влияние рн на холинэстеразный α-нафтилацетата в присутствии гидролиз катионных детергентов

УДК 577.151.042 : 577.152.311
влияние рн на холинэстеразный
гидролиз α-нафтилацетата в присутствии
катионных детергентов
Л. П. КУЗНЕЦОВА, Е. Р. НИКИТИНА, Е. Е. СОЧИЛИНА, К. А. ВАСИЛЬЕВА
Институт эволюционной физиологии и биохимии
им. И. М. Сеченова РАН, Санкт-Петербург, Россия;
e-mail: esoch@iephb.ru
Изучено влияние катионных детергентов цетилпиридиния и цетилтриметиламмония на каталитическую активность бутирилхолинэстеразы (БуХЭ) плазмы крови лошади в реакции гидролиза
α-нафтилацетата при различных pН реакционной среды. Показано, что в отсутствие эффекторов
при снижении рН в интервале 8,5–5,5 величина константы Михаэлиса К m энзиматической реакции
возрастает, а величина предельной скорости V остается постоянной. В присутствии эффекторов в
изученном диапазоне рН величины К m и V практически не изменяются. Вследствие этого активация
энзиматического гидролиза α-нафтилацетата в присутствии цетилпиридиния и цетилтриметиламмония при рН 5,5 значительно выше по сравнению с нейтральным значением рН реакционной среды.
К л ю ч е в ы е с л о в а: БуХЭ плазмы крови лошади, энзиматический гидролиз, α-нафтилацетат, активация, цетилпиридиний, цетилтриметиламмоний.
Э
нзим бутирилхолинэстераза (БуХЭ)
обнаружен в крови практически всех
млекопитающих. Несмотря на то, что
структура активного центра этого энзима
плазмы крови человека установлена рентгеноструктурным анализом [1], функциональная
его роль до настоящего времени окончательно
не выяснена. В последние годы БуХЭ плазмы
крови чаще всего рассматривают как защитный агент, вступающий в действие при попадании в кровяное русло нежелательных веществ,
в первую очередь ингибиторов холинэстераз
[2]. Исследования особенностей кинетики
реакций, катализируемых БуХЭ, сохраняют
актуальность многие годы и продолжаются в
настоящее время. Особый интерес представляет изучение факторов, увеличивающих реакционную способность этого энзима. Так, в
работе [3], посвященной изучению гидролиза
бутирилтиохолина под действием мутантных
форм БуХЭ плазмы крови человека, был обнаружен эффект активации гидролиза субстрата
при его избытке в диапазоне низких рН. Ранее [4] сообщалось, что типичный обратимый
ингибитор – тетраметиламмоний при низких
значениях рН способен вызывать активацию
энзиматического гидролиза ацетилхолина под
действием БуХЭ плазмы крови лошади.
При исследовании энзиматического гидролиза флуорогенного субстрата α-нафтил­
ацетата нами были обнаружены интересные
особенности взаимодействия БуХЭ сыворотки
ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2009, т. 81, № 4
крови лошади с азотсодержащими катио­нными
детергентами: цетилпиридинием и цетилтриметиламмонием [5]. Было показано, что эти
детергенты оказывают различное влияние на
взаимодействие холинэстеразы с холиновыми
субстратами и с α-нафтилацетатом: они являются конкурентными обратимыми ингибиторами энзиматического гидролиза бутирилхолина и ацетилхолина, а в реакциях гидролиза
α-нафтилацетата оказывают активирующее
действие. Учитывая приведенные выше данные об изменении свойств БуХЭ при кислых
рН, определенный интерес представляло изучение взаимодействия указанных эффекторов
с БуХЭ при различных рН реакционной среды.
Целью настоящей работы является исследование влияния рН среды на реакционную
способность БуХЭ сыворотки крови лошади в
реакциях гидролиза α-нафтилацетата в присутствии катионных детергентов цетилпиридиния и цетилтриметиламмония.
Материалы и методы
В работе использовали: α-нафтилацетат
(Aldrich, США) и азотсодержащие катионные
детергенты цетилпиридиний хлорид (ЦП,
Sigma, США) и цетилтриметиламмоний бромид (ЦПА, Aldrich, США).
В качестве энзима использовали препарат
БуХЭ плазмы крови лошади (3.1.1.8.) производства Пермского НИИВС с удельной актив23
Експериментальні роботи
Изученные катионные детергенты представляют собой соли четвертичных аммониевых (ЦТА) и пиридиниевых (ЦП) соединений
с протяженным алкильным радикалом (С16).
Известно, что соединения, имеющие «заряженную головку» и длинный углеводородный
«хвост» являются поверхностно-активными
веществами (ПАВ). В силу своей амфифильной
природы эти соединения в растворах склонны к образованию агрегатов, так называемых
мицелл, и при определенных концентрациях
способны вызывать денатурацию протеина.
Однако в разбавленных растворах при концентрациях, существенно ниже критической
концентрации мицеллообразования (ККМ),
составляющей обычно 10-2–10-4 М, ПАВ образуют истинные растворы, т.е. молекулы подобных веществ находятся в «мономерном» состоянии и взаимодействуют с протеинами как
обратимые эффекторы [8].
Ранее было установлено, что эффекторы
ЦП и ЦТА активируют гидролиз α-нафтил­
ацетата под действием БуХЭ сыворотки крови лошади [5] и величина их активирующего
действия на энзим зависит как от концентрации эффектора, так и от концентрации субстрата. На рис. 1, в качестве примера, представлена зависимость начальных скоростей
гидролиза α-нафтилацетата от его концентрации в присутствии 1×10-5 М ЦТА при рН 7,5,
где видно, что активирующее влияние ЦТА в
наибольшей степени проявляется при малых
концентрациях­ субстрата.
3
v, усл. ед.
ностью 9,7 Е(БуХ) на 1 мг протеина, дополнительно очищенный нами [5]. Очищенный
препарат энзима имел удельную активность не
менее 400 Е(БуХ) на 1 мг протеина и по данным электрофореза и субстратно-ингибиторного анализа не содержал заметных примесей
других эстераз.
Скорость холинэстеразного гидролиза
α‑нафтилацетата в отсутствие и в присутствии
ЦП или ЦТА определяли по скорости нарастания интенсивности флуоресценции продукта
реакции, α-нафтола, при малых степенях превращения субстрата (<<10%), т.е. в режиме измерений начальных скоростей реакций, с учетом неэнзиматического гидролиза субстрата [5].
В предварительных опытах было установлено,
что ЦП и ЦТА в используемых концентрациях
в отсутствие энзима во всем изученном диапазоне рН не гидролизуют α-нафтилацетата и
не вызывают изменения флуоресценции реакционной смеси. Измерения проводили в кварцевой кювете с длиной оптического пути 1 см
при температуре 25 °С в 5 мМ трис-HCl-буфере при заданной величине рН (от 5,00 ± 0,05
до 8,50 ± 0,05). Реакцию начинали добавлением энзима в пробу, содержащую субстрат и
детергент. Каждую серию опытов проводили,
используя одинаковую исходную активность
энзима. Исходную активность холинэстеразы
определяли методом потенциометрического
титрования образующейся карбоновой кислоты [6] при температуре 25 °С и рН 7,5 ± 0,1
и концентрации бутирилхолина 0,02 М в присутствии 0,1 М хлористого калия.
Скорость холинэстеразного гидролиза
α‑нафтилацетата выражали в условных единицах (усл. ед.). Одна условная единица соответ­
ствовала увеличению интенсивности флуоресценции реакционной смеси на одно деление
шкалы самописца за 1 минуту.
Величины кинетических параметров энзиматической реакции: константу Михаэлиса
(К m) и предельную скорость реакции (V ) находили графическим методом Лайнуивера-Берка
[7] в режиме программы Microsoft Excel. Полученные результаты обрабатывали статистически с использованием t-критерия Стьюдента.
2
1
2
1
0
0
2
Результаты и обсуждение
В экспериментах использовали высокоочищенную БуХЭ плазмы крови лошади, которая по многим свойствам близка к БуХЭ
плазмы крови человека. Действие ЦП и ЦТА
на энзиматический гидролиз α-нафтилацетата
изучали в интервале рН от 5,0 до 8,5 при различных концентрациях субстрата.
24
4
6
8
10
α-нафтилацетат, 10-4 М
Рис. 1. Зависимость скорости энзиматическоα-нафтилацетата от его концентрации в присутствии цетилтриметиламмоний бромида (ЦТА) (0,005 М трис-НCl-буфер,
рН 7,5, 25 °С): 1 – в отсутствие ЦТА; 2 – в
присут­ствии 1×10 -5 М ЦТА
Ɋɢɫ.
1.
го гидролиза
ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2009, т. 81, № 4
Л. П. КУЗНЕЦОВА, Е. Р. НИКИТИНА, Е. Е. СОЧИЛИНА, К. А. ВАСИЛЬЕВА
Представление этих экспериментальных
данных в координатах Лайнуивера–Берка
(рис. 2) наглядно демонстрирует, что активация гидролиза α-нафтилацетата связана с понижением величины К m в 7 раз с (4,8 ± 0,4)×10-4
до (0,7 ± 0,1)×10-4, тогда как величина V остается неизменной.
Подобным образом на гидролиз α-нафтил­
ацетата действует и ЦП, но сравнительно с
ЦТА, при меньших его концентрациях.
Как уже отмечалось выше, ЦТА и ЦП, будучи активаторами бутирилхолинэстеразного
гидролиза α-нафтилацетата, проявляют себя
как сильные обратимые конкурентные ингибиторы гидролиза катионного субстрата бутирилхолина (БХ). Значения констант связывания
ЦТА и ЦП с энзимом, определенные по степени активации гидролиза α-наф­тилацетата, составляют (5,1 ± 0,4)×10-6 М и (3,0 ± 0,3)×10-7 М
соответственно. Величины констант конкурентного ингибирования гидролиза БХ этими
соединениями составляют (5,0 ± 0,5)×10-6 М и
(2,9 ± 0,3)×10-7 М соответственно [5]. Совпадение, в пределах ошибки опыта, величин констант связывания для эффектов ингибирования и активации позволяет считать с большой
долей вероятности, что молекулы ЦТА и ЦП
взаимодействуют с активным центром энзима
с образованием одного и того же комплекса
энзим–эффектор.
По отношению к реакции гидролиза холинового эфира комплекс энзим–эффектор
является энзимингибиторным. При этом вероятно, что при связывании молекул холиновых
эфиров, несущих положительный заряд, имеет
место конкуренция между ними и положительно заряженными молекулами эффектора
при взаимодействии с «анионным» центром,
который является частью активного центра энзима и обеспечивает, согласно существующим
представлениям, связывание молекул заряженного субстрата. По отношению к реакции
гидролиза α-нафтилацетата, молекулы которого не несут заряда, комплекс энзим–эффектор
не создает препятствий связыванию молекул
нейтрального субстрата, поскольку конкуренция за анионный центр отсутствует. Кроме
того, вероятно, что ПАВ даже при концентрациях ниже ККМ могут сорбироваться на
макромолекуле энзимного протеина, изменяя
ее заряд. В связи с этим нельзя исключать, что
активация гидролиза α-нафтилацетата в присутствии эффектора может быть обусловлена
изменениями в расположении отдельных участ­
ков активного центра (возможно конформацио­
нными), возникающими при взаимодействии
макромолекулы энзима с несущей заряд молекулой эффектора, что приводит к созданию
более благоприятных условий для связывания
α-нафтилацетата.
(1/v), (усл. ед.)-1
4
1
3
2
1
2
0
-2
-1
0
1
2
3
(1/[α-нафтилацетат]), 104 М-1
Рис. 2. Величины кинетических параметров V и К m энзиматического гидролиза α-нафтилацетата
в отсутствие и в присутствии цетилтриметиламмоний бромида (ЦТА) (0,005 М трис-HCl-буфер,
рН 7,5; 25 °С): 1 – в отсутствие ЦТА; 2 – в присутствии 1×10 -5 М ЦТА
ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2009, т. 81, № 4
Ɋɢɫ. 2.
25
Експериментальні роботи
Для выяснения механизмов влияния рН
на кинетические параметры реакций гидролиза α-нафтилацетата под действием БуХЭ, были
определены величины К m и V в контрольном
опыте и в присутствии 1×10-5 М ЦТА или
5×10-6 М ЦП при рН от 5,0 до 8,5. Эти данные
представлены в виде графиков зависимости V
(рис. 3, а) и К m (рис. 3, б) от рН реакционной
среды. Как видно из этих рисунков, величина
V практически не зависит от рН в интервале
5,5–8,5 в контрольном опыте и не изменяется
в присутствии эффекторов. При рН ниже 5,5
в обоих случаях наблюдается незначительное
уменьшение этой величины. Величина К m в
реакции энзиматического гидролиза α-нафтил­
ацетата в отсутствие эффекторов не изменяется в интервале рН 8,0–6,5. При снижении рН
ниже 6,5 величина К m возрастает, и при рН 5,0
увеличивается более чем в 3 раза по сравнению
с К m при нейтральном рН. В присутствии эффекторов величина К m остается практически
постоянной во всем изученном диапазоне рН.
Вследствие этого, при рН 5,0–5,5 наблюдаемая
степень активации значительно выше, чем при
нейтральном значении рН и составляет для
ЦП 30–35, а для ЦТА 12–15 раз.
Согласно существующим представлениям,
гидролиз сложных эфиров на активном центре
холинэстеразы происходит при активном участии имидазольного фрагмента гистидина [9].
Протекание этой реакции должно быть неминуемо затруднено при протонировании имид­
азольного остатка в кислой среде с соответ­
ствующим падением величины V. Отсутствие
зависимости V от рН при одновременном изменении К m приводит к предположению о том,
что в комплексе энзим–α-нафтилацетат протонирование имидазольного остатка гистидина
подавлено (вероятно конкурентно) вследствие
экранирующего действия громоздкой ароматической спиртовой группы в молекуле α-нафтил­
ацетата. Увеличение К m для α-нафтилацетата при уменьшении рН ниже 6,5 может быть
обусловлено тем, что протонирование имид­
азольного цикла при высоких концентрациях
водородных ионов конкурентно препятствует
связыванию α-нафтилацетата активным центром энзима. Причиной ослабления связывания
α-нафтилацетата и соответственно увеличения
К m, также может быть изменение сольватации
участка активного центра при протонировании имидазола.
При связывании ЦТА и ЦП активным
центром энзима, т.е. при образовании комплекса энзим–эффектор, протонирование имид­
азольного фрагмента гистидина при кислых
значениях рН може быть подавлено за счет
экранирующего эффекта массивных алифатических заместителей у эффекторов. За счет
этого взаимодействие комплекса энзим–эффектор с α-нафтилацетатом нечувствительно
к изменению концентрации водородных ионов
при изменении рН в широком диапазоне, что
приводит к сохранению величины К m и соответственно к значительному увеличению эффекта активации в кислой среде.
Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что бутирилхолинэстеразный гидролиз α-нафтилацетата при рН ниже
6,5 существенно замедляется за счет возрастания величины К m. При этом ЦТА и ЦП пред­
отвращают возрастание К m при увеличении
А
К m, 10-4 М
1,0
v, усл. ед.
Б б
15
0,8
0,6
10
5
0,4
0,2
0
5
6
7
рН
8
0
5
6
7
8
рН
Рис. 3. Зависимость величин максимальной скорости
гидролиза α-нафтилацетата V (А) и константы
Ɋɢɫ. 3.
Михаэлиса К m (Б) от рН реакционной среды: □ – α-нафтилацетат, ○ – α-нафтилацетат + 1×10 -5 М
цетилтриметиламмоний бромид, ∆ – α-нафтилацетат + 5×10 -6 М ЦП
26
ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2009, т. 81, № 4
12
Л. П. КУЗНЕЦОВА, Е. Р. НИКИТИНА, Е. Е. СОЧИЛИНА, К. А. ВАСИЛЬЕВА
концентрации водородных ионов и в их присутствии бутирилхолинэстеразный гидролиз
α-нафтилацетата практически не зависит от
рН среды в диапазоне от 8,5 до 5,5.
Следует отметить, что многие ПАВ, к которым относятся исследованные соединения,
входят в состав синтетических моющих средств
и являются распространенными экологическими загрязнителями. Кроме того, ЦТА и ЦП в
настоящее время широко используют в современной медицине и косметологии, применяют
для выделения ДНК и др. Существенно, что
азотсодержащие катионные детергенты даже
в малых концентрациях могут вызывать сильные аллергические реакции и представлять
серьезную угрозу для здоровья человека и домашних животных. В связи с этим, получение
дополнительных сведений о влияние катионных детергентов на БуХЭ плазмы крови может
принести практическую пользу.
вплив рн на холінестеразний
гідроліз α-нафтилацетату
за присутності катіонних
детергентів
Л. П. Кузнєцова, О. Р. Нікітіна,
О. Є. Сочіліна, К. О. Васильєва
Інститут еволюційної фізіології і біохімії
ім. І. М. Сеченова РАН, Санкт-Петербург, Росія;
e-mail: esoch@iephb.ru
Вивчено вплив катіонних детергентів цетилпіридинію та цетилтриметиламонію на
каталітичну активність бутирилхолінестерази
плазми крові коня в реакції гідролізу за різних рН реакційного середовища. З’ясовано,
що за відсутності ефекторів у разі зниження
рН в інтервалі 8,5–5,5 константа Михаеліса К m
ензиматичної реакції зростає, а величина граничної швидкості V залишається сталою. За
присутності ефекторів у досліджуваному діапазоні рН величини К m та V практично не змінюються. Завдяки цьому активація ензиматичного гідролізу α-нафтилацетату за присутності
цетилпіридинію та цетилтриметил­амонію при
рН 5,5 є значно вищою порівняно з нейтральним рН реакційного середовища.
К л ю ч о в і с л о в а: бутирилхолінестераза плазми крові коня, ензиматичний гідроліз,
α‑нафтилацетат, активація, цетилпіридиній,
цетилтриметиламоній.
the influence of рн
on cholinesterase hydrolysis
of α‑naphthylacetate in the
presence of some cationic
detergents
L. P. Kuznetsova, E. R. Nikitina,
E. E. Sochilina, K. A. Vasiljeva
Sechenov Institute of Evolutionary physiology
and biochemistry, Russian Academy
of Sciences, Sankt-Petersburg, Russia;
e-mail: esoch@iephb.ru
Summary
The influence of some cationic detergents
on the catalytic activity of the horse blood plasma
cholinesterase in reaction of hydrolysis of α-naphthylacetate at different рН were investigated. It was
shown, that in the absence of detergents in acid рН
of the reaction medium the К m value increases, but
V remain constant. In the range of рН from 8.5
to 5.0 in the presence of detergents the К m and V
values are not practically changed. That is why the
activation of cholinesterase hydrolysis of α-naphthylacetate in the presence of detergents is conside­
rably higher than that of the neutral pH.
K e y w o r d s: BuCHE of horse blood plasma,
enzymatic hydrolysis, α-naphthylacetate, activation, cetylpyridinium, cetyltrimethylammonium.
1. Nicolet Y., Lockridge O., Masson P. et al. // J.
Biol. Chem. – 2003. – 278, N 42. – P. 41141–
41147.
2. Saxena A., Sun W., Luo C. et al. // Mol.
Neurosci. – 2006. – 30, N 1–2. – P. 145–
148.
3. Masson P., Nachon F., Bartels C. F. et al.
// Eur. J. Biochem. – 2003. – 270, N 2. –
P. 315–324.
4. Бресткин А. П., Брик И. Л. // Биохимия. –
1967. – 32, вып. 1. – С. 3–12.
5. Жуковский Ю. Г., Кузнецова Л. П., Сочили­
на Е. Е. // Укр. биохим. журн. – 1995. – 67,
№ 4. – С. 40–46.
6. Яковлев В. А. Кинетика энзиматического
катализа. – М.: Наука, 1965. – 248 с.
7. Диксон М., Уэбб Э. Энзимы. – М.: Мир,
1982. – 2. – С. 497–559.
8. Ямпольская Е. П. Молекулярные взаи­
модействия. 1984. – C. 151–183.
9. Бресткин А. П., Кузнецова Л. П., Моралев С. Н.
и др. Холинэстеразы наземных животных
и гидробионтов. – Владивосток, ТИНРОцентр, 1997. – 466 с.
Получено 25.05.2009
ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2009, т. 81, № 4
27