красителя от его концентрации в растворах
содержащих соответствующий рецептор. Наш анализ, однако, показал, что использовать
интенсивность флуоресценции красителя от его концентрации для корректного определения
6
параметров связывания можно лишь после коррекции интенсивности флуоресценции,
учитывающей так называемый эффект "внутреннего фильтра", да и то только в том случае,
если все сайты связывания красителя с рецептором принадлежат одной моде связывания.
Литература
1. Э. Маршелл Биофизическая химия. Принципы, техника и приложения в 2-х томах. Изд.
Мир, Москва, 1981.
2. Harvard Apparatus/Amika (USA) device, www.nestgrp.com and
wolfson.huji.ac.il/purification/PDF/dialysis/NestGroup_EquilDial.pdf.
3. Oravcova J, Bohs B, Lindner W (1996) Drug-protein binding sites. New trends in analytical and
experimental methodology. J Chromatogr B Biomed Appl 677: 1-28.
4. Nolting B.,. Springer-Verlag, Berlin-Heidelberg, 1999, 191.
5. Sulatskaya A.I., Kuznetsova I.M., Turoverov K.K. 2011. Interaction of thioflavin T with
amyloid fibrils: stoichiometry and affinity of dye binding, absorption spectra of bound dye. J.
Phys. Chem. B. 115 (39): 11519-11524.
6. Kuznetsova I.M., Sulatskaya A.I., Uversky V.N., Turoverov K.K. 2012. Analyzing thioflavin T
binding to amyloid fibrils by an equilibrium microdialysis-based technique. PLoS ONE 7(2)
e30724.
7. Sulatskaya A.I., Kuznetsova I.M., Turoverov K.K. 2012. Interaction of thioflavin T with amyloid
fibrils: fluorescence quantum yield of bound dye. J. Phys. Chem. B. 116 (8): 2538-44
8. Kuznetsova I.M., Sulatskaya A.I., Uversky V.N., Turoverov K.K. 2012. A new trend in the
experimental methodology for the analysis of the Thioflavin T binding to amyloid fibrils. Mol.
Neurobiol. 45(3):488-98
9. Kuznetsova I.M., Sulatskaya A.I., Povarova O.I. Turoverov K.K. 2012. Reevaluation of ANS
binding to Human and Bovine Serum Albumins: Key Role of Equilibrium Microdialysis in Ligand
– Receptor Binding Characterization. PLoS One 7(7):e40845.