RIDASCREEN® Influenza A IgA, IgG - R

RIDASCREEN® Diphtherie IgG
Код: K3821
1. Предназначение набора
Для диагностики in vitro. Набор RIDASCREEN® Diphtherie IgG это
иммуноферментный тест для количественного определения IgG антител к
дифтерийному анатоксину в сыворотке человека.
Тест может быть использован для уточнения иммунного статуса.
2. Общая информация и пояснения к тесту
Благодаря тому, что строго соблюдается вакцинирование малышей, дифтерия
сейчас – довольно редкое заболевание. После прививки дифтерийным
анатоксином, начинается выработка специфических антител, как ответная
реакция иммунной системы. Иммунологические методы позволяют определять
эти антитела в сыворотке крови. Анатоксин обладает такими же антигенными
свойствами, как и бактериальный токсин, но без токсического эффекта. Поэтому
можно определить и титры пост-вакцинальных IgG, и иммуноглобулинов,
появившихся после выздоровления. Сопоставимость измеренных значений
достигается за счёт их корректирования по международным единицам.
3. Принцип теста
Дифтерийный анатоксин наносится на микролунки плашки.
Антитела,
присутствующие в образце сыворотки пациента, связываются с антигенами и
выявляются во время второй инкубации, при помощи меченных ферментом античеловеческих антител (коньюгата). Фермент превращает бесцветный субстрат
(H2O2/TMB) в конечный продукт голубого цвета.
Ферментная реакция
останавливается при добавлении серной кислоты, при этом цвет реакционной
смеси меняется из голубого в жёлтый. Окончательное измерение проводится на
плашечном фотометре при длине волны 450 нм с референсным 620 нм.
2
RIDASCREEN® Diphtherie 11-05-05
4. Поставляемые реагенты
Таблица 1: Состав набора (Компонентов набора достаточно для выполнения 96
определений)
96 лунок
Plate
SeroPP
110 мл
SeroWP
100 мл
Микротитровальная плашка; 12 микролуночных стрипов
(разборных) в стрип-холдере; сорбированные антигеном
дифтерийного анатоксина
Буфер для образцов, готовый к работе; Фосфатно-буферный
раствор NaCl, жёлтого цвета
Буфер для промывки, 10-х концентрат; трис-буферный раствор
NaCl
Control IgG │+
зелёная крышка
2.5 мл
Стандартный контроль IgG, готовый к работе; разбавленная
сыворотка человека; зелёного цвета
Control IgG │
бесцветная крышка
1.2 мл
Отрицательный контроль IgG, готовый к работе; разбавленная
сыворотка человека
Control IgG │A
зелёная крышка
1.2 мл
Контроль А IgG, готовый к работе; разбавленная сыворотка
человека
Control IgG │B
зелёная крышка
1.2 мл
Контроль В IgG, готовый к работе; разбавленная сыворотка
человека
SeroG HD
зелёная крышка
12 мл
Коньюгат анти-человеческих IgG (кроличьих), готов к работе;
антитела, коньюгированные пероксидазой в стабилизированном
белковом растворе
12 мл
Субстрат;
Н2О2/тетраметилбензидин, готовый к работе
SeroSC
SeroStop
12 мл
Стоп-реагент;
0.5 М серная кислота, готовая к работе
Сведения об опасных веществах в соответствии с требованиями к маркировке.
Для получения дополнительной информации см. сведения о безопасности
материалов (MSDS) на веб-сайте www.r-biopharm.com.
5. Инструкции по хранению
Набор должен храниться при 2 – 8 °C и может быть использован после
открывания до истечения срока годности, указанного на этикетке. Растворённый
промывочный буфер должен быть использован в течение 4 недель, при условии,
что хранится при 2 - 8°C или в течение одной недели, если хранится при
комнатной температуре 20 – 25 °C .Гарантия качества не сохраняется после
окончания срока годности.
RIDASCREEN® Diphtherie 11-05-05
3
Упаковка из фольги, в которой находятся микроплашки, должна быть открыта
таким образом, чтобы не повредился закрывающий зажим. Неиспользованные
микролунки надо сразу же вернуть назад в эту упаковку, и они должны храниться
в этой упаковке при 2 - 8 °C .
Не следует допускать контаминации реагентов, а бесцветный хромоген должен
быть защищён от попадания прямого света
6. Материалы необходимые, но не поставляемые
6.1. Реагенты
дистиллированная или деионизованная вода
6.2. Дополнительные материалы
Инкубатор на 37 °C
- Тестовые пробирки
Вортекс-миксер
Микропипетки на объёмы 10-100 μл и 100-1000 μл
Мерный цилиндр (1000 мл)
Таймер
Плашечный промыватель или многоканальная пипетка
Плашечный считыватель (450 нм, референсная длина волны 600 нм)
Фильтровальная бумага (лабораторные полотенца)
Контейнер для отходов с 0.5 % раствором гипохлорита
7. Предупреждения для пользователей
Только для диагностики in vitro.
Данный тест должен выполняться только обученным лабораторным персоналом.
Необходимо соблюдать рекомендации по методам работы в медицинских
лабораториях. Необходимо соблюдать руководство с инструкциями по процедуре
теста. Не допускайте попадания проб или реагентов в рот. Избегайте контакта с
поврежденной кожей или слизистыми оболочками. Во время работы с реагентами
либо пробами надевайте соответствующие средства защиты (перчатки,
лабораторный халат, защитные очки) и мойте руки после завершения процедуры
теста. Не курите, не ешьте и не пейте в зонах, где ведется работа с пробами или
реагентами.
Для получения дополнительной информации см. сведения о безопасности
материалов
(MSDS) на веб-сайте www.r-biopharm.com.
Контрольные сыворотки, (положительный и отрицательный контроли), входящие в
состав набора, были протестированы на ВИЧ- и ВГС-Aт, а так же на HbsAg и
показали отрицательные результаты.
Но, тем не менее, с ними следует обращаться, как с потенциально
инфекционным материалом, т.е. так же, как с образцами пациентов, и соблюдать
все меры предосторожности, согласно местным правилам по работе с
инфекционными материалами.
4
RIDASCREEN® Diphtherie 11-05-05
Все использованные реагенты и материалы должны утилизироваться
надлежащим образом. Для получения дополнительной информации об
утилизации см. соответствующие национальные требования.
8. Сбор и хранение образцов
Данный тест разработан для тестирования образцов сыворотки крови. После
взятия крови, сыворотку необходимо как можно скорее отделить от сгустка, во
избежание гемолиза. До тестирования образцы можно хранить в холоде или
замороженными. Ни в коем случае не допускаются повторные оттаивания и
замораживания образцов и микробная контаминация. Использование образцов
инактивированных нагреванием, или с признаками липемии, гемолиза,
желтушности или мутности, может привести к ложным результатам.
Taблица 1: Хранение образцов
Неразбавленная сыворотка
Разбавленная сыворотка
2 – 8 °C
–20 °C
2 – 8 °C
1 неделя
> 1 недели
7 часов
9. Ход работы
9.1. Общая информация
Все реагенты и микролунки перед работой следует довести до комнатной
температуры (20 – 25 °C). Стрипы с микролунками должны находиться в упаковке
из фольги, пока не дойдут до комнатной температуры и только после этого их
можно извлечь из упаковки. Перед использованием тщательно перемешайте
реагенты. По окончании работы набор необходимо немедленно поместить в
холодильник и хранить при 2 - 8 °C.
Отберите только необходимый для работы объём реагентов. Во избежание
контаминации, не возвращайте оставшийся объём реагентов назад во флаконы.
Микролунки могут быть использованы только один раз. Нельзя использовать
реагенты и стрипы, если упаковка повреждена или произошла утечка реагентов из
флаконов.
Не все реагенты данного набора лот-специфичные. Реагенты с этикеткой Sero
(например, SeroPP) можно использовать с другими реагентами линии
RIDASCREEN® Sero ELISA.
Контрольные сыворотки лот-специфичны. Их нельзя использовать с
наборами других серий.
RIDASCREEN® Sero ELISA контроли A и B поставляются как дополнительные
компоненты к соответствующим наборам
RIDASCREEN® Sero ELISA. Эти
контроли предназначены для повышения контроля качества и могут быть
использованы по необходимости. В них содержится контрольная сыворотка
человека с различными концентрациями антител.
RIDASCREEN® Diphtherie 11-05-05
5
9.2. Подготовка промывочного буфера
1 часть концентрированного буфера SeroWP разводится в 9 частях
дистиллированной воды. Чтобы получить рабочий раствор, внесите 100 мл
концентрированного промывочного буфера в мерный цилиндр на 1000 мл и
доведите дистиллированной водой до конечного объёма 1000 мл. Если в
концентрированном растворе присутствуют кристаллы, их надо растворить
(например, нагревая на водяной бане при 37 °C). Разбавленный буфер должен
быть использован в течение 4 недель, при условии, что хранится при 2 – 8 °C, или
в течение одной недели, если хранится при комнатной температуре 20 – 25 °C)
9.3. Подготовка образцов
Перед началом тестирования образцы сыворотки следует разбавить буфером для
образцов SeroPP в соотношении 1:100, например:
10 μл сыворотки + 990 μл SeroPP
Внимание:
Отрицательный контроль, стандартный контроль, контроль качества А и
контроль качества В готовы к работе и их НЕ НАДО разбавлять или
адсорбировать.
9.4. Первая инкубация
Вставьте необходимое для исследования количество лунок в рамку, внесите по
100 μл разбавленных сывороток и по 100 μл готовых к работе контролей в
соответствующие лунки, оставив лунку А1 пустой (бланк реагента).
Отрицательный контроль - Control IgG │- вносится в синглетах, а стандартные
контроли – Control IgG │+ - вносятся в дублях. Контроль качества Control │A и
Control │B добавляются один раз. Накройте плашку и инкубируйте 30 минут при
температуре 37 °C в инкубаторе. Во время инкубации, дно плашки не должно
соприкасаться с горячими поверхностями теплопроводника (меллические полки
инкубатора или влажная бумага).
Микроплашка должна быть обязательно накрыта во время инкубации.
A1 Бланк реагента
B1 Отрицательный контроль
C1 Стандартный контроль
D1 Стандартный контроль
E1 Контроль качества А
F1 Контроль качества В
G1, Н1 Образец сыворотки пациента 1 и 2, и т.д.
Внимание:
Плашки с микролунками нельзя помещать в холодный инкубатор и
доводить до 37 °C во время инкубации. Температура инкубатора должна
быть доведена до 37 °C заблаговременно.
6
RIDASCREEN® Diphtherie 11-05-05
9.5. Промывка
Содержимое лунок сливается в контейнер для отходов, содержащий раствор
гипохлорита натрия, для обеззараживания. После чего, следует промакнуть
плашку на фильтровальной бумаге для полного удаления жидкости. Затем
плашку отмывают 4 раза, каждый раз заполняя лунки 300 μл промывочного
буфера. Убедитесь, что лунки не содержат остатков жидкости, для этого после
каждой промывки просушите их на чистой фильтровальной бумаге или
лабораторном полотенце.
Если используется плашечный промыватель, подберите правильный
протокол промывки для типа используемой плашки. После промывки
промакните плашку на фильтровальной бумаге, чтобы полностью удалить
остатки влаги.
9.6. Вторая инкубация
Внесите по 100 μл Коньюгат анти-человеческих IgG HD
SeroG HD в
соответствующие лунки (включая A1). Затем накройте плашки и инкубируйте при
37 °C 30 минут в инкубаторе (см. п. 9.4).
9.7. Промывка
Промойте плашку 4 раза, как описано в п. 9.5.
9.8. Третья инкубация
Внесите в каждую лунку по 100 μл субстрата SeroSC. Накройте плашку и
оставьте на 30-ти минутную инкубацию при температуре 37 °C в инкубаторе.
Затем остановите реакцию, добавив по 100 μл стоп реагента SeroStop в каждую
лунку. После чего аккуратно встряхните плашку для перемешивания реагентов и
учтите абсорбцию образцов на плашечном фотометре при длине волны 450 нм
(референсный фильтр 600 nm). Откалибруйте по бланку реагента (позиция А1) в
качестве нуля.
Внимание:
Перед учётом результатов, необходимо промакнуть дно микролунок, чтобы
удалить образовавшийся конденсат.
10. Контроль качества – признаки нестабильности или порчи реагентов
Для контроля качества, стандартные контроли (в дублях) и отрицательные
контроли должны использоваться при каждом тестировании. Тестирование
считается выполненным правильно, если средняя абсорбция стандартных
контролей при 450/620 нм вписывается в пределы, указанные в приложенной
спецификации.
RIDASCREEN® Diphtherie 11-05-05
7
Если два из индивидуальных измерений отличаются от среднего значения более,
чем на 20 %, тестирование необходимо повторить. Абсорбция отрицательного
контроля при 450/620 нм должна быть < 0.3.
RIDASCREEN® Sero ELISA контроли A и B используются, как дополнительные
контроли для проведения контроля качества и могут применяться по усмотрению.
Целевые значения установлены в прилагаемом, лот-специфичном сертификате
гарантии качества. Полученные значения
(Ед/мл, МЕд/мл или mМЕд/мл)
рекомендованы, как референсные значения для обеспечения качества в
аккредитованных лабораториях.
Если эти значения отличаются от рекомендуемых, если хромоген мутный или
становится голубым до внесения в лунки, это может означать, что реагенты
испорчены.
Если не получены предусмотренные значения, то
тестированием необходимо проверить следующие моменты:
перед
повторным
Срок годности используемых реагентов
Работоспособность используемого оборудования (например, калибровка)
Правильность хода работы
Визуальная проверка компонентов набора на отсутствие контаминации или
протекания реагентов – раствор хромогена, который стал голубым, нельзя
использовать для тестирования.
Если и после повторного тестирования с соблюдением всех выше перечисленных
условий, результаты не удовлетворяют требованиям, пожалуйста, свяжитесь с
Вашим местным представителем R-Biopharm.
11. Оценка и интерпретация результатов
Результаты тестирования можно учитывать тремя разными способами:
1. Используя стандартный график, прилагаемый к набору
2. Используя таблицу значений (см. спецификации, прилагаемые к набору)
3. Математически, используя 4-параметровый метод или метод
Значение абсорбции бланка реагентов должно быть вычтено из всех
измеренных значений, перед тем, как приступить к расчетам.
11.1. Учёт результатов по стандартному графику, прилагаемому к набору
Чтобы провести расчёт результатов по стандартному графику, сначала
необходимо сделать поправку на среднее значение стандартного контроля, для
того чтобы принять во внимание возможные отклонения, происходящие изо дня в
день. Корректирующий фактор рассчитывается из реально полученного среднего
значения стандартного контроля и его идеального (целевого) значения, которое
зависит от лота и указано в спецификациях.
8
RIDASCREEN® Diphtherie 11-05-05
F=
Целевое (идеальное) значение контрольного стандарта
Среднее рассчитанное значение реального контрольного стандарта
Все полученные значения ОП необходимо умножить на этот фактор F. Затем,
принимая во внимание эти скорректированные значения, по стандартному
графику определяют соответствующие величины Ед/мл.
11.2. Учёт результатов по таблице значений
МЕд/мл
Предел значений для стандартного контроля
0.77 -
0.81
Рисунок 1: Пример (Фрагмент лот-зависимой спецификации)
Абсорбция стандартного контроля используется для определения в данной
таблице колонки с пределами значений, соответствующими проводящемуся
измерению. Полученная абсорбция образца подставляется в подходящие
пределы значений и – далее – соответствующий титр в МЕд/мл определяется во
второй колонке слева.
Например, абсорбция стандартного контроля для конкретного измерения
получилась 0.81. В этом случае, для определения результатов, используется
колонка таблицы значений с показаниями 0.77 - 0.81. Образец пациента с
абсорбцией 0.41, таким образом, соответствует титрам 0.50 - 0.99 МЕд/мл. (Эти
значения приведены только в качестве примера и могут отличаться от данных,
приведённых в листе спецификаций).
11.3. Математическая оценка результатов
Значения, необходимые для математической оценки результатов по 4параметровому методу или методу, вписаны в прилагаемых спецификациях.
Внимание:
RIDASCREEN® Diphtherie 11-05-05
9
При расчёте по альфа методу, получаются очень высоки значения в МЕд по
фактору 100, необходимому для правильного подсчёта. Поэтому, чтобы получить
истинное значение в МЕд, необходимо поделить конечный результат на 100.
Этого требуют математические условия альфа метода.
11.4 Результаты
Таблица 3: Оценка полученных единиц
МЕд/мл
<0.1
0.1-0.9
1.0-1.4
1.5-2.0
>2.0
Рекомендации по вакцинации
Основная иммунизация
Бустерная прививка
Бустерная прививка через 5 лет
Бустерная прививка через 7 лет
Бустерная прививка через 10 лет
12. Ограничения метода
Данные, приведенные в п. 11.4, основаны на публикации Pietsch, от 1993 г. Автор
приходит к выводу, что иммунная защита может быть обеспечена уже при титре
0.1 МЕд/мл, но достаточной она становится, начиная с титра 1.0 МЕд/мл. При
титрах, меньших, чем 0.1 МЕд/мл, следует провести основную (базовую)
иммунизацию.
13. Технические характеристики
Таблица 4: Межлабораторное отклонение (n = 5)
Межлабораторное
отклонение
ОП
КВ
Сыворотка 1
0.427
6.1%
Сыворотка 2
0.917
6.8%
Сыворотка 3
2.003
6.7%
Таблица 5 Внутрилабораторное отклонение (n = 24)
Внутрилабораторное
отклонение
ОП
КВ
Сыворотка 1
0.433
6.0%
Сыворотка 2
0.958
6.4%
Сыворотка 3
2.105
4.8%
10 RIDASCREEN® Diphtherie 11-05-05
Таблица 6: Сравнение результатов с двумя другими коммерческими ИФА
наборами
RIDASCREEN®
Тесты
сравнения
МЕд/мл
<0.1
0.1-0. 9
<0.1
27
2
0.1-0.9
6
29
1.0-1.4
1.0-1.4
1.5-2.0
>2.0
4
1.5-2.0
2
>2.0
8
Таблица 7: Распределение в 200 образцах сыворотки от доноров крови,
полученных в Донорском Центре в Германии
МЕд/мл
<0.1
0.1-0.9
1.0-1.4
1.5-2.0
>2.0
Рекомендации по вакцинации
Основная иммунизация
Бустерная прививка
Бустерная прививка через 5 лет
Бустерная прививка через 7лет
Бустерная прививка через 10 лет
Распределение
59.9%
25.0 %
6.6%
3.8%
4.7%
Список литературы
1. Naumann, P. und Nemes, G. (1982). Die Diphtherie und ihre aktuelle Bedeutung.
Deutsches Arzteblatt 51/52, pp. 21-28
2. Naumann, P., Hagedorn, H.-J., Paatz, R. (1983), Diphtherie-Immunitat und ihre
epidemiologische Bedeutung. Dtsch. med. Wschr. 108, pp. 1090-1096
3. Naumann, P., Paatz, R., und Thomas, L., Diphtherie-Adsorbat-Impfstoff fur
Erwachsene: Immunologische Wirksamkeit. Die gelben Hefte XXIV (1984), pp. 109-115
4. Thilo, W., Farchim, F., Hоlzer, E., Winkler, C., Sowa, W. und Kilias, F., Serologische
Immunita gegen Diphtherie 1986. Z. Klin. Med. 42 (1987) Heft 20, pp. 1807-1808
5. Krech, T., Naumann, P., Wittelburger, Ch., Reinicke, H.H, Retgen, B., Jungnitz, Be.,
RIDASCREEN® Diphtherie 11-05-05
11
Watermann, R. (1987), Die Diphtherie, eine Importkrankheit. Dtsch. med. Wschr. 112,
pp. 541-544
6. Alexander, M. und Raettig, H.J., Infektionskrankheiten. Thieme Verlag Stuttgart, New
York (1987)
7. Brandis, H., Pulverer, G., Lehrbuch der Medizinischen Mikrobiologie. Gustav Fischer
Verlag Stuttgart, New York (1988), 6th edition
8. Naumann, P. und Weber, H.G.: Diphtherie Immunitаt bei Schulanfangern und nach
Wiederimpfung mit d-Impfstoff. Dtsch. med.Wschr., 117, 1308-1312, 1992
9. Pietsch, M., Impfserologie zur Erganzung von Impfungen. Der Allgemeinarzt, 18,
1993
10. Pietsch, M., et al., Immunitatslucken gegen Diphtheri
12 RIDASCREEN® Diphtherie 11-05-05