Регенерация печени и афферентное звено нейрогенной
advertisement
На правах рукописи ДУШКОВА Зинаида Геннадьевна Регенерация печени и афферентное звено нейрогенной регуляции репаративного процесса. 03 00 13 - Физиология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Нижний Новгород - 2004 Работа выполнена в ГОУ ВПО Нижегородской государственной медицинской академии Минздрава России на кафедре биологии Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор Садовникова В.В. Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор доктор биологических наук, профессор Бирюкова О В. Чурмасов А В. Ведущая организация: ФГОУ ВПО Чувашская государственная сельскохозяйственная академия (г. Чебоксары) Защита диссертации состоится часов на заседании диссертационного совета Д220 047.01 при Нижегородской государственной сельскохозяйственной академии по адресу: 603107, г. Нижний Новгород, пр. Гагарина, 97 С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Нижегородской государственной сельскохозяйственной академии Автореферат разослан Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук _ 2004 г. ' Асафова Н Н. 1 Актуальность темы Регенерация печени - это комплекс жестко регулируемых физиологических процессов пролиферации гепатоцитов, непаринхиматозных клеток и восстановления нарушенной функции органа после его повреждения. Несмотря на большое количество научных данных, касающихся морфологических, физиологических и биохимических аспектов регенерации печени, сложный механизм этого уникального феномена остается недостаточно изученным. Предложенные гипотезы пусковых механизмов клеточной пролиферации: гемодинамические, иммунологические, гиперфункции сохранившихся клеток, наличие местных регулирующих факторов — стимуляторов, кейлонов, специфических факторов роста: гепатопоэтинов, цитокинов, биогенных эндорфинов и других биологически активных веществ. (Алов,И.А.,1964; Логинов,А.С., 1976,1981; Балаж,Л.,1982; Романов,ЮЛ., 1984; Ивашкин,В-Г.,1998; БожковА-И-, 1999; Лебедев,ВЛ.,2000; ГарбузенкоД.В.,2001; Смахин,МЛО.,2003; Zivny,R.,1989; Blaha,V.,1990; LinJL-X., 1998; Yong,Xin-M.,1998; Blackshow,L.A.,2000; SmartJ)., 2000; Fausto,N.,2000) не являются универсальными и не объясняют все аспекты репаративного процесса. Исходя из положения о том, что репаративная регенерация печени является системным процессом, большой интерес представляет изучение роли нервной системы в регуляции репаративных процессов и определение удельного веса различных ее отделов в трофическом обеспечении ткани регенерирующей печени. Исследованиями В. В. Садовниковой (1990, 1992, 1994 г.г.) установлено участие симпатического отдела вегетативной нервной системы (ганглиев солнечного сплетения) в регуляции пролифсративиых процессов в печени при действии импульсного магнитного поля. Известно, что афферентный нейрон имеет ведущее этиологическое и патогенетическое значение в поддержании структурной целостности и адекватной дифференцированности иннервируемых структур (Григорьева,Т.А.,1951-1963; Астахова,А. М, 1967-1974; Никифоров,А.Ф., 1973; Дубовая,Т.К., 1970; Спиридонов, В.К.,1999; Плахова, В.В.Д000). Находит дальнейшее развитие выдвинутое П.К. Анохиным (1975, 1978, 1980 г.г.) положение о центральном месте афферентного звена нервной системы в интегративной деятельности функциональных систем, направленной па достижение полезпого адаптивного результата. (СудаковДСВ., 1984,1996,2000,2002; НаточинДО.В., 2000,2002; Ноздрачев,А.Д., 1999,2000, Золотарев,В.А.Д001) Афферентное звено нервной системы рассматривается как инициальное в регуляции процессов жизнедеятельности и ему отводится главенствующая«роль в формировании адекватной реакции систем организма при изменении условий (Волкова,О. В., 1978; Жукова,Е.М.,1999Д002.; Спирйдонов,В.К.,2000). Учитывая' высокую чувствительность нервной- системы к магнитным полям (Холодов.Ю.А.,1975-1995; Белоусова,Т.Е.,1991; Calvo,A.C.,1999), большой интерес представляет метод стимуляции репаративной регенерации органов и тканей под воздействием магнитного поля (ЛаринЗ-С.,1990; СадовниковаЗ-В,1992; Ушаков,А.А., 1995; Романова,Е.Б.,1997; Левицкий,Е.Ф.,1998; Субботина,ТЛ.,1998; Canc,V.1997; Ottani,V., 1997). Вместе с тем сохраняют свою актуальность проблемы, далекие от своего решения. Одна из. основных - механизмы, запускающие, поддерживающие и завершающие пролиферацию клеток. Лфференпгый нейрон и печень - элементы единой равновесной саморегулируемой функциональной системы, связанные рефлекторно, взаимовлияющие и взаимообусловливающие состояние друг друга. Исследование коррелятивных взаимоотношений этих двух компонентов» системной архитектоники регуляции регенерационного процесса позволит выявить причшшо-следственные связи в развитии альтернативных процессов при- различных экспериментальных воздействиях и последующем восстановлении структуры и функции исследуемых органов. Выявленные закономерности могут быть методов 2 стимуляции регенерации печени путем целенаправленного воздействия на отдельные звенья указанный системы, в частности, на чувствительные нейроны и их окончания. Цель исследования Целью настоящего исследования является: выявление . характера участия афферентного звена нервной системы, в частности, нсйроцитов спинномозговых узлов нижнегрудного отдела и дистального ганглия блуждающего нерва, в процессах регуляции репаративной регенерации печени. Для достижения поставленной цели решались следующие задачи: 1. Изучить характер взаимосвязи между состоянием регенерациониых процессов в ткани печени и морфо-функциональным состоянием иннервирующих орган чувствительных ганглиев. 2. Оценить степень долевого участия афферентных нейронов различных отделов чувствительной иннервации: спинномозговых узлов грудного отдела с Th 5 по Th 13и дистального ганглия блуждающего нерва - в процессе регуляции регенерации печени. 3. Выяснить значение афферентации в поддержании структурной целостности и адекватного функционирования печени в условиях воздействия четыреххлористым углеродом. 4. Определить роль афферентного звена нейрогенной регуляции в реализации стимулирующего действия импульсного магнитного поля на регенерацию ткани печени. Научиая новизна рабогы. Впервые установлен характер, масштабы и степень вовлечения афферентного звена нервпой системы в регуляцию регенерационных процессов в ткани печени. Определен спектр количественных и качественных изменений в структуре чувствительных ганглиев, участвующих в иннервации ткани печени: право- и левосторонних спинномозговых узлов нижнегрудного отдела с Th5 по ТЫЗ и дистального ганглия блуждающего нерва в условиях её регенерации. Выявлены - коррелятивные взаимоотношения между морфофункциональным состоянием афферентных нейронов исследуемых ганглиев и структурой регеперирующей печени. Впервые исследовано влияние импульсного магнитного поля па структуру чувствительных ганглиев при стимуляции регенерации ткани печени. Проведен сравнительный анализ эффективности стимулирующего действия импульсного магнитного поля на регенерационные процессы при его воздействии на область проекции печени на вентральной поверхности тела и область проекции спинно-мозговых узлов на дорсальной поверхности. Теоретическая и практическая значимость работы. Анализ результатов собственных исследований и сопоставление с данными литературных источников позволили подойти к раскрытию возможных механизмов участия афферентного звена нервной системы в регуляции процессов репаративной регенерации печени. Построена гипотетическая м'одель фрагмента функциональной системы, деятельность которой направлена на восстановление структурной целостности и адекватного функционирования поврежденной печени в процессе регенерации, центральное место в которой занимает афферентный нейрон. В прикладном аспекте возможно использование полученных, в работе данных в экспериментальной биологии, медицине и ветеринарии- для моделирования регенерационных процессов в тканях, поврежденных органов (в частности, в чувствительных ганглиях и печени), путем прямого и рефлекторного воздействия на афферентное звено нервной системы. 3 На основании сделанных по результатам работы выводов о большей эффективности стимулирующего воздействия импульсного магнитного поля на афферентные центры (сгашальные ганглии), чем на иннервируемый ими орган (печень), представляется весьма перспективным разработка новых методов и способов регенерациопной терапии. Материалы диссертации могут быть использованы в подготовке лекций и практических занятий по общей биологии; цитологии и гистологии; физиологии человека и животных для студентов биологических, медицинских и ветеринарных специальностей. Положения, выносимые на защиту. 1. В процесс регуляции регенерации печени при различных условиях вовлекается афферентное звено нервной системы, что проявляется в изменениях морфофункционального состояния нейронов иннервирующих печень чувствительных ганглиев: реактивного, дистрофического, адаптивного и компенсаторного характера. 2. Импульсное магнитное поле оказывает прямое и рефлекторное действие на структуру чувствительных гапглиев при стимуляции регенерации печени, активируя процессы биосинтеза и внутриклеточной регеперации в афферентных нейроцитах. 3. Стимулирующий эффект импульсного магнитного поля- на интенсивность регенерационных процессов в измененной введением четыреххлористого углерода ткани печени значительно более выражен при воздействии на иннервирующие орган сшшальные ганглии грудного отдела, чем на область проекции самой печени. Апробация работы и публикации. Материалы диссертации представлены, доложены и обсуждены на областной научно методической конференции «НИРС - путь к высокой профессиональной подготовке». (Горький, 1989); на конференции молодых ученых в честь 70-летия ГМИ (Горький, 1990); на конгрессе ассоциации морфологов: АГЭ (Тюмень, 1994); I Всероссийском конгрессе по патофизиологии с международным участием (Москва, 1996) ; научно — практической конференции: «Экология, здоровье и природопользование в Поволжье» (Саратов, 1997); I Всероссийской конференции студентов и аспирантов морфологических кафедр медицинских ВУЗов и НИИ России (С. Петербург, 1998); Всероссийской научной конференции- АГЭ (Тюмень, 1998); на IV Конгрессе Международной ассоциации морфологов (Н. Новгород, 1998); IV Всероссийском съезде АГЭ с международным участием (Ижевск, 1999); на расширенном заседании кафедры биологии Нижегородской государственной медицинской академии (2003,2004) По теме диссертации опубликовано 11 работ. Получен патент на изобретение: «Способ нормализации структуры спинно-мозговых ганглиев грудных сегментов» (№ 2123867) Структура и объем работы. Диссертация представляет собой том машинописного текста на 148 страницах, состоит из введения, обзора литературы, характеристики материала и методов исследования, трех глав результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов, списка литературы и приложения. Включает в себя 65 рисунков и 39 таблиц. Список литературы содержите 211 источников информации (118 отечественных и 93 иностранных). 4 МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Исследования выполнены на 120 белых беспородных крысах обоего пола массой 150 -180г. Изучали морфо-функциональное состояние чувствительных ганглиев: право- и левосторонних спинномозговых узлов шшнегрудного отдела (Th 5 - Th 13) и дистального ганглия блуждающего нерва (G. nodosum) на различных моделях регенерирующей печени. Были проведены две серии экспериментов, включающие 7 групп животных (табл.1). 1 серия — на модели регенерирующей печени после частичной гепатэктомии. Под эфирным наркозом удаляли левую боковую долю печени, что составило около 30 % массы органа. 17 прооперированных крыс подвергали воздействию ИМП в качестве стимулятора регенерации печени. Магнитотерапию проводили 2 раза в день на 1, 2, 4 и 5 сутки после операции. 18 крыс после операции не омагничивали (оперированный контроль). Животных этой серии забивали нембуталовым наркозом (чрезмерной дозой) на 1 и 5 сутки после операции. 2-я серия проведена на модели регенерирующей печени, поврежденной введением 66% раствора CCL4 на растительном масле в дозе 0,3 мл в паховую складку или бедро подкожно 3 раза в неделю в течение 2,5 месяцев. В процессе воспроизведения модели гибель животных составила 48%. Через 3 дня после отмены CCL4 животные подвергались воздействию ИМП: 8 крыс получили 4 процедуры на область проекции печени на вентральной поверхности тела, 10 крыс - на область проекции СМУ грудного отдела на дорсальной поверхности. Оставшихся 9 животных не «омагничивали». Животных забивали нембуталовым наркозом на 7 сутки после прекращения введения CCU- 8 крыс, не подвергшихся никаким воздействиям составляли интактную группу. Воздействие ИМП создавали генератором ИМП аппарата «АМИТ — 01» индукцией 100 мТл на поверхности тела,'частотой 10 Гц, длительностью импульса треугольной формы 1,2 - 3,5 мс, продолжительностью процедуры 10-15 мин. Выбор параметров ИМП в аппарате обусловлен рекомендациями, разработанными ранее в исследованиях В.В.Садовпдковой (1983-1992 г.г.) Для гистологического исследования материал фиксировали в 10% нейтральном формалине. Парафиновые срезы печени толщиной 4-5 микрон окрашивали гематоксплинэозином, парафиновые срезы ганглиев толщиной 10 микрон окрашивали гематоксилинэозином и крезиловым фиолетовым (по Нисслю). Наряду с визуальным изучением препаратов, количествешгую опенку структур чувствительных ганглиев и печени проводили методами морфометрического анализа, основанного на принципах стереологии. (Глаголев,А.А.,1941, Салтыков,С.А.,1948, 1976, Автандилов,Г.Г.,1980). Подсчет структур проводили с помощью адаптивной окулярной морфометрической сетки с равномерным шагом, состоящая из 25 узлов, образующих 16 рабочих полей. Увеличение микроскопа подбирали оптимально для распознавания интересующих объектов на площади препарата, ограниченного сеткой: для морфометрии ганглиев - 10 * 40 * 1,5; печени - 10 60 1,5. Результаты подсчёта количества структур (К) выражали в абсолютных единицах и процентах. Суммарный объе'м клеток и их ядер определяли по среднему числу узлов сетки (Р), попавших в фигуры при многих случайных наложениях сетки на изображение препарата. После подсчёта общего количества (К) и суммарного объема (Р) структур на площади препарата, ограниченного сеткой, вычисляли средний объём (Р/К). Оба показателя: Р и Р/К - выражали в условных единицах (усл.ед.). На серийных гистологических препаратах ганглиев в 10 случайных срезах морфометрировали по 10 полей зрения, занимающих весь срез. Для оценки морфофункционального состояния чувствительных ганглиев подсчитывали общее количество нейронов на тест-площадь препарата, количество нормальных (НН) и дистрофически измененных (ДН). Отдельно выделяли количество нейронов гиперхромных, с эктопией ядра, эктопией ядрышка, содержащих 2 и более ядрышек. Определяли суммарный и средшш объем нейронов и их ядер. Таблица i. Характеристики проведенных опытов н экспериментальных воздействии. 6 Для количественной оценки структуры печени морфометрировали по 50 случайно взятых полей зрения из разных зон среза. Подсчитывали количество нормальных (НГ) и дистрофически изменённых (ДГ) гепатоцитов на тест - площадь препарата с вычислением коэффициента пормализации паренхимы - НГ/ДГ (Солопаева,И.М.,1982). Кроме того, подсчитывали количество ядер и ядрышек, двуядерных гепатоцитов. Определяли суммарный и средний объем гепатоцитов и их ядер, а также суммарпую площадь просвета синусоидпых капилляров по числу узлов (Р), попавших на их изображегше на тест площадь препарата. Пролиферативпую активность геиатоцитов оценивали по величине митотического индекса. Просматривали 5-6 тыс. гепатоцитов на парафиновых срезах, учитывая все клетки, делящиеся митозом. Полученные данные пересчитывали на 1000 гепаюцитов и выражали в промиллях (О/оо). Материал для электронномикроскопического исследования (печень и ганглии) фиксировали в глютаровом альдегиде на фосфатном буфере и дофиксировали в 2% растворе четырёхокиси осмия (E.S.Reinolds,1963, I.B.CoufieId,1957). Заливка материала осуществлялась в аралдит. Ультратонкие срезы изготовляли на ультрамикротоме LKB III 808 А, просматривали в электронный микроскоп ЭВМ - 100 Л при увеличении 10-20 тыс. Методическая помощь в проведении электронномикроскопических исследований была оказана инженером лаборатории электронной микроскопии кафедры нормальной анатомии (зав. каф., проф., д.м.н. Кочетков Л.Г.) НижГМЛ Бирюковым Ю.В. В целях выявления механизмов нарушения морфо-функциональной целостности мембранных структур гепатоцитов изучали уровень перекисного окисления липидов (ПОЛ) в условиях воздействия четыреххлористого углерода и стимуляции ИМП. Состояние ПОЛ оценивали по содержанию диеновых конъюгатов (ДК) в нмоль/мг и основания Шиффа (OIII) в условных единицах в ткани печени по методу И.Д.Стальной (1977). Статистическую обработку экспериментального материала проводили на электронновычислительной машине IBM. Сравниваемые выборки данных проверялись на нормальность распределения с помощью критерия Уилко Шапиро (W). Достоверность различий оценив&чи в выборках с нормхтышм распределением по критерию Стьюдента (t), при отсутствии нормального распределения - по критерию Вилкокксопа-Ману-Уитии (U). СОБСТВЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ. Афферентное звено нервной системы в условиях регенерации частично геиагэктомированнон печени. На ранних сроках регенерациошюго процесса после частичной гепатэктомии в ткани печени наблюдаются явления воспалительного и деструктивного характера, выражающиеся в белковой и жировой дистрофии гепатоцитов, очаговых круглоклеточных инфильтратах в строме органа, расширении синусоидных капилляров с внутрисосудистой агрегацией эритроцитов. К 1 суткам после операции дистрофические изменения охватывают в среднем 62% клеток паренхимы. Одновременно уменьшается общее количество гепатоцитов контроля и их ядер, что свидетельствует о деструкции и гибели части клеток (табл. 2).. 7 Таблица 2 Морфометрические показатели паренхимы печени после частичной гепатэктомии у к р ы с (X+-Sx) - достоверные различия по сравнению с группой интактных животных (Р<0,05) Наряду с этим имеет место явление пролиферации гепатоцитов. Обнаружено значительное количество митотически делящихся гепатоцитов на всех стадиях деления, которые у интактных животных встречаются крайне редко. Митотиточеский индекс (МИ) составляет 10,61 + 0,01 %0. На 5 сутки после операции митотичсски делящиеся клетки единичные, но в 2 раза увеличивается количество двуядериых гепатоцитов. Возрастает общее количество гепатоцитов, в том числе и с нормальпой структурой (табл.2). Соответственно менее выражены жировая инфильтрация и белковая дистрофия гепатоцитов, реже встречаются очаги круглоклеточвой инфильтрации стромы, что дает возможность предполагать тенденцию к спонтанному восстановлению структуры органа в процессе интенсивно протекающей регенерационной гипертрофии. Известно, что травма печепи в эксперименте (разрезы, слепые и сквозные отверстия, удаление части или целой доли) вызывают в течение первой декады дегенеративные; затем регенерациошше изменения се первных элементов с последующим разрастанием сохранившихся первных структур (волокоп, перЕных окончаний). Это объясняется наличием в печени выраженных зон перекрытия или сопряженных полей иннервации; то есть локальное повреждение (раздражение) нервных окончаний при травме вызывали ответную реакцию всего органа, в том числе в интактных, неповреждённых долях. Митотическое и амитотическое деление гепатоцитов, наблюдаемое при экспериментальной травме печени, зависит от состояния ей нервных элементов в послеоперационный период. (КарупуВ.Я.,1967,ИсанбаевЧ.П., 1995,1996.) По данным Карупу,ВЛ.(1967), МельманаДП.(1970) чувствительная иннервация печени обеспечивается отростками клеток сшшальных ганглиев от Th 5 по Th 13, преимущественно Th 8 - Th 11, а так же чувствительных нейронов узловатого или дистального ганглия блуждающего нерва (ДГ БН), причем преимущественно левостороннего (Аккураюв,Е.Г., Румянцева,Т.А., 1993, Аккуратов,Е.Г., 1996, СагоЫ,С, Magni,F., 1981, Magni,F., Carobi,C, 1983, Carobi,C.,1985, Aranza M.S., 1987, Silva-Caracho, L.,2000). Наряду с воспалительными, дистрофическими и пролиферативными процессами в ткани печет! на ранних сроках регенерации имеют место однотипные, песпецифические реактивно-дистрофические изменения нейронов чувевительных ганглиев : спинномозговых узлов (СМУ) грудного отдела и дистального ганглия блуждающего нерва (ДГ БН). Характер и степень выраженности отмечаемых нзменепий варьировали в широких пределах : от первичного раздражения до тяжелых необратимых форм дегенерации. У большинства нейронов наблюдали признаки острого набухания, распыления и лизиса хроматофилыюй субстанции различной степени, смещение ядер п ядрышек. В некоторых клетках, напротив, уплотнение и склеивание хроматофильного вещества - так называемый 8 гиисрхроматоз или сморщивание нейрощггов. В части нейронов изменения стали необратимыми: гидропическая дистрофия с резкой вакуолизацией цитоплазмы, эктопией и деформацией ядра; кариопикноз, кариоцитолиз, нейронофагия - проникновение глиозньге элементов в лизирующий нейроцит. Выявленный полиморфизм нейронов чувствительных ганглиев свидетельствует о различном функциональном состоянии этих клеток. Оценку морфо-функционального состояния осуществляли в соответствии с положениями функциональной морфологии нейрона, разработанными Жаботинским Ю.М.(1965) и Ярыгиным Н.Е.(1973). Весьма показательной для оценки функционального .состояния нейроцита представляется реакция хроматофилыюй субстанции, которую Ярыгин Н.Е. определяет как «морфологический эквивалент» физиологической и биохимической активности клетки. Два противоположных состояния, затрагивающие субстанцию Ниссля : хроматолиз и пшерхроматоз - являются проявлениями противоположных процессов: активации и инактивации функции клетки. Различные степень и форма хроматолиза позволяют судить о направлении, скорости и обратимости обменных процессов в клетке. В случае прогрессирования хроматолиз становится тотальным и может завершиться гибелью клетки. Гиперхроматоз и сморщивание нейронов, происходящие вследствии дегидротации цитоплазмы, накопления липофусцина и ослабления белкового синтеза, свидельствуют о состоянии «глубокого торможения» всех физиологических процессов в клетке. Дистрофически измененные нейроны составляют в среднем - 50-60%, в некоторых и более: S ТЪ 9 - 67%, что в 3-4 раза превышает их количество в интактной гpyппe: 13-15% , Р < 0,01. Характерно, что в СМУ наибольшую долю составляют нейроны с эктопией ядра и ядрышка: 30-40%, а в ДГ БН преобладают нейроциты с хроматолизом: 40-50%, преимущественно с центральным. Гиперхромные клетки также чаще встречаются в СМУ от 3 до 9%, а в ДГ БН их значительно меньше: 1 -2%, тогда как в интактном контроле они крайне редки. Выявление особенности говорят о специфике реакции нейронов различных чувствительных ганглиев па частичную гепатэктомию и предполагают большую степень повреждения периферических отростков нейронов спинальных ганглиев, что вызывает перераспределение функциональной нагрузки между различными участками афферентного звена нервной системы и возрастание функционального напряжения нейронов дисталыюго ганглия блуждающего нерва. Значительное снижение общего количества нейроцитов во всех исследуемых ганглиях, прогрессирующее в течение эксперимента, так же указывает на развитие дегенеративных процессов и деструкцию нейронов, ведущих к гибели. Элиминация нейроцитов в СМУ на 1 сутки после операции составляет 10 - 28%, а на 5 сутки достигает 16-36%. В ДГ БН оно возрастает or 22% до 29%. Среди СМУ наиболее повреждается структура левосторонних Th5 - ТЫ 1 и правосторонних Th7 - ThlO, причем дегенеративные изменения охватывают более широкий спектр левосторонних ганглиев. Обращает внимание достоверное снижение на 1 сутки после операции по сравпепию с интактным контролем суммарного и среднего объема нейронов СМУ и их ядер. Предполагается, что это связано с преимущественным выпадением больших, функционально активных нейроцитов и выживанием популяции мелких и средних, остающихся в резерве (Бородаевская, Г.Н., 1976; Крюков, А.Г., 1990; Schmalbruch, H., 1987). Для оценки масштабов вовлечения афферентного звена нервной системы в процесс регуляции регенерации нормальной печени были проведены гистологические и морфометрические исследования структуры как право- так и левосторонних спинномозговых узлов 9 грудных сегментов: с Th 5 по Th 13. Нами отмечена зависимость форм и степени выраженности морфо-функциональных изменений нейроцитов от уровня расположения СМУ. Результаты анализа полученных данных представлены на рис. 1. Выявлено, что при в среднем равной степени повреждения нейронов как право- так и левосторонних СМУ, дистрофические и дегенеративные изменения охватывают большее •*—•• - интактный контроль D-dexter S-smister Рис. 1 Реактивные изменения нейронов и их максимальное проявление в СМУ с Тп5 по Тп13 на 5 сутки после частичной гепатэктомии. 10 число левосторонних сегментов ( с Th 5 по Th 13), чем правосторонних ( с Th 7 по Th 12). Наибольшее количество дистрофических изменений зарегистрировано в S - с Th 5 по Th 1 1 , B D - C Th7noThlO. Параллельно с деструктивными изменениями в чувствительных ганглиях наблюдали признаки развития компенсаторно-восстановительных процессов. Обращает внимание значительное увеличение на 1 сутки после операции в СМУ числа ядер содержащих 2 и более ядрышек - до 20 - 21%, по сравнению с интактными животными: 10-15% (Р < 0,01), что свидетельствует об активации белок-синтезирующей функции нейроцитов с последующим увеличением па 5 сутки среднего объема нейроцитов и их ядер в отдельных ганглиях увеличивается число нормальных нейроцитов, при соответствующем снижении числа дистрофически измененных, но в целом выраженность регенерационных процессов незначительна. Известно, что дистрофические изменения и гибель нейронов могут возникать при повреждении их периферических отростков (Карупу, В Л., 1967, Бородаевская, Г.Н., 1976, Крюков, М.А., 1990, Варзин, С.А., 1996). В тоже время, нарушение иннервации органа, особенно чувствительной, ведет к развитию нейродистрофического процесса в денервированной ткани (Елецкий, Ю.К., 1988, Князев, Г.Б., 1988, Воробьева, Н.В., 1997). В очаге деафферентации выделяют два протекающих одновременно, по противоположно направленных процесса: процесс дегенерации и деструкции тканевых элементов и процессы клеточной пролиферации и шпертрофических изменений клеточных структур. Восстановление структуры и функции денервированного органа зависит в значительной степени от активности регенерационных процессов, направленных на восстановление его нервных элементов (волокон, рецепторов, нервных клеток). (Астахова, А.М.,1966, 70, 77, Алексеева, Г.В., 1967, Дубовая, Т.К., 1970, Никифоров, А.Ф., 1969, 70, 73; Собиева, З.И., 1970,74). Таким образом, анализ полученных данных о состоянии чувствительных нейронов ДГ БН и СМУ пижнегрудного отдела после частичной гепатэктомии позволяет предполагать, что первичные реактивно-дистрофические изменения нейрощггов возникают вследствие повреждения их периферических отростков, участвующих в иннервации печени. Нарушение аффереитпой импульсацпи органа приводит к развитию, с одной стороны, дегенеративно-деструктивных процессов, с другой - к дедифференцировке и усилению пролиферативной активности гепатоцитов. Включение компенсаторновосстановительных механизмов в чувствительных нейронах, направленных на стабилилацию структуры и восстановление адекватной импулъсации, можно рассматривать как один из факторов нейрогенной регуляции регенерации нормальной печени после частичной гепатэктомии. Стимулирующее 'действие ИМП в условиях регенерации нормальной печени проявляется в значительном усилении пролиферативной активности гепатоцитов и существенном ускорении восстановления структуры органа. Митотический индекс: 23,52 + 0,03% и количество двуядерных гепатоцитов: 5,31 + 0,89% у омагниченных после частичной гепатэктомии животных в 2 раза превышают соответствующие показатели: 10,61 ± 0,01% и 2,74 + 0,89% у оперированного контроля. Коэффициент нормализации паренхимы (Кнг/Кдг) у экспериментальных животных уже на первые сутки после операции (0,96 + 0,04) достоверно выше контрольных значений (0,62 + 0,03 и 0,71 + 0,05), а на пятые сутки (2,16 + 0,07) ие отличается (Р>0,05) от интактного контроля (1,72 ± 0,05). Общее количество гепатоцитов, количество ядер и ядрышек, их суммарный объём, отмечаемые у омапшченных животных на 1 сутки, в оперированном ко1ггроле достигают аналогичного уровня только к 5 суткам после операции (табл.2). В условиях воздействия импульсного магнитного поля после проведения частичной гепатэктомии были выявлены коррелятивные взаимоотношения между уровнем развития регенерационных процессов в ткани печени и иннервирующих ее" нейроцитах чувствительных ганглиев.В спинномозговых узлах нижнегрудного отдела (Th 5 - Th 13) и 11 дистальном ганглии блуждающего нерва в условиях регенерации нормальной печени так же отмечается стабилизирующий и стимулирующий эффект ИМП. Общее количество нейроцитов у животных, подвергавшихся магнитному воздействию, не снижается в течение всего эксперимента, в отличии от оперированного контроля, где гибель вейропов прогрессирует. Нейроны с тяжелыми формами дегенеративных и деструктивных изменений встречаются в незначительном количестве. Гиперхромныс клетки в СМУ и нейроны с тотальным хроматолизом в ДГ БН только единичные. Нейроциты с реактивными и обратимыми дистрофическими изменениями встречаются в 2-2,5 раза реже, чем у неомагниченных животных: 25 - 30% против 55 - 60%. В СМУ это, в основном, нейроны с эктопией ядра: 25 - 27%. В ДГ БН - нейроны с хроматолизом: 22%, преимущественно с центральным, а эктопия ядра и ядрышка наблюдается не чаще, чем в интактном контроле, что ещб раз подтверждает предположение о повреждении отростков нейроцитов сшшальных ганглиев при частичной гепатэктомии в большей степени, чем у нейронов ДГ БН. В тоже время, значительная доля клеток с центральным хроматолизом в узловатом ганглии, сохраняющаяся в течение всего эксперимента, указывает на высокое функциональное напряжение этих нейронов, что, возможно, связано с некоторым перераспределением функциональной нагрузки между нейроцитами СМУ и ДГ БН в связи с различной степенью их повреждения. При стимуляции импульсным магнитным полем темпы восстаповительных процессов в чувствительных ганглиях значительно быстрее, чем при спонтанной pcreiiepainm после частичной гепатэктомии. На 5 сутки в СМУ животных, прошедших курс магнитотерапии, количество нейропов с эктопией ядра снижается в 2 - 3 раза (5 - 8%) по сравнению с 1 сутками (15 - 16%) и в 5 - 8 раз меньше, чем в оперированном контроле (34 - 41%), что свидетельствует об интенсивно протекающих процессах регенерации периферических нервных элементов в ткани печени. Большинство нейронов (70 - 76%) ДГ БН и СМУ омагпиченных животных имеют нормальную структуру, а на 5 сутки их количество (80 - 82%) приближается к интактному контролю. В оперированном контроле таких клеток значительно меньше: 40 - 60% (ряс. 1). Во всех исследуемых ганглиях существенно увеличивается средний объем нейроцитов: до 0,8 - 1,0 усл.ед. по сравнению с иптактным (0,6 - 0,7 усл. ед.) и оперированным контролем (0,55 - 0,6 усл. ед.) и их ядер: 0,26 - 031 усл. ед. против 0,15 ОД усл. ед. в интактпом контроле, 0,13-0,18 усл. ед. в оперированном контроле (рис.3), что по-видимому связано с интенсификацией биосинтетических процессов и может рассматриваться как проявление регенерационной гипертрофии нейроцитов в условиях стимуляции регенерации поврежденной печени. Особенности функциопальпо-приспособительпой и компепсаторной перестройки чувствительных нейроцитов в условиях регенерации нормальной печени обусловлены морфофункциопальной гетерогенностью клеток. Большие нейроны, обладающие большей функциональной активностью при увеличении нагрузки, связанной с воздействием повреждающего фактора на иянервируемые ткани, изнашиваются быстрее, а затем гиб1гут. Популяция средних и мелких нейронов является тем резервом, который берет на себя функцию атрофировавшихся клеток. При достаточном трофическом обеспечении в условиях стимуляции ИМП происходит активация биосиптетических процессов, вследствии чего увеличивается функциональный объём перикариопа и клетки переходят в разряд больших. Резкий подъем количества ядер с несколькими ядрышками: до 24- 27% (в норме 9-13 %) также подтверждает усиление функциональной активности чувствительных нейронов при магнитном воздействии. Причём в ДГ БН такое увеличение (до 24%) отмечается уже на 1 сутки и сохраняется в течение всего эксперимента: около 20% (в оперироваппом контроле подъема нет). А в СМУ увеличите числа нейронов с несколькими ядрышками (до 25 - 27%) наблюдается на 5, сутки (в контроле меньше: до 20 - 21% - на 1 сутки), что позволяет предполагать, что в СМУ экспериментальных животных это уже второй подъём, 12 а первый прошел pauee 24 часов и поэтому не зафиксирован, тем более, что гипертрофия нейронов отмечается уже на I сутки. Появление в структуре СМУ и ДГ БН двуядершлх нейронов, не характерных для интактных животных, так же укачивает на активную компенсаторную реакцию чувствительных нейроцитов в условиях магнитного воздействия после частичной гепатэктомии. Электромагнитные поля малой напряжённости способны вызывать значительные биологические эффекты, свидетельствующие о наличии в биологических объектах систем, реагирующих резонансным образом. (Аристархов, В.М.,1978, Торопдев, И.В., 1982, Барсукова, Л.П.,1983, Девятков, Н.Д.,1986, Шихляровз, Л.И.,1989, Пирузян, Л.Л.,1991, Алексеева, Н.Т., 1996, Путилина, М.В.,1996, Рудин, М.В.,1998, Карнаухова, Н.А., 2000, Calvo, A.C., 1999, Kawakubo, Т., 1999). Экспериментально показана возможность воздействия ИМП индукцией 100 мТл частотой 10 Гц на контуры управления различными звеньями метаболических процессов, имеющих колебательный характер. Установлено стимулирующее действие 11МП на пролнфератив1гую активность гепатоцитов нормальной и патологически измененной печени, связанное с синхронизацией и активацией синтетических и обменных процессов в клетках: сиптез белка, ДНК, гликогена, активация мембранных, рецепторов, ферментов (Садовникова, В.В.,1983-1992, Ottani, V., 1997; Sieron, A.,1997). Различные звенья нервной системы обладают высокой чувствительностью к магнитным полям. (Холодов, Ю.А.,1971, 82; Артюхипа, Н.И.,1988, Меркулова, Л.М., 1990, Белоусова, Т.Е., 1991, Садовникова, В.В., 1992, Алексеева, Н.Т., 1993, 1996, Путилина, MB., 1996, Calvo, A.C., 1999) Используемые в эксперименте биотропные параметры импульсного магнитного поля приближаются по своей характеристике к низкочастотным метаболическим биоритмам клеток. С точки зрения системных представлений, клетку можно рассматривать как гомеостатическую систему, включающую в себя различные контуры регуляции процессами энергетики, трофики, специфических функций и др. Деятельность каждого контура управления, а следовательно метаболического процесса, имеет свой биоритм, которые под влиянием внешних ритмических воздействий могут в определенном диапазоне частот изменяется - трансформироваться или усиливаться (Бродский, В Л., 1973, Крыжановский, Г.Н., 1973, Саркисов, Я . С , 1975, Кондратова, М.Н, 1987 , Авсеенко, Н.В., 1989, Кудрявцева, М.В., 1990). При воздействии импульсного магнитного ноля возможен эффект его усвоения и >силения контурами управления нарушенного при частичной гепатэктомии метаболизма, с последующей нормализацией жизнедеятельности. Возможность при магнитотсрапии оказывать воздействие как на печень, так и на чувствительные ганглии, позволяет влиять на каждый из взаимосвязанных элементов в единой структурно функциональной системе, что способствует более эффективному восстановлению их структуры. Афферентное звено нервной системы в условиях воздействия четыреххлористым углеродом. В печени крыс, длительно получавших CCI4, развиваются выраженные изменения деструктивного и воспалительного характера, проявляющиеся в дискомплексации печеночных балок, белковой и жировой дистрофии гепатоцитов, очаговыми некрозами и круглоклеточной инфильтрацией паренхимы. Количество дистофически изменённых гепатоцитов увеличивается в 4-5 раз по сравнению с интактным контролем (табл.3). Соответственно уменьшается доля клеток, имеющих нормальную структуру. Достоверно снижается общее количество гепатоцитов, ядер, ядрышек и их суммарный объем (табл.3). Увеличивается средний объем гепатоцитов при сохранении среднего объёма ядер в пределах интактных значений, что возможно связано с отёчными явлениями. Почти в 2 раза возрастает по сравнению с интактным контролем суммарная площадь просвета 13 синусоидных капилляров (табл.3), что совместно с признаками стаза и агрегации форменных элемешов крови свидетельствует о нарушении микроциркуляции и застойных явлениях в органе. Таблица 3 Морфометрические показатели паренхимы печени, изменённой введением СС14 (X+-SX) ИМП-1 - воздействие на проекцию печени; ИМП-2 - воздействие на проекцию СМУ Примечание: а - достоверные различия по сравнению с группой, получавшей ССЦ (Р<0,05) b - достоверные различия по сравнению с группой интактных животных (Р<0,05) При электронно-микроскопическом исследовании выявленное повреждение энергетических и пластических компонентов клетки. Большинство митохондрий набухшие с частично или полностью лизированпыми кристами, некоторые разрушены полностью. Отмечается очаговое расширение канальцев ЭПР. Уменьшается количество рибосом и гранул гликогена. В цитоплазме некоторых гепатоцитов встречаются крупные вакуоли и многочисленные жировые капли. Увеличивается число вторичных лизосом. В ядрах гепатоцитов уменьшено количество хроматина. В единичных случаях происходит разрыв ядерной оболочки и выход ядерного вещества в цитоплазму. В условиях экспериментального поражения печени четыреххлористым углеродом наблюдается активация процессов ПОЛ. Токсическое действие CCL» обусловлено свободными радикалами (CR), образующимися при участии цитохромов. Инициированное CR усиление ПОЛ и чрезмерное накопление продуктов липопероксидации ведёт к изменению биофизических свойств и ферментативных функций мембран, в следствии чего нарушается морфофункциональиая целостность мембранных улътраструктур клеток печени. Повреждение ЭПР сопровождается деградацией полирибосом и угнетением синтеза белка, инактивацией микросомальной системы гидроксилирования и ингибированием транспорта кальция, что приводит к жировой инфильтрации и белковой дистрофии гепатоцитов. Лабилизация мембран митохондрий и лизосом является причиной разобщения окислительного фосфорилирования, угнетения дыхалня, высвобождения и активации аутолитических ферментов. Перечислены нарушения, возникаюпще в результате усиления ПОЛ, приводят к глубоким расстройствам фуикций и гибели клетки (Барабой.ВЛ., 2001;Kuppusamy,P.,1994;Majno,G.,1995). Анализ состояния НОЛ в ткани печени после длительного введения СС14 показал значительное увеличение количества продуктов липопероксидации по сравнению с группой интактных жиивотных (табл.4). Уровень диеновых коныогагов вырос до 424,48+- 14 38,81 нмоль/мг против 231,54+-37.0 нмоль/ мг, основания Шиффа - до 28,75+- 3,06 усл.ед. против 17, 38+-0.66 усл.ед., что свидетельствует о глубоком повреждении мембраниых структур клеток органа. Таблица 4 Содержание продуктов липопероксидации в ткани пенсии, изменённой введением CCL«, в условиях стимуляции регенереции импульсным магпитпым полем * - достоверные различия по сравнению с группой, не подвергавшейся омапшчиванию после воздействия ССЦ (Р<0,05) С другой стороны, активация ПОЛ является существенным фактором инициации репаративной регенерации печени (Пашков^ Н.,1998; AUen,R.G., 1998; Kishino,T.,1998). Предполагается, что свободные радикалы являются химическими стимулами, избирательно действующими па вапилоидные рецепторы афферентных волокон в ипиервируемых тканях (Schullz,H.D.,1998), благодаря чему способны модулировать Са2+ - проводимость через связашше с пими катионные капалы. Важным следствием входа Са2+ и индуцированных им вторичных ионных токов является выделение пейропептидов из периферических отростков афферентных нейронов СМУ и ДГ БН, осуществляющих регуляцию трофики окружающих ткапей (Золотарев,В.А., 2001;Lcu, L, 1996,1998). В зависимости от интенсивпости воздействия па рецепторный аппарат активируется или угнетается секреция нейропептидов «воспаления» (субстанции Р, нейрокинина А, кальцитопин ген родственного пептида) и нейропептидов «репарации» (галанила, допорфина, лейэнкефалина, ВИЛ), что обеспечивает участие первичных афферентов в реакциях нервной системы па состояния, сопровождающиеся продукцией свободпых радикалов. В условиях токсического поражения печени СС14 во всех исследуемых ганглиях развиваются неспецифические реактинно-дистрофичсскис изменения нейроцитов, аналогичные таковым после частичной гепатэктомии. Количество дистрофически измененных нейронов у экспериментальных животных возрастает по сравнению с интактным контролем в 3-4 раза, а отдельных ганглиях и в 5 раз, что составляет в среднем около 53-63% клеток. В спинномозговых узлах наибольшую долю составляют пейроны с эктопией ядра: 30-40%, в большинстве случаев сопровождаемой и эктопией ядрышка. В дистальном ганглии блуждающего нерва преобладают нейроциты с выраженным хроматолизом: до 40%, причем преимущественно с центральным. Соответственно, почти в 2 раза меньше в ДГ БН нейронов с эксцентричным расположением ядра: 18-20%, а СМУ - с хроматолизом: 15-25%. Наличие пгаерхромных и сморщепиых нейронов во всех ганглиях свидетельствует о выключении этих клеток из афферентной импульсации, возможпо в связи с пекротическими изменениями, деструкцией и гибелью инпервируемых ими гепатоцитов при токсическом повреждении печени CCL*. Причем в СМУ их число достигает в среднем 7-15%, а в ДГ БН - около 1%, что также указывает на большую повреждепиость спинальпых ганглиев. Развитие дегенеративных процессов, ведущих к гибели части нервных клеток, подтверждает значительное снижепие суммарного объема и общего количества нейроцитов: в ДГ БИ - в среднем на 19%, в СМУ- на 14-18% (в отдельных узлах до 26%). Характерно некоторое уменьшение среднего объема нейронов и их ядер (особенпо в СМУ 15 Th8-ThlO), что по-видимому связанно с преимущественным выпадением больших нейроцитов и выживанием популяции мелких. Изучение улътраструктуры чувствительных нейронов в условиях воздействия CCL» выявило изменения реактивно-приспособительного, дистрофического и деструктивного характера, касающиеся в основном энергетического аппарата и белоксинтелирующих компонентов клетки. Изменения митохондрий носят, в основном, стереотипный характер и проявляются в набухании, просветлении матрикса, частичном или полном разрушении крист, повреждении наружной мембраны.- Отдельные . органеллы подвергаются вакуолизации и «миелиновой дегенерации». Резко выражепо повреждение ЭПР, причем в большой степени в нейроцитах ДГ БН. Канальца его расширены, значительная часть их вакуолизированна, что приводит к образованию в цитоплазме множества пузырьков и щелевидных просветлений. Расположение рибосом на мембранах ГЭР неравномерно, число свободных рибосом снижено. Истощение энергетических ресурсов нейроцитов связано с высоким функциональным напряжением клеток, направленном на восстановление повреждений, вызванпых воздействием CCl4 Количество и размеры гранул липофусцина, напротив, заметно увеличиваются, что свидетельствует о изнашивании и физиологическом «старении» клеток. Повреждение ядерного аппарата в отдельных клетках выражается в вымывании хроматина, лизисе кариоплазмы и ядрышка, расширении межмембранного пространного и разрыве ядерной оболочки, что приводит к глубоким необратимым изменениям таких нейронов и их гибели. Наряду с деструктивными явлениями выявлены изменения компенсаторного характера. Об активизации ядра и повышении белоксинтезирующий функции нейроцитов свидетельствует значительное увеличение: почти в 2 раза- количества ядер, содержащих два и более ядрышек, причем наиболее выражен этот процесс в нейронах дпеталыюго ганглия БН (до 26% клеток). На ультраструктурном уровне отмечается инвагинация ядерной оболочки с образованием впячиванием, увеличивающих ее поверхность, концентрация органелл в околоядерной зоне, сближение митохондрий с цистернами ГЭР и комплекса Гольджи. Увеличите числа вторичных лизосом и набухание отдельных цистерн комплекса Гольджи указывают на повышение уровня обмена веществ, возможно, в результате гиперфункции чувствительных нейронов. Анализ полученных данных показывает, что в процесс повреждения ткани печени четыреххлористым углеродом вовлекаются чувствительные нейроны узловатого ганглия блуждающего нерва и епшшомозговых узлон пижнегрудного отдела Th5-Thl3, о чем свидетельствует значительные изменения нейроцитов реактивного и деструктивного характера на клеточном и ультраструктурпом уровнях. Однотипность разнонаправленных процессов, протекающих в измененной CCL» ткани печени и чувствительных ганглиях, включающих дистрофические и дегенеративные изменения с одпой стороны и компепсаторновосстановительные - с другой, предполагает наличие коррелятивных связей между этими звеньями единой структурно-функциональной системы. Влияние импульсного магнитного поля на реларативные процессы в печепи и иннервирующие ее чувствительные ганглии, изменённые введением четыреххлористого углерода.. Обратимость изменений в ткани печени и иннервирующих ее чувствительных ганглиях, вызванных введением CCL*, исследовали в условиях воздействия ИМП на область проекции печени на вентральной поверхности тела (1 экспериментальная группа) и область проекции спинномозговых узлов грудного отдела на дорсальной поверхности (2 экспериментальная группа). Для выявления роли афферентного звена нервной системы в реализации стимулирующего действия ИМП и регуляции репаративной регенерации изучали коррелятивные взаимоотношения между морфо-функциональным состоянием чувствительных нейронов исследуемых ганглиев и структурой изменённой 16 четырёххлористым углеродом ткани печени. Стимулирующее влияние НМЛ осуществлялось как прямым воздействием, так и рефлекторпо, что вызывает взаимовлияющис и взаимообусловливающие процессы в тканях исследуемых органов. Установлено, что ИМП стимулирует восстановительные процессы пс только в измененной введением CCL4 ткани печепи (Садовникова,В.В., 1983-1992), но и во всех исследуемых ганглиях. Стабилизируется структура узлов, в два - три раза уменьшается количество дистрофически измененных нейроцитов: до 15-30% клеток. Соответственно увеличивается количество клеток, имеющих нормальную структуру: 70-80%, что приближается к нормальным значениям (около85%). Тяжелые дегенеративные изменения встречаются лишь в единичных случаях, снижается гибель нейронов, до 5-10% (Р < 0, 05), что можно рассматривать как следствие Внутриклеточной регенерации в пейроцитах экспериментальных животных. Электрономикроскопически выявлены явления гиперплазии и гипертрофии ультраструктур. Увеличивается количество канальцев ЭПР, рибосом, полисом, митохондрий, цистерн комплекса Гольджи. Тотальная реакция мембранных компонентов свидетельствует об их участии в метаболических перестройках, происходящих в клетках. Деструктивные изменения, вызванные воздействием CCL4 в условиях стимуляции ИМП существенно уменьшаются. У отдельных животных еще присутствуют незначительная вакуолизация и фрагментация ЭПР, гипертрофия митохондрий с просветлением матрикса и частичпым разрушением крист, по очевидна тенденция к нормализации ультраструктурных компонентов. Особенно это проявляется у животных при воздействии на дорсальную поверхность тела. Значительно увеличено количество митохондрий имеющих нормальную структуру. Часто они группируются в большом количестве вместе с комплексом Гольджи вблизи ядерной оболочки, имеющей характерные впячивания, увеличивающие ее поверхность, что является проявлением формирования сложных ядерпо-цптошшменных взаимоотношений. Ядрышки (два и более) также занимают эксцентричное положение, что свидетельствует об активации ядра и функций клетки в целом. Обращает внимание существенное развитие гранулярного ЭПР со множеством рибосом. Цитоплазма таких нейроцитов имеет хорошо выраженную хроматофильную субстанцию, глыбки которой интенсивно окрашены и равномерно распределены. Явления центрального и других видов хроматолиза, выявленные при воздействии CCL4: от15 до 40%, у животных данной экспериментальной группы встречаются в пределах интактных значений (в 8% клеток; Р< 0,05). Увеличение числа ядер, содержащих два и более ядрышек: 15-20% (в норме 6-13%) подтверждает высокую активность биосинтетических процессов в условиях стимуляции ИМП. Как следствие активации энергетических и синтетических процессов можно рассматривать увеличение суммарного и среднего объема тел и ядер нейронов. Характерно, что в условиях воздействия CCL4 средпий объем нейронов чувствительных ганглиев достоверно снижается до 0,5- 0,6 усл.ед. (у шггактных животных: 0,7-0,8 услед.). Рядом авторов высказывалось предположение о предпочтительном выживании популяции мелких клеток и гибели больших, как наиболее функционально активных (ЯрыгинД1.Е.,1973; Бородаевская,Г.И.,1976; Крюков,М.А.,1990). В наших исследованиях выявлено, что при стимуляции регенерации ИМП во всех исследуемых ганглиях средний объем нейронов достоверно возрастает по сравнению с контролем: в первой группе - до нормальных значений (0,7- 0.,8 усл.ед.); во второй группе - превосходит их (0,8-0,9 усл.ед.). Таким образом, наблюдается переход нейроцитов из мелких в разряд средних и больших клеток, что можно рассматривать как специфическую форму регенерационпой гипертрофии афферентных нейронов, способствующую повышению их функциональной активности и компенсирующую утрату части клеток. Известно, что нарушение целостности периферических отростков нервных клеток вызывает различные дегенеративные изменения, в том числе резкую эктопию ядер нейронов (Ярыгип,Н.Е.,1973; Бородаевская,Г.И.,1976; Крюков,М.А.,1990). Наши исследования структуры афферентных ганглиев после частичной гепатэктомии 17 подтверждаю эти данные. Аналогичные изменения выявлепы в условиях воздействия CCL4, особенно в нейронах спинальных ганглиев. У 38-39% клеток СМУ ядра и ядрышки занимают резко эксцентричное положение по отношению к мембране. После курса магнитотерапии этот процесс значительно уменьшается: до 10-20% и у некоторых животных приближается к нормальным значениям, что позволяет предположить регенерацию поврежденных окончаний и волокон в тканл печепи. В ходе наших исследований установлено, что различия в активности репаративных процессов в ткани печени при разных методах воздействия ИМП (на дорсальную и вентральную поверхности тела) имеют еще более выраженный характер, чем в ганглиях (табл.3). Четырех процедур магнитотерапии на область проекции печени оказалось недостаточно для восстановления нормальной структуры органа. Активпость пролиферативных процессов незначительна. Число двуядерных и общее количество гепатоцитов не превышают' аналогичные показатели в контроле. Уровень дистрофических изменений остается высоким: 59% клеток от общего количества гепатоцитов (у «неомагаиченных» животных после длительного введения СС14 - 86%). В основном это клетки в состоянии белковой и жировой дистрофии. Балочная структура восстановлена частично. У многих животных сохранились очаги инфильтрации стромы печени круглоклеточными элементами. Деструктивные процессы в значительной степени затрагивают ультраструктуру органа. Большинство митохондрий гипертрофированы, с просветленным матриксом и частично или полностью разрушенными кристами. Сеть канальцев ЭПР слабо развита. Во многих клетках канальцы ЭПР расширены и вакуолизированы. Такие же изменения в структуре комплекса Гольджи. Количество рибосом увеличилось незначительно. Цитоплазма бедна гликогеном. Число лизосом и гранул липофусцина, напротив, сохраняется на высоком уровне, что говорит об изношенности и старении клеток. Тем не менее, положительный эффект стимулирующего действия ИМП имеет место и при данном методе воздействия. Достоверно увеличивается количество гепатоцитов, имеющих нормальную структуру: до 41% (в контроле-14%, Р<0,05). На ультраструктурном уровне компенсация функций поврежденных и разрушенных клеток- и их органелл происходит путем гипертрофии структур: расширения канальцев и увеличения площади поверхности мембран ЭПР, гипертрофии митохондрий, вакуолизации цистерн комплекса Гольджи. На клеточном уровне наблюдается увеличение среднего объема гепатоцитов (табл.3), что также можно рассматривать как проявление компенсаторной гипертрофии. До интактных значений снижается суммарная площадь просвета сипусоидов в ткани"печени (табл.3), что говорит о тенденции к нормализации микроциркулящш органа. У животных второй экспериментальной группы восстановление структуры, поврежденной введением CCL4 ткани печепи имеет более выраженный характер. О высокой активности пролиферативных процессов говорит увеличение общего количества гепатоцитов до уровня интактпых значений, Р>0,1 (табл.3). Обращает на себя внимание резкое (в 4-6 раз) увеличение числа двуядерных гепатоцитов по сравнению с «неомагниченным» контролем и первой экспериментальной группой (табл.3). У большинства животных восстанавливается балочная структура ткани печени. Уменьшаются явления белковой и жировой дистрофии. Очаги некрозов и инфильтрации стромы круглоклеточными элементами - единичные. Количество клеток, имеющих нормальную структуру возрастает до 58% (табл.3). Деструктивные повреждения ультраструктуры незначительны. Коэффициент нормализации паренхимы печеип (Кпг/Кдг) у животных 2 группы в 2 раза выше, чем в 1 группе и в 8 раз - чем у «неомалшчешюго» контроля. Хорошо развит граггулярный ЭПР и энергетический аппарат клеток. Цитоплазма насыщена гранулами гликогепа, свободными рибосомами и полисомами. Резкое увеличение числа ядрышек: до 5-6 в одном ядре свидетельствует о их высокой 18 транскринциошюй активности в процессе внутриклеточной регенерации. Снижается суммарная площадь просвета синусоидов (табл.3), что способствует восстановлению мшфоциркулящш органа. Получеш1ые данные указывают на отчетливую тенденцию к нормализации структуры и функции измененной введением CCL4 ткани печени при воздействии ИМП на дорсальную поверхность тела. О стабилизации морфо-функционалшого состояния мембранных компонентов гепатоцитов в условиях стимуляции ИМП свидетельствует снижение уровня ПОЛ в ткани изменённой введением ССЦ печени (табл.4). Количество диеновых конъюгатов у животных 1 экспериментальной группы уменьшается по сравпению с «неомагниченными»: 424,48^-33,81 нмоль/мг — до 321,48+38,05 нмоль/мг; основания Шиффа - до 22,41+-2,03 усл.ед. против 28,75+-3,06 уел ед. (Р<0,05). Во 2 экспериментальной группе эти же показатели приближаются к значениям иптактпого контроля: ДК - до 293,62+-34,6 нмоль/мг; 0111 - до 19,32+-0,85 усл.ед., соответственно против 231,54+-37,0 нмоль/мг и 17,38+-0,66 усл.ед. (Р>0,05). Достоверное снижение начальных (ДК) и конечных (ОШ) продуктов липопероксидации в ткани печени, изменённой введением CCL4, в условиях стимуляции импульсным магнитным полем подтверждает тенденцию к нормализации морфо-функционального состояния ткали печени у «омалгачеппых» животных, причбм более выраженную во 2 экспериментальной группе. Возможно, нормализующий эффект ИМП на уровень процессов перекисного окисления в ткани изменеппой четыреххлористым углеродом печени реализуется через влияние на систему антиоксидантной защиты гепатоцитов, обеспечивающую ингибирование ПОЛ (Singh,S.,1999). Таким образом, сравнительный анализ коррелятивных взаимоотношений структуры измененных СС14 ткани печени и чувствительных ганглиев при различных методах воздействия ИМП (на дорсальную и вентральную поверхность тела) выявил большой стимулирующий эффект при омагничивании области СМУ, чем области проекции печени. Возможно, это объясняется как прямым влиянием ИМП на иннервирующие печень нервные центры (СМУ, спинной мозг), так и стимуляцией рефлексогенных зон в соответствующих дерматомерах, масштабы воздействия на которые значительно превышают аналогичное влияние на чувствительные окончания и волокна в ткани печени. Кроме того, полученные данные позволяют предположить, что неврогенный фактор, в частности, афферентное звепо, имеет преобладающее значение в реализации стимулирующего действия ИМП на репаративные процессы в печени. Не вызывает сомнений так же и роль афферентной иннервации в механизмах регуляции регенерации печени в целом. ВЫВОДЫ: 1. На различных моделях регенерирующей печени установлено участие афферентного звена нервной системы: спинномозговых узлов грудного отдела с Th5 по ТЫЗ и дистальпого ганглия блуждающего нерва - в регуляции репаративных процессов, что проявляется в изменениях морфо-функционального состояния нейронов иннервирующих печень чувствительных ганглиев реактивного, дистрофического, адаптивного и компенсаторного характера. 2. Раздражение периферических отростков и нарушение их целостности при различных экспериментальных воздействиях на ткань печени вызывает: с одной стороны - реактивно-дистрофические изменения в чувствительных ганглиях, охватывающие 50%-60% нейронов и приводящие к их массовому выпадению из рефлекторных дуг: при частичной гепатэктомии - в среднем от 16 до 30% (в отдельных ганглиях - до 36%); при воздействии четыреххлористым углеродом - в среднем от 14 до 19% (в некоторых - до 26%); с другой стороны, нарушение афферентной имнулъсации и локальной "эффекторной" функции вызывает .развитие характерных для деафферептироваиного органа процессов 19 воспаления, дедофференцировки, деструкции и пролиферации тканевых элементов: дистрофически изменённые гепатоциты после частичной гепатэктомии составляют в среднем 62%, снижается общее число гепатоцитов при одновременном появлении митотически делящихся (МИ:10,61+0,01%0) и увеличении (на 75%) количества двуядерных. 3. На ранних этапах регенерации печени после частичной гепатэктомии и воздействия четыреххлористым углеродом в чувствительных нейроцитах исследуемых ганглиев развиваются стереотипные реактивные изменения, характер и степень выраженности которых варьируют в широких пределах: от первичного раздражения с эктопией ядра и распылением хроматофильной субстанции (в среднем: 40 - 50% клеток) до глубоких необратимых форм таких как: гидропическая дистрофия, кариоттаюз, кариоцитолиз и нейронофагия (от 1 до 10% клеток), что свидетельствует о сложной морфо функциональной перестройке компонентов нервной ткани на клеточном и ультраструктурном уровнях. 4. Выраженный полиморфизм чувствительных нейроцитов в условиях репаративной регенирации печени показывает различное функциональное состояние этих клеток. Высокая функциональная' активность нейронов, сопровождаемая интенсивным потреблением рибонуклеопротеидов, проявляется в-различных формах хроматолиза. Гиперфункция отдельных нейронов приводит к чрезмерному перенапряжению с истощением энергетических и пластических ресурсов и преждевременному «изнашиванию» клеток. Тотальный лизис хроматофильной субстанции у таких нейронов связан с деградацией гранулярного ЭПР, вакуолизацией и фрагментацией его канальцев, сокращение числа рибосом, деструктивными изменениями митохондриального аппарата. Гиперхроматоз и сморщивание нейронов, обусловленные дегидротацией цитоплазмы, ослаблением белкового синтеза и накоплением липофусцина - являются проявлениями «глубокого торможения» всех физиологических процессов в клетке. Нарушение целостности рецепторного аппарата и проводимости связанных с ним ионных каналов проявляется в отёке перикариона , эктопии ядра, набухании митохондрий, с последующей гидропической дегенерацией и осмотическим лизисом нейроцитов. Длительное состояние чрезмерного перенапряжения, так же как и продолжительная дефункционализация нейронов с выключением синтетической и секреторно-трофической функции приводят к необратимым дегенеративным изменениям и элиминации части клеток. 5. После часшчиои генапшомии и воздействия четыреххлористым углеродом в спинномозговых узлах наибольшую долю: 30-40% - составляют нейроциты с эктопией ядра и ядрышка, а в дисталыюм ганглии блуждающего нерва преобладают нейроны с хроматолизом: 40-50%, преимущественно с центральным. Гиперхромные клетки также чаще встречаются в спинальных ганглиях: от 3 до 15%, тогда как в дистальном ганглии блуждающего нерва их не более 2%. В связи с большей степенью нарушения отростков и нейроцитов спинальных ганглиев наблюдается перераспределение функциональной нагрузки и трофического влияния между различными участками афферентной иннервации с возрастанием функционального напряжения нейроцитов дистального ганглия блуждающего нерва. 6. В условиях репаративной регенерации печени после частичной гепатэктомии отмечается зависимость форм и степени выраженности морфо-функциональных изменений нейроцитов спинномозговых узлов от уровня их расположения. Дистрофические и дегенеративные изменения охватывают большее число левосторонних сегмептов: с Th5 по ТЫЗ, чем правосторонних: с Th7 по ТЫ2, с максимальным проявлением в S: с Th5 по Thll;BD:cTh7noThlO. 7. Особенности адаптивно-приспособительной и компенсаторной перестройки чувствительных нейронов в условиях репаративной регенерации печени обусловлены морфо-функциональной гетерогенностью клеток. При увеличении функциональной нагрузки происходит преимущественное выпадение больших нейронов, обладающих 20 сравнительно большей физиологической активностью. Усиление транскрипционной, белоксинтезирующей, секреторной активности нейроцитов шгациирует внутриклеточную регенерацию, проявляющуюся в гипертрофии и гиперплазии органелл клетки, в следствии чего увеличивается функциональный и средний объем перикариона. В результате перехода находившихся в резерве мелких и средних нейроцитов в разряд больших происходит компенсация функции утраченных клеток, что можно рассматривать как специфическую форму регенерационной гипертрофии нейронов чувствительных ганглиев. 8. Им1гульсное магнитное поле оказывает стабилизирующее и стимулирующее действие на структуру и функцию чувствительных нейронов изучаемых ганглиев в условиях репаративной регеперации печени. В 2-3 раза снижается уровень дистрофических и деструктивных процессов: 15-30% по сравнению с «неомагниченным» контролем: 5060%, Р<0.05.Элиминация нейронов уменьшается до 5-10% у животных, подвергавшихся воздействию четьгреххлористым углеродом, а после частичной гепатэктомии — отсутствует. Нормализуется структура у 70-80% нейроцитов в результате активно протекающих процессов внутриклеточной регенерации, сопровождаемой гипертрофией и гиперплазией клеточных органелл, обусловленных интенсификацией транскрипционной и белоксинтетической активности клетки. 9. Рефлекторное влияние импульсного магнитного поля на изменённую четыреххлористым углеродом ткань печени через иннервирующие орган нервные центры: грудной отдел спинного мозга и спиннальные ганглии, а также рецепторный аппарат рефлексогенных зон соответствующих дерматомеров, оказало более выраженный стимулирующий эффект на регенерационные процессы, чем прямое воздействие непосредственно на проекцию самой печени. Нормализуется общее количество и средний объём гепатоцитов при резком увеличении: в 4 раза - числа двуядерных геиатоцитов; в 2 раза - коэффициента нормализации паренхимы (Кнг/Кдг); на 39% - количества ядрышек. 10. В условиях воздействия четыреххлористым углеродом в ткани печени наблюдается активация свободно-радикальных процессов с увеличением уровня начальных и конечных продуктов липопероксидации: диеновых конъюгатов - до 424,48*33,81 нмоль/мг; оспования Шиффа - до 28,75±3,06 уел ед. по сравнению с группой шггактных животных: 231,54±37,0 пмоль/мг и 17,38±0,66 усл.сд. соответственно (Р<0,05). При стимуляции регенерации импульсным магнитным полем происходит уменьшение активности перскисного окисления липидов в ткани печени, причбм с большей тендепцией к нормализации при омагничивалии дорсальной поверхности тела (уровень диеновых конъюгатов снижается до 293,62±34,б пмоль/мг, основания Шиффа - до 19,32±0,85 усл.сд.), чем вентральной поверхности ( диеновых конъюгатов - 321,48±38,05 нмоль/мг, основания Шиффа - 22,41±2,03 усл.ед., Р<0,05), что связано со стабилизирующим действием импульсного магнитного ноля на мембранные структуры клетки и активацией системы антярадикальной защиты. ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ Анализ полученных результатов и сопоставление их с литературными данными позволили приблизиться к пониманию механизмов участия афферентного звена нервной системы в регуляции процессов репаративной регенерации печени. Выявленные закономерности могут служить теоретическим обоснованием при разработке новых эффективных методов и способов регенерационной терапии путем воздействия на чувствительные нейроны и их окончания. Возможно также использование получепных данных в экспериментальной биологии, медицине и ветеринарии для моделирования регенерационных процессов в тканях повреждённых органов (в частности, в чувствительных ганглиях и печени) путём прямого п рефлекторного воздействия на афферентное звено нервной системы. Материалы, представленные в диссертации могут быть использованы при чтении лекций, проведении практических и семинарских занятий по общей биологии; цитологии и 21 гистологии; физиологии человека и животных для студентов биологических, медицинских и ветеринарных специальностей. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ. 1. Лобко, 3. Г*. Влияние стимуляции регенерации печени на перекисное окисление литщдов. /3. Г. Лобко // Материалы обл. научно-мстод. конф. «НИРС - путь к высокой професс. подготовке». - Н.Новгород, 1990. - С. 47 - 48. 2. Лобко, 3. Г.* Содержание диеновых конъюгатов в печени крыс в условиях стимуляции регенерации. 13. Г. Лобко // Тез. докл. конф. молодых ученых в честь 70-летия ГМИ.-Н.Новгород, 1991. - С. 32. 3. Садовникова, В.В. Стимуляция пролиферации гепатоцитов нормальной и патологически измененной печени воздействием импульсного магнитного поля./В.В. Садовникова, 3. Г. Лобко*, И. В. Садовникова // Бюл. экспер. биол. и мед. - 1993 - T.CXV, №3. - С. 295 -297. 4. Садовникова, В.В. Корреляция структурных изменений ганглиев солнечного сплетения и печени при репаративных процессах. /В.В. Садовникова, А. Г. Гретен, 3. Г. Лобко*, И. В. Садовникова // Журнал Российские морфологические ведомости. - М. 1994.№4.-С. 6 0 - 6 1 . 5. Регенерация патологически измененной печени и нервпая регуляция пролиферативных процсссов./В. В. Садовпикова, Н. Л. Иванова, 3. Г. Лобко* и др //Морфология.- 1994.-Т. 105.-№9-10. - С. 145. 6. Лобко, 3. Г*. Реактивные изменения нейроцитов спинно-мозговых ганглиев. / 3. Г. Лобко*, В. В. Садовникова, Н. Л. Иванова // Матер, научн. конф. "Структурная организация органов и тканей в норме, патологии, эксперименте." - Тверь, 1996. - С. 102. 7Лобко, 3. Г*. Роль афферентного звена первной системы в регуляции репарации печени. / 3. Г. Лобко // Тез. докл. I Всерос. конф. студ. и аспирантов мед. вузов и НИИ России. - С. Петербург, 1998. - С. 70 - 71. 8. Лобко, 3. Г*. Нейрогенная регуляция репаративного процесса в патологически измененной печепи. / 3. Г. Лобко*, В.В. Садовникова, Л. Г. Третей, // Морфология. - 1998. - Т . 113,№3.-С. 72. 9.Нейрогенные механизмы репаративных процессов в патологически измененной печени. /В.В. Садовпикова, Л. Г. Грстсн, 3. Г. Лобко* и др. // Журнал Российские морфологические ведомости. -1999. - № 1-2, раздел 2. - С. 128. 10. Садовникова, В.В. Системные механизмы в патогенезе экспериментального токсического гепатита. /В.В. Садовникова, А. Г. Гретен, Н. А. Бобылёва, 3. Г. Душкова // Структурные преобразования органов и тканей па этапах онтогенеза в норме и при воздействии антропогенных факторов. - Астрахань, 2000. — С. 139. 11. Душкова, З.Г. Влияние ИМП на структуру чувствительных ганглиев при стимуляции регенерации патологически измененной печени. / 3. Г. Душкова, В.В. Садовникова, Е. М. Смирнова. //Вестник 11НГУ, сер. Биология. - 2003. - вып. 1 (6). - С. 32 36. 6 12. Пат. №2123867 РФ МКИ . Способ нормализации структуры спинно-мозговых ганглиев грудных сепиентов. / Садовникова В.В, Лобко 3. Г*, Иванова Н.Л. - № 96116654/14 (022822); Заявлено 13.08.96; Опубл. 27.12.1998. 22 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ, ПРИНЯТЫХ В РАБОТЕ СМУ - спинномозговой узел ДГ БН - дистальный ганглий блуждающего нерва D - dexter (правый) S - sinister (левый) ИМП - импульсное магнитное поле мТл - индукция импульсного магнитного поля в миллитеслах АМИТ - аппарат магнитноимпульсной терапии CCL» - четыреххлористый углерод НГ - нормальные гепатоциты ДГ -дистрофически изменённые гепатоциты К - количество структур (клеток, ядер и др.) Р - суммарный объем Р/К - средний объём структур МИ - митотический индекс НГ/ДГ—коэффициент нормализации паренхимы печени ПОЛ *- перекисное окисление липидов ДК - диеновые конъюгаты ОШ - основание Шиффа НН - нормальные нейроны ДН - дистрофически измененные нейроны Подписано в печать 12.05.2004. Усл. печ. л. 1,5 Тираж 100 экз. Заказ 150 Нижегородская государственная сельскохозяйственная академия 603107, г. Н. Новгород, пр. Гагарина, 97 Типография НГСХА
