ridascreen - R

RIDASCREEN® Leishmania Ab
Код.: K7121
R-Biopharm AG, An der neuen Bergstraße 17, D-64297 Darmstadt, Germany
Tel.: +49 6151 8102-0 / Telefax: +49 6151 8102-20
1. Предназначение набора
Для диагностики in vitro. Набор RIDASCREEN® Leishmania Ab это
иммуноферментный тест для качественного определения специфических IgG
антител к Leishmania infantum в сыворотке человека.
Тест может быть использован с подтверждающей целью, в случаях подозрения
на лейшманиоз или для уточнения иммунного статуса.
2. Общая информация и пояснения к тесту
После инфицирования лейшманией, как результат ответа иммунной системы
начинают вырабатываться специфические антитела к этому патогену. Эти
антитела можно определить в сыворотке человека, применяя иммунологические
методы. Метод тестирования и выбор патогенспецифического антигена очень
важны для правильного подбора теста.
3. Принцип теста
Очищенные антигены наносятся на микролунки. Антитела, присутствующие в
образце сыворотки пациента, связываются с этими антигенами и выявляются во
время второй инкубации, при помощи меченного ферментом анти-человеческих
антител (коньюгата). Фермент превращает бесцветный субстрат (пероксид
мочевины/TMB) в конечный продукт голубого цвета.
Ферментная реакция
останавливается при добавлении серной кислоты, при этом цвет реакционной
смеси меняется из голубого в жёлтый. Окончательное измерение проводится на
плашечном фотометре при длине волны 450 нм с референсным ≥ 620 нм.
RIDASCREEN® Leishmania Ab 2014-02-14
2
4. Поставляемые реагенты
Компонентов набора достаточно для выполнения 96 определений
Plate
96 лунок
Микротитровальная плашка; 12 микролуночных
стрипов (разборных) в стрип-холдере;
сорбированных антигеном Leishmania infantum
Diluent
100 мл
Буфер для образцов, Фосфатно-буферный
раствор NaCl, готовый к работе; жёлтого цвета
Буфер для промывки, 10-х концентрат; трисбуферный раствор NaCl
SeroWP
Control│+
IgG положительный контроль, сыворотка
человека
красная крышка
1.2 мл
Control│бесцветная крышка
2.5 мл
Conjugate
оранжевая крышка
12 мл
SeroSC
12 мл
Субстрат;
Н2О2/тетраметилбензидин, готовый к работе
SeroStop
12 мл
Стоп-реагент;
0.5 М серная кислота, готовая к работе
IgG отрицательный контроль, сыворотка
человека
Коньюгат анти-человеческих IgG, готов к
работе; Коньюгировнный пероксидазой
Протеин А, в стабилизированном белковом
растворе
Сведения об опасных веществах в соответствии с требованиями к маркировке. Для
получения дополнительной информации см. сведения о безопасности материалов
(MSDS) на веб-сайте www.r-biopharm.com.
5. Инструкции по хранению
Набор должен храниться при 2 – 8 °C и может быть использован после
открывания до истечения срока годности, указанного на этикетке. Растворённый
промывочный буфер должен быть использован в течение 4 недель, при условии, что
хранится при 2 - 8°C. Гарантия качества не сохраняется после окончания срока
годности.
Упаковка из фольги, в которой находятся микроплашки, должна быть открыта таким
образом, чтобы не повредился закрывающий зажим. Неиспользованные микролунки
надо сразу же вернуть назад в эту упаковку, и они должны храниться в этой упаковке
при 2 - 8 °C .
Не следует допускать контаминации реагентов, а бесцветный субстрат должен быть
защищён от попадания прямого света.
RIDASCREEN® Leishmania Ab 2014-02-14
3
6. Материалы необходимые, но не поставляемые
6.1. Реагенты
дистиллированная или деионизованная вода
6.2. Дополнительные материалы
- Тестовые пробирки
- Вортекс-миксер
- Микропипетки на объёмы 10-100 µл и 100-1000 µл
- Мерный цилиндр (1000 мл)
- Таймер
- Плашечный промыватель или многоканальная пипетка
- Плашечный считыватель (450 нм, референсная длина волны 600 нм)
- Фильтровальная бумага (лабораторные полотенца)
- Контейнер для отходов с 0.5 % раствором гипохлорита
7. Предупреждения для пользователей
Только для диагностики in vitro.
Данный тест должен выполняться только обученным лабораторным персоналом.
Необходимо соблюдать рекомендации по методам работы в медицинских
лабораториях. Необходимо соблюдать руководство с инструкциями по процедуре
теста. Не допускайте попадания проб или реагентов в рот. Избегайте контакта с
поврежденной кожей или слизистыми оболочками. Во время работы с реагентами либо
пробами надевайте соответствующие средства защиты (перчатки, лабораторный
халат, защитные очки) и мойте руки после завершения процедуры теста. Не курите, не
ешьте и не пейте в зонах, где ведется работа с пробами или реагентами.
Для получения дополнительной информации см. сведения о безопасности материалов
(MSDS) на веб-сайте www.r-biopharm.com.
Контрольные сыворотки, (положительный и отрицательный контроли), входящие в
состав набора, были протестированы на ВИЧ- и ВГС-Aт, а так же на HbsAg и показали
отрицательные результаты. Но, тем не менее, с ними следует обращаться, как с
потенциально инфекционным материалом, т.е. так же, как с образцами пациентов, и
соблюдать все меры предосторожности, согласно местным правилам по работе с
инфекционными материалами.
Все использованные реагенты и материалы должны утилизироваться надлежащим
образом. Для получения дополнительной информации об утилизации см.
соответствующие национальные требования.
RIDASCREEN® Leishmania Ab 2014-02-14
4
8. Сбор и хранение образцов
Данный тест можно применять для образцов сыворотки крови. После взятия
крови, сыворотку необходимо как можно скорее отделить от сгустка, во избежание
гемолиза. До тестирования образцы можно хранить в холоде или замороженными.
Ни в коем случае не допускаются повторные оттаивания и замораживания образцов
и
микробная контаминация. Использование образцов, инактивированных
нагреванием, или с признаками липемии, гемолиза, желтушности или мутности,
может привести к ложным результатам.
Taблица 1: Хранение образцов
Неразбавленная сыворотка
2 – 8 °C
1 неделя
–20 °C
> 1 недели
Разбавленная сыворотка
2 – 8 °C
7 часов
9. Ход работы
9.1. Общая информация
Все реагенты и микролунки перед работой следует довести до комнатной
температуры (20 – 25 °C). Стрипы с микролунками должны находиться в упаковке
из фольги, пока не дойдут до комнатной температуры и только после этого их
можно извлечь из упаковки. Перед использованием тщательно перемешайте
реагенты. По окончании работы набор необходимо немедленно поместить в
холодильник и хранить при 2 - 8 °C.
Отберите только необходимый для работы объём реагентов. Во избежание
контаминации, не возвращайте оставшийся объём реагентов назад во флаконы.
Микролунки могут быть использованы только один раз. Нельзя использовать
реагенты и стрипы, если упаковка повреждена или произошла утечка реагентов из
флаконов.
Промывочный буфер, буфер для образцов и субстрат не зависят от серии набора;
их можно использовать с другими реагентами линии RIDASCREEN® ELISA для
определения антител к паразитам.
9.2. Подготовка промывочного буфера
1 часть концентрированного буфера для промывки разводится в 9 частях
дистиллированной воды. Чтобы получить рабочий раствор, внесите 100 мл
концентрированного промывочного буфера в мерный цилиндр на 1000 мл и
доведите дистиллированной водой до конечного объёма 1000 мл.
Если в
концентрированном растворе присутствуют кристаллы, их надо растворить
(например, нагревая на водяной бане при 37 °C). Разбавленный буфер должен
быть использован в течение 4 недель, при условии, что хранится при 2 – 8 °C.
RIDASCREEN® Leishmania Ab 2014-02-14
5
9.3. Подготовка образцов
Перед началом тестирования образцы сыворотки следует разбавить буфером для
образцов Diluent в соотношении 1:50, например:
10 µл сыворотки + 490 µл Diluent
Внимани:
Отрицательный контроль и положительный контроль готовы к работе и
их не надо разбавлять.
9.4. Первая инкубация
Вставьте необходимое для исследования количество лунок в рамку, внесите по
100 µл разбавленных сывороток и по 100 µл готовых к работе контролей
Control│- и Control│+ в соответствующие лунки и инкубируйте 15 минут при
комнатной температуре (20 - 25 °C). Мы рекомендуем ставить отрицательный
контроль Control│- в дублях.
9.5. Промывка
Содержимое лунок следует слить в контейнер для отходов
с раствором
гипохлорита натрия,
для обеззараживания.
После чего, следует промакнуть
плашку на фильтровальной бумаге для полного удаления жидкости. Затем
плашку отмывают 5 раз, каждый раз заполняя лунки 300 µл промывочного
буфера. Убедитесь, что лунки не содержат остатков жидкости, для этого после
каждой промывки просушите их на чистой фильтровальной бумаге или
лабораторном полотенце.
Если используется плашечный промыватель, подберите правильный протокол
промывки для типа используемой плашки. После промывки промакните плашку
на фильтровальной бумаге, чтобы полностью удалить остатки влаг.
9.6. Вторая инкубация
Внесите по 100 µл коньюгата анти-человеческих IgG Conjugate , в каждую лунку.
Затем инкубируйте плашку 15 минут при комнатной температуре (20-25 °C).
9.7. Промывка
Промойте плашку 5 раз, как описано в п. 9.5.
9.8. Третья инкубация
Внесите в каждую лунку по 100 µл субстрата SeroSC и инкубируйте 15 минут при
комнатной температуре (20 - 25 °C). Затем остановите реакцию, добавив по 50 µл
стоп реагента SeroStop в каждую лунку. После чего аккуратно встряхните плашку
для перемешивания реагентов и учтите абсорбцию образцов на плашечном
фотометре при длине волны 450 нм (референсный фильтр 620 nm). Откалибруйте
ноль по воздуху.
RIDASCREEN® Leishmania Ab 2014-02-14
6
10. Контроль качества
реагентов
–
признаки
нестабильности
или
порчи
Для контроля качества, положительный контроль и отрицательные контроли (в
дублях) должны использоваться при каждом тестировании. Тестирование считается
выполненным правильно, если
абсорбция отрицательного контроля при 450 нм
меньше 0.3. Если каждое из двух индивидуальных измерений отличаются от
среднего значения более, чем на 25 %, тестирование необходимо повторить.
Экстинкция положительного контроля при 450 нм должна быть выше
0.8.
Если эти значения отличаются от рекомендуемых, если субстрат мутный или
становится голубым до внесения в лунки, это может означать, что реагенты
испорчены.
Если
не
получены
предусмотренные значения,
то
тестированием необходимо проверить следующие моменты:
-
перед
повторным
Срок годности используемых реагентов
Работоспособность используемого оборудования (например, калибровка)
Правильность хода работы
Визуальная проверка компонентов набора на отсутствие контаминации или
протекания реагентов – раствор субстрата, который стал голубым, нельзя
использовать для тестирования
Если и после повторного тестирования с соблюдением всех выше перечисленных
условий, результаты не удовлетворяют требованиям, пожалуйста, свяжитесь с
Вашим местным представителем R-Biopharm.
11. Оценка и интерпретация результатов
11.1. Расчёт индекса образца
1. Рассчитайте среднее значение абсорбции отрицательного контроля.
2. Добавьте к полученному среднему значению абсорбции 0.150. Это и будет cut- off
для данного теста.
3. Индекс образца получают при делении абсорбции образца на cut-off.
Например:
Отрицательный контроль 1
Отрицательный контроль 2
Образец
ОП = 0.115
ОП = 0.125
ОП = 0.508
cut-off = 0.115 + 0.125 + 0.150 = 0.270
2
Индекс образца =
0.508 = 1.88
0.270
RIDASCREEN® Leishmania Ab 2014-02-14
7
11.2. Результаты теста
Таблица 2: Оценка индекса образца
отрицательный
Индекс образца
< 0.9
сомнительный положительный
0.9 – 1.1
> 1.1
12. Ограничения метода
RIDASCREEN® Leishmania Ab ELISA улавливает IgG антитела к Leishmania infantum.
Тестирование следует выполнять при подозрении на лейшманиоз. Полученные
результаты всегда должны интерпретироваться на фоне клинической картины и
других диагностических подходов.
Сигнал антител зависит от локализации паразитоза и может отличаться у разных
пациентов.
Сомнительные или слабоположительные результаты можно получить в ниже
перечисленных случаях:
- у лиц, ужаленных инфицированными песчаными мухами (phlebotomae), в регионах,
где это заболевание эндемично, и антитела вырабатываются в низком титре без
манифестных проявлений инфекции
- у лиц, выздоровевших или только что перенёсших инфекцию бессимптомно, но всё
ещё вырабатывающих антитела в низком титре
- у лиц, перенесших заболевание в прошлом, но которые всё ещё вырабатывают
остаточные титры антител
- у лиц находящихся в ранних стадиях заболевания
- из-за неидентифицируемых неспецифических факторов
В таких случаях необходимо повторное тестирование с новым образцом,
принимая при этом во внимание клинические симптомы, и используя другие
диагностические методы. В отсутствии какого-либо точного диагноза, тестирование
надо повторить через две-четыре недели с новым образцом.
Умеренно и высоко положительные результаты могут быть получены у лиц,
страдающих острой формой заболевания или совсем недавно его перенёсшим.
Повышенные титры антител могут быть за счёт того, что они вырабатывались после
длительной инфекции, которая была в прошлом. В неясных случаях результаты
должны интерпретироваться на фоне истории болезни, клинических симптомов и с
использованием других диагностических методов.
Отрицательный результат не всегда позволяет исключить лейшманиоз. На ранних
стадиях инфекции количество антител может быть настолько низким, что результаты
теста оказываются сомнительными или отрицательными. В случае подозрения на
лейшманиоз, основанного на клинической истории, следует выполнить повторное
тестирование нового образца сыворотки через четыре недели.
RIDASCREEN® Leishmania Ab 2014-02-14
8
В нескольких случаях в Южной Америке регистрировалась перекрёстная реакция в
сыворотках с антителами к T. Cruzi (трипаносомоз). Этот факт следует
принимать во внимание при проведении тестирования в ареале Южной Америки, для
которой трипаносомоз является эндемичным заболеванием.
Положительный результат не исключает присутствия другого патогена, как причины
заболевания.
13. Технические характеристики
Таблица 3: Межлабораторное отклонение (n = 5)
Межлабораторное
отклонение
IgG
ОП
КВ
Сыворотка 1
0.225
15.0%
Сыворотка 2
0.451
10.6%
Сыворотка 3
0.927
14.2%
Таблица 4: Внутрилабораторное отклонение (n = 24)
IgG
Внутрилабораторное
отклонение
ОП
КВ
Сыворотка 1
0.133
18.5 %
Сыворотка 2
0.438
10.4 %
Сыворотка 3
0.963
12.1 %
Таблица 5: Сравнение чувствительности и специфичности с двумя другими
коммерческими ИФА наборами
IgG
Чувствительность
87.5 %
Специфичность
88.7 %
RIDASCREEN® Leishmania Ab 2014-02-14
9
Таблица 6: Результаты тестирования образцов сыворотки 200 доноров крови,
полученных в Донорском Центре в Германии
отрицательный
200 сывороток от
доноров крови
89.0 %
RIDASCREEN® Leishmania Ab 2014-02-14
сомнительный
5.5 %
положительный
5.5 %
10
Список литературы
1. Bray, R.S. and Lainson, R., Trans. Roy. Soc. Trop. Med. Hyg., 60, 605-609 (1966).
2. Bray, R.S. and Lainson, R., Trans. Roy. Soc. Trop. Med. Hyg., 61, 490-505 (1967).
3. Bray, R.S., Ecol. Dis., 4, 257-267 (1982).
4. Hommel, M., Peters, W., Ranque, J., Quilici, M. and Lanotte, G., Ann. Trop. Med.
Parasitol., 72, 213-218 (1978).
5. Kager, P.A., Rees, P.H., Wellde, B.T., Hockmeyer, W.T. and Lyerly, W.H., Trans. R.
Soc. Trop. Med. Hyg., 75, 556-559 (1981).
6. Lainson, R., Trans. Roy. Soc. Trop. Med. Hyg., 77, 569-596 (1983).
7. Low-A-Chee, R.M., Rose, P. and Ridley, D.S., Ann. Trop. Med. Parasitol., 77, 255-260
(1986).
8. Ranque, J. and Quilici, M., Journal of Parasitology, 56, 277-278 (1970).
RIDASCREEN® Leishmania Ab 2014-02-14
1
1