ТЕСТ-СИСТЕМЫ СИФИЛИС ОБЩИЕ АНТИТЕЛА ИФА II

ТЕСТ-СИСТЕМЫ СИФИЛИС ОБЩИЕ АНТИТЕЛА ИФА II
96 тестов
480 тестов
72518SP
72519SP
Дистрибьютор:
Био-Рад,
Бульвар Пуанкаре
92430 Марн-ля-кокетт, Франция
Лаб21 Хеалскейр Лтд.
Лэнуэйдс Бизнес Парк,
Кентфорд, Ньюмаркет, CB8 7PN – UK
Сифилис Общие
антитела ИФА II
96 тестов
480 тестов
Кат. №72518
Кат. №72519
Определение антител к T. pallidum в человеческой сыворотке или плазме
Все производимые и реализуемые реагенты контролируются полноценной системой
контроля качества от этапа получения сырья до этапа конечной реализации продукта.
Каждая партия подвергается контролю качества и выпускается на рынок только после
подтверждения ее соответствия критериям приемки продукции.
В нашей компании хранится документация по производству и контролю качества каждой
партии продукции.
Наборы для качественного и полуколичественного определения антител к Treponema pallidum в
человеческой сыворотке или плазме с помощью иммуноферментного анализа
1 - КЛИНИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ
Сифилис – это хроническое инфекционное заболевание, в развитии которого выделяют несколько четко
определяемых стадий - первичный, вторичный, третичный и четвертичный сифилис. Эти стадии
сопровождаются различными клиническими симптомами, типичными из которых являются
первоначально возникающая кожная язва (шанкр), за которым следует длительный латентный период
без каких-либо видимых клинических проявлений, затем развивается сифилитическая сыпь. При
отсутствии лечения в конечном счете могут развиваться поражения сердечно-сосудистой системы и
нейросифилис.
Возбудителем данной инфекции является спирохета Treponema pallidum. Заражение обычно происходит
при половом контакте, однако болезнь может передаваться при переливании инфицированной крови.
Кроме того, возможно развитие внутриутробной инфекции. Было установлено, что данный
микроорганизм практически невозможно выращивать на искусственных питательных средах, и
диагностика этой инфекции обычно основана на определении антител в крови, появляющихся вскоре
после первоначального заражения.
Выделяют четыре категории тестов на сифилис: прямое микроскопическое исследование; тесты на
антитела против трепонемы; тесты, не связанные с определением антител против трепонемы; и прямые
тесты на антиген. В связи с наличием длительных латентных периодов заболевания и неспецифическим
характером не-трепонемных тестов, при проведении скрининговых исследований все чаще
используются тесты, основанные на определении специфических антител против трепонемы в пробах
крови. Одним из таких тестов является СИФИЛИС Общие антитела ИФА II.
НАЗНАЧЕНИЕ
Данные диагностические наборы предназначены для выявления антител против Treponema pallidum в
сыворотке и плазме крови человека. Тесты выполняются обученным надлежащим образом и
квалифицированным лабораторным персоналом.
2 - ПРИНЦИП ТЕСТА
В наборах для выполнения 96 и 480 тестов ИФА II на сифилис использованы три рекомбинантных антигена
для проведения одновременно высокоспецифичного и высокочувствительного теста по методу “сэндвич”.
Антигены выявляют анти-T. pallidum специфичные IgG, IgM, IgA, позволяя детектировать антитела на всех
стадиях заболевания. Все реагенты, за исключением Промывающего раствора, представлены в форме,
готовой для использования, и окрашены в различные цвета (цветовая кодировка). Процедура
исследования не требует разведения и использует стандартные объемы образцов для удобства
выполнения, как при ручном, так и при автоматическом протоколе исследования. С помощью данного
теста можно исследовать как пробы сыворотки, так и пробы плазмы крови.
Лунки микропланшета покрыты смесью рекомбинантных антигенов T. pallidum 15kD, 17kD и 47kD. В
течение инкубации специфические антитела из исследуемой сыворотки или плазмы связываются с
твердой фазой и добавленным в лунки коньюгатом, который состоит из таких же антигенов и пероксидазы
хрена. После удаления не связавшихся компонентов в процедуре промывки, наличие специфических
антиген-антительных комплексов определяют по изменению цвета, которое наблюдается в результате
ферментативной реакции после добавления хромогенного субстрата. Интенсивность окрашивания
содержимого лунки относительно оптической плотности контрольных образцов является показателем
наличия или отсутствия специфических антител.
3 - СОСТАВ НАБОРА
РЕАГЕНТЫ И ИХ ОПИСАНИЕ
R1
R2
R3
Микропланшет: 12 стрипов по 8 лунок, покрытых
рекомбинантными антигенами T. Pallidum.
Концентрированный промывочный раствор (20 x)
Отрицательный контроль (человеческий) Желтый
R4
Положительный контроль (человеческий) Красный
R5
Готовый к применению конъюгат Синий
Рекомбинантный антиген, конъюгированный с пероксидазой хрена
Субстрат Розовый
Стоп-раствор 0,5 М раствор H2SO4
R6
R7
Футляр для хранения неиспользованных лунок.
ПРЕДСТАВЛЕНИЕ
72518
72519
1 планшет
5 планшетов
1 x 125 мл
1 x 2 мл
2 x 125 мл
1 x 2 мл
1 x 1,5 мл
1 x 1,5 мл
1 x 8 мл
1 x 30 мл
1 x 7 мл
1 x 7 мл
1 x 30 мл
1 x 30 мл
1
1
4 – МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ
Достоверность результатов зависит от правильного выполнения нижеследующих правил
Хорошей Лабораторной Практики (Good Laboratory Practices):
Не используйте реагенты с истекшим сроком годности.
Не смешивайте при выполнении теста реагенты, относящиеся к разным партиям.
Все реагенты перед использованием следует выдержать при комнатной температуре.
Концентрированные реагенты следует разводить с осторожностью, избегая любых загрязнений.
Не выполняйте тест в присутствии паров реактивов (паров кислот, щелочей или альдегидов) или пыли,
которые способны изменить ферментативную активность конъюгата.
Используемую стеклянную посуду следует предварительно тщательно промыть и ополоснуть
деионизованной водой; использование одноразовой посуды предпочтительно.
Ферментативная реакция очень чувствительна к присутствию ионов металлов. В связи с этим, нельзя
допускать контакта какого-либо металлического элемента с растворами конъюгата или субстрата.
Для каждой пробы следует использовать новый одноразовый наконечник.
Важнейшим этапом данной методики является промывание лунок: соблюдайте рекомендуемое
количество циклов промывания и следите за тем, чтобы все лунки сначала полностью заполнялись, а
затем полностью опорожнялись. Неправильное промывание может приводить к неточным результатам.
Не допускайте пересыхания лунок микропланшета в период между окончанием операции промывки и
последующим внесением реагентов.
Никогда не используйте один и тот же контейнер, для приготовления коньюгата и субстратного
раствора с хромогеном.
Проверяйте точность и правильность работы пипеток а также другого оборудования и
принадлежностей.
Не вносите изменений в протокол теста.
5 – ТЕХНИКА БЕЗОПАСНОСТИ И ОХРАНА ТРУДА
Все реагенты в наборе предназначены для использования только «in vitro диагностики».
Надевайте одноразовые перчатки при работе с реагентами и образцами и тщательно мойте руки
после работы.
Не осуществляйте пипетирование ртом.
Поставляемые в составе набора контрольные материалы содержат человеческую сыворотку. Все они
были протестированы и определены как негативные на HBs антиген, анти-ВГС и ВИЧ1/2 антитела, с
помощью методов, одобренных FDA. Однако, в настоящее время не существует методов, который бы
давал полную гарантию отсутствия возбудителя в образце, поэтому с компонентами набора,
содержащими человеческую кровь, сыворотку или плазму, следует обращаться, как с
потенциально способными передавать инфекцию.
Оборудование и приборы, находившиеся в контакте с образцами или реагентами в том числе и с
промывающим буфером, должны рассматриваться как контаминированные и обрабатываться
должным образом.
Не допускайте проливания образцов или растворов, содержащих образцы.
Пролитый материал необходимо обработать 10% хлорированным раствором. Если пролитая жидкость
является кислотой, ее необходимо нейтрализовать содой и вытереть насухо фильтровальной
бумагой. Материалы, используемые для дез. обработки, должны быть утилизированы в контейнер для
загрязненного материала.
Образцы и реагенты человеческого происхождения, так же как материалы и продукты, подвергшиеся
контаминации должны утилизироваться после дезинфекции:
- Либо погружением в дезинфицирующий раствор в конечной концентрации 5% гипохлорита
натрия (1 часть дезинфицирующего раствора на 10 частей контаминирванной жидкости) на
30 минут.
- Либо автоклавированием при температуре 121 оС как минимум в течении 2 часов.
Автоклавирование является лучшим способом инактивации ВИЧ и вируса гепатита Б.
Не забывайте нейтрализовать и/или автоклавировать растворы или отработанный промывающий
буфер, а так же любую жидкость, содержащую биологические пробы, перед утилизацией.
6 – ПРИГОТОВЛЕНИЕ РЕАГЕНТОВ И УСЛОВИЯ ХРАНЕНИЯ.
Набор следует хранить при температуре 2-8оС. Флаконы должны храниться в вертикальном положении.
Все реагенты стабильны при температуре 2-8оС до окончания срока годности (за исключением
разведенных реагентов и открытых планшетов). Не замораживайте.
Не подвергайте субстрат воздействию прямых солнечных лучей.
Неиспользованные стрипы микропланшета могут храниться в течении 4 недель при температуре 4оС
внутри упаковочного пакета, который входит в состав набора.
Промывочный раствор (20х): Разведите 1:20 в дистиллированной или деионизированной воде перед
использованием. Разведенный промывающий буфер остается стабильным в течение 4 недель при
температуре 4о С.
7 – НЕОБХОДИМОЕ ОБОРУДОВАНИЕ.
Тщательно откалиброванные дозирующие устройства, предназначенные для внесения объемов 50 мкл
(образцы и реагенты) и около 300 мкл (промывочный раствор).
Микропланшетный ридер для регистрации оптической плотности на 450 нм и в интервале длин волн 620 –
690 нм.
Инкубатор на 37 оС
Используемое оборудование должно отвечать следующим параметрам по точности:
Дозируемый объем
+/- 10%
Температура инкубации
+/- 1 оС
Время инкубации
+/- 5 минут
8 – СБОР И ХРАНЕНИЕ ОБРАЗЦОВ
Исследование может быть выполнено с использованием сыворотки или плазмы (собранной с ЭДТА,
гепарином или цитратом). Если в исследуемых образцах присутствуют посторонние включения, пробы
перед проведением анализа, следует центрифугировать. Образцы перед использованием могут храниться
при температуре 2 – 8 ºС до 7 дней. Образцы, требующие более длительного хранения, следует
замораживать при - 20 ºС. Не допускайте повторного замораживания/размораживания образцов. Образцы,
подвергшиеся нагреванию при температуре 56 ºС в течение получаса, пригодны для исследования. Не
используйте загрязненную, гемолизированную сыворотку или плазму, а так же материал с повышенным
содержанием липидов. Перед исследованием образцы необходимо разморозить и тщательно перемешать.
9 – ПРОТОКОЛ ИССЛЕДОВАНИЯ (ручной метод)
Все реагенты и пробы перед использованием следует выдержать при комнатной температуре.
Концентрат промывочного раствора перед использованием следует разбавить в соотношении 1:20
дистиллированной или деионизованной водой.
Протокол описывает ручное выполнение методики исследования. Тест СИФИЛИС общие антитела ИФА II
может быть без труда автоматизирован как на этапе внесения образцов и реагентов, так и интерпретации
результатов. Для получения подробной информацией обращайтесь в местное представительство Био-Рад.
Считывайте результаты через 30 мин после добавления стоп-раствора.
Процесс промывки планшета должен быть выполнен очень тщательно, с полным заполнением и
опустошением лунок на каждом цикле. Иногда в случае использования вошеров различных моделей
необходимо оптимизировать выполнение процедуры промывки (увеличить количество циклов и/или объем
промывающего раствора на каждый цикл). Информацию об адаптации вошеров различных моделей для
выполнения теста обращайтесь в местное представительство Био-Рад.
Контроли
Положительный и отрицательный контрольные образцы должны быть использованы в каждой постановке
теста для правильной оценки достоверности результатов исследования.
Используйте в каждом исследовании три лунки для отрицательного контрольного образца.
Отрицательный контрольный образец используется для расчета критического значения оптической
плотности (уровня среза (cut-off)).
Используйте в каждом исследовании две лунки для положительного контрольного образца.
Контроль правильности внесения образцов и реагентов
Визуально
Исследуемые образцы и отрицательные контроли желтого цвета
Плазма/сыворотка + Коньюгат – зеленый/синий
Положительный контроль + Коньюгат – темно-синий
Отрицательный контроль + Коньюгат – зеленый
Автоматический контроль
Внесение образцов и контролей проверяется при регистрации на длинах волн 450/620 нм. Лунки с
внесенными образцами и контролями должны иметь оптическую плотность (ОП) в пределах 0.05 – 1.000
Внесение коньюгата проверяется при регистрации на 620/450 нм. Лунка, содержащая образец + коньюгат
должна иметь ОП больше или равную 0.000, а лунка содержащая только образец < 0.000
Внесение субстрата проверяется при регистрации на 550 нм. Лунка, содержащая субстрат должна иметь
ОП больше, чем 0.080
Процедура исследования
1- При исследовании каждой партии образцов должны быть внесены три отрицательных и два
положительных контроля. Контроли должны быть исследованы в той же процедуре, что и
образцы пациентов.
2- Инкубация образцов и коньюгата:
Внесите в лунки по 50 мкл неразведенного образца, так же внесите отрицательный (в 3 лунки) и
положительный (в 2 лунки) контроль.
В каждую лунку внесите по 50 мкл коньюгата. Коньюгат поставляется в рабочей концентрации.
С использованием шейкера для микропланшет перемешивайте содержимое лунок в течение 30
сек.
Инкубируйте закрытый планшет в течение 30 минут при 37 оС.
3- Промывка:
5 раз тщательно промойте планшет промывающим раствором в рабочей концентрации.
Рекомендуется небольшой интервал (около 30 сек) «замачивания» между циклами промывки.
Избыток жидкости следует сливать.
4- Инкубация с субстратным раствором:
Внесите по 50 мкл субстрата в каждую лунку. Инкубируйте 30 минут при комнатной
температуре. Так как субстратный раствор чувствителен к свету, рекомендуется на время
инкубации поместить планшет в затемненное место. В случае наличия положительных образцов
они окрашиваются в синий цвет.
5- Остановка хромогенной реакции:
Добавьте в каждую лунку по 50 мкл стоп-реагента (0.5М H2SO4). Все лунки, окрашенные в синий
поменяют цвет на желтый.
6- Регистрация оптической плотности:
Аккуратно протрите дно планшета. Считайте оптическую плотность (ОП) на 450/(620-690 нм) при
помощи фотометра в течение 30 минут после добавления стоп-реагента. Использование
референсной длины волны 620 – 690 нм позволяет избежать влияния царапин и пузырьков на дне
лунки.
9 – РАССЧЕТ И ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ
Подтверждение правильности выполнения теста
ОП каждого отрицательного контроля (ОК) должна быть меньше или равна 0.080, если один из контролей
не удовлетворяет этому условию, его следует отбросить и рассчитывать критическую оптическую
плотность по оставшимся двум.
ОП каждого положительного контроля должна быть больше или равна 1.0
Расчет критической оптической плотности (уровня среза)
Рассчитывается как средняя оптическая плотность отрицательного раствора плюс 0,100,
то есть:
ОК1 + ОК2 + ОК3
————————— + 0,100.
3
Пример:
0,030 + 0,025 + 0,035
——————————— = 0,030.
3
ОП критическое = 0,030 + 0,100 = 0,130.
Интерпретация
Образцы с ОП ниже, чем величина ОП критического следует считать отрицательными в тесте СИФИЛИС
ИФА II.
Результаты с оптической плотностью немного ниже ОП крит. (ОПкрит.-10 % < ОП < ОПкрит.) следует
интерпретировать с осторожностью. Рекомендуется повторить исследование соответствующих образцов в
дублирующих пробах (если имеющиеся системы и лабораторные процедуры позволяют это сделать).
Образцы с ОП больше или равной критической величине следует интерпретировать как положительные в
тест-системе СИФИЛИС ИФА II и должны быть повторно исследованы в дублях для конечной
интерпретации.
Если среди повторно исследованных дублированных образцов хотя бы один имеет ОП выше критической
величины, данная сыворотка должна считаться положительной и быть подвергнута дальнейшим
исследованиям для постановки окончательного диагноза. Если среди повторно исследованных
дублированных образцов оба имеют ОП ниже критической величины, данная сыворотка должна считаться
отрицательной.
Характеристики теста
Специфичность
Независимые исследования, проведенные на образцах, взятых у 528 доноров, отобранных случайным
образом, показали, что специфичность теста составляет 99,4 % (95 % доверительный интервал 97,44 % –
100 %). Исследования, проведенные на отрицательных образцах, взятых у 2296 доноров, отобранных
случайным образом, показали 100 % специфичность теста (доверительный интервал 98 % – 100 %).
Исследования, проведенные на 40 нормальных образцах сыворотки, взятых у беременных женщин
показали специфичность теста равную 100 %
(95 % доверительный интервал 98 – 100 %)
При исследовании образцов пациентов со следующими заболеваниями: ревматоидный артрит ,
боррелиоз, токсоплазмоз, инфекционный мононуклеоз (вирус Эппштейн-Барра), лептоспироз не было
зафиксировано ни одного положительного результата.
Чувствительность
Внутреннее исследование на 110 образцах плазмы и сыворотки с уже установленным диагнозом
сифилиса, показала 100% чувствительность (Интервал 98.02 – 100% с доверительной вероятностью 95%).
Исследования, проведенные в независимом научном центре на 200 положительных образцах,
соответствующих всем стадиям инфекции, показали 100% чувствительность (Интервал 98.04 – 100% с
доверительной вероятностью 95%).
Из 25 образцов, взятых в этом исследовании у пациентов на стадии раннего первичного сифилиса, все
показали положительный результат, продемонстрировав 100% чувствительность (Интервал 97.94 – 100% с
доверительной вероятностью 95%).
Аналитическая чувствительность
При исследовании Первого Международного Стандарта Сифилитической Сыворотки Человека (NIBSC, UK)
данная тест-система оказалась способной определять минимальную концентрацию антител, равную
0,0016 МЕ/мл
Воспроизводимость
Образец
Кол-во
Средн ОП450-620
1
2
3
20
20
20
2.274
1.240
0.674
Внутрисерийная
воспроизводимость
% CV
4.7
3.9
3.9
Воспроизводимость
%CV
6.5
8.5
7.6
Образец
Кол-во
Средн ОП450-620
4
5
6 (Отрицат).
20
20
20
0.350
0.174
0.013
Внутрисерийная
воспроизводимость
% CV
3.5
3.8
6.4
Воспроизводимость
%CV
6.7
5.2
8.9
11 – БИБЛИОГРАФИЯ:
1. Larson S.A. et al. Laboratory Diagnosis и interpretation of Tests for Syphilis. Clinical Microbiology Reviews Jan.1995,
Vol 8.
2. Pope V. et al A manual of tests for Syphilis.
3. Norris S.J. Plypeptides of Treponema pallidum: Progress toward understanding their structural, functional и
immunological role. Microbiological Reviews, Sept. 1993 Vol 57.