«Использование метода внутриклеточного окрашивания цитокинов для определения содержания эффекторных субпопуляций Т-лимфоцитов » МУ «Клинико-диагностический центр» Институт иммунологии и физиологии УрО РАН г.Екатеринбург Трансформации CD4+лимфоцитарных субпопуляций Наивные Т-лимфоциты Нестабильны TGF iTreg Foxp3 IL-6 Th17 Th1 IL-4 RORt, AhR IFN-, IL-12 T-bet IL-12R2+ Th1+2 IFN-, IL-12 IFN I GATA-3 IL-12R2- Стабильны Murphy KM et al. Effector T cell plasticity: flexibility in the face of changing circumstances. Nature Immunology, 2010,11(8): 674-679 Th2 Характеристика отдельных CD4 эффекторных Т-клеточных субпопуляций Субпопуляции CD4 Тэффекторов Поляризационные факторы Транскрипционные факторы Маркерные цитокины Th1 IL-12, IFN- T-bet IFN-, TNF, IL-2 Th2 IL-4 GATA-3 Th17 TGF, IL-6, ROR- t IL-4, IL-5, IL-13 IL-17, IL21, IL-22 K.K.McKinstry et al. The potential of CD4 T-cell memory. Immunology, 2010, 130, 1-9 Tс1/Тс2-лимфоциты Tс2 Tс1 Маркерные молекулы Цитокиныиндукторы Участие в иммунном ответе Tc1 IL2, IFN IFN, IL12 Вирусные инфекции, противоопухолевый иммунитет Tc2 IL4, IL5, IL6, IL10 IL4 Вирусные инфекции, противоопухолевый иммунитет Участие в иммунопатологичес ких реакциях Аутоиммунные заболевания Актуальность изучения возрастных особенностей баланса Th1, Tc1 и Th2, Tc2, Th17 и Tnc17 лимфоцитов Определение содержания различных эффекторных T-лимфоцитарных субпопуляций, начиная с периода новорожденности вплоть до взрослого возраста, имеет важнейшее значение: • для оценки колебания их уровня в ходе того или иного патологического процесса • для представления о нормальных иммунологических вариациях в различных возрастных группах • для исследования процессов иммунологического созревания Объект исследования Образцы гепаринизированной венозной крови 150 здоровых детей и 45 взрослых: 7-12 месяцев – 30 детей 1-3 года-30 детей 4-7 лет – 30 детей 8-14 лет – 30 детей 15-18 лет – 30 подростков 25-45 лет – 45 взрослых Метод внутриклеточного окрашивания цитокинов в стимулированных лимфоцитах периферической крови: Активация PMA (50 нг/мл)с иономицином (1 мкг/мл) в присутствии Брефелдина А, 4 часа Фиксация , 10 мин Пермеабилизация сапонинсодержащим раствором , 10 мин Одновременное окрашивание поверхностных рецепторов и внутриклеточное окрашивание антицитокиновыми mAb, 30 мин Анализ Моноклональные антитела: Для определения внутриклеточных цитокинов использовались следующие моноклональные антитела: Фикоэритрин (PE)-коньюгированные 45.15 для определения IFN- (IO Test, Immunotech, France) - Th1, Tc1 PE-коньюгированные 4D9 для определения IL-4 (IO Test, Immunotech, France) –Th2, Tc2 PE-коньюгированные SCPL1362 для определения IL-17А (BD Pharmingen) –Th17, Tnc17 Для окрашивания поверхностных рецепторов: Фикоэритринцианин 5.1 (PC-5)-коньюгированные UCHT1 CD3 (IO Test, Immunotech, France) Флюоресцеин изотиоцианат (FITC)-коньюгированные 13В8.2 CD4 (IO Test, Immunotech, France) FITC-коньюгированные В9.11 CD8 (IO Test, Immunotech, France) Для определения содержания Т-клеток-памяти: CD45RA FITC/CD62L PE/CD3 PerCP/CD4 APC и CD45RA FITC/CD62L PE/CD3 PerCP/CD8 APC MultiTest (BDIS). Спонтанная экспрессия цитокинов лимфоцитами периферической крови (4 часа в присутствии брефелдина А) Стимулированная экспрессия цитокинов лимфоцитами периферической крови (ФМА и иономицин, 4 часа в присутствии брефелдина А) CD69s=96% CD69cyt=98% Содержание Th1-лимфоцитов в разных возрастных группах 20 Тэффекторы /клетки памяти 18 16 CD3+CD4+IFN % 14 12 10 8 6 7-12 мес 1-3 года 4-7 лет 8-14 лет 15-18 лет 25-45 лет Медиана Нижний и верхний квартили 1 Медиана Нижний и верхний квартили 2 Медиана Нижний и верхний квартили 3 Медиана Нижний и верхний квартили 4 Медиана Нижний и верхний квартили 5 Медиана Нижний и верхний квартили 6 0,95 0,40 1,45 2,55 1,34 3,39 3,80 1,96 4,50 6,34 5,47 8,17 5,30 4,43 6,40 7,55 5,90 8,74 3,4,5,6 4,5,6 1,4,5,6 1,2,3 1,2,3 1,2,3 49,76 26,44 74,32 108,08 65,91 153,05 82,16 53,57 143,54 125,50 98,54 169,78 115,34 96,13 161,26 147,98 100,22 176,35 2,4,5,6 1 1 1 1 4 2 0 -2 1 2 3 4 5 6 Median 25%-75% Min-Max возрастные группы 0,45 0,40 Th1 % 0,35 CD3+CD4+IFN а 0,30 0,25 Th1 0,20 0,15 Абс./мк л 0,10 0,05 0,00 -0,05 1 2 3 4 возрастные группы 5 6 Median 25%-75% Min-Max Содержание Th2-лимфоцитов в разных возрастных группах 1,6 Тэффекторы /клетки памяти 1,4 1,2 CD3+CD4+IL4+, % 1,0 0,8 0,6 0,4 7-12 мес 1-3 года 4-7 лет 8-14 лет 15-18 лет 25-45 лет Медиана Нижний и верхний квартили 1 Медиана Нижний и верхний квартили 2 Медиана Нижний и верхний квартили 3 Медиана Нижний и верхний квартили 4 Медиана Нижний и верхний квартили 5 Медиана Нижний и верхний квартили 6 0,10 0,00 0,18 0,10 0,05 0,20 0,10 0,10 0,20 0,20 0,10 0,30 0,10 0,00 0,20 0,38 0,20 0,80 6 6 6 6 6 1,2,3,4, 5 4,98 0,00 10,16 5,24 1,40 8,50 3,24 1,82 5,41 3,74 1,15 5,56 2,88 0,00 4,60 7,80 3,38 13,96 1,6 5 0,2 0,0 -0,2 1 2 3 4 5 6 Median 25%-75% Min-Max возрастные группы 0,07 0,06 Th2 % CD3+CD4+IL4+, 109/л 0,05 0,04 Th2 0,03 0,02 Абс./мк л 0,01 0,00 -0,01 1 2 3 4 возрастные группы 5 6 Median 25%-75% Min-Max 5 Содержание Th17-лимфоцитов в разных возрастных группах 2,0 Тэффекторы /клетки памяти 1,8 1,6 CD3+CD4+IL17+, % 1,4 7-12 мес 1-3 года 4-7 лет 8-14 лет 15-18 лет 25-45 лет Медиана Нижний и верхний квартили 1 Медиана Нижний и верхний квартили 2 Медиана Нижний и верхний квартили 3 Медиана Нижний и верхний квартили 4 Медиана Нижний и верхний квартили 5 Медиана Нижний и верхний квартили 6 Th17 % 0,20 0,10 0,40 0,20 0,10 0,25 0,10 0,10 0,40 0,20 0,15 0,30 0,20 0,10 0,40 0,30 0,12 0,45 Th17 11,01 5,59 20,29 5,62 2,25 15,90 5,90 2,97 8,33 1 4,21 2,42 8,03 1 4,49 1,91 9,68 2,3,4,5,6 4,10 1,65 8,83 1 1 1 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 -0,2 1 2 3 4 5 6 Median 25%-75% Min-Max возрастные группы 140 120 CD3+CD4+IL17+, 10 6/ л 100 80 60 40 Абс./мк л 20 0 -20 1 2 3 4 возрастные группы 5 6 Median 25%-75% Min-Max Содержание Tс1-лимфоцитов в разных возрастных группах 22 Тэффекторы /клетки памяти 20 18 16 CD3+CD8+IFN % 14 12 10 8 6 7-12 мес 1-3 года 4-7 лет 8-14 лет 15-18 лет 25-45 лет Медиана Нижний и верхний квартили 1 Медиана Нижний и верхний квартили 2 Медиана Нижний и верхний квартили 3 Медиана Нижний и верхний квартили 4 Медиана Нижний и верхний квартили 5 Медиана Нижний и верхний квартили 6 0,50 0,20 1,12 1,50 0,93 2,39 2,30 1,50 2,90 4,05 3,40 5,46 4,22 3,36 6,55 6,00 3,73 8,87 4,5,6 5,6 5,6 1 1,2,3 1,2,3 84,68 56,62 160,55 204,65 126,68 312,77 150,56 104,65 249,74 236,76 174,87 280,06 232,83 191,45 309,08 276,88 185,33 377,41 1 1 4 2 0 -2 1 2 3 4 5 6 Median 25%-75% Min-Max возрастные группы 0,8 0,7 Tс1 % 0,6 CD3+CD8+IFN а 0,5 0,4 Tс1 0,3 0,2 Абс./мк л 0,1 0,0 -0,1 1 2 3 4 возрастные группы 5 6 Median 25%-75% Min-Max 5,6 Содержание Tс2-лимфоцитов в разных возрастных группах Тэффекторы /клетки памяти 0,9 0,8 0,7 7-12 мес 1-3 года 4-7 лет 8-14 лет 15-18 лет 25-45 лет Медиана Нижний и верхний квартили 1 Медиана Нижний и верхний квартили 2 Медиана Нижний и верхний квартили 3 Медиана Нижний и верхний квартили 4 Медиана Нижний и верхний квартили 5 Медиана Нижний и верхний квартили 6 Tс2 % 0,10 0,07 0,18 0,10 0,00 0,13 0,05 0,00 0,10 0,10 0,08 0,10 0,10 0,00 0,20 0,10 0,10 0,20 Tс2 6,99 3,39 10,46 3,66 0,00 5,88 1,68 0,00 3,69 1,90 1,11 3,74 2,25 0,00 4,35 2,24 1,25 4,04 2,3,4,5, 6 1 1 1 1 1 CD3+CD8+IL4+, % 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 -0,1 1 2 3 4 5 6 Median 25%-75% Min-Max возрастные группы 0,07 0,06 CD3+CD8+IL4+, 109/л 0,05 0,04 0,03 Абс./мк л 0,02 0,01 0,00 -0,01 1 2 3 4 возрастные группы 5 6 Median 25%-75% Min-Max Содержание Tnс17-лимфоцитов в разных возрастных группах 1,4 Тэффекторы /клетки памяти 1,2 CD3+CD8+IL17+, % 1,0 7-12 мес 1-3 года 4-7 лет 8-14 лет 15-18 лет 25-45 лет Медиана Нижний и верхний квартили 1 Медиана Нижний и верхний квартили 2 Медиана Нижний и верхний квартили 3 Медиана Нижний и верхний квартили 4 Медиана Нижний и верхний квартили 5 Медиана Нижний и верхний квартили 6 Tnс17 % 0,10 0,10 0,30 0,10 0,10 0,20 0,10 0,05 0,20 0,10 0,05 0,20 0,30 0,20 0,40 0,10 0,10 0,16 Tnc17 7,53 4,63 15,62 5,62 3,58 12,04 3,19 1,19 7,35 1 2,78 1,40 4,46 1 6,15 3,81 9,58 2,01 1,39 3,79 1 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 -0,2 1 2 3 4 5 6 Median 25%-75% Min-Max возрастные группы 100 CD3+CD8+IL17+, 10 6/л 80 60 40 Абс./мк л 20 0 3,4,5,6 -20 1 2 3 4 возрастные группы 5 6 Median 25%-75% Min-Max Соотношение Th1/Th2, Tc1/Tc2 лимфоцитов в разных возрастных группах 200 Тэффекторы /клетки памяти 180 160 140 7-12 мес 1-3 года 4-7 лет 8-14 лет 15-18 лет 25-45 лет Медиана Нижний и верхний квартили 1 Медиана Нижний и верхний квартили 2 Медиана Нижний и верхний квартили 3 Медиана Нижний и верхний квартили 4 Медиана Нижний и верхний квартили 5 Медиана Нижний и верхний квартили 6 Th1/ Th2 5,00 3,00 9,75 3,4,5,6 17,32 10,38 27,60 26,80 17,97 39,90 1 39,70 17,33 52,50 1 31,08 23,00 45,50 1 15,25 10,11 31,00 1 Tc1/ Tc2 3,00 1,75 6,30 18,20 7,10 22,03 22,55 12,57 34,88 34,00 19,75 58,35 23,85 16,58 43,55 46,00 29,00 58,00 1 1 1 Th1/Th2 120 100 80 60 40 20 0 -20 1 2 3 4 5 6 Median 25%-75% Min-Max возрастные группы 220 200 180 160 140 Tc1/Tc2 120 100 80 60 40 20 0 -20 1 2 3 4 возрастные группы 5 6 Median 25%-75% Min-Max 4,5,6 Т-лимфоциты памяти Центральные CD4+Т-клеткипамяти Эффекторные CD4+Т-клеткипамяти Наивные Тхелперы Относительное содержание центральных и эффекторных CD4+и CD8+ Т-лимфоцитов памяти 60 90 80 50 70 40 CD4+TEM, % CD4+ TCM, % 60 30 20 50 40 30 10 20 0 -10 10 1 2 3 4 5 6 возрастные группы Median 25%-75% Min-Max 0 1 2 3 4 5 6 возрастные группы 35 Median 25%-75% Min-Max 100 30 80 20 CD8+TEM, % CD8+ TCM, % 25 15 60 40 10 5 20 0 -5 1 2 3 4 N 5 6 Median 25%-75% Min-Max 0 1 2 3 4 возрастные группы 5 6 Median 25%-75% Min-Max Содержание CD4+ и CD8+Т-лимфоцитов памяти в разных возрастных группах 100 120 90 100 70 CD8+ Т-клетки памяти, % CD4 Т-клетки памяти, % 80 60 50 40 30 20 80 60 40 20 10 0 1 2 3 4 5 6 возрастные группы Median 25%-75% Min-Max 0 2 3 4 5 6 5 6 возрастные группы 1800 1000 1600 900 Median 25%-75% Min-Max 800 CD8 + Т-клетки памяти, 10 6/л 1400 CD4+Т-клетки памяти. 10 6/л 1 1200 1000 800 600 700 600 500 400 300 200 400 100 200 0 1 2 3 4 возрастные группы 5 6 Median 25%-75% Min-Max 0 1 2 3 4 возрастные группы Median 25%-75% Min-Max Коррелятивные связи между содержанием Th1, Th2, Th17-субпопуляций и CD4+Tлимфоцитами памяти Ранговая корреляция по Спирмену, коэффициент корреляции=.267 p=0,000258 CD4+TCM + CD4TEM Ранговая корреляция по Спирмену, коэффициент корреляции =.646 p<.000000 CD4+TCM + CD4TEM Th2 Ранговая корреляция по Спирмену, коэффициент корреляции=. 082 p=0,0269843 Th1 CD4+TCM + CD4TEM Th17 Коррелятивные связи между содержанием Tс1, Tс2, Tnc17-субпопуляций и CD8+Tлимфоцитами памяти Ранговая корреляция по Спирмену, коэффициент корреляции =.066 p=0,375756 CD8+TCM + CD8TEM Ранговая корреляция по Спирмену, коэффициент корреляции = .499 p=.000000 CD8+TCM + CD8TEM Tc2 Ранговая корреляция по Спирмену, коэффициент корреляции =-.029 р=0,688191 Tc1 CD8+TCM + CD8TEM Tnc17 Заключение: • На фоне редуцированного Th1 и Тс1иммунитета на 7-12 месяце жизни у ребенка наблюдается преимущественная поляризация дифференцировки Тлимфоцитов по пути Th2 (Tc2) и Th17 (Tnc17), что, по всей видимости, способствует манифестации Th2опосредованных аллергических заболеваний у детей с предрасположенностью к атопии. Заключение: • У детей старше одного года количество Th1 и Тс1, Th2 и Тс2 лимфоцитов значимо не отличалось от содержания этих субпопуляций у взрослых. Заключение: • В подростковом возрасте увеличение индекса Th1/Тh2 связано со снижением содержания Th2-субпопуляции. В этой же группе наблюдалась тенденция к нарастанию содержания IL17А-позитивных лимфоцитов, что может способствовать предрасположенности к индукции различных аутоиммунных заболеваний в подростковом возрасте. Заключение: • У взрослых людей 25-45 летнего возраста содержание Th1-субпопуляции преобладало над содержанием Th2 в 15 раз, Тс1 над Тс2 – в 46 раз. Увеличение с возрастом относительного содержания Th1 и Тс1-субпопуляций лимфоцитов непосредственно связано с формированием пула Т-лимфоцитов памяти. Спасибо за внимание