Биомишень-направленный скрининг ингибиторов серин

Биомишень-направленный скрининг
ингибиторов серин-треониновых
протеинкиназ - потенциальных
противораковых и
антибактериальных лекарств
Штиль А. А., М.Н.Преображенская, В.Н. Даниленко
Институт общей генетики им. Н. И. Вавилова РАН
НИИ по изысканию новых антибиотиков им. Г. Ф. Гаузе РАМН
Российский онкологический научный центр им. Н. Н. Блохина РАМН
Руководитель проекта: профессор В.Н. Даниленко
Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН, Москва
IV ВСЕРОССИЙСКАЯ НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ КОНФЕРЕНЦИЯ
«МЕДБИОТЕК-4»
Москва, 2 декабря 2008 г.
1
Группа по изучению протеинкиназ
как терапевтически важных
мишеней
„
В.Н.Даниленко (ИОГен РАН): концепция,
новые бактериальные тест-системы для
прескрининга ингибиторов киназ, проверка
активности in vitro на панели киназ;
„
M.Н.Преображенская (НИИНА РАМН):
синтез новых ингибиторов - производных
индолилмалеимидов;
„
A.А.Штиль (РОНЦ РАМН): новые тестсистемы в опухолевых клетках
2
ЗАДАЧИ:
Мишень:
Продвижение
валидация для Лидерные
“кандидатов”
создания
соединения в лекарства
тест-систем
СТПК-киназы
Actinobacteria,
СТПК
человека
прескрининг, предклиниотбор
ческое
и оптимизация изучение
3
Европейский консорциум
‘Protein Kinases, Novel Drug Targets
for Post-Genomic Era’ (2007-2009):
„
„
„
„
>30 лабораторий из 26 стран;
5 рабочих групп, 272 участника;
Протеинкиназы как важнейший язык
биологической регуляции; создание мишеньспецифических лекарств;
Финансирование European Commission
4
Tест-системы для
скрининга ингибиторов
серин-треониновых ПК:
Actinobacteria,
опухолевые клетки
человека
5
Тест-система в актинобактериях
сигнал
клеточная стенка
Аминогликозидфосфотрансфераза APHVIII, Kans (5 мкг/мл)
РК12
12
РК25
25 (PKCα – like)
AphVIII Ser 146P, Kanr (50 мкг/мл)
Ингибитор
ПК
Ингибитор
ПК
Снижение устойчивости к канамицину
6
Фосфорилирование Ser146
увеличивает активность APHVIII
AVAEG
S146VDLED
-фосфо-Ser в
активационной
петле
S95
S215
S160
7
Бис-индолилмалеимид I
и ЛХТА-1313
O
H
N
O
N
O
O
N
N
N
N
H
N
Бис-I
N
ЛХТА-1313
8
ЛХТА-1313 активнее, чем Бис I
Бис I
1313+Kan
Бис I+Kan
1313
1313+Kan
Бис I+Kan
Kan
9
Новые производные ингибируют α-ПKC
и снижают устойчивость Actinomyces
к канамицину
3-диалкиламинометилиндолил-производные
O
R
N
N
O
N
X
10
Преимущественная активность
полианнелированных производных
диазепина для бактерий
Cоединение
Диаметр зоны
лизиса, мм
4a
13±0.5
4b
14±1
5b
13±1
10e
9±1
Bis I
10±2
Bis V
7.5±0.5
O
N
O
N
O
N
N
N
O
Danilenko et al.,
J.Med.Chem., 2008
N
N
O
N
H
N
N
O
N
N
11
Тест-система в опухолевых клетках
„ Протеинкиназа
С регулирует
срочную активацию гена MDR1
противоопухолевыми препаратами;
„ В клетках лейкоза активацияMDR1
регулируется изоформой альфа;
„ Ингибиторы α-изоформы
предотвращают активацию MDR1?
12
Срочная активация MDR1
13
Активация гена MDR1
Neomycin,
U73122
Out
Плазматическая
мембрана
TPA
PI-PLC
In
Ca2+
АраС
cенсор?
IP2
IP3 + DAG
PKC
BAPTA/AM
салицилаты,
PDTC, TPCK
elevated Ca2+
кальмодулин?
Calmidazolium
chloride
NFκB
Calphostin C,
Chelerythrine
ERKs
PD 98059
JNK1/2
Стабилизация иРНК MDR1
Активация транскрипции MDR1
14
Новое соединение ЛХТА-1313 – более
мощный ингибитор α-ПКС, чем Бис I
СОЕДИНЕНИЕ
IC50, нМ
Бис I
140+11
ЛХTA-1313
52+7
Активность рекомбинантной киназы в присутствии Са2+ ,
диолеина, фосфатидилсерина, [γ-32Р]АТФ и гистона Н1
15
IC50 для ПKCα
№
соединение
IC50 ± SD, нM
1
LCTA-1313
52±7
2
LCTA-1237
89±5
3
LCTA-1183
94±3
4
LCTA-1123
114±11
5
LCTA-1314
130±19
6
LCTA-1286
130±15
7
LCTA-1212
1 3 5 ±1 2
8
LCTA-1276
175±30
9
LCTA-1122
>250
10
LCTA-1222
>250
11
LCTA-1365
>250
12
LCTA-1398
>250
13
LCTA-1417
>250
14
LCTA-1367
>250
15
LCTA-1388
>250
16
Bis-I
100±6
16
Селективность ингибирования
ПКС соединением ЛХТА-1313
Киназа
Остаточная
активность, %
РКСα
7±1*
РКСβI
4±2
РКСβII
18±2
РКСγ
11±5
РКСδ
31±2
РКСε
40±5
РКСθ
39±3
РКСι/λ
41±2
РКСζ
43±4
РКА
91±8
17
ЛХТА-1313 предотвращает
активацию гена MDR1
Dox+5uМ 1313
Dox+2.5uМ 1313
Dox+1uМ 1313
Dox+5uМ Bis I
Dox+2.5uМ Bis I
Dox+1uM Bis I
Dox
untreated
0
25
50
75
100
activation, units
18
Нетоксичные ингибиторы
предотвращают активацию MDR1 в
клетках лейкоза K562
O
R
N
N
X
O
N
LCTA-1237, 1212,
1183, 1313
Me
N
O
N
O
N
LCTA-1276
Me2N
19
Основные структуры,
использованные для химических
модификаций
% подавления, 10 мкM
PIM1 - 9; PIM3 - 13;
PKCa - 30; FGF-R1 - 31
IC50 2.3 mcM (L1210)
O
N
O
HN
NH
HN
O
O
H
N
O
N
LCTA-804
N
H
H
N
O
PIM1 - 4; PIM3 - 18; GF-R1 - 17;
DYRK3 - 22; MST2 - 32;
IC50 40 mcM (HeLa cells)
N
N
H
LCTA 1187
O
LCTA-1186
O
H
N
O
N
NH
LCTA-1086
PIM1 - 13; PIM3 - 9; HIPK2 - 14;
RSK1 - 29; SmMLCK - 24;
GSK3b - 26;; MARK3 - 34;
DYRK2 - 33;; PIM2 - 38;
IC50 40 mcM (HeLa cells)
DYRK3 - 11; PIM1 - 2; PIM2 - 7;
PIM3 - 6; MST2 - 12;HIPK2 - 16;
Src - 21; FGF-R1 - 10; ROCK2 - 30;
MARK3 - 32; BRSK2 - 29; PAK4 34; SYK -25; IC50 40 mcM
H
N
O
PIM1 - 17;
N
N
H
LCTA-1455
20
ЗАДАЧИ:
Мишень:
Продвижение
валидация для Лидерные
“кандидатов”
создания
соединения в лекарства
тест-систем
СТПК-киназы
Actinobacteria,
СТПК
человека
прескрининг, предклиниотбор
ческое
и оптимизация изучение
21
Выводы (I)
„
„
„
Созданы новые тест-системы для
скрининга ингибиторов серинтреониновых протеинкиназ;
Тест-система в Actinobacteria основана на
предотвращении фосфорилирования
APHVIII и сенситизации бактерий к
аминогликозидным антибиотикам;
Тест-система в опухолевых клетках
основана на предотвращении активации
гена MDR1.
22
Выводы (II)
„
„
Создана библиотека оригинальных
ингибиторов серин-треониновых
протеинкиназ на основе индолилмалеимидов;
Скрининг химической библиотеки с
использованием бактериальной и
эукариотической тест-систем позволяет
отобрать соединения-кандидаты в
антибактериальные или противоопухолевые
лекарства.
23
Благодарность:
С.М.Елизаров, M.А.Алексеева, O.Б.Беккер,
O.Ю.Сусова
С.А.Лакатош, А.Ю.Симонов
24