Минимальная остаточная болезнь Диагностика с помощью
advertisement
Современные технологии и новые тесты в лабораторной диагностике Биохиммак Минимальная остаточная болезнь Диагностика с помощью проточной цитометрии Е.Е.Зуева Москва 2011 Диагностика опухолевого процесса de novo и в ходе терапии Опухольассоциированные маркеры На поверхностной мембране клетки – морфология, ИГХ, ПЦ Внутри клетки – цитохимия, цитогенетика, FISH, ПЦР, РТ ПЦР В биологических жидкостях Примеры Здоровые De novo МОБ Лейкозассоциированные антигены - + + t(14;18), t(9;22), + + + ПСА, ЛДГ + + - PML-RARa 100% специфичность – в норме отсутствует 100% чувствительность – выявляется у каждого онкологического больного Е.Е.Зуева МОБ. Что это? Стратегия терапии лейкозов • Достижение клинико-гематологической ремиссии • Полная редукция опухолевого клона Специфическое состояние, при котором уровень бластных клеток в костном мозге ниже 5%, но опухолевый клон определяется другими методами описывают термином «минимальная остаточная/резидуальная болезнь» Например Диагноз – В-клеточный хронический лимфоцитарный лейкоз 16.03.2011. Терапия FCR. Направление: МОБ ХЛЛ • Известно: иммунофенотип трансформированных клеток в дебюте CD5+CD19+CD20+HLA-DR+CD23+CD43+CD22+ CD2 2 SS SS CD5 SS CD2 0 CD2 2 CD2 2 CD2 3 CD1 9 CD1 9 SS Гейт CD19+ CD3 CD5 CD5 Плюсы проточной цитометрии диагностики МОБ • Основана на отличии экспрессии антигенов лейкозными бластами и нормальными предшественниками, выявляя субстрат заболевания • Применима практически для всех больных с учетом лейкоз-ассоциированного фенотипа 2010 2009 • Позволяет – Исключать нежизнеспособные клетки (в отличие от молекулярной диагностики) – Получать количественные результаты 2008 • Не требует много времени 0 • Информация доступна для пересмотра 500 МОБ 1000 1500 все случаи Е.Е.Зуева Основные направления выявления МОБ Нозологические группы • ОЛЛ детского возраста • ОМЛ детского возраста • ХЛПЗ В-клеточного происхождения • Множественная миелома • ОЛ взрослых • Нейробластома Биологический материал • Костный мозг • Периферическая кровь • Ликвор Условия выявления МОБ в лаборатории Условия выявления МОБ Выбор биологического материала Направления реализации Костный мозг ОЛ детского и взрослого возраста, ММ, лейкемические формы ХЛПЗ Кровь Ликвор Преаналитика Т-ОЛЛ детского возраста при наличии нейролейкоза в дебюте или рецидиве ОЛ, ДВКЛ температура и время доставки Фенотип бластов в дебюте База данных поддерживается непрерывно с 2000 г. Фенотип клеток предшественников База данных – создается Внутрилабораторные правила работа с литературой СОПы пробоподготовки, сбора и анализа данных цитометрии и интерпретации результатов Е.Е.Зуева Мониторинг нейробластомы CD45negCD56+ 205 056 событий SS SS CD45 SS CD56 SS CD56 CD56 Самые частые проблемы выявления МОБ Направление Причины Клиника Гемодилюция аспирата костного мозга Отсутствие данных о фенотипе дебюта/рецидива Морфология Несовпадение данных из-за дебриса / эритроидных предшественников (окрашивание – лизис - ...) Прибор Отсутствие контрольного материала острого лейкоза и МОБ и программ сопоставления интерпретации результатов Опухоль Индуцированный ХТ или прогрессией опухоли сдвиг экспрессии якорных маркеров и гематогонассоциированных антигенов – CD45, CD19 (MM), CD20 (ХЛПЗ) и др. Костный мозг Присутствие нормальных предшественников на разных этапах ХТ Трудно разделить / отличить друг от друга лейкозные бласты и нормальные клетки предшественники на выходе из терапии – для пациентов с отсутствием аберрантности фенотипа Продолжительность лечения - около двух лет Coustan-Smith, Blood 2006, 108, 97–102. Howard et al., Leukemia 2005, 19, 323–325. Howard, et al. JAMA 2004, 291, 2471–2475. Janossy G. Biotechnol. J. 2008, 3, 32–42 Зачем? Значимость МОБ для жизни Выживаемость Низкий уровень МОБ 91% Высокий уровень МОБ 23% Месяцы после установления диагноза Методы выявления МОБ Пожелания • Возможность применения для основной массы пациентов • Простота стандартизации и получения данных • Воспроизводимость • Точность уровня МОБ Специфичность - для данного пациента Чувствительность – 0-0,1%, т.е. 10-4 ядросодержащих клеток к/м – зависимость результата от клеточности и объема образца (костный мозг, ликвор) Voskova et al. Leukemia & Lymphoma, 2007 Требования высокая специфичность и чувствительность 1) Иммунофенотипирование – выявление трансформированных клеток – субстрат заболевания 2) RT-PCR: генетические транскрипты химерных (fusion) генов - на уровне РНК клональность - на уровне ДНК реарранжировки гена Тклеточного рецептора или В-клеточного рецептора T Szczepan´ ski, Leukemia, 2007 Зачем? Лейкоз – это опухолевая масса Ранний рецидив Поздний рецидив Морфологическая ремиссия Опухолевая масса Предел выявления морфологии Предел выявления FISH Предел выявления проточной цитометрии Предел выявления PCR Диагноз 2 года 5 лет Гетерогенность В-клеток предшественников Cytometry Part B (Clinical Cytometry) 74B:261–271 (2008) Количественное определение МОБ Выявление клеток с аберрантным фенотипом – для интерпретации необходимо 10-20 событий = кластер – для каждой комбинации маркеров - 106 клеток – реально достигаемая чувствительность составляет 1/105 клеток Клетки «Х», % Соотношение нормальных и патологических клеток Доли от целого 1 1 /100 10-2 0,1 1 /1000 10-3 0,01 1/10 000 10-4 0,001 1/100 000 10-5 0,0001 1/1 000 000 10-6 Каждый образец - анализ 107 клеток и больше Количество лейкоцитов приблизительно 10 х 109/л = 10 000 000 000 клеток на литр (1000 мл) 10 000 000 клеток на мл (1000 мкл) 1 000 000 на 100 мкл – объем биологического материала в каждой пробирке ≈ количество анализируемых клеток Нестабильность фенотипа опухолевых клеток Правила независимой прогресси Практика онкогематологии Факты Независимая прогрессия множественных опухолей Лейкозы с гетерогенной популяцией бластов в дебюте Независимый сдвиг экспрессии маркеров каждого клона Прогрессия не зависит от роста опухолей Изменение экспрессии не зависит от размера опухоли Опухоли с первичной резистентностью к ХТ Прогрессия не всегда беспрерывна Изменение экспрессии не зависит от длительности опухолевого процесса Стабильность фенотипа клеток В-ХЛЛ в отсутствие терапии в течение многих лет Возможны разные пути прогрессии для опухолей одного гистотипа Динамика экспрессии маркеров индивидуальна даже в рамках одной нозологии Необходимость учета лейкозассоциированного фенотипа пациента Независимая прогрессия различных признаков опухоли Потеря экспрессии трансмембранных белков Омоложение фенотипа лейкозных бластов Потеря аберрантности экспрессии Е.Е.Зуева Лейкозные клетки попадают в «пустые пространства» гистограмм, где нет нормальных клеток предшественников данной линии гемопоэза SSC CD45 Е.Е.Зуева В-ОЛЛ: В-клетки в пространстве гистограмм TdT/CD10/CD19 Иммунофенотип гематогонов До 15 лет После 15 лет 1. 70% В TdT/CD34/CD10bright/CD19/СD22dim/CD45dim/CD клеток 38bright/CD202. TdT-/CD34/CD10bright/CD19/D22dim/CD45dim/CD38bright/CD20/s Ig 3. CD34-/TdTCD19 CD10 до 70% В- CD19 /CD10/CD19/CD22bright/CD45/CD38/CD20/sIg 2 3 3 1 клеток 2 2 1 3 Tdt 1 TdT CD10 Е.Е.Зуева Маркеры В клеток Субпопуляции В клеток маркер незрел ость транзиторные Т1 Т2 Т3 наивн ые CD27+ В клетки памяти IgD - + ++ ++ ++ + - - CD27 - - - - - + + high CD19 + + + + + + + low CD10 + + +/- -/+ - - - +/- CD24 +++ +++ ++ + + ++ ++ - IgM ++ +++ ++ + + + - - (IL3 R) R123 + + + int - + + + CD38 +++ +++ +++ + + low low high Нет перекл Плазма перекл ючени тическ ючени е ие я клетки Journal of Investigative Dermatology, 2009, N Manjarrez-Ordun ̃o et al. Е.Е.Зуева Мониторинг В-ОЛЛ Основные правила Маркеры Причина Неинформативное гейтирование CD45 CD45-негативные случаи Информативное гейтирование CD19 или CD19+CD34+ или CD10+CD19+CD34+ Якорный линейный маркер Гистограммы клеток предшественников CD19/CD34, CD10/CD20 Градиент созревания Гематогонассоциированные антигены CD10, CD20, CD22, CD29, CD38 и CD58, HLADR Три стадии созревания гематогонов CD13, CD33, CD56 Аберрантность фенотипа опухолевых клеток Лейкоз-ассоциированные антигены Е.Е.Зуева ВII ОЛЛ, нормальные и трансформированные В-клетки предшественники, Д19 Недооценка МОБ на практике Случаи работы в регионе – два случая ОЛЛ детского возраста Отсутствие адекватного спектра антител дебют заболевания - бласты позитивны по CD10, CD20, CD22, CD52, CD58, CD79a и TDT. CD19 определен иммунопероксидазным методом День +15 от начала терапии: диагностические антитела к CD3, CD4, CD8, CD16/56, CD19, CD45 Результат: лимфоциты CD3+=79,4 CD45low=1,2% Заключение популяция патологических клеток не выявлена CD19+= 0,8% Отсутствие фенотипа бластов в дебюте Популяция бластных клеток экспрессирует CD19. Оценка иммунофенотипа бластов затруднена. В пробирке сгусток Заключение популяция патологических клеток не выявлена Е.Е.Зуева В-ХЛПЗ: гистограмма CD5/CD19 для диагностики и мониторинга CD19 1 - нормальные Т-лимфоциты CD5+CD19- CD19 2 - нормальные B-лимфоциты CD5-CD19+ 2 4 3 - трансформированные CD5dim+CD19+ клетки 3 4 - трансформированные CD3 1 CD5 CD5-CD19dim+ клетки В-ХЛЛ, гейт CD19+ CD23 3 CD5 Е.Е.Зуева Мониторинг неходжкинских В-лимфом Основные правила Маркеры Причина Неинформативное гейтирование CD45 Сохранные лимфоциты, моноциты, гранулоциты Информативное гейтирование CD19 Якорный линейный маркер CD19/CD34, CD10/CD20 Градиент созревания Маркеры зрелых В-клеток CD21, CD22, CD23, CD38, CD79, CD81, FMC7 и HLADR Преобладание зрелых В-клеток Лейкоз-ассоциированные антигены CD5+CD23+ (В-ХЛЛ), CD25 и CD103 на В-клетках (ВКЛ) Аберрантность фенотипа опухолевых клеток Гистограммы клеток предшественников Частые проблемы – отсутствие информации о фенотипе клеток в дебюте и/или до начала терапии - замена костного мозга на периферическую кровь (ВХЛЛ) - потеря CD20 в ходе терапии Е.Е.Зуева 15-03-2007 17-04-2008 (3FC+3FCR) CD45 28-05-2009 (3FMD+4Campath) CD45 CD45 CD19 CD19 CD19 CD3 CD3 CD19 CD19 CD3 CD3 CD23 CD23 CD23 CD20 CD20 CD5 CD5 CD5 Е.Е.Зуева Множественная миелома: диагностика и мониторинг SSC SSC Гр Мо лф ? Гр ? Мо лф FSC CD138 CD45 CD38 CD117 CD56 CD19 CD38 CD38 CD38 Е.Е.Зуева Мониторинг множественной миеломы Основные правила Маркеры Причина Неинформативное гейтирование CD45, CD19 Сохранные лимфоциты, моноциты, гранулоциты Информативное гейтирование CD38+CD138+ Плазматические клетки Маркеры сохранных плазматических клеток CD38+CD138+ Отсутствуют CD19, CD20, Маркеры трансформированных плазматических клеток CD10, CD19, CD27, CD40, CD117, CD56, CD45 Нестабильная экспрессия Маркеры негативного прогноза CD45, CD56, CD117, CD28 Аберрантность фенотипа опухолевых клеток CD56, CD117 Е.Е.Зуева 02-09-2008 CD38+CD138+CD117+CD19-CD5606-10-2009 трПК 1,3% CD45negCD38+CD138+CD56+CD117+ 24-11-2009 трПК 1,3% 01-02-2010 трПК 0,45% CD45negCD38+CD138+CD56+CD117+CD19-CD2726-04-2010 трПК 13,1% 31-08-2010 трПК 0,34% 15-12-2010 трПК 5,7% 05-05-2011 трПК 40,0% 06-10-2009 CD45 26-04-2010 SSC SSC CD14 SSC CD138 CD45 CD38 CD45 06-10-2009 CD56 CD56 SSC SSC CD117 CD45 CD19 CD45 Е.Е.Зуева МОБ при ОМЛ • • • Фенотипические отличия лейкозных миелоидных клеток: – Экспрессия маркеров, обычно отсутствующих на миелоидных клетках – Коэкспрессия маркеров, обычно появляющихся на разных стадиях созревания – Изменение уровня экспрессии миелоидных маркеров по сравнению с нормальным – Благодаря фенотипической гетерогенности клетки ОМЛ занимают на гистограмме довольно значительную площадь, в отличие от бластов ОЛЛ, формирующих четкий кластер – Клетки ОМЛ обладают высоким уровнем светорассеяния и аутофлюоресценции, сходными с нормальными аналогами Для бластов при ОМЛ характерна нестабильность антигенного профиля Бласты при ОМЛ не экспрессируют специфические антигены, которые могут без сомнения идентифицировать лейкозные клетки в регенерирующем костном мозге Е.Е.Зуева Мониторинг ОМЛ Основные правила Маркеры Информация для мониторинга Неинформативное гейтирование FS/SS Нестабильность экспрессии SS/CD45, CD45/CD33, CD(33+13) Якорные маркеры гранулопоэза Гистограммы клеток предшественников CD(13+33)/CD34, CD34/CD117, CD15/CD33 Градиент созревания Пролиферирующие гранулоциты CD34+CD33+, CD34/CD117 Информативное гейтирование Созревающие гранулоциты Лейкозассоциированные антигены CD10, CD11, CD13, CD15, CD16, CD32, CD33, CD45, CD64 Маркеры, несоответствующие стадии созревания, CD2, CD19 Градиенты созревания Аберрантность фенотипа опухолевых клеток Е.Е.Зуева De novo 10-02-2011 17 y.o. CD45dim tobright CD4+CD13+CD33+CD34+CD38+CD56+CD117+HLA-DR+ SS SS FS CD4 CD4 CD3 CD56 CD3 CD117 CD45 CD4 CD3 CD56 CD4 CD3 CD33 CD4 CD38 CD4 CD45 CD34 CD34 CD3 CD56 CD4 CD117 CD7 CD4 CD3 CD56 CD34 CD45 FS CD4 CD3 CD56 SS SS CD45 MRD 06-05-2011 CD33 CD34 CD33 CD34 CD4 • ДГБ№1, отд. химиотерапии лейкозов, Э.Г.Бойченко • ГБ№15, отд. гематологии, Е.В.Карягина • ГБ№31, детское отделение, М.Б.Белогурова • НИИ ГиТ, отд.гематологии, В.А.Шуваев • Е.Т.Полякова • О.В.Штапрова • • • • А.В.Куртова Е.Б.Русанова К.Ю.Слободнюк М.В.Горчакова
