Занятие 3. Иммунодиффузия иммуноглобулинов. Температура и

Занятие 3. Иммунодиффузия иммуноглобулинов.
Температура и продолжительность иммунодиффузии
Температура существенно не влияет на результаты диффузии. Опыт можно ставить
при 4°С, 20 °С или 37 °С. Обычно простую радиальную иммунодифузию проводят в
холодильнике при 4—6°С с целью предупреждения роста грибов и бактерий. Следует
избегать резких колебаний температуры (размах не более +5°С). Процесс
иммунодиффузии при работе, например, с альбумином и ферритином, завершается через
48 ч; с IgG и IgA — через 2— 3 дня; с IgM, аг-макроглобулином и другими белками с
крупными молекулами — через 5—7 дней. Первый ориентировочный замер диаметра
преципитата можно получить уже через 4 ч. Существует модификация простой
радиальной иммунодиффузия с постоянным временем диффузии, равным 24 часа. Это
означает, что диффузия антигена по крайней мере при его высокой концентрации
полностью не заканчивается. Получаемые результаты вполне сопоставимы с результатами
простой линейной иммунодиффузии. Соответственно наблюдается линейная зависимость
между логарифмом концентрации антигена и радиусом преципитации. Раньше считалось,
что эта модификация уступает по чувствительности методу, предложенному Манчини.
Недавние исследования указывают, что оба метода имеют одинаковую чувствительность.
Иммуноэлектрофорез (микрометод)
Иммуноэлектрофоретический анализ представляет собой сочетание электрофореза в
агаровом геле с иммунодиффузией. Иммуноэлектрофорез (ИЭФ) впервые описали Грабар
и Уильяме в 1953 г. В 1955 г. Шейдеггер предложил микромодификацию этого метода,
применив обычные предметные стекла. Принцип ИЭФ состоит в следующем. Вначале
проводят электрофоретическое разделение белков в забуференном геле агара; после
разделения в канавку, которая идет в направлении миграции белков, вносят
преципитирующую иммунную сыворотку. АГ и АС диффундируют в геле навстречу друг
другу, и в месте их взаимодействия возникают дугообразные линии преципитации, число,
положение и форма которых дают представление о составе исходной смеси антигенов.
Материалы и оборудование. Для работы нужно иметь предметные стекла,
пробирки с пробками, пипетки (10 мл), очищенный агар или агароза, консервант
(например, мертиолят), препаровальную иглу или небольшой шприц с иглой;
микропипетку со шлангом и мундштуком или микрошприц (50—100 мкл),
фильтровальную бумагу, например, FN 14; NaCl ч. д. а, ледяную уксусную кислоту, амидо
черный 10 В, веронал-натрий, NaCH3COO-3 Н20, 0,1 н. HCl; комплект приборов для
1
электрофореза, в который входят источник тока, электрофоретическая камера, штампы,
водяная баня, стеклорез, уровень, ванночки для окрашивания предметных стекол.
Приготовление агарового геля
Суспендируют 1,5 г очищенного агара в 100 мл веронал-ацетатного буфера (рН 8,6,
ионная сила 0,1), добавляют мертиолят до конечной концентрации 0,1% и нагревают
суспензию на водяной бане до полного расплавления агара (раствор становится
прозрачным).
Состав буфера:
веронал-натрий —29,43г., ацетат натрия (ЗН20) — 19,42 г., 0,1 М HCl 180,0мл,
дистиллированная вода до 3000,0 мл.
Горячий прозрачный раствор агара разливают по пробиркам (заполнять только до
половины), закрывают пробками, дают остыть при комнатной температуре и после
охлаждения хранят в холодильнике при 4 °С.
Приготовление агаровых пластинок
Тщательно очищенные и обезжиренные предметные стекла надписывают
стеклорезом и помещают на горизонтальную плоскость. Несколько пробирок с 1,5% гелем
агара нагревают на водяной бане. При помощи предварительно нагретой пипетки (10 мл)
на каждое предметное стекло наносят по 2,5 мл горячего золя агара. Раствор агара должен
равномерно распределиться по обезжиренной поверхности стекла и после затвердения
образовать однородный слой геля.
Формирование лунок и канавок в геле
При помощи штампов в слое геля вырезают лунки для антигенов и канавки для
антисывороток. Выбор подходящего штампа определяется задачей исследования. Очень
удобны штампы с изменяемым профилем. Вырезанные фрагменты геля удаляют иглой
или при помощи водоструйного насоса. В образовавшиеся лунки вносят примерно по 2
мкл исследуемого материала микрошприцем. Полоски геля, образовавшиеся после
вырезания канавок, также следует удалить до электрофореза, так как после это будет
трудно сделать вследствие нагревания геля. Вырезанные фрагменты геля удаляются
гораздо легче, если пластинки на 1—2 мин поместить в морозильник.
Проведение электрофореза
Электрофоретическую камеру присоединяют к источнику постоянного тока,
выдерживающего нагрузку до 100 мА. Электродные отсеки заполняют веронал-ацетатным
буфером с рН 8,6 и устанавливают камеру строго горизонтально по уровню.
Внесение антисыворотки
После электрофоретического разделения белков в продольную канавку вносят
0,03—0,05 мл преципитирующей иммунной сыворотки. Сыворотка не должна
переливаться через край канавки, иначе расположение линий преципитации будет
искажено.
Иммунодиффузия, элюирование, окрашивание
Иммунодиффузия продолжается не менее 24 ч во влажной камере.
Затем сразу же начинают элюировать белки, которые не участвовали в
преципитации, с помощью 0,15 М NaCl. Элюирование проводят 3 сут с ежедневной
сменой раствора. После этого пластины геля накрывают фильтровальной бумагой (не
оставляя пузырьков воздуха) и высушивают при комнатной температуре или в сушильном
шкафу при температуре не выше 40 °С. Для окрашивания белков чаще всего применяют
амидо черный 10 В, лиссаминовый (светлый) зеленый, азокармин В или пунцовый 2R.
Липопротеиды окрашивают су-даном черным В. При этом важно окрашивать полностью
высушенный препарат, так как судан черный В нерастворим в воде и не воспринимается
влажным гелем или образует неспецифические осадки. Иммунофореграмма белков
2
сыворотки человека, проявленная
представлена на рисунке.
полиспецифической
антисывороткой
кролика,
Гели и их свойства.
Основная функция геля — локализация преципитата. Она становится возможной,
если растворенные антигены и антитела легко диффундируют в геле, но образующиеся
иммунные комплексы ввиду их величины остаются внутри ячеек геля. Благодаря
локализации преципитата достигается следующее:
а. В множественных системах антиген-антитело отдельные компоненты реакции
диффундируют с различной скоростью, обусловленной неодинаковой величиной молекул
и их концентрацией. В связи с этим могут образовываться множественные
пространственно разделенные преципитаты, т. е. создается возможность анализа
множественных систем.
б. По форме и расположению преципитатов можно судить о диффузионных
свойствах и, следовательно, об относительной молекулярной массе антигена или антитела.
в. Порядок расположения линий преципитации по отношению друг к другу
позволяет делать выводы об полном или частичном иммунохимическом сходстве, а также
об отсутствии такового.
г. Исходя из величины ареала и удаленности от линии старта иммунных комплексов,
можно проводить их количественное определение.
3
Наиболее распространены гели агара и агарозы; гели желатины, пектина, крахмала,
полиакриламида или ацетата целлюлозы применяются в реакциях иммунодиффузии реже.
Модификации метода.
По различным причинам в стандартную методику приходится вводить ряд
изменений. Для повышения чувствительности метода используют более толстые слои геля
и более вместительные лунки для антигенов (до 20 мкл). Слабые преципитаты становятся
лучше различимыми после обработки танином. Танин используют в концентрациях от 0,2
до 4% при рН 1,5. Усиление действия танина наблюдается при обработке неокрашенных
препаратов раствором дигидроксифениланилина. Использование подобных приемов
позволяет определять даже IgE у верхней границы нормальной концентрации. Усиление
преципитации наблюдается при добавлении к смеси агароза —антисыворотка карбовакса
20 М в количестве до 20 г/л. Внесение неионных полимеров (полиэтиленгликоль,
карбовакс, оксидвакс) в лунки для антигена или обработка пластин для иммунодиффузия
антииммуноглобулиновой сывороткой также усиливает преципитацию. Некоторые
изменения при постановке простой радиальной иммунодиффузии связаны с экономией
антисыворотки.
Определенное небольшое количество антисыворотки до или после диффузии
антигена наносится на область предполагаемой преципитации на поверхности геля.
Антиген, диффундирующие радиально, и антитела, диффундирующие соответственно
вертикально, встречаются в толще геля и образуют преципитаты. При этом следует
избегать подогревания геля. Простая радиальная иммунодиффузия пригодна в равной
мере для количественного и для качественного анализа иммунохимически близких
белков. Если количество в лунках постоянно, можно судить о титре антитела в
антисыворотках различных животных по величине колец преципитации при точно
известном содержании антисыворотки в геле. Для определения титра антитела смешивают
гель в установленной пропорции с антигеном, антитела диффундируют в гель (так
называемая обратная радиальная иммунодиффузия). Радиус колец преципитации
пропорционален титру. Вместо агара или агарозы в реакции простой радиальной
иммунодиффузия можно использовать пленку ацетата целлюлозы. Разработан интересный
вариант данного метода, позволяющий количественно оценить степень структурного
сходства родственных антигенов.
4
а — определение IgG на пластинах 100X70 мм (препарат д-ра Linneke, Висмар);
б — определение IgM на предметных стеклах. Два противоположных резервуара на
узких сторонах стекла служат для внесения контрольной пробы.
Этот метод прочно удерживается в лабораториях. Многие белки можно определять,
используя коммерческие наборы стандартов или даже готовые иммунодиффузионные
пластинки. Ошибка метода при работе с одной серией реагентов составляет 3—7%
(литературные и собственные данные). Контрольные измерения изо дня в день в течение
длительного времени дают коэффициент вариации 8—10% для оценки иммуноглобулин.
Известно, что в норме содержание многих сывороточных белков сильно колеблется,
например IgG от 8 до 18 г/л. С учетом этого средняя ошибка определения нижних границ
концентрации составляет для сывороточного IgA— 18,3%, для IgG— 17,4%, для IgM—
15,7%, для гаптоглобина—13,6%, для трансферрина — 9,8%. Соответствующие значения
для верхней границы составляют 8,6%, 6,5%, 7,3%, 7,1% и 5,2% (60—70 измерений
последовательно в течение 26 дней).
Необходимо помнить, что концентрации ИГ, определяемые методом простой
радиальной иммунодиффузия у здоровых лиц, не укладываются в нормальную кривую
распределения результатов; об этом следует помнить при статистической обработке
данных. Относительно простая постановка опыта, несложное оборудование, надежность
метода способствуют широкому использованию простой, радиальной иммунодиффузия. К
числу недостатков метода следует отнести большую длительность реакции по сравнению
5
с другими методами, в основе которых лежит образование иммунных преципитатов. С
точки зрения клиницистов, например специалистов в области клинической иммунологии,
этот недостаток не столь существен, поскольку ситуации, когда необходимо знать
концентрацию иммуноглобулин в день взятия пробы, встречаются редко.
Двойная радиальная иммунодиффузия
В слое агара равномерной толщины на определенном расстоянии друг от друга
делают лунки для антигена или антисыворотки. После внесения растворов в лунку эти
компоненты начинают диффундировать радиально в гель. Встречаясь друг с другом,
антигены и антитела начинают образовывать иммунные комплексы, которые
преципитируют в ячейках геля и становятся видимыми как линии преципитации.
Двойную радиальную иммунодиффузию проводят на предметных стеклах (микрометод).
Материалы и оборудование. Для работы необходимо иметь моно- и
полиспецифические сыворотки, чистый агар (специальный агар Noble или очищенный
агар Difko, США), который можно заменить агарозой. В качестве растворителей для агара
используются самые разнообразные растворы, мы приводим состав трех из них:
— 0,15 М NaCl;
— забуференный раствор NaCl с рН 7,2, состоящий из 9 частей 0,15 М NaCl и 1
части 0,07 М фосфатного буфера по Серенсену. Состав фосфатного буфера: КН2Р04—
9,073 г/л; Na2HP04*2H20— 11,87 г/л; раствор КН2Р04 в количестве 29,6 мл доводят
раствором Na2HP04 до 100 мл. В результате получается 0,07 М фосфатный буфер с рН
7,2;
— натрий-ацетат — натрий-диэтилбарбитуратный буфер с рН 8,6 и ионной силой 0,1
(веронал-ацетатный буфер по Backhausz) Na-диэтилбарбитурат — 9,75 г; Na-ацетат —
6,47 г; 0,1 М HCl — 60 мл; дистиллированная вода до 1000 мл.
6