Вопросы качества при исследовании уровня IgE антител

Вопросы качества при
исследовании уровня IgE антител
Научный центр здоровья детей
К.м.н. Геворкян А.К.
г.Москва
ФГБУ
«НЦЗД» Минздрав РФ
НИИ Гигиены и
охраны здоровья детей
и подростков
НИИ
педиатрии
НИИ
профилактической
педиатрии и
восстановительного
лечения
Ученый совет ГУ НЦЗД РАМН
MRT 3.0 Discovery 750
КТ Discovery 750HD
Optima-430s 1,5 Tl
Optima_MR_450w 1,5 Tl
Rg Discovery 650XR
Logic E 9
Voluson 730
expert
Vivid E 9
Siemens S -2000
Siemens Antares
Voluson E 8
Рентгеновское отделение КДЦ
ЦИФРОВОЙ РЕНТГЕН
ДИАГНОСТИКА И ЛЕЧЕНИЕ
МОЛОЧНЫХ ЖЕЛЕЗ
5 г.
1
0
С2
За 2014г выявлено 16 фиброаденом
у девочек-подростков размерами
более 3 см. (прооперированы)
Всего
Консультации
УЗИ м/ж
Маммография
Пункции
1968
1798
684
41
Из них
ДЕНСИТОМЕТРИЯ
2014
год
амб
д/с
к/с
1821
1651
684
33
44
44
0
6
103
103
0
2
Денсито
метрия
Всего
1536
Из них
амб
д/с
к/с
195
567
774
34 лекции по молочной железе в 2014г в годах России: Владивосток, Хабаровск, Курск, Кировск,
Челябинск, Орел, а также в Астане и Ташкенте.
Лабораторные методы диагностики
Преимущества использования тестов in vitro:
Нет противопоказаний к обследованию (нет необходимости отмены
лекарственных препаратов)
Не вызывают дополнительной сенсибилизации, нет риска анафилактических
реакций
Нет возрастных ограничений, возможно проводить в самом раннем возрасте
Большое число тестируемых аллергенов
Использование сыворотки для исследования в любой лаборатории (тесты на
расстоянии)
Диагностика In vitro:
Общий и специфический IgE
Клеточные тесты (FLOW-CAST, EK-CAST, CAST-COMBI)
Медиаторы эффекторных клеток в крови и моче, метаболиты медиаторов
In vitro аллерготесты
Дореволюционны
е
XXI столетия
Дореволюционные тесты
Фотометрическая детекция
или
Отсутствие автоматизации процесса
Что должен знать клиницист об in vitro аллерготестах:
Вопросы:
1.Единицы измерения sIgE?
2.Метод детекции sIgE?
3.Участие в программе внешнего
контроля качества измерения sIgE?
Звонок в лабораторию
Правильные ответы:
1.kU/l
2.Автоматическая иммунофлуоресценция
3.Успешно участвуем в программе…,
готовы предоставить копию сертификата
Чувствительность in vitro
аллерготестов
Специфичность in vitro аллерготестов
Ложноположительные результаты,
которые ставят нас в тупик…
Что означает качество, когда мы говорим о
измерении IgE антител?
Точность
Воспроизводимость
Предел определения
Параллелизм
Контроль качества
Контроль качества IgE тестов
Контроль качества осуществляется производителем во
время производства реагентов и наборов
«Внутренний» интра-лабораторный контроль качества –
это второй уровень контроля качества клинической
лаборатории
«Внешний» межлабораторное профессиональное
тестирование (e.g. UKNEQAS в Europe, CAP в USA и
Quality Club для ImmunoCAP по всему миру)
Стандартизация аллергенов
Аллергон • Ведущий производитель
аллегренсодержащего
материала
• Отделение /дочернее
предприятие Phadia
• >25 лет практического опыта
16
Клуб качества sIgE
17
Результаты:
Воспроизводимость
90
80
EuroEQAS for specific IgE, Distribution 031, 2008
70
CV [%]
60
50
Hycor
40
DPC Microplate
30
DPC Immulite
20
Pharmacia CAP System™
10
ImmunoCAP® 100
0
d1
Der.
pteronyssinus
e1
Cat
k82
Latex
m3
Aspergillus
fumigatus
Аллергены
18
m6
Alternaria
alternata
t3
Birch
Важно понимать: что означает CV в kU/L
19
Измерение sIgE антител – наиболее сложная
иммунологическая методика
Низкая концентрация IgE в сыворотке
Каждый аллерген содержит большое количество
протеинов/компонентов, способных провоцировать ответ
sIgE антител
Для каждого аллергена тест должен быть достаточно
чувствителен, чтобы связывать все sIgE антитела ко
всем значимым компонентам
Тест должен иметь достаточную ёмкость, чтобы связать
все sIgE, конкурирующие с другими классами Ig.
20
Чрезвычайно низкая концентрация sIgE в сыворотке в сравнении с другими
классами IG требует сверхчувствительной технологии измерения
21
Аллерген-специфические IgE
методики
Специфические IgE тесты не имеют противопоказаний и
ограничений
“Тестирование на аллерген-специфический IgE должно проводиться
валидизированным методом и может быть выполнено в любом
возрасте”
“Большинство валидизированных sIgE методик используют метод
ELISA-типа и обеспечивают количественные результаты. Эти тесты
связывают сывороточные аллерген-специфические IgE антитела с
экстрактом аллергена, адсорбированном на твердой фазе
“sIgE уровни >0.1 kU/ml, также как >0.35 kU/ml считаются
положительными, но существует значительная вариация между
техниками, в основном из-за методологических отличий.”
Eigenmann P.A. et al. Pediatric Allergy and Immunology 24 (2013) 195-209.
Пример валидизированного теста
Calibration(a)
ImmunoCAP Specific IgE Calibrators
Calibrator range: 0-100 kU/l.
Reference
material: The IgE calibrators are traceable (via an unbroken
chain of calibrations) to the 2nd International Reference Preparation
(IRP) 75/502 of Human Serum Immunoglobulin E from World Health
Organisation (WHO).
ImmunoCAP 250
PHADIA (ImmunoCAP)
25
ImmunoCAP™
обладает
уникальной
трехмерной
твердой фазой
с чрезвычайно
Твердая
высокой
фаза
связывающей
способностью
активированн активированн активированн
ая
ый бумажный
ая
поверхность
диск;
целлюлозная
лунки
“губка”
активированн
планшета
ые шарики
Классификация аллерген-специфических IgE тестов
Качественные (Phadiatop, Phadiatop infant, fx5)
Полуколичественные (Мультиаллергенные тесты)
Количественные (ImmunoCAP)
27
Один день “из жизни” ImmunoCAP 250
28
October 19, 2015
Менеджмент качества:
определение уровня специфического IgE
Внутренние контроли
1) Обязательные контроли:
При каждом запуске – контроли калибровочной кривой (верхний и нижний)
2) Дополнительные контроли:
F1 (яичный белок)
D1 клещ домашней пыли (Dermatophagoides pteronyssinus)
E1 (кошка, эпителий и перхоть)
F14 (соя)
G6 (тимофеевка луговая)
M6 (Alternaria alternata)
T3(Береза бородавчатая)
W1 (Амброзия высокая)
Поликомпонентный положительный контроль
отрицательный контроль
Внешний контроль – Клуб качества (Phadia, Швеция):
4 раза в год по 4 “слепых” образца
МЕТОДИКИ
Общий IgE
(2-5000kU/l)
Специфический IgE
(0 - 100 kUA/l)
IgG
(2-200 мгА/л)
IgG4
(0-30 мгА/л)
IgA Целиакия
(1-100 мгА/л)
IgG Целиакия
(2-100 мгА/л)
Эозинофильный катионный белок (2-200 мкг/л)
Триптаза
Аутоиммунитет
(1-200 мкг/л)
(0-600 мкгА/л)
Идентификация
>9 из10
Яичный белок
Молоко
Арахис
Клещ домашней
пыли
Кошка
Собака
Травы
Деревья
Кустарники
ЭКСКЛЮЗИВНЫЕ ТЕСТЫ IMMUNOCAP
Phadiatop – скрининг атопии
Phadiatop Infant – скрининг
атопии у детей до 4-х лет
Скрининг заболеваний
соединительной ткани CTD
Высокопроизводительная
автоматическая платформа
для аутоиммунных тестов
Триптаза - маркер анафилаксии
Тесты молекулярной
аллергологии – более 100
аллергенкомпонентов
Компонент-разрешающая (молекулярная)
аллергодиагностика
Аллергены яйца:
Овомукоид – Gal d 1
Овальбумин – Gal d 2
Овотрансферрин – Gal d 3
Лизоцим – Gal d 4
Наличие множество
Аллергены коровьего молока:
•α-лактальбумин - Bos d 4
•β -лактоглобулин - Bos d 5
•Казеин - Bos d 8
•Лактоферрин коровы - Bos d
•Бычий сывороточный альбумин – Bos d 6
аллергенных молекул
в составе
продукта/источника
требует точного
определения
причинно-значимого
аллергена для подбора
лечебной тактики и
создания прогноза
заболевания
Аллергены фруктов и овощей:
Яблоко: Mal d1 (PR-10), Mal d3 (LTP), Mal d4
Персик: Pru p1 (PR-10), Pru p3 (LTP), Pru p4
Вишня: Pru av1, Pru av3, Pru av4
Морковь: Dau c1 (PR-10), Dau c3 (LTP), Dau c4
XVIII Конгресс педиатров с международным участием
«Актуальные проблемы педиатрии»
Аллергены березы:
Bet v1 (PR-10)
Bet v2 (профилин)
Bet v4 (Са-связывающий
белок)
Bet v6 (изофлавонредуктаза)
Аллергены тимофеевки:
Phl p1, Phl p2, Phl p4,
Phl p5b, Phl p7, Phl p11, Phl p12
Аллергия на клещей домашней пыли
•Der p1 – аллерген dermat.pteronyssinus
•Der p2 – аллерген dermat.pteronyssinus
•Der p10 – тропомиозин
Аллергия на собаку
•Can f 1 - липокалин
•Can f 2 - липокалин
•Can f 5 – простатический
калликреин
•Can f 3 – сывороточный альбумин
Аллергия на кошку
• Fel d 1 – секреторный гликопротеин
•Fel d 2 – сывороточный альбумин
• Fel d 3 - цистатин
• Fel d 4 – липокалин
Школа детского аллерголога-иммунолога
Методы обнаружения антител
sIgE к аллергокомпонентам
Иммунохимически
е анализаторы
-Высокая точность
определения
-Индивидуальный подбор
аллергенов
Микрочипы
(microarray)
- Точность определения
уступает, но достаточно
хорошая
-Только панели аллергенов
-Высокая стоимость
исследования
-Высокая стоимость
исследования
-Ограниченный набор
аллергокомпонентов (десятки)
-Широкий набор
аллергокомпонентов (сотни)
Компонент-разделенная аллергодиагностика
- возможность определять sIgE к специфическим аллергенным белкам или
компонентам белка
Смесь аллергенов
и неаллергенных
молекул
Компонент
A
Компонент
B
Компонент
C
Нативный аллергенный
экстракт
Нативные/рекомбинантные белки А, В, С
Цельный аллерген
Аллергенные компоненты
XVIII Конгресс педиатров с международным участием
«Актуальные проблемы педиатрии»
Школа детского аллерголога-иммунолога
Клиническая значимость диагностики
с аллергокомпонетами
Определение сенсибилизации к аллергокомпонентам:
- необходимо для установления правильного диагноза
- позволяет предсказывать случаи перекрестной реактивности
- позволяет прогнозировать
пищевым продуктам
развитие
толерантности
к
некоторым
- наличие или отсутствие сенсибилизации к минорным аллергенам влияет
на прогноз заболевания: легкие симптомы (ОАС) или анафилаксия
- является основой назначения специфической
прогнозирования ее эффективности
иммунотерапии
и
Молекулярная диагностика аллергии на
куриное яйцо
•
•
•
•
Аллергия на куриное яйцо – одна из наиболее часто
встречающихся у детей
Распространенность: 1-2%
Некоторые пациенты переносят употребление
отварных/печеных яиц
Часто проходит к дошкольному возрасту
Пациент А.
АтД
п.4
С 3-х мес
В 2года: кожн. тестир. –
кур. яйцо
Диета +симпт.средства
Терапия
3 года: нарушение диеты
АтД, бронхообструкция
20 кЕ/л
IgE к яйцу (белок)
АтД, аллергический
В 5 лет: нарушение
ринит, бронхообструкция
диеты
Пациент Б.
АтД
п.5
Диета +
симпт.средства
АтД, бронхообструкция
25 кЕ/л
Нет симптомов
Аллергены белка куриного
яйца
1. Овальбумин (Gal d2) – наиболее общий аллерген в белке
2. Овомукоид (Gal d1) – аллерген с наибольшей
иммуногенностью для детей
3. Овотрансферин (кональбумин) (Gal d3)
4. Лизоцим (Gal d4)
Содержание в
Температурна
Аллерген
белке яйца
Овомукоид
11%
Лизоцим
3,4%
Кональбумин
13%
Овальбумин
54%
я
стабильность
Аллергенна
я
активность
++++
+++
+++
++
++
+
+
++
Benhamou AH, state of the art for egg allergy, Allergy 2010, 65:283–289
Ando H. JACI 2008: Уровень sIgE к овомукоиду у детей с персистирующей аллергией на яйца
значительно выше, чем у детей, которые «переросли» аллергию к куриному яйцу
sIgE к экстракту
аллергенов яйца
А.
20 кЕ/л
Б.
25 кЕ/л
sIgE к овомукоиду
12 кЕ/л
0,4 кЕ/л
Нарушение
элиминационной диеты
АтД, аллергический
ринит,
бронхообструкция
Нет
симптомов
sIgE при лекарственной аллергии
38
In vitro тесты
Доступны только для
нескольких препаратов
39
http://www.phadia.com/en/Allergen-information/ImmunoCAP-Allergens/Drugs/
БЛАГОДАРЮ ЗА ВНИМАНИЕ !