ЯББАРОВ НИКИТА ГРИГОРЬЕВИЧ Разработка подхода к
реклама
На правах рукописи ЯББАРОВ НИКИТА ГРИГОРЬЕВИЧ Разработка подхода к созданию универсальных систем направленной доставки в опухолевые клетки на основе дендримеров 03.01.03 – молекулярная биология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2014 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Центре «Биоинженерия» Российской академии наук. Научный руководитель: член-корреспондент РАН, профессор, доктор химических наук Северин Евгений Сергеевич Официальные оппоненты: Кочетков Сергей Николаевич, доктор химических наук, член-корреспондент РАН, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН, лаборатория молекулярных основ действия физиологически активных соединений, заведующий Гроздова Ирина Дмитриевна, доктор биологических наук, Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова», химический факультет, лаборатория функциональных полимеров, ведущий научный сотрудник Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова Российской академии наук Защита состоится «____» декабря 2014 года в 11 часов на заседании Совета Д 501.001.76 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, на соискание ученой степени доктора наук на базе Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова» по адресу: 119234, Москва, Ленинские горы, дом 1, стр. 12, биологический факультет, аудитория 389. С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке МГУ имени М.В.Ломоносова (Фундаментальная библиотека, Ломоносовский проспект, 27, отдел диссертаций) и на сайте www.bio.msu.ru. Автореферат разослан «__» __________ 2014 года. Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук Крашенинников И.А. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследования. Злокачественные новообразования являются одной из основных причин смертности среди населения – около 5 млн человек заболевает и около 2 млн погибает ежегодно по данным Всемирной организации здравоохранения. Терапия опухолевых заболеваний включает в себя хирургические вмешательства, радиационное облучение и химиотерапию, которые, в зависимости от обстоятельств, химиопрепаратов зачастую бывают вызывают малоэффективны, тяжелые системные а также, побочные в случае эффекты. Из вышесказанного следует, что современная противоопухолевая терапия нуждается в новых подходах к лечению и препаратах со сниженной токсичностью и повышенным терапевтическим индексом. Среди наиболее эффективных подходов для повышения специфичности действия химиопрепаратов можно выделить следующие: создание новых высокоселективных соединений и разработка новых систем их избирательного транспорта в опухолевые клетки. Для повышения селективности транспорта в клетки-мишени противоопухолевый препарат (ПП) может быть соединен с векторной молекулой, которая обладает сродством к специфическим лигандам на поверхности клеток. Такими векторными молекулами могут быть физиологические лиганды рецепторов факторов роста или онкофетальных белков, а также антитела, РНК-аптамеры к поверхностным белкам. Связывание векторной молекулы со специфическим рецептором на поверхности клетки инициирует процесс рецепторопосредованного эндоцитоза, в результате которого происходит аккумуляция химиопрепарата опухолевыми клетками, мишень которого находится внутри клетки. Необходимо отметить, что при рецептор-опосредованном эндоцитозе препарат попадает в клетку через эндолизосомальный компартмент, избегая прямого транспорта через цитоплазматическую мембрану, в процессе которого он может быть захвачен и выброшен из клетки с помощью ABC-транспортеров. Таким образом, данный подход является не только методом повышения селективности действия препарата, но и одним из способов преодоления множественной лекарственной устойчивости. Проблемой при таком подходе является ограниченное количество химических групп на векторных молекулах пригодных для конъюгирования с ПП, либо малое количество сайтов связывания, и, как следствие 3 низкое соотношение количества ПП к вектору в конечном препарате. Это приводит к необходимости получения и использования больших количеств вектора. Одним из решений проблемы низкого соотношения ПП к векторной молекуле в таких конъюгатах и комплексах является использование макромолекулярных носителей. Подобные носители, нагруженные ПП, способны самостоятельно проникать в клетку опухоли посредством неспецифического эндоцитоза. Связывание таких макромолекулярных носителей с векторными молекулами способно привести к увеличению эффективности ПП. Решение проблемы избирательного транспорта ПП на основе рецепторопосредованного эндоцитоза определяется, в первую очередь, выбором векторной молекулы. Векторные молекулы должны удовлетворять ряду требований, к которым относятся высокая афинность к соответствующим рецепторам, стабильность, возможность химической модификации при конъюгирования с ПП без потери биологических свойств, доступность в препаративных количествах. Указанным требованиям наиболее близко соответствуют онкофетальный белок альфа- фетопротеин (AFP) и эпидермальный фактор роста человека (EGF). Важными факторами при разработке систем направленной доставки ПП также являются выбор лекарственного препарата и линкера, соединяющего адресный и цитотостатический компоненты. Кроме того, если используется макромолекулярный носитель – он должен обладать низким уровнем токсичности и быть биодеградируемым. Скрининг созданных конструкций in vitro и изучение их внутриклеточного поведения позволяет выявить наиболее оптимальные варианты систем направленной доставки. Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось исследование эффективности использования рекомбинантного С-концевого домена альфа-фетопротеина человека (rAFP3D), эпидермального фактора роста (EGF) и пептидных лигандов рецептора EGF (MY и YH) в качестве векторных агентов при создании универсальной системы направленной доставки биологически-активных соединений в опухолевые клетки. Для выполнения цели в работе решались следующие задачи: 1. Создание штамма-продуцента rAFP3D, экспрессия, очистка, фолдинг и характеристика полученного белка; 4 2. Исследование связывания рекомбинантного белка rAFP3D с рецептором AFP, а также EGF и синтетических пептидов (YH и MY) с рецепторами эпидермального фактора роста; 3. Синтез конъюгатов флуоресцеина и доксорубицина с макромолекулярным носителем (PAMAM дендримеры 2-го поколения) и белковыми и пептидными векторными молекулами (rAFP3D, EGF, YH и MY); 4. Исследование эффективности интернализации и внутриклеточного распределения конъюгатов в сравнении с интернализацией векторных белков (пептидов), дендримеров и доксорубицина; 5. Исследование возможности преодоления множественной лекарственной устойчивости с помощью синтезированных систем направленного транспорта Dox; 6. Оценка противоопухолевой эффективности Dox в составе полученных систем направленной доставки in vitro. Научная новизна и практическая значимость работы. Предложен новый способ выделения и ренатурации функционально-активного С-концевого домена АФП, экспрессированного в тельцах включения, осуществляемый в один этап. Разработаны методы синтеза конъюгатов полиамидоаминовых дендримеров содержащих доксорубицин и флуоресцеин rAFP3D, EGF и синтетическими пептидами взаимодействующими с рецептором EGF (EGFR) - YH и MY. Показано, что синтезированные конъюгаты способны избирательно связываться с поверхностью опухолевых клеток и с высокой эффективностью интернализоваться ими. Доказана эффективность и избирательность противоопухолевого действия синтезированных конъюгатов in vitro в отношении ряда клеточных линий опухолей человека. Изучены закономерности их внутриклеточной локализации. Показана зависимость эффективности действия конъюгатов от лабильности химической связи между белком и цитостатическим агентом. При использовании систем адресной доставки на основе AFP3D обнаружена возможность полного, а в случае EFG, MY и YH - частичного преодоления множественной лекарственной устойчивости опухолевых клеток. 5 Практическая значимость работы обусловлена потенциальной возможностью использования полученных векторных систем направленного действия для транспорта в клетки-мишени широкого ряда биологически-активных молекул. Публикации и апробация работы. Основные результаты работы были доложены на 4th International Congress of Molecular Medicine (2011, Istanbul, Turkey), 8th International Dendrimer Symposium (2013, Madrid, Spain), 38th FEBS Congress (2013, Saint Petersburg, Russia), 17 конференции молодых ученых “Биология – наука XXI века” (2013, Пущино, Россия), XXI Международной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов» (2013, Москва). По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ, в том числе 5 статей в журналах, входящих в перечень ВАК РФ. Личный вклад автора состоит в участии в постановке задач исследования, разработке экспериментальных подходов, анализе, обобщении и интерпретации полученных результатов. Все эксперименты выполнены при непосредственном участии автора. Вклад соавторов заключался в постановке и целей и задач исследования, ассистировании микроскопических при исследований, проведении а также цитофлуориметирческих проведение ЯМР и и масс- спектрометрических анализов. Имена соавторов указаны в соответствующих публикациях. Структура и объем диссертации. Работа изложена на 119 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, который включает 177 источников. Диссертация содержит 30 рисунков и 2 таблицы. ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Дендритные полимеры сегодня все чаще используют в качестве переносчиков широкого ряда биологически-активных соединений [Sampathkumar S. et al, 2007]. PAMAM дендримеры 2-го поколения (G2) несут на своей поверхности 16 первичных аминогрупп, с которыми можно конъюгировать различные биологически-активные соединения. В качестве полимерного носителя для доксорубицина (Dox) мы использовали ацетилированное производное G2, которое 6 конъюгировали с конъюгировали с анти свободными аминогруппами дендримера с помощью кислотолабильного линкера – цис-аконитовой кислоты (CAA). В качестве векторных молекул мы использовали рекомбинантный Сконцевой фрагмент AFP человека, [Moskaleva E. et al, 1996], EGF и пептиды YH и MY способные связываться с EGFR [Schäfer A. et al, 2011], которые должны были: 1) обеспечить поступление конструкций, содержащих противоопухолевый агент в эндосомы и использование лизосомы; 2) обеспечить обуславливается избирательность способностью к доставки. активному Такое поглощению указанных векторных молекул целевыми клетками, в первую очередь опухолевыми, благодаря высокому уровню экспрессии ими рецепторов AFP и EGF. Так, исследование экспрессии AFPR с помощью моноклональных антител выявило присутствие его высоких уровней в клетках злокачественных опухолей в отличие от лимфоцитов периферической крови человека [Moro R. et al, 2005]. Таким образом, AFPR может служить мишенью на поверхности опухолевых клеток, а системы доставки на основе AFP и его рецептор-связывающих фрагментов, в том числе и rAFP3D, обеспечивать избирательный транспорт лекарственных препаратов. Исследования связывания и эндоцитоза флуоресцентно меченного AFP и rAFP3D позволяют говорить о высокой эффективности и специфичности их накопления в активно пролиферирующих опухолевых клетках, и отсутствии его накопления в нормальных лимфоцитах. В бактериальной системе экспрессии нами был получен рекомбинантный Сконцевой фрагмент AFP, сравнительное исследование связывания и эндоцитоза которого выявило идентичные природному AFP уровни поглощения опухолевыми и контрольными клетками (рис. 1). 7 Интенсивность флуоресценции, о.е. 90 60 90 А o Лимфоциты SKOV3 +37 C 60 30 30 0 0 0,1 1 rAFP3D, мкМ Б Лимфоциты SKOV3 0,1 o +4 C 1 rAFP3D, мкМ Рис. 1. Поглощение (А) и связывание (Б) rAFP3D-FITC с клетками аденокарциномы яичника человека SKOV3 и лимфоцитоами периферической крови человека за 1 ч инкубации при, оцениваемая по интенсивности флуоресценции клеток с помощью проточной цитометрии. В ходе получения rAFP3D нами был подобран оптимальный метод фолдинга белка с помощью гель-фильтрации, позволяющий проводить ренатурацию с минимальными потерями. Полученный rAFP3D был использован для синтеза системы адресной доставки лекарственных препаратов на основе PAMAM дендримеров, которая представляла из себя конъюгированный с помощью водорастворимого карбодиимида rAFP3D с 2-мя молекулами дендримера. Нами было показано, что эффективность связывания и эндоцитоза флуоресцентно меченого конъюгата rAFP3D с G2 (rAFP3D-G2-FITC) опухолевыми клетками линии SKOV3 была значительно выше связывания и эндоцитоза конъюгата G2-FITC, не содержащего векторного белка. При этом уровни связывания и эндоцитоза rAFP3DG2-FITC клетками линии SKOV3 были аналогичны уровням флуоресцентно меченного rAFP3D, что свидетельствует о незначительном влиянии двух молекул PAMAM дендримеров связанных с rAFP3D на процесс взаимодействия с AFPR. В то же время было обнаружено, что захват этими же клетками конъюгата rAFP3D-G2Dox за 1 ч инкубации лишь незначительно превышал захват G2-Dox (рис. 2 А). Накопление в опухолевых клетках rAFP3D-G2-Dox более чем в 5 раз превышало накопление в этих же клетках свободного Dox. Поглощение конъюгата rAFP3D-G2-Dox лимфоцитами периферической крови, не несущих на поверхности AFPR, было низким, примерно в 50 раз, в сравнении с опухолевыми клетками линии SKOV3 (рис. 2Б) и более чем в 3 раза ниже поглощения лимфоцитами конъюгата G2-Dox, без векторного белка. По8 видимому, основной вклад в накопление rAFP3D-G2-Dox в мононуклеарных лейкоцитах периферической крови вносят моноциты: хотя их всего 5% в составе мононуклеарных лейкоцитов, но они в высокой степени поглощают AFP [Esteban C. А Интенсивность флуоресценции et al, 1993] и rAFP3D. 90 rAFP3D-G2-Dox G2-Dox Dox 1 2 60 30 Б 30 rAFP3D-G2-Dox G2-Dox Dox Лимфоциты SKOV3 2 1 3 3 0 0 0,1 0,1 1 1 В Интенсивность флуоресценции Dox, мкM 90 60 30 Dox, мкM rAFP3D-G2-Dox G2-Dox Dox 1 SKVLB 2 3 0 0,1 1 Dox, мкM Рис. 2. Накопление rAFP3D-G2-Dox, G2-Dox и свободного Dox в чувствительных клетках аденокарциномы яичника человека SKOV3 (A), лимфоцитах периферической крови человека (Б) и в клетках резистентной линии аденокарциномы яичника человека SKVLB (В) оцениваемое по интенсивности флуоресценции клеток. 1 – rAFP3D-G2-Dox, 2 – G2-Dox, 3 – Dox. С увеличением времени инкубации аккумуляция клетками конъюгата rAFP3D-G2-Dox неуклонно возрастала (рис. 3). При этом локализована флуоресценция была как в цитоплазме, так и в ядрах клеток, а через 24 ч инкубации – преимущественно в ядрах. 9 Рис. 3. Внутриклеточное распределение Dox (А), G2-Dox (Б) и rAFP3D-G2-Dox (В) в клетках линии SKOV3 после 24 ч инкубации. Слева – флуоресцентная конфокальная микроскопия. Справа – дифференциально-интегральный контраст. Bar – 10 мкм. Срез через середину клетки по высоте. Это свидетельствует о постепенном гидролизе кислотoлабильного линкера и высвобождении Dox из конъюгата rAFP3D-G2-Dox, благодаря кислым значениям pH поздних эндосом, и диффузии свободного антибиотика в ядра клеток. Рис. 4. Внутриклеточное распределение Dox (А, Б, Д, Е) и rAFP3D-G2-Dox (В, Г, Ж, З) в клетках чувствительно линии SKOV3 (А, Б, В, Г) и резистентной к Dox SKVLB (Д, Е, Ж, З) после 4 ч и 24 ч инкубации. Наложение изображений флуоресцентной конфокальной микроскопи и. дифференциально-интегрального контраста. Bar – 10 мкм. Срез через середину клетки по высоте. 10 Гидролиз линкера и высвобождение антибиотика подтверждается данными исследования высвобождения Dox из конъюната G2-Dox. Рис. 5. Динамика высвобождения Dox из конъюгата G2-Dox при разных значениях pH. 1 – при pH 5; 2 – pH 5.5; 3 – pH 6; 4 – pH 7.4. T1/2 – период полувысвобождения Dox. Скорость высвобождения Dox коррелировала со значением pH. При снижении pH скорость высвобождения Dox возрастала (рис. 5). Через 24 ч инкубации при pH 5, 5.5 и 6 от 75% до 93% Dox находилось в свободном состоянии, в то время как при pH 7,4 из конъюгата высвобождалось лишь 8%, так как характер линкера между Dox и G2 обуславливал стабильность конъюгата в растворе и высвобождение антибиотика во внутриклеточных компартментах с кислыми значениями рН – лизосомах и поздних эндосомах. Конъюгат rAFP3D-G2-Dox проявлял высокую цитотоксическую активность в отношении опухолевых клеток SKOV3 (рис. 6 А) и был малотоксичен для лимфоцитов (рис. 6 Б) в отличие от конъюгата G2-Dox. Цитотоксичность G2-Dox для лимфоцитов была сравнима с токсичностью свободного Dox и близка к цитотоксической активности G2-Dox для аденокарциномы SKOV3 – значение IC50 для G2-Dox составляло 4 мкМ для SKOV3 и 3 мкМ для лимфоцитов. Следует отметить, что цитотоксическая rAFP3D-G2-Dox в отношении чувствительной линии клеток SKOV3 была схожа с токсичностью этого конъюгата для резистентной линии SKVLВ (рис. 6 А, В), что указывает на обращении резистентности клеток SKVLВ к Dox. Введение в состав конъюгата векторного белка rAFP3D заметно повысило избирательность действия G2-Dox, что выразилось в значительном снижении токсичности rAFP3D-G2-Dox в отношении для контрольных клеток (рис. 6Б). 11 Выживаемость, % А 90 Б 90 3 2 60 SKOV3 30 30 rAFP3D-G2-Dox G2-Dox Dox 0 60 0,1 Выживаемость, % 0,01 3 1 Лимфоциты rAFP3D-G2-Dox G2-Dox Dox 0 0,1 1 Dox, мкM 1 2 1 100 10 Dox, мкM В 80 60 40 2 SKVLB 20 0 1E-3 1 rAFP3D-G2-Dox G2-Dox Dox 0,01 3 0,1 1 10 100 Dox, мкM Рис. 6. Выживаемость клеток аденокарциномы яичника человека линии SKOV3 (А), лимфоцитов периферической крови человека (Б) и резистентной линии клеток аденокарциномы яичника человека SKVLB (В) после 72 ч инкубации с Dox и его конъюгатами с G2 и rAFP3D-G2. 1 – Dox, 2 – G2-Dox, 3 – rAFP3D-G2-Dox. Несмотря на то, что конъюгат G2-Dox, не содержащий векторной молекулы, поглощался опухолевыми клетками почти так же интенсивно, как rAFP3D-G2-Dox (рис. 2), его цитотоксическая активность в отношении клеток линии SKOV3 была низкой: значение IC50 для G2-Dox было в 9 раз ниже IC50 для Dox (рис. 6). Анализ интернализации конъюгата G2-Dox и свободного Dox в этих же клетках за более продолжительные промежутки времени – 4 и 24 ч выявил значительную разницу в эффективности проникновения, а также в локализации указанных препаратов. Уровень внутриклеточного накопления свободного Dox превышал таковой для G2Dox, при этом преимущественно флуоресценция в ядрах клеток. свободного Конъюгат антибиотика G2-Dox имел наблюдалась равномерно- распределённую по всей цитоплазме флуоресценцию и даже после 24 ч инкубации в ядрах наблюдалось минимальное количество высвободившегося антибиотика (рис. 3Б). Механизмы клеточной интернализации дендримеров определяются в основном зарядом поверхностных групп [Perumal O. et al, 2008]. Введение 12 ацетамидных групп в молекулу G2 повышает гидрофобность, что теоретически может улучшить проникновение G2-FITC или G2-Dox в клетки. Однако, при такой модификации существенно снижается заряд G2, что, в свою очередь ослабляет тропность G2 к плазматической мембране. Учитывая, что Dox также обладает достаточно высокой гидрофобностью можно предположить, что конъюгат G2-Dox может проникать в клетки не только путем эндоцитоза, но и за счет диффузии, что частично подтверждают наши данные по внутриклеточному распределению флуоресценции в клетках, обработанных G2-Dox (рис. 3). Нельзя с точностью утверждать, каким именно путем G2-Dox интернализуется опухолевыми клетками, но только в случае клатрин-зависимого эндоцитоза G2-Dox транспортируется в клеточные компартменты с кислыми значениями рН – поздние эндосомы и лизосомы. Судя по внутриклеточному распределению G2-Dox (рис. 3) и данным по цитотоксической активности в отношении клеток линии SKOV3, в указанные компартменты конъюгат G2-Dox, повидимому, не попадает. При нейтральных рН конъюгат G2-Dox весьма стабилен: через 24 ч инкубации при 37°С из конъюгата высвобождалось всего 8% Dox. Повидимому именно этим и обусловлена низкая активность конъюгата для клеток линии SKOV3 и SKVLB. Кроме того, из-за гидрофобности Dox максимальное количество молекул антибиотика, которое удалось присоединить к G2 при конъюгировании, не превышало трех, то есть эффективность G2 как переносчика также оказалась относительно невысока. Другими векторными молекулами, использованными для увеличения специфичности действия G2-Dox, были рекомбинантный EGF, а также пептиды YH и MY взаимодействующие с EGFR, показавшие ранее высокий потенциал в качестве адресных агентов. В отличие от конъюгата на основе rAFP3D, в котором для ковалентного присоединения молекул дендримера к белку использовали водорастворимый карбодиимид, EGF, MY и YH конъюгировали с дендримерами посредством “клик-реакции”. Для этого в белковый компонент вводили линкер, содержащий терминальную алкиновую группу, в дендример – линкер с терминальной азидной группой, после смешивания азидные и алкиновые группы вступали в реакцию циклоприсоединения. 13 Такой подход помог избежать образования нежелательных агрегатов, которые, хотя и в малых количествах, образовывались при синтезе rAFP3D-G2. Рис. 7. Схема синтеза конъюгатов EGF-G2Dox, YH-G2-Dox, MYG2-Dox. Пептид MY (MYIEALDKYAC) представляет собой фрагмент петли EGF, взаимодействующей с EGFR, и состоит из 11 аминокислот. Как и EGF, MY сопособен активировать EGFR и обладает митогенной активностью (рис. 10), но при этом уровни поглощения его производного (MY-G2-Dox) различными линиями опухолевых клеток были меньше: от 2,5 до 5 раз в зависимости от линии клеток в сравнении с EGF-G2-Dox (рис. 9). В то же самое время, уровни поглощения MY-G2Dox теми же линиями опухолевых клеток достоверно не отличались от таковых для YH-G2-Dox (рис. 9), что вероятно свидетельствует о близких значениях Kd полученных конъюгатов. Стоит упомянуть, что согласно ранее опубликованным данным величина Kd EGF составляет от 200 пМ до 8 нМ в зависимости от типа рецептора, а Kd YH была определена в районе 20 нМ. Ранее способность связываться с EGFR пептида YH (YHWYGYTPQNVI) была показана с помощью фагового дисплея [Li Z. et al, 2005]. Не являясь фрагментом EGF, данный пептид связывается с EGFR с Kd порядка 20 нM, но при этом он не способен активировать димеризацию и аутофосфорилирование рецептора (рис. 8) и, соответственно, не обладает митогенными свойствами. 14 60 40 20 MY-G2-Dox 80 EGF-G2-Dox Интенсивность флуоресценции EGF YH-G2YH Dox Рис. 8. Активация фосфорилирования EGFR после инкубации клеток А431 с EGF, конъюгатом EGF-G2-Dox, пептидами MY и YH, конъюгатами MY-G2-Dox, YН-G2-Dox, оцениваемая по интенсивности флуоресценции клеток после окрашивания антителами к фосфорилированному EGFR. 0 Более того, взаимодействие рекомбинантного EGF и MY с EGFR приводит к постепенной десенситизации клеток в результате эндоцитоза активированных комплексов лиганд-рецептор (с последующей деградацией в эндолизосомальном компартменте), скорость которой зависит от Kd образующегося комплекса - быстрее для EGF, медленнее для MY и YH. При этом, комплекс EGFR c YH, также как комплексы с EGF и MY, подвергается эндоцитозу, но в данном случае “неспецифическому” – не вызванному активацией рецептора, результатом которого является возвращение большей части рецепторов в состав цитоплазматическй мембраны и, как итог, отсутствие десенситизации при длительной обработке клеток YH и его производными. Так, было показано, что при обработке EGFR положительных клеток флуоресцентно меченными производными EGF и YH при времени инкубации менее 1 часа EGF интернализуется в заметно более высоких количествах, при инкубации в течении часа исходный белок и пептид обладают одинаковыми уровнями поглощения, а при интервалах превышающих 1 час YH поглощается более активно не вызывая при этом снижения количества EGFR на поверхности клеток в сравнении с EGF, инкубация с которым вызывала практически полную десенситизацию клеток [Schäfer A. et al, 2011]. Исследование внутриклеточного распределения FITC меченных EGF, YH и MY после 1 ч инкубации с клетками линии A549 выявило их преимущественную, характерную для эндолизосомального компартмента, цитоплазматическую локализацию. Наиболее высоким уровнем накопления обладал флуоресцентно меченный EGF в сравнении с YH-FITC и MY-FITC, что можно объяснить на порядок более высоким сродством его к EGFR. В то же самое время уровень накопления YH-FITC незначительно превышал таковой для MY-FITC. Данные 15 внутриклеточного распределения были подтверждены данными поглощения конъюгатов EGF-G2-Dox, YH-G2-Dox и MY-G2-Dox опухолевыми клетками несущими EGFR (Her1) (SKOV3, SKVLB, A549) (рис. 9). При этом самый низкий уровень поглощения EGFR-положительными линиями клеток наблюдался для Dox, самый высокий – для EGF-G2-Dox. Значения поглощения YH-G2-Dox и MY-G2-Dox отличались незначительно и находились на промежуточном уровне. Интернализация конъюгатов контрольными клетками линии K562, не экспрессрующими EGFR, была на 1-2 порядка ниже (рис. 9 Г), что свидетельствует об избирательности поглощения конъюгатов с векторными Интенсивность флуоресценции молекулами. 120 А EGF-G2-Dox 120 SKVLB 100 100 80 80 60 60 YH-G2- MY-G2Dox Dox 40 20 Б EGF-G2-Dox SKOV3 YH-G2Dox MY-G2Dox 40 Dox 20 Dox Интенсивность флуоресценции 0 120 100 0 В 120 A549 100 EGF-G2-Dox K562 80 80 60 60 40 20 Г Dox YH-G2Dox MY-G2Dox 40 20 Dox MY-G2EGF-G2Dox Dox YH-G2Dox 0 0 Рис. 9. Накопление EGF-G2-Dox, YH-G2-Dox и MY-G2-Dox и свободного Dox в клетках линий SKVLB (А), SKOV3 (Б) и A549 (В) оцениваемое по интенсивности флуоресценции клеток. Исследование внутриклеточной локализации конъюгатов EGF-G2-Dox, YHG2-Dox и MY-G2-Dox на клетках чувствительной к Dox линии SKOV3 и резистентной SKVLB после 4 ч инкубации показало схожую картину - конъюгаты находились в эндолизосомальном компартменте (колокализация с маркером лизосом LAMP2), в области ядра флуоресценция Dox была минимальна (рис. 10 Д, рис. 11 А, Д). После 24 ч инкубации конъюгатов EGF-G2-Dox, YH-G2-Dox и MYG2-Dox высокий уровень флуоресценции Dox наблюдался в области ядер как чувствительных (рис. 10 Е, рис. 11 Б, Е) так и резистентных клеток (рис. 10 З, рис. 11 Г, З), при этом, в отношении клеток линии SKOV3 наиболее высоким уровнем 16 интернализации обладал EGF-G2-Dox, а для клеток линии SKVLB - YH-G2-Dox, что коррелирует с данными анализа цитотоксической активности. Рис. 10. Внутриклеточная локализация Dox (А, Б, В, Г) и EGF-G2-Dox (Д, Е, Ж, З) в клетках SKOV3 (А, Б, Д, Е) после 4 ч инкубации (А, Д) и 24 ч инкубации (Б, Е), и в клетках SKVLB (В, Г, Ж, З) после 4 ч инкубации (В, Ж) и 24 ч инкубации (Г, З). Bar – 10 мкм. Срез через середину клетки по высоте. Зеленая флуоресценция – антитела к маркеру поздних эндосом и лизосом LAMP2. 17 Рис. 11 Внутриклеточная локализация YH-G2Dox (А, Б, В, Г) и MYG2-Dox (Д, Е, Ж, З) в клетках SKOV3 (А, Б, Д, Е) после 4 ч инкубации (А, Д) и 24 ч инкубации (Б, Е), и в клетках SKVLB (В, Г, Ж, З) после 4 ч инкубации (В, Ж) и 24 ч инкубации (Г, З). Bar – 10 мкм. Срез через середину клетки по высоте. Окрашивание антителами к LAMP2. Цитотоксическая активность конъюгатов EGF-G2-Dox, YH-G2-Dox и MYG2-Dox после 72 часов инкубации с клетками линии SKOV3 и A549 была близка к активности свободного Dox (таб. 1). Так, в отношении клеток линии SKOV3 наиболее активен был EGF-G2-Dox (IC50=53нМ), конъюгаты MY-G2-Dox и YH-G2Dox обладали одинаковой токсичность (IC50=87 нМ), активность же свободного Dox была несколько ниже (IC50=110 нМ). Для клеток линии A549 наиболее 18 токсичным оказался YH-G2-Dox (IC50=74 нМ), а наименее токсичным MY-G2-Dox (IC50=156 нМ). Более высокий уровень активности, в сравнении с Dox, конъюгаты проявляли в отношении резистентных клеток (SKVLB) (таб. 1), причем разница в значениях IC50 конъюгатов была более выраженной. Самым активным в отношении резистентных клеток линии SKVLB оказался конъюгат YH-G2-Dox (IC50=1609 нМ), что видимо связано тем, что YH не обладает митогенными свойствами и не вызывает десенситизации рецепторов. Почти в 2 раза менее активными оказались конъюгаты EGF-G2-Dox и MY-G2-Dox, для которых значения IC50 составили 3187 нМ 2743 нМ соответственно. В то же время значение IC50 для Dox составило 10716 нМ. При этом конъюгаты не проявляли токсического эффекта в отношении контрольных клеток (K562) в отличие от свободного Dox. Таблица 1. Значения IC50 для Dox и конъюгатов EGF-G2-Dox, YH-G2-Dox и MY-G2Dox. Dox, нM EGF-G2-Dox, нM MY-G2-Dox, нM YH-G2-Dox, нM A549 87 100 156 74 K562 147 >2000 >2000 >2000 SKOV3 110 53 87 87 SKVLB 10716 3187 2743 1609 Сравнивая данные по высвобождению Dox и внутриклеточному распределению конъюгатов rAFP3D-G2-Dox, EGF-G2-Dox, YH-G2-Dox, MY-G2-Dox и G2-Dox можно предположить, что токсический эффект конъюгатов будет проявляться медленнее по сравнению со свободным Dox. Так за 4 ч при pH 5,5 (значение pH в поздних эндосомах) из конъюгата G2-Dox высвобождается более 40% Dox (рис. 1). Высвободившийся из состава конъюгатов Dox выходит из эндолизосомального компартмента и мигрирует в ядро (рис. 5, рис. 10 Д-З, рис. 11). Только через 24 ч при pH 5-5,5 Dox практически полностью высвобождается из состава конъюгатов. Свободный же Dox эффективно проникает в клетку путем диффузии и быстро накапливается в ядре (рис. 5 В, Г, рис. 10 А, Б), где и оказывает цитотоксическое действие, что справедливо для чувствительных линий опухолевых клеток. Действительно, цитотоксическая активность свободного Dox в отношении 19 опухолевых клеток in vitro либо была на сопоставимом уровне (EGF-G2-Dox, YHG2-Dox, MY-G2-Dox) (рис. 11 А, В), либо превышала активность конъюгатов (rAFP3D-G2-Dox) (рис. 6 А). При этом следует отметить, что флуоресценция Dox высвободившегося из rAFP3D-G2-Dox, наблюдалась в ядрах клеток (рис. 4, 5) уже через 4 ч, в то время как для конъюгатов EGF-G2-Dox, YH-G2-Dox, MY-G2-Dox была характерна другая картина: флуоресценция Dox в ядрах наблюдалась только после 24 ч инкубации. При этом нельзя сказать, что активация EGFR влияла на такую задержку, так как YH и его производные давали схожую картину распределения флуоресценции, но при этом не активировали EGFR. Ранее в литературе приводились данные исследования внутриклеточной локализации непосредственных конъюгатов EGF и MY c Dox, флуоресценция которого наблюдалась в ядрах EGFR положительных клеток линии DU145 уже на 4-ый час инкубации [Фельдман Н., 2010]. Вероятно, размер молекул, в данном случае EGF, MY и YH, имеет важную роль при синтезе таких систем направленной доставки. В случае малых молекул, вероятность блокирования сайта взаимодействия с рецептором, а также изменение общего заряда вектора, увеличивается, чем можно объяснить более низкую скорость поглощения EGF-G2-Dox, YH-G2-Dox, MY-G2Dox, в сравнении с другой системой доставки - rAFP3D-G2-Dox, на основе rAFP3D, молекулярная масса которого более чем в 3 раза превышает массу EGF. Вероятно, использование более длинного линкера позволит увеличить специфичность взаимодействия с рецептором, но для того, чтобы уверенно говорить об этом, необходимы дальнейшие исследования кинетики поглощения модифицированных и не модифицированных векторных молекул. Сравнение цитотоксической активности синтезированных систем направленной доставки в отношении чувствительных клеток линии SKOV3 выявило более высокую активность конъюгатов взаимодействующих с EGFR (IC50 от 53н М до 110н М) в сравнении с rAFP3D-G2-Dox (IC50=615 нМ). В то же самое время для rAFP3D-G2-Dox по отношению к линии клеток SKVLB мы наблюдали полное обращение резистентности к Dox(IC50=520 нМ), тогда как та же линия клеток была более устойчива к действию антибиотика в составе EGF-G2-Dox, YH-G2-Dox, MYG2-Dox (IC50 от 1609 нМ до 3187 нМ), что, по-видимому, можно объяснить снижением скорости эндоцитоза конъюгатов взаимодействующих с EGFR. При этом 20 в отношении EGF-G2-Dox, YH-G2-Dox, MY-G2-Dox все же имело место, хотя и неполное как в случае rAFP3D-G2-Dox, обращение резистентности к Dox (IC50Dox=10870 нМ ). Полученные результаты свидетельствуют об избирательности действия в отношении опухолевых клеток конъюгатов rAFP3D-G2-Dox, EGF-G2-Dox, YH-G2Dox и MY-G2-Dox, что было подтверждено при исследовании связывания, эндоцитоза, внутриклеточного распределения и цитотоксической активности конъюгатов в отношении опухолевых и контрольных клеток. Это позволяет сделать вывод об эффективности их использования в качестве системы направленной доставки Dox и FITC. Возможно, эффективность этих систем доставки можно повысить при использовании в качестве переносимых веществ более полярных лигандов, что в целом повысит растворимость комплекса в водных условиях, использовании дендримеров более старших поколений, что позволит конъюгировать с их поверхностными группами большее количество векторных молекул и переносимых лигандов. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Использование векторных белков определяет взаимодействие систем направленной доставки со строго определенными клетками и тканями, реализуя, таким образом, избирательность действия препаратов. Механизм рецепторопосредованного эндоцитоза обеспечивает аккумуляцию опухолевыми клетками лекарственного препарата, молекулярная мишень которого находится внутри клетки. Полученные нами экспериментальные данные позволяют сделать заключение, что эффективность доставки противоопухолевых препаратов в опухолевые клетки можно значительно повысить, используя систему избирательной доставки, содержащую в качестве векторных молекул рекомбинантный С-концевой домен AFP, рекомбинантный EGF, а также пептиды YH и MY, связывающиеся с EGFR. Для повышения полезной нагрузки в состав конъюгата был введен полимерный носитель - полиамидоаминовые дендримеры 2-го поколения, к которым доксорубицин был присоединен с помощью кислотолабильного линкера. Синтезированные rAFP3D-G2-Dox, EGF-G2-Dox, YH-G2-Dox и MY-G2-Dox эффективно и избирательно аккумулировались опухолевыми клетками, проявляя высокую цитотоксическую активность, и обращали множественную лекарственную 21 устойчивость резистентных к Dox клеток; в то же время конъюгаты были неактивны в отношении контрольных клеток. Полученные данные позволяют предположить универсальность применения полученных конъюгатов rAFP3D-G2, EGF-G2, YH-G2 и MY-G2 не только для доставки Dox или FITC, но и других малых молекул, в том числе фрагментов нуклеиновых кислот и пептидов. ВЫВОДЫ 1) Получен бактериальный штамм продуцент rAFP3D. Разработан высокоэффективный метод очистки и ренатурации целевого белка позволяющий получить rAFP3D чистотой порядка 95%, в один этап; 2) Показана способность флуоресцентно меченных векторных молекул (rAFP3D, EGF и пептидов YH и MY) эффективно связываться и интернализоваться клетками несущими рецепторы AFP и EGF; 3) Синтезированы конъюгаты FITC и Dox с PAMAM дендримерами 2-го поколения и белковыми и пептидными векторными молекулами (rAFP3D, EGF, YH и MY); 4) Выявлена способность полученных конъюгатов эффективно и специфично связываться и интернализоваться клетками, несущими рецепторы AFP и EGF. Выявлена преимущественная локализация синтезированных конъюгатов в эндолизосомальном компартменте как чувствительных, так и резистентных опухолевых клеток, и отсутствие возможности поглощения полученных препаратов контрольными клетками; 5) Выявлена способность синтезированных конъюгатов обращать множественную лекарственную устойчивость опухолевых клеток; 6) Выявлена высокая специфическая активность конъюгатов в отношении опухолевых клеток. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в рецензируемых журналах, входящих в список ВАК РФ 1. Яббаров Н.Г., Посыпанова Г.А., Воронцов Е.А., Северин Е.С. Направленный транспорт доксорубицина: система доставки на основе PAMAM дендримеров. // Биохимия 2013. Т. 78. №8. С. 884-894. 2. Яббаров Н.Г., Посыпанова Г.А., Воронцов Е.А. Мультифункциональные дендритные молекулы: перспективы применения в медицине и биологии. // Молекулярная медицина 2012. Т. 6. C. 36-45. 22 3. Годованый А.В., Воронцов Е.А., Гукасова Н.В., Позднякова Н.В., Василенко Е.А., Яббаров Н.Г., Северин С.Е., Северин Е.С. Противоопухолевая активность наносомальных систем направленной доставки, приготовленных на основе PLGAнаночастиц, паклитаксела и рекомбинантного фрагмента альфа-фетопротеина. // Российские нанотехнологии 2012. Т. 7. №1-2. С. 76-84. 4. Годованый А.В., Воронцов Е.А., Гукасова Н.В., Позднякова Н.В., Василенко Е.А., Яббаров Н.Г., Северин С.Е., Северин Е.С., Гнучев Н.В. Разработка подхода избирательной доставки паклитаксела в составе наночастиц, связанных с рекомбинантным фрагментом альфа-фетопротеина, в опухолевые клетки. // Доклады академии наук (Биохимия и биофизика) 2011.Т. 439. №1. С. 260-262. 5. Годованый А.В., Савватеева М.В., Сотниченко А.И., Яббаров Н.Г., Климова О.В., Гнучев Н.В., Северин С.Е. Изучение противоопухолевой активности in vitro конъюгата рекомбинантного С-концевого домена альфа-фетопротеина с цисплатином. // Молекулярная медицина 2011. Т. 1. С. 44-53. Статьи в международных журналах 1. Yabbarov N.G., Posypanova G.A., Vorontsov E.A., Obydenny S.I., Severin E.S. A new system for targeted delivery of doxorubicin into tumor cells. // Journal of Controlled Release 2013. V. 168. P. 135–141. 2. Pozdnyakova N.V., Yabbarov N.G Gukasova., N.V. Recent progress in refolding of the C terminal domain of recombinant human alpha-fetoprotein. // Journal of Biochemical Technology 2012. V. 4. P. 595–599. Тезисы докладов 1. Yabbarov N.G., Posypanova G.A., Vorontsov E.A., Severin E.S. Development of the novel dendrimer and vector protein based targeted delivery systems of doxorubicin into tumor cells. // Abstract of the 8th international dendrimer symposium 2013 (Madrid, Spain). P. 79. 2. Yabbarov N., Posypanova G., Nikolskaya E., Arsenkova O., Zavarzina V., Kuznetsov S., Severin S. A new approach for targeted drug delivery into tumor cells. // Abstract of the 38th FEBS congress 2013 (Saint Petersburg, Russia). V. 280 (Suppl. 1). P. 305. 3. N. Gukasova, A. Godovanniy, A. Naidenova, G. Posypanova, N. Pozdniakova, N. Yabbarov, Vasilenko E., Moskaleva E., Severin S., Severin E. Targeted delivery of anticancer drugs using rh-linked PLAGA-nanoparticles by receptor mediated endocytosis. // AFPrf Abstracts of the 4th International Congress of Molecular Medicine 2011 ( Istanbul, Turkey). In Vivo. V. 25. №3. P. 467-476. 4. Яббаров Н.Г., Никольская Е.Д. Создание системы избирательной доставки противоопухолевых препаратов в опухолевые клетки. // Тезисы конференции “Ломоносов” 2013 (Москва, Россия). С. 45. 5. Яббаров Н.Г., Василенко Е.А., Посыпанова Г.А. Создание системы направленной доставки противоопухолевых препаратов на основе дендритных молекул. // Тезисы конференции “Биология наука 21 века” 2013 (Пущино, Россия). С. 581. 23
