մարգարիտա հարությունի դանիելյան даниелян маргарита
реклама
Հ ԱՅ ԱՍ Տ Ա ՆԻ Հ Ա Ն Ր Ա ՊԵ Տ Ո ՒԹ Յ ԱՆ ԳԻ Տ Ո Ւ ԹՅ Ո ՒՆ Ն Ե Ր Ի Ա Զ Գ ԱՅ ԻՆ Ա Կ Ա ԴԵ Մ Ի Ա Հ. ԲՈ Ւ Ն ԻԱ ԹՅ Ա ՆԻ Ա ՆՎ Ա Ն Կ Ե ՆՍ Ա ՔԻ Մ Ի Ա ՅԻ ԻՆ Ս ՏԻ Տ Ո Ւ Տ ՄԱՐԳԱՐԻՏԱ ՀԱՐՈՒԹՅՈՒՆԻ ԴԱՆԻԵԼՅԱՆ ԱՌՆԵՏՆԵՐԻ ՈՒՂԵՂԻ ԲՋՋԱՅԻՆ ԿԱՌՈՒՅՑՆԵՐԻ ՄՈՐՖՈՖՈՒՆԿՑԻՈՆԱԼ ՀԵՏԱԶՈՏՈՒԹՅՈՒՆԸ ԻՄՈԲԻԼԻԶԱՑԻՈՆ ՍԹՐԵՍԻ և ՏԱՈՒՐԻՆԻ ԱԶԴԵՑՈՒԹՅԱՆ ՊԱՅՄԱՆՆԵՐՈՒՄ Գ.00.09 – «Մարդու և կենդանիների ֆիզիոլոգիա» մասնագիտությամբ կենսաբանական գիտությունների թեկնածուի գիտական աստիճանի հայցման ատենախոսության ՍԵՂՄԱԳԻՐ ԵՐԵՎԱՆ – 2013 _________________________________________________________ НАЦИОНАЛЬНАЯ АКАДЕМИЯ НАУК РЕСПУБЛИКИ АРМЕНИЯ ИНСТИТУТ БИОХИМИИ ИМЕНИ Г. БУНЯТЯНА ДАНИЕЛЯН МАРГАРИТА АРУТЮНОВНА МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ КЛЕТОЧНЫХ СТРУКТУР МОЗГА КРЫС В УСЛОВИЯХ ИММОБИЛИЗАЦИОННОГО СТРЕССА И ПОД ВОЗДЕЙСТВИЕМ ТАУРИНА АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.09 - «Физиология человека и животных» ЕРЕВАН – 2013 Ատենախոսության թեման հաստատվել է ՀՀ ԳԱԱ Լ.Ա. Օրբելու անվ. Ֆիզիոլոգիայի ինստիտուտի գիտական խորհրդում: Գիտական ղեկավար` կ.գ.դ., Ի.Բ.Մելիքսեթյան Պաշտոնական ընդդիմախոսներ` կ.գ.դ., պրոֆ. Ջ. Ս. Սարգսյան բ.գ.դ., Ա.Լ.Մինասյան Առաջատար կազմակերպություն` Երևանի Մ. Հերացու անվան պետական բժշկական համալսարան Ատենախոսության պաշտպանությունը կկայանա 2013թ. նոյեմբերի 8-ին, ժ. 1500 –ին ՀՀ ԳԱԱ Հ. Բունիաթյանի անվան կենսաքիմիայի ինստիտուտում գործող կենսաքիմիայի, մոլեկուլային կենսաբանության և ֆիզիոլոգիայի 042 մասնագիտական խորհրդի նիստում (ՀՀ, 0014, ք. Երևան, Պ. Սևակի փ. 5/1): Ատենախոսությանը կարելի է ծանոթանալ ՀՀ ԳԱԱ Հ. Բունիաթյանի անվան կենսաքիմիայի ինստիտուտի գրադարանում և http://aab.sci.am կայքում: Սեղմագիրն առաքվել է 2013թ. հոկտեմբերի 7-ին: 042 մասնագիտական խորհրդի գիտական քարտուղար, կենս. գիտ. թեկնածու՝ Մ.Ա. Բաբայան Тема диссертации утверждена в Институте физиологии им. Л.А.Орбели НАН РА. Научный руководитель: д.б.н., И.Б.Меликсетян Официальные оппоненты: д.б.н., проф. Дж. С. Саркисян д.м.н., А.Л. Минасян Ведущая организация: Ереванский государственный медицинский университет имени М. Гераци Защита диссертации состоится 8 ноября 2013г. в 1500 ч. на заседании специализированного совета 042 по биохимии, молекулярной биологии и физиологии, действующего в Институте биохимии имени Г. Бунятяна НАН РА (РА,0014, г. Ереван, ул. П. Севака 5/1). Автореферат разослан 7 октября 2013г. Ученый секретарь специализированного совета 042, канд. биол. наук 2 М.А. Бабаян ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Одним из наиболее распространѐнных в наши дни видов аффектов является стресс. Перенасыщенность жизни современного человека стрессорными ситуациями повышает интерес исследователей к острому воздействию на организм стрессовых факторов. Известно, что стресс может стать причиной возникновения ряда тяжелых заболеваний [Цфасман А. и др. 1983, Morrison W.E. et al., 2003]. Распространѐнным стрессовым фактором в человеческом обществе является гипокинезия, связанная с малоподвижным образом жизни. Положение на спине не характерно для большинства животных, поэтому привязывание на дощечке спиной вниз вызывает у них сильный стресс. Более 50 лет назад Г.Селье [Селье Г., 1960, 1982а, 1982б] сформулировал основные представления о механизмах формирования стресса. Он рассматривал стресс как совокупность неспецифических приспособительных и защитных реакций организма в ответ на изменение условий окружающей среды и выявил важную роль гипоталамогипофизарно-надпочечниковой системы (ГГНС) в процессе формирования стрессовых реакций. У высших животных и человека помимо ГГНС в стрессовые реакции организма вовлекаются также различные структуры ЦНС, ответственные за восприятие и оценку характера внешних воздействий. Стрессовая реакция позволяет организму быстро мобилизоваться, чтобы на определѐнный срок противостоять угрозе нарушения физиологического равновесия, благодаря устойчивости тех или иных структур, а также их высокореактивным свойствам вновь восстанавливаться. При участии нервной системы осуществляются наиболее совершенные процессы адаптации даже к резким изменениям среды. При различных неблагоприятных жизненных ситуациях и особенно при действии экстремальных факторов физиологическая нагрузка на нервную систему резко увеличивается [Горизонтов П.Д., Сиротинин Н.Н.,1973]. Поражение нервной клетки, как структурно-функциональной единицы центральной нервной системы (ЦНС), определяет момент возникновения функциональных и морфологических нарушений, поэтому ответ клеточного метаболизма на стресс заслуживает особого внимания в новейшей литературе и хорошо изучен для нейронов ЦНС [Kogure K., Kato H.,1993]. Однако механизмы сигнализирования и координации этих изменений являются далеко неизученными [Sackmann M., Niller H.,1994; Marcuccilli C.et al.1996], а координационный клеточный ответ на физиологический стресс группируется под множественными названиями, каждое из которых играет определѐнную роль при нормальных или патологических состояниях [Padgett D.A.,Glasser R.,2003]. Естественным показателем изменений, которые формируются в ЦНС в ответ на стрессовое воздействие, является фоновая импульсная активность (ФИА) нейронов различных структур мозга. В электрофизиологических (ЭФ) исследованиях показано, что иммобилизационный (ИМО) стресс приводит к значительному изменению ФИА нейронов центрального (CAM) и латерального (LAM) ядер амигдалы [Ханбабян М.В. и др., 2000], а также ФИА нейронов голубого пятна (LC) [Ханбабян М.В. и др., 2003; Khanbabyan M.V.et al., 2004]. Миндалина и моноаминергические структуры LC активно вовлекаются в процессы нейрональных перестроек во время стрессорных воздействий. Поэтому представляется актуальным исследование характера изменений параметров ФИА нейронов указанных структур мозга 3 Под воздействием стресса происходит ряд физиологических процессов, которые в первую очередь затрагивают кровоснабжение наиболее кислород-зависимых тканей, а именно-головной мозг. Общеизвестно, что в кровоснабжении мозга ведущее место занимает микроциркуляторное русло (МЦР), важнейшим компонентом которого являются капилляры, через стенку которых происходит обмен между кровью и внутритканевой средой, то есть транскапиллярный обмен. Изучение микроциркуляции беспорно актуально во многих областях науки. В современной научной литературе полностью отсутствуют работы, посвященные комплексному изучению в динамике капиллярного звена МЦР мозга крыс после острого ИМО стресса, что позволяет предположить, что данное исследование можно считать важным как в фундаментальной медицине, так и в практическом здравоохранении (нейрохирургия, неврология и т.д.). Таурин обладает радиопротекторным, антиоксидантным, мембраностабилизирующим действиями, является тормозным нейромодулятором, проявляет гепато- и кардиопротекторные, антиаритмические и нормотензивные свойства [Azuoma I. Et al., 1988; Hayes K.C., Sturman J.A., 1981; Huxtable R.J., 1992]. Имеется достаточное число работ, демонстрирующих широкий спектр эффектов фармакологически активных доз этого соединения [Гуревич В.С., 1986; Раевский К.С., Георгиев В.П., 1986; Dorvil N.P. et al., 1983; Nakashima T. Et al., 1990; Naskalski J.W., 1977]. На сегодняшний день существует более чем достаточно предпосылок, обосновывающих актуальность фундаментальных исследований и прикладных разработок для дальнейших испытаний биологической активности и выяснению механизмов действия таурина, а также показаний и способов его применения в медицинской практике. Специфические черты морфофункционального состояния изучаемых клеточных структур обусловлены своеобразием действия раздражителя, однако помимо определения локализации поражения, распространѐнности процесса, его природы, очень важно установить наиболее ранние и отдалѐнные проявления патологического процесса для выяснения критериев необратимости и возможной обратимости изменений поражѐнной ткани, а значит и содействия терапевтическими средствами. В соответствии с вышеизложенным были определены цели и задачи настоящей работы. Целью настоящей работы являлось динамическое исследование морфофункционального состояния сенсомоторной коры (СМК) больших пoлушарий, гиппокампа, миндалевидного комплекса, супраоптического и паравентрикулярного ядер гипоталамуса, голубого пятна, чѐрной субстанции, мозжечка и спиннoгo мозга крыс, а также капиллярного звена микроциркуляторного русла СМК пoсле вoздействия иммобилизационного стресса. Было исследовано также влияние биологически активного вещества таурина на морфофункциональное состояние клеточных структур вышеперечисленных отделов мозга и на капилляры СМК пoсле иммобилизационного стресса. Для достижения поставленной цели были поставлены следующие задачи: Провести сравнительное электрофизиологическое изучение нейронов голубого пятна и амигдалы при высокочастотной стимуляции соответствующих афферентных входов (паравентрикулярное ядро, гиппокамп) у интактных животных и крыс, подвергнутых воздействию острого стресса. Выявить в динамике степень повреждения нейронов исследуемых отделов мозга крыс пoсле иммобилизационного стресса в течение выбранных нами сроков выхода из состояния стресса. 4 Провести морфометрический анализ диаметра капиллярного звена микроциркуляторного русла сенсомоторной коры мозга как у интактных крыс, так и в динамике после воздействия стресса. Исследовать структурно-функциональные (гистологические, гистохимические, морфометрические), а также электрофизиологические изменения нейронов разных отделов мозга при введении таурина с целью определения протекторного влияния этого биологически активного вещества на изменѐнные вследствие стресса параметры мозга. Провести иммуногистохимический анализ данных по определению локализации стрессвызванного пептида (c-Fos), который является отличным морфологическим орудием для наглядного представления об острой активации нервных клеток после стресса. Научная новизна работы. Анализ данных электрофизиологических исследований ФИА нейронов голубого пятна и амигдалы в норме, после ИМО стресса и в условиях сочетания с введением таурина показывает, что ИМО стресс приводит к значительному изменению параметров данного показателя активности нейронов исследованных структур мозга. Установлено, что таурин оказывает нейропротекторное воздействие на нейроны голубого пятна и амигдалы. Получены новые сведения о морфофункциональном состоянии клеточных структур мозга в динамике пoсле вoздействия острого ИМО стресса. В сравнении с интактными животными, в коре больших полушарий, гиппокампе, ядрах гипоталамуса, в голубом пятне, чѐрной субстанции, миндалевидном комплексе, мозжечке и спинном мозге крыс, подвергнутых 2-х часовой иммобилизации, выявлены дегенирующие, потерявшие отростки нейроны с низкой фосфатазной активностью. В более отдалѐнные сроки в исследуемых отделах мозга выявлены регенерация нейронов, значительно много восстановленных нейронов с длинными дендритами, на которых, как и на соме, видны синапсы, свидетельствующие о повышении деятельности мозга. Полученные результаты дают возможность предполагать наличие защитных реактивных свойств нейронов, ведущих к их морфофизиологическому восстановлению в отдалѐнные сроки после стресса. Продемонстрировано, что ИМО стресс в течение одного часа вызывает активацию реагирующих на стресс нейронов, особенно в паравентрикулярном и супраоптическом ядрах гипоталамуса, а также в коре с выявлением c-fos (одноименный ген, продуцирующий белок) в ядрах клеток, что служит морфологическим показателем стрессвызванного ответа. У крыс на модели вышеотмеченной нейродегенерации с введением таурина выявлен протекторный эффект этой аминокислоты, обеспечивающий регенерацию и выживаемость нейронов в определѐнных областях мозга (восстановление формы, размеров большинства нейронов, реакции отростков, возвращение ядра в центр клетки), а также усиление метаболизма, в частности фосфатазной активности. На основании обнаружения КФпозитивных капилляров с тѐмно окрашенными перицитами выявлены ангиогенные свойства таурина через его включение в нейро-гематопоэтические взаимодействия при данном стрессовом состоянии. Впервые проведены морфометрические исследования капиллярного звена МЦР мозга в динамике после вoздействия иммобилизационного стресса и под влиянием таурина. Полученные в ходе исследований данные указывают на компенсаторноприспособительные изменения капиллярного звена МЦР мозга крыс в динамике после ИМО стресса и на сосудорасширяющий, ангиопротекторный эффект таурина на капиллярное звено МЦР мозга крыс. Вышеизложенное предусматривает в перспективе 5 возможность применения таурина в клинической практике при нарушениях мозгового кровообращения. Научно–практическое значение работы. Получены новые сведения об особенностях изменения показателей ФИА нейронов ряда структур мозга во время ИМО стресса и под влиянием таурина. Показано, что стрессорные воздействия приводят к существенному изменению ФИА нейронов исследованных структур и что таурин обладает нейропротекторным действием. Полученные на использованной нами модели нейродегенерации без и с участием таурина гистохимические и иммуногистохимические данные подтверждают нейропротекторную эффективность этого биологически активного вещества и возможное его включение в механизмы восстановления и ремоделирования путем повышения выживаемости поврежденных нейронов и участия в регулировании пластичности мозга через нейрогенез. Показано, что таурин обладает ангиопротекторным действиями на капиллярное звено микроциркуляторного русла мозга. Это позволяет с определѐнной долей вероятности предположить в будущем возможность применения таурина в клинической практике в связи с эффективной протекцией при нарушениях ЦНС, вызванных воздействием стресса. Апробация работы. Материалы и основные положения работы были представлены на Науч.конференции Института физиологии им. Л.А.Орбели НАН РА, посв. 60-летию основания института, Ереван, 6-7 Октября, 2003; Межд. II Науч. конференции, организованной Горисским гос. университетом, 26-27 мая, 2011; III съезде физиологов СНГ, Ялта, 1-6 октября, 2011; 3-ем Межд. Мед. конгрессе Армении ''Вместе во имя здоровья'', 7-9 июля, 2011; Межд. конференции «Ломоносов-2013»,8-13 апреля, 2013; 3-ей Межд. конференции по Нейронауке и Биолог.Психиатрии, Ереван, 22-24 сент., 2013. Публикации. Основное содержание диссертации отражено в 8 научных публикациях. Структура и объѐм работы. Диссертационная работа изложена на 147 страницах и состоит: из введения, обзора литературы, описания методов исследований, результатов исследований и их обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 239 источников. Диссертация содержит 36 рисунков, 3 таблицы и 3 графика. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В электрофизиологических исследованиях (ЭФ) экстраклеточно были зарегистрированы фоновая и вызванная спайковой активности одиночных нейронов голубого пятна и амигдалы при высокочастотной стимуляции соответствующих афферентных входов (паравентрикулярное ядро, гиппокамп) у интактных крыс, после иммобилизации и под воздействием таурина. В остром эксперименте ненаркотизированных крыс Альбино обездвиживали 1% дитилином (25 мг/кг в/б), фиксировали в стереотаксическом аппарате и переводили на искусственное дыхание. Модель изолированного бодрствующего головного мозга крысы получали перерезкой спинного мозга на уровне грудных Т2-Т3 сегментов под местным 0.5% новокаиновым наркозом. Cтеклянный микроэлектрод и раздражающий электрод были погружены в соответствующие структуры мозга согласно стереотаксическим координатам [Paxinos G., Watson C., 2005]. Импульсный поток подвергали программному анализу (разработчик В.С. Каменецкий). Традиционным методом проверки являлся t-критерий Стьюдента. Морфофункциональные исследования клеточных структур головного и спинного мозга (СМ) крыс проводились на полученных нами нейродегенеративных моделях с 6 помощью 2-х часового ИМО стресса посредством фиксирования животного на спине. Животные были разделены на следующие группы: 1) интактные крысы (n=5); крысы, подвергшиеся ИМО стрессу и изученные в разные постстрессовые сроки: 2) непосредственно после стресса (n=5); 3) через 24ч. (n=5); 4) через 5-10д. (n=5); и 5) через 15мес. (n=5) после иммобилизации. Для изучения влияния таурина на морфофункциональное состояние клеточных структур мозга крыс с нейродегенерацией были использованы две группы животных, ежедневно получивших водный раствор таурина (50 мг на 1 кг веса, внутрибрюшинно) непосредственно после стресса в первой группе в течение 3-х дней (n=5), а во второй группе - 7-и дней (n=5). Головной и спинной мозг интактных и экспериментальных животных были удалены и зафиксированы в 5% растворе нейтрального формалина при температуре 4°С в течение 48 часов. Затем замороженные серийные срезы, толщиной 40-50 мкм, переносились в соответствующие инкубационные смеси, предназначенные для проведения гистохимических и иммуногистохимических исследований. В работе применяли гистохимические методы по определению активности Ca2+-зависимой кислой фосфатазы [Меликсетян И., 2007] и кальций аденозинтрифосфатный безинъекционный гистоангиологический метод Чилингаряна [Чилингарян А., 1986] для выявления внутримозгового микроциркуляторного русла (МЦР), а также ABC иммуногистохимический метод [Hsu. Et al., 1981] с использованием антисыворотки против стресс-вызванного пептида c-fos (в разведении 1:2000). РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Электрофизиологическое исследование воздействия острого стресса и протекторного влияния таурина на активности нейронов голубого пятна и миндалины после иммобилизационного стресса Анализ импульсной активности отдельных нейронов голубого пятна (41 клетки) и амигдалы (37 клеток) в норме, в условиях стресса 1 (16 и 40 клеток, соответственно), 90 (28 и 30 клеток, соответственно) и 7 дневного в сочетании с таурином (61 и 33 клетки, соответственно) выявил формирование ответов на ВЧС ПВЯ в LC, гиппокампе и амигдале в виде ТП и ТД, с последующими проявлениями активности в виде ПТП и ПТД. Сравнительная количественная оценка всего массива испытаний изученных нейронов выявила формирование возбудительных и депрессорных ответов в одиночных нейронах голубого пятна и амигдалы на ВЧС ПВЯ и гиппокампа, соответственно, исчисляемых на основе усредненного количества спайков (PETH), с пересчетом в межимпульсные интервалы и частоты в Гц (Frequency Average) на примере комплексных усредненных перистимульных гистограмм, привел к следующему заключению о соотношении возбудительных и депрессорных постстимульных проявлений спайкинга активности. ТП ПТП нейронов голубого пятна на ВЧС ПВЯ в норме, по сравнению с престимульным уровнем фоновой активности, выявляла ТП в пределах 1,75-кратного превышения (Рис. 1А, Группа Г), ТП ПТД демонстрировала ТП в пределах 2-кратного превышения (Рис. 1Б, Группа Г), ТД ПТД нейронов голубого пятна в норме на ВЧС ПВЯ достигала ТД в пределах 3-кратного занижения (Рис. 1В, Группа Г), ТД ПТП нейронов голубого пятна в норме на ВЧС ПВЯ достигала снижения ТД порядка 5-кратного (Рис. 1Г, Группа Г). 7 В условиях 1 дневного стресса ТД ПТД нейронов голубого пятна на ВЧС ПВЯ, по сравнению с престимульным уровнем фоновой активности, выявляла ТД в пределах 6кратного занижения (Рис. 1В, Группа А), ТД ПТП демонстрировала ТД в пределах 5кратного занижения (Рис. 1 Г, Группа А), не отмечалось возбудительных постстимульных проявлений активности как однонаправленных, так и смешанных (Рис. 1А и Б, Группа А). Рис. 1. А-В –комплексные усредненные перистимульные (PETH Average), кумулятивные (Сumu-lative Average) и гистограммы частоты (Frequency Average) спайковой активности единичных нейронов LC на ВЧС ПВЯ (А-Г), и амигдалы на ВЧС гиппокампа (Д-З) для тетанических и постте-танических возбудительных (А, Д), однонаправленных депрессорных (В, Ж), смешанных тетанических возбудительных, посттетани-ческих депрессорных (Б, Е) и тетанических депрессорных, посттетанических возбудитель-ных (Г, З) реакций в условиях 1, 90 дневного стресса (группы , А и Б, соответственно, 7 дневного – в сочетании с таурином (Группа В) и в норме (Группа Г). Остальные обозначения в рисунке. После 90 дневного стресса ТП ПТП выявляла ТП в пределах 3.66-кратного превышения (Рис. 1А, Группа Б), ТП ПТД демонстрировала ТП в пределах 1- кратного превышения (Рис. 1Б, Группа Б), ТД ПТД нейронов голубого пятна на ВЧС ПВЯ, по сравнению с престимульным уровнем фоновой активности, достигала занижения ТД в пределах 3-кратного (Рис. 1В, Группа Б), ТД ПТП нейронов голубого пятна на ВЧС ПВЯ достигала снижения порядка 3.66-кратного (Рис. 1Г, Группа Б). В условиях 7 дневного стресса в сочетании с таурином ТП ПТП выявляла ТП в пределах 6кратного превышения (Рис. 1 А, Группа В), ТП ПТД демонстрировала ТП в пределах 5.75-кратного превышения (Рис. 1Б, Группа В), ТД ПТД нейронов голубого пятна на ВЧС ПВЯ, по сравнению с престимульным уровнем фоновой активности, достигала занижения ТД в пределах 38 кратного (Рис. 1В, Группа В), ТД ПТП нейронов голубого пятна на ВЧС ПВЯ достигала снижения порядка 1-кратного (Рис. 1 Г, Группа В). ТП ПТП нейронов амигдалы на ВЧС гиппокампа в норме, по сравнению с престимульным уровнем фоновой активности, выявляла ТП в пределах 3-кратного превышения (Рис. 1Д, Группа Г), ТП ПТД демонстрировала ТП в пределах 3-кратного превышения (Рис. 1Е, Группа Г), ТД ПТД нейронов голубого пятна в норме на ВЧС ПВЯ достигала занижения ТД в пределах 2.25-кратного занижения (Рис. 1Ж, Группа Г), ТД ПТП нейронов голубого пятна в норме на ВЧС ПВЯ достигала снижения порядка 2кратного (Рис. 1З, Группа Г). Рис. 2. А-З – перистимульные гистограммы суммы спайков (сверху), построенные на основе«растера» пре- и постимульных возбудительных – ТП ПТП (А, Д),депрессорных - ТД ПТД (В, Ж) и смешанных ТП ПТД (Б, Е) и и ТД ПТП (Г, З) проявлений спайковой активности единичных нейронов голубого пятна на ВЧС ПВЯ и амигдалы на ВЧС гиппокампа (А–Г и Д-З, соответственно) в норме. Здесь и в следующих рисунках: снизу – диаграммы усредненной частоты спайков, с указанием сред-них цифровых значений (М) в реальном времени 20 сек до и после стимуляции для временного отрезка до стимуляции (BE–before event), на время тетаниза-ции (TT– tetanization time) и после (PE–post event) стимуляции. В условиях 1 дневного стресса ТП ПТП нейронов амигдалы на ВЧС ПВЯ, по сравнению с престимульным уровнем фоновой активности, выявляла ТП в пределах 2-кратного завышения (Рис. 1Д, Группа А), ТП ПТД демонстрировала ТП в пределах 2.25-кратного превышения (Рис. 1Е, Группа А), ТД ПТД достигала занижения ТД порядка 2.25-кратного, ТД ПТП давала начало занижению ТД в пределах 8-кратного. После 90 дневного стресса ТП ПТП нейронов амигдалы на ВЧС гиппокампа выявляла ТП в пределах 1.33-кратного превышения (Рис. 1Д, Группа Б), ТП ПТД не регистрировались (Рис. 1Е, Группа Б), ТД ПТД нейронов амигдалы на ВЧС гиппокампа достигала занижения ТД в пределах 4-кратного (Рис. 1Ж, Группа Б), ТД ПТП нейронов амигдалы достигала снижения порядка также 4-кратного (Рис. 1З, Группа Б). В условиях 7 дневного стресса в сочетании с таурином ТП ПТП выявляла ТП в пределах 4.25кратного превышения (Рис. 1Д, Группа В), ТП ПТД демонстрировала ТП в пределах 6кратного превышения (Рис. 1Е, Группа В), ТД ПТД нейронов, достигала занижения ТД в пределах 2.25-кратного (Рис. 1Ж, Группа В), ТД ПТП достигала снижения порядка 1кратного (Рис. 1З, Группа В). На следующих Рис. 2 и 3 представлены перистимульные гистограммы суммы спайков (сверху) нейронов голубого пятна на ВЧС ПВЯ и нейронов амигдалы на ВЧС гиппокампа, построенные на основе «растера» пре– и постстимульных депрессорных и 9 возбудительных проявлений спайковой активности в норме (Рис. 2) и 7 дневного стресса в сочетании с воздействием таурина (Рис. 3). Рис. 3. А-З – перистимульные гистограммы суммы спайков (сверху) и диаграммы усредненной частоты спайков (снизу), построенные на основе «растера» преи постстимульных возбудительных – ТП ПТП и ТП ПТД (А, Б, Д) и депрессорных - ТД ПТД и ТД ПТП (В, Г, Е, Ж) проявлений спайковой активности единичных нейронов голубого пятна на ВЧС ПВЯ и нейронов амигдалы на ВЧС гиппокампа (А–Г и Д-Ж, соответственно) 90 дней спустя после стресса. В нейронах голубого пятна, в сравнении с нормой, через 1 день после стресса, получено абсолютное подавление возбуди тельных постстимульных проявлений активности, затем некоторое усиление возбудитель ных реакций на 90 день (Рис. 3) и мощное их усиление на 7 день стресса в условиях сочетания с введением таурина (Рис. 4). В нейронах амигдалы, наоборот, в сравнении с нормой, после усиления выше нормы постстимульного возбуждения к 1 дню, показано резкое его ослабление на 90 день (Рис. 3), и такое же значительное его усиление при сочетании с таурином (Рис. 4), как и в случае активации голубого пятна. Что же касается депрессорных постстмульных эффектов, то в нейронах голубого пятна, в сравнении с нормой, показано некоторое ослабление депрессии после 1 дня стресса, дальнейшее ослабление депрессии к 90 дню (Рис. 3) испытаний и ее резкое снижение при сочетании с таурином на 7 день стресса (Рис. 4). В амигдале после 1 дня испытаний идет более резкое снижение депрессии, на 90 день (Рис. 3), наоборот, усиление депрессии, но такое же резкое ее снижение при сочетании с таурином на 7 день стресса (Рис. 4). Иными словами, в целом, по сравнению с нормой, в условиях сочетания с таурином к 7 дню стресса возбуждение резко нарастает и так же резко снижается депрессия, что свидетельствует о способности таурина содействовать тенденции восстановления соотношения разнонаправленных постстимульных эффектов. В аспекте процентного соотношения возбудительных и депрессорных постстимульных проявлений активности в нейронах голубого пятна при ВЧС ПВЯ в условиях 1, 90 дневного стресса и 7 дневного - в сочетании с таурином, по сравнению с нормой, вышеотмеченные данные представлены в виде дисковых диаграмм (Рис. 5). С учетом процентного соотношения степени выраженности (по усредненной частоте) возбудительных и депрессорных эффектов в одиночных нейронах голубого пятна и амигдалы на тетаническую стимуляцию паравентрикулярного ядра и гиппокампа, 10 Рис. 4. А-З – перистимульные гистограммы суммы спайков (сверху) и диаграммы усредненной частоты спайков (снизу), построенные на основе «растера» пре- и постстимульных возбуди-тельных – ТП ПТП и ТП ПТД (А, Б, Д, Е,) и депрессорных - ТД ПТД и ТД ПТП (В, Г, Ж, З) проявлений спайковой активности единичных нейронов голубого пяна на ВЧС ПВЯ и нейронов амигдалы на ВЧС гиппокампа (А–Г и Д - З, соответственно) после 7 дней стресса в сочетании с воздействием таурина. соответственно, на 1 и 90 дни после стресса и на 7 день в условиях воздействия таурина, в сравнении с нормой, получены следующие результаты исследования (Рис. 6). Видно, на А, в нейронах голубого пятна, в случае однонаправленных возбудительных постстимульных проявлений активности в виде ТП ПТП, в сравнении с нормой, через 1 день после стресса имелось незначительное увеличение тетанических возбудительных постстимульных проявлений активности, затем прогрессивное усиление возбудительных реакций на 90 день и мощное их усиление на 7 день стресса в условиях сочетания с введением таурина. Рис. 5 На Д, в нейронах амигдалы, наоборот, к 1 дню после абсолютного отсутствия постстимульного тетанического возбуждения, в сравнении с нормой, следовало резкое его ослабление на 90 день, и такое же значительное, как и в случае активации голубого пятна, дальнейшее его усиление при сочетании с таурином. На Б, в сравнении с нормой, в условиях регистрации разнонаправленных постстимульных реакций в голубом пятне в виде ТП ПТД, после полного отсутствия тетанических возбудительных эффектов к 1 дню после стресса, имело место достаточное их ослабление на 90 день, сопровождаемое мощным усилением тетанических возбудительных реакций на 7 день после стресса в сочетании с таурином. На Е, в нейронах амигдалы, в условиях отведения ТП ПТД, после относительного ослабления тетанических возбудительных эффектов к 1 дню после стресса 11 Рис. 6 и полного их отсутствия на 90 день, выявлялось значительное их усиление на 7 день после стресса в сочетании с таурином. Что же касается депрессорных постстимульных реакций, то на В, в голубом пятне, в сравнении с нормой, после резкого (почти двухкратного) ослабления однонаправленных тетанических депрессорных эффектов, в виде ТД ПТД, к 1 дню после стресса и дальнейшего еще более значительного их ослабления на 90 день, имело место их некоторое усиление на 7 день после стресса в сочетании с таурином. На Ж, в тех же условиях регистрации ТД ПТД в нейронах амигдалы, в сравнении с нормой, после ослабления тетанических депрессорных реакций к 1 дню, отводили мощное их усиление, трехкратно превышающее норму, на 90 день, с последующим их ослаблением, но не достигающим нормы, на 7 день после стресса в сочетании с таурином. Наконец, на Г, в условиях регистрации ТД ПТП в голубом пятне, после фактического отсутствия изменений в тетанических депрессорных эффектах, в сравнении с нормой, к 1 дню после стресса, регистрировали их ослабление на 90 день, которое не изменялось и на 7 день после стресса в сочетании с таурином. В то же время, на З, в тех же условиях регистрации ТД ПТП в нейронах амигдалы, отводили, в сравнении с нормой, после несколько меньше двухкратного ослабления тетанических депрессорных эффектов, их наиболее мощное (порядка трехкратного) усиление на 90 день, но в тех же пределах (трехкратно) резко ослабленное на 7 день после стресса в сочетании с таурином. Таким образом, выявлено мощное, в сравнении с нормой, усиление тетанических возбудительных эффектов на 7 день после стресса, в условиях сочетания с таурином, как в голубом пятне, так и амигдале (Рис. 6 А, Б, Д и Е), в то время как в амигдале выявляли такое же мощное усиление и тетанических депрессорных эффектов на 90 день после стресса, в отличие от голубого пятна, в котором, наоборот, имелось относительно значительное, в сравнении с нормой, их ослабление как на 90 день, так и 7 день в сочетании с таурином, не достигающее нормы (Рис. 6 В, Г, Ж и З). 12 Морфогистохимические исследования клеточных структур различных отделов мозга в динамике после иммобилизационного стресса Поражение нервной клетки, как структурно-функциональной единицы центральной нервной системы (ЦНС), определяет момент возникновения функциональных и морфологических нарушений, поэтому ответ клеточного метаболизма на стресс заслуживает особого внимания в новейшей литературе и хорошо изучен для нейронов ЦНС [Kogure K., Kato H.,1993]. Целью настоящей работы было изучение клеточных структур мозга крыс, подвергшихся 2-х часовому иммобилизационному (ИМО) стрессу в различные постстрессовые сроки. По нашим данным, почти во всех ядрах мозга интактных крыс нейроны имеют отростки, центрально расположенные ядра нормальных размеров и высокую активность КФ в цитоплазме клеток. У травмированных крыс после ИМО стресса, по сравнению с нормой, выявляемые дегенеруюшие клетки с низкой активностью КФ гипертрофированы и не имеют отростков. Непосредственно после стресса на срезах мозга крыс активность кислой фосфатазы выявляется в ядрах крупных пирамидных нейронов предлобной коры больших полушарий (Рис. 7 А,Д) и нейронов СА3 поля Рис.7. Активность Са2+ - зависимой КФ в ядрах пирамидных гиппокампа (Рис. 7В). клеток аnterior cingulate предлобной коры мозга (А, Б) и нейронов По результатам СА1 поля гиппокампа (В) крыс непосредственно (в течение 15 проведенного нами мин) после 2 часового иммобилизационного стресса. c-Fos- иммуногистохимического иммунонегативные ядра в нейронах (г,Г) супраоптического (SON) ядра интактных крыс; c-Fos-иммунореактивные ядра в нейронах: исследования с использовани(д,Д) SON и (е,Е) паравентрикулярного (PVN) ядер гипоталамуса ем антисыворотки против через 1 час после стресса. (А-Б) Гистохимический метод стресс-вызванного пептида cопределения Са2+ зависимой КФ; (Г-Е) АВС Fos (одноименный ген, иммуногистохимический метод. продуцирующий белок), выявляются c-Fos-иммунореактивные ядра нейронов коры, гипоталамических SON (Рис. 7д,Д) и PVN (Рис. 7е,Е) в течение 30-60 минут после иммобилизации. В дальнейшем иммунореактивность постепенно ослабевает и исчезает. Более ранее выявление активности КФ в ядрах пирамидных нейронов коры и нейронов ряда областей мозга непосредственно после стресса указывает на наличие фосфорилирования, как одного из путей, 13 предшествующих образованию стресс-зависимых пептидов [Marcuccilli C. et all, 1996; Padgett D.A., Glasser R., 2003], в данном случае c-fos, что является отличным морфологическим доказательством для наглядного представления об активации клеточных структур, вызванной стрессовым стимулом, в данном случае иммобилизацией. Под воздействием стресса наиболее часто поражаются пирамидный (Рис. 8Г,Д,Ж,З) и зернистый (Рис. 8 Е,И) слои коры, более устойчив – полиморфный слой. Нейроны теряют свою характерную форму, округляются, гипертрофируются, у большинства перестают реагировать отростки, гипертрофированные ядра эктопируют к периферии. По сравнению с нормой (Рис. 8А,Б), у апикальных дендритов дегенерированных пирамидных нейронов нарушается ориентация и через 24 часа (Рис. 8Г,Д), и через 5 дней (Рис. 8Ж,З) после стресса. У гипертрофированных гранулярных нейронов (Рис. 8Е) дегенерация происходит в основном по принципу центрального хроматолиРис. 8. Клеточные структуры пирамидного и за, а у крыс через 5 дней после гранулярного слоев аnterior cingulate предлобной коры стресса наблюдается эктопия ядер 8И). В обоих слоях мозга интактных крыс (А-В) и крыс, подвергшихся 2-х (Рис. часовому ИМО стрессу через 24 часа (Г-Е) и 5 дней (Ж-И ) наблюдается исчезновение после стресса. В норме у пирамидных нейронов (А,Б) синаптических окончаний, демонстрирована высокая активность КФ, их апикальные разбросанных вокруг нейронов дендриты направлены к гранулярному слою, а в (Рис. 8А-В) в этих же отделах у гранулярных клетках (В) кольцевидный осадок фосфата свинца окружает центрально расположенные интактных крыс. В отличие от коры мозга, в негативные ядра; синаптические окончания разбросаны вокруг нейронов, что указывает на высокую мозговую гиппокампальном комплексе (HP) после стресса активность. В результате стресса у отростков непосредственно дегенерированных пирамидных нейронов нарушена особых отличий в реагировании ориентация и через 24 часа (Г,Д), и через 5 дней (Ж,З) нервных клеток не наблюдается, в после стресса. У гипертрофированных гранулярных сравнении с (Рис. 9А-В) нейронов (Е) дегенерация происходит в основном по интактными крысами. Наибольшие принципу центрального хроматолиза (стрелка), а у крыс через 5 дней после стресса наблюдается эктопия ядер изменения в HP наблюдаются через (головки стрелок). Гистохимический метод определения 24 часа после стресса (Рис. 9Г-Е). Са2+ - зависимой КФ. 14 Основным ранним проявлением патологии в HP является редукция дендритного дерева пирамидных нейронов HP, что предполагает нарушения межнейрональных связей. У гранулярных клеток с нечеткими контурами наблюдается усиление фосфатазной активности во всех постстрессовых сроках (Рис. 9Д,З,Л), ), а у гипертрофированных пирамидных клеток в поле СА4 (Рис. 9Е,И,М) в цитоплазме выявляется глыбчатый осадок фосфата свинца. Однако, в средние постстрессовые сроки у некоторых клеток отростки сохранены (Рис. 9И). В поздние сроки, спустя 1 и 2 месяца после иммобилизации, отмечается углубление процессов поражения клеточных стуктур в разных регионах HP. Лишь спустя 5 месяцев после стресса морфологическая картина характеризуется восстановлением формы, размеров нейронов HP, хотя гранулярные клетки СА4 поля остаются все ещѐ несколько гипетрофированными. Известно, что гипоталамус осуществляет нервную регуляцию эндокринных функций, получает Рис. 9. Клеточные структуры гиппокампального информацию о появлении стрессора и комплекса у интактных крыс (А-В) и крыс, "запускает" работу стресс-системы. подвергшихся 2-х часовому ИМО стрессу через 24 часа Морфологическая картина SON и (Г-Е), 5 дней (Ж-И ) и 1 мес.(К-М) после стресса. В PVN в ранние сроки после стресса норме у (Б) гранулярных клеток (стрелка) и у нейронов нарушением (В) СА4 поля с четкими контурами демонстрирована характеризуется умеренная фосфатазная активность в лизосомах контуров клеток, нейроны теряют характерную форму, мелких размеров. У гранулярных клеток (стрелки) с свою нечеткими контурами наблюдается усиление деформируются, гипертрофируются, фосфатазной активности во всех постстрессовых ядра с высокой активностью КФ сроках (Д,З,Л); у гипертрофированных пирамидных эктопируются. У большинства из них клеток в поле СА4 (Е,И,М) в цитоплазме перестают реагировать отростки. демонстрирован глыбчатый осадок фосфата свинца; у Однако, местами обнаруживаются некоторых клеток отростки сохранены (И). В поздние сроки воздействия стресса (К-М) наблюдается набухшие клетки с отростками и тканевой отек (звездочки). Гистохимический метод синаптическими окончаниями на них. Выявляются ядра глиальных клеток определения Са2+ - зависимой КФ. (не демонстрировано). В средние сроки после стресса в набухших нейронах SON и PVN настолько высока активность КФ, что субклеточные структуры не видны из-за тѐмной и диффузной окраски. Форма клеток нарушена, они напоминают бесформенные структуры с нечѐткими размытыми контурами. Отростки не выявляются. Имеется тенденция к группированию нейронов на фоне тканевого отѐка. Спустя 1 и 2 месяца после иммобилизации наблюдается положительные изменения структурных свойств нейронов SON и PVN. У некоторых регенерированных 15 нейронов ядра занимают центральное положение. Повсюду выявляются длинные и короткие отростки, на которых обнаруживаются синапсы, что свидетельствует о восстановлении межклеточных контактов ядер гипоталамуса. А спустя 5 месяцев после стресса морфологическая картина нейронов обоих ядер гипоталамуса напоминает норму. Голубое пятно (LC) вегетативное ядро, расположенное в стволе мозга, которое несѐт ответственность за многие посреднические симпатические влияния во время стресса. Непосредственно после ИМО стресса особых отличий в реагировании нервных клеток на срезах LC крыс не наблюдается, в сравнении с интактными крысами (Рис. 10А,Б). Через сутки (Рис. 10В) и и 5 дней (Рис. 10Г) после стресса наблюдается нарушение контуров и укорочение отростков клеток дорсолатеральной части Рис. 10. Клеточные структуры (А-Е) голубого пятна (LC) и LC. Гипертрофированные ядра с (Ж-К) черной субстанции (SN) у интактных (А,Б; Ж) и фосфатазной активностью подвергшихся ИМО стрессу крыс в разные постстрессовые деформируются, становятся сроки (24 часа - В и З; 5 дней - Г и И; 1 мес.- Д и К; 5 мес. - Е). зернистыми и занимают основное (А) клетки дорсолатеральной (стрелка) и пространство в клетке (Рис. 10В). вентролатеральной (головка стрелки) частей LС интактных отметить, что клетки крыс; демонстрированы только нейроны дорсолатеральной Надо начинают регенерировать в более части LC (Б-Е). Через сутки и 5 дней после стресса клетки деформируются и теряют четкие контуры и отростки поздние сроки иммобилизации 10Д,Е): пока еще (В,Г), которые начинают регенерировать (стрелки) в более (Рис. поздние сроки иммобилизации (Д,Е). По сравнению с нормой гипертрофированные нейроны с (Ж), в черной субстанции у иммобилизированных животных четкими контурами в LC (З,К) наблюдается потеря отростков и перемещение ядер обладают высокой активностью клеток, в цитоплазме которых крупноглыбчатый осадок КФ и характерной формой. имеет различное расположение; однако в поздние сроки Анализ клеточных структур стресса (К), как и в норме (Ж), у некоторых нейронов субстанции (SN) мелкозернистый осадок свинца равномерно локализован черной вокруг пока еще гипертрофированных ядер (стрелки). иммобилизированных животных Тканевой отек (звездочки). Гистохимический метод (Рис. 10З,И,К) показал, что, по определения Са2+ - зависимой КФ. сравнению с нормой (Рис. 10Ж), наблюдается потеря отростков и перемещение ядер клеток с нечеткими контурами, в цитоплазме которых крупноглыбчатый осадок имеет различное расположение. Характерным признаком непосредственного воздействия стресса является процесс сморщивания нейронов и нарушение их полигональной формы (Рис. 10З). В средние постстрессовые сроки, через 5-10 дней, проявляется ядерная окраска (Рис. 10И). В поздние же сроки стресса, 1-5 месяцев (Рис. 10К), как и в норме (Рис. 10Ж), у некоторых нейронов мелкозернистый осадок свинца равномерно локализован в цитоплазме. В миндалевидном комплексе интактных крыс нейроны треугольной формы, нормальных размеров и с 16 длинными отростками (Рис. 11а,А) плотно расположены и демонстрируют умеренную фосфатазную активность. В ранние сроки после стресса наблюдается поражение нейронов миндалины, которое идѐт по типу центрального хроматолиза (Рис. 11Б,В). Деформированные же клетки с высокой фосфатазной активностью лишены отростков (Рис. 11Б-Г). В более поздние сроки иммобилизации, 2 и 5 месяца, выявляются регенерированные нейроны разных форм и размеров и с отростками (Рис. 11Д,Е). Восстановление клеточных структур более наглядно и убедительнее происходит в спинном мозге крыс в поздние сроки иммобилизации, указывая тем самым на пластичность мозга без каких либо вмешательств. Так, у интактных крыс (Рис. 11Ж) мотонейроны с высокой активностью КФ имеют длинные отростки, которые перестают реагировать у сморщенных мотонейронов через 24 часа после иммобилизации (Рис. 11З). в поздние сроки Рис. 11. Клеточные структуры (A-E) миндалевидного Однако, форма, комплекса (Am) и (Ж-К) спинного мозга (SC) у интактных воздействия стресса (а,А; Ж) и подвергшихся ИМО стрессу крыс в разные пост- размеры и отростки стрессовые сроки (24 часа - Б,З; 5 дней- В; 1мес.- Г; 2мес.- Д; мотонейронов почти полностью 5 мес.- Е,К). (а,А) нейроны треугольной формы, нормальных восстанавливаются (Рис. 11 И, размеров и с длинными отростками Am интактных крыс; К) и показывают высокую Через сутки, 5 дней и 1 мес. после стресса деформированные фосфатазную активность. клетки с высокой фосфатазной активностью лишены Однако надо отметить, что во отростков (Б-Г), которые регенерируют (Д,Е) в более исследованных сроках поздние сроки иммобилизации (2 и 5 мес.). (Ж) интактные всех выявляется мотонейроны с высокой активностью КФ имеют длинные иммобилизации отростки, которые перестают реагировать через 24 часа тканевой отек. после иммобилизации (З). Однако, в поздние сроки В ранние сроки после воздействия стресса отростки нейронов почти полностью иммобилизации в клетках восстанавливаются (И,К). Тканевой отек (звездочки). Пуркинье мозжечка особых 2+ Гистохимический метод определения Са - зависимой КФ. изменений не отмечается. Процесс хроматолиза не выявляется. Однако, характерным является выявление гипертрофированных ядер с высокой активностью КФ (Рис. 12Б). Клетки грушевидной формы, несколько гипертрофированы, набухшие ядра в основном центрально расположены, отростки укорочены, по сравнению с интактными клетками (Рис. 12а,А), у которых аксональные воронки сильно расширены. В средние сроки после иммобилизации клетки Пуркинье с нечѐткими контурами, деформированы, увеличены в размерах и неплотно расположены, а ядра эктопированы (Рис. 12В). В поздние сроки после стресса (Рис. 12Г) клетки с уже чѐткими контурами гипертрофированы и ещѐ округлой формы по 17 сравнению с нормой. В целом, наблюдаются тенденция к восстановлению нормальной морфологической картины клеток Пуркинье. Рис. 12. Клетки (А-Г) Пуркинье (P) и (Д-З) нейроны зубчатого ядра (ND) мозжечка у интактных (а,А; Д) и подвергшихся ИМО стрессу крыс в разные постстрессовые сроки (24 часа Б,Е; 5 дней - В,Ж; 1мес. - Г,З;). По сравнению с нормой (а,А), в ранние и средние сроки после стресса (Б,В) превалируют нейроны с позитивными для КФ ядрами клеток (головки стрелок). В зубчатом ядре через 5 дней после иммобилизации (Ж) полнотью стираются контуры деформированных и лишенных отростков нейронов (стрелки). Примечательно, что и вокруг клеток Пуркинье (Б), и около нейронов в зубчатом ядре (Е) сохраняются синаптические окончания на следующий день после ИМО стресса; в поздние сроки иммобилизации (З) у некоторых нейронов с регенерированными отростками гипертрофированные ядра демонстрируют высокую КФ активность (стрелки). (а,д) зубчатое ядро (стрелки); (а) клетки Пуркинье (головка стрелки). Тканевой отек (звездочки). Гистохимический метод определения Са2+ зависимой КФ. В зубчатом ядре мозжечка через 5 дней после иммобилизации (Рис. 12Ж) на фоне околоклеточного отѐка нарушается чѐткость контуров нейронов, перестают реагировать отростки нейронов, местами встречаются сморщенные нейроны, подвергнутые глубокому дегенеративному поражению. Примечательно, что и вокруг клеток Пуркинье (Рис. 12Б), и около нейронов в зубчатом ядре (Рис. 12Е) сохраняются синаптические окончания на следующий день после ИМО стресса. В поздние сроки иммобилизации (Рис. 12З) в нейронах зубчатого ядра отмечаются положительные изменения структурных свойств нейронов: клетки принимают нормальные формы и размеры, восстанавливаются отростки, их контуры становятся чѐткими. Морфогистохимическое исследование протекторного влияния таурина на клеточные структуры различных отделов мозга после иммобилизационного стресса У взрослых особей биосинтез таурина в обычных условиях относительно достаточен, однако стрессовые состояния, как правило, приводят к обеднению пула таурина в организме и возникновению так называемого функционального дефицита этого соединения [Vinton N.E. et al., 1986], и для улучшения деятельности организма необходимо его применение, оказывающее модулирующее действие на функциональное состояние организма и способствующее стабилизации деятельности нервной системы. Исходя из этого, целью исследований являлось морфогистохимическое изучение влияния таурина на клеточные структуры мозга крыс после ИМО стресса. В этой серии экспериментов нами были проведены гистохимические исследования аминокислоты таурина на клеточные структуры тех же стресс-ответственных отделов 18 мозга крыс, подвергшихся 2-х часовому ИМО стрессу и исследованных в разные постстрессовые сроки (3-7 дней). Во всех исследуемых нами отделах мозга наблюдается регенерация нейронов, морфологическая картина которых не отличается от интактных клеток по форме и размеров. Так, в гипоталамическом супраоптическом ядре выявляются регенерированные магноцеллюлярные клетки с высокой фосфатазной активностью в их цитоплазме (Рис. 13 З, И). По сравнению с поврежденными нейронами (Рис. 13А), в цитоплазме этих нейронов видны короткие толстые отростки и равномерно рассеянный мелкозернистый осадок фосфата свинца, а пока еще эктопированные ядра отличаются фосфатазной активностью (Рис. 13З,И), что Рис. 13. Влияние таурина на морфофункциональное состояние указывает на активирование наблюдаемое, клеточных структур: (Б,В) пирамидного слоя коры головного нейронов, мозга (Cortex), (Г,Д,Е) СА4 поля гиппокампа; (З,И) обычно, у дегенерированных гипоталамического супраоптического ядра (SON). Во всех клеток. Примечательно, что во отмеченных областях мозга при 7-дневнoм воздействии всех отмеченных областях мозга таурином очевидна более выраженная нейрорегенерация при 7-дневном воздействии (В,Е,И) по сравнению с его 3-дневным влиянием (Б,Д,З); по таурином очевидна более сравнению с лишенными отростков клетками, наблюдаемыми выраженная нейрорегенерация в 5-й день после стресса в пирамидном слое коры мозга (А) и (Рис. 13В,Е,И), по сравнению с SON (Ж), почти у всех клеток восстанавливаются отростки. Зубчатая фасция гиппокампа (GD); Тканевой отек его 3-дневным влиянием (Рис. (звездочки). Гистохимический метод определения Са 2+ - 13Б,Д,З). Клетки в наружном зернисзависимой КФ. том слое сильно отличаются от клеток пирамидного и полиморфного слоев коры мозга с центральным хроматолизом (не демонстрировано). Так, у пирамидных клеток с умеренной фосфатазной активностью направление коротких отростков не нарушено как при 3дневном (Рис. 13Б), так и при 7-дневном воздействии таурина, в отличие от дегенерированных пирамидных клеток иммобилизированных крыс, у которых направление отростков полностью нарушено (Рис. 13А). Все пирамидные клетки коры нормальной формы и размеров, в цитоплазме которых равномерно локализован осадок фосфата свинца средней величины, ядра клеток имеют центральное расположение, а их отростки, как и в норме, направлены вверх к молекулярному слою (Рис. 13В). Таурин приводит также к выраженной регенерации нейронов во всех извилинах гиппокампа крыс с вышеприведенной дегенерацией. Восстановление клеток СА3, СА2, СА4 (Рис. 13Д,Е) полей и зернистого слоя гиппокампа очевидно с преимуществом при 7-дневном воздействии таурина (Рис. 13Е), по сравнению с 3-дневным. Как показал анализ МГХ данных влияния таурина на морфофункциональное состояние клеточных структур в 19 голубом пятне (Рис. 14 Б, В), чѐрной субстанции (Рис. 14 Д, Е) и миндалевидном комплексе (Рис. 14З,И), и при 3-дневном (Рис. 14Б,З), и при 7-дневном влиянии таурина (Рис. 14 В,Д,Е,И) демонстрирована нейрорегенерация, по сравнению с поврежденными нейронами этих же ядер (Рис. 14А,Г,Ж) через 5-дней после иммобилизации: нейроны с телами различной формы, длинными отростками и с центрально расположенными, но пока еще увеличенными ядрами, полностью восстановлены. Рис. 14. Влияние таурина на морфофункциональное состояние клеточных структур: (Б,В) голубого пятна (LC), (Д,Е) черной субстанции (SN) и (З,И) миндалевидного комплекса (Am). В вышеуказанных ядрах головного мозга, и при 7-дневном воздействии таурином (В,Д,Е,И), и при его 3-дневном влиянии (Б,З) демонстрирована нейрорегенерация по сравнению с поврежденными нейронами этих же ядер (А,Г,Ж) через 5-дней после иммобилизации. Тканевой отек (звездочки). Гистохимический метод определения Са2+ зависимой КФ. Рис. 15. Влияние таурина на морфофункциональное состояние клеточных структур: (Б,В) клеток Пуркинье (P) Д,Е) и (Д,Е) зубчатого ядра (ND) мозжечка и (З,И) спинного мозга (SC). Через 5 дней после ИМО стресса (А) клетки Пуркинье и нейроны (Г) ND деформированы и гипертрофированы, их КФ-позитивные ядра эктопированы. При 3-дневнoй инъекции таурина (Б,Д) клетки еще гипертрофированы, но в результате 7-дневного воздействия таурина (Б,Е) клетки с длинными отростками имеют нормальные размеры и форму. Более очевидна регенерация мотонейронов SC при обоих сроках влияния таурина (З,И), чем через 5 дней (Ж) после иммобилизации. Тканевой отек (звездочки). Гистохимический метод определения Са2+ зависимой КФ. Через 5 дней после ИМО стресса клетки Пуркинье (Рис. 15А) и нейроны зубчатого ядра (Рис. 15Г) деформированы и гипертрофированы, их КФ-позитивные ядра эктопированы. Изучение морфофункционального состояния клеточных структур мозжечка и спинного мозга (SC) под влиянием таурина на 3-й и 7-й дни выявило полностью регенерированные клетки Пуркинье (Рис. 15Б,В) и нейроны зубчатого ядра (Рис. 15Д,Е), а также полностью восстановленные мотонейроны SC (Рис. 15З,И) при двух исследуемых сроках влияния таурина (Рис. 15З,И), в сравнении с 5-ю днями после стресса (Рис. 15Ж). Морфогистохимические данные настоящего исследования касаются, в основном, изменения размера и формы тел нейронов, характера реагирования отростков, что имеет большое значение для сравнения пораженных клеток с таковыми на препаратах, полученных у интактных животных. Примечательны также изменения форм, размеров и локализации осадка фосфата свинца как в цитоплазме нейронов, аксональной воронке, так 20 и в синаптических окончаниях вокруг нейронов во внеклеточном пространстве. Как видно из приведенных данных, под воздействием таурина очевидна регенерация клеточных структур почти во всех отделах мозга крыс с вышеприведенными моделями нейродегенерации, вызванной иммобилизацией. Мы допускаем, что в определенных стресс-ответственных областях мозга иммобилизированных крыс и, особенно под воздействием нейропротекторного таурина, имеет место внутриклеточный лизосомальный и аутофагический катаболический процесс, приводящий к регуляции клеточного гомеостаза и выживанию нервных структур в целом. Морфогистохимическое исследование изменения диаметра капилляров сенсомоторной коры головного мозга крыс в динамике после иммобилизационного стресса и в условиях применения таурина Примечательно, что на данной моделе нейродегенерации в префронтальной коре больших полушарий головного мозга крыс выявляются кровеносные сосуды с многочисленными сильно окрашенными с КФ перицитами, явление, которое является морфологическим доказательством процесса ангиогенеза в поврежденной ткани. Исследование диаметра капиллярного звена микроциркуляторного русла (МЦР) во всех изучаемых нами отделах мозга крыс, подвергшихся воздействию ИМО стресса, вероятно, в результате недостаточности кровоснабжения, выявило нарушение микроциркуляции без каких-либо поражений сосудистой стенки. Так, в сенсомоторной области коры больших полушарий (СМК) отмечается редукция капиллярного звена (Рис. 16 В-Е), по сравнению с контрольными животными (Рис. 16 А,Б). Сразу после стресса (Рис. 16Б,Г) наблюдается сужение артериол и венул.Через 24 часа после стресса (Рис. 16Д) выявляются обрывчатые капилляры почти во всей области. У крыс, инъецированных таурином непосредственно после стресса и исследованных при 7-дневном его воздействии (Рис. 16Ж,З), сосуды всех звеньев МЦР полностью регенерируют, становясь схожими с интактными капиллярами (Рис. 16А) и по диаметру, и по беспрерывности. Как показали наши морфометрические измерения, во всех опытных группах, в отличие от контрольных, на микропрепаратах наблюдается сужение капилляров СМК мозга, которое разнится в зависимости от срока выхода из состояния стресса. Среднее значение диаметра капилляров СМК у контрольных животных составляет 6.1±0.22 мкм. После воздействия стресса капиллярная сеть реагирует констрикцией. Непосредственно после стресса происходит сужение просвета капилляров на 17.21%, через 24 часа - дилатация на 2.5%, в сравнении с нормой; через 48 часов и 72 часа – сужение на 5.57% и 5.1% соответственно, через 10 дней - резкое сужение на 18.1% и через 15 дней – ещѐ более выраженная констрикция на 40.1%, в сравнении с нормой. Через 1 месяц сильный спазм сменяется умеренным расширением диаметра капилляров, сужение составляет 10.5%, и через 2 месяца показатели приближаются к интактной группе, и сужение составляет 3.28%, по сравнению с нормой. Большой интерес представляет морфометрический анализ диаметра капилляров мозга, связанный с поведением животных. В отличие от спокойной группы животных, у агрессивных крыс наблюдаются более резкие колебания калибра капилляров после стресса. Непосредственно после стресса у агрессивных животных констрикция составляет 20%, а у спокойных - 17.21%, в сравнении с нормой. Через 24 часа после стресса у спокойной группы дилатация идѐт постепенно (на 2.5%). В отличие от этого, у агрессивных крыс происходит резкое расширение просвета капилляров, превышая показатели мозга интактных животных на 14,7%. 21 Рис. 16. Капиллярное звено микроциркуляторного русла сенсомоторной области коры больших полушарий (А,Б) интактных крыс, крыс, (В-Е) подвергшихся 2-х часовому ИМО стрессу и (Ж,З) крыс, инъецированных таурином непосредственно после стресса. (Б,Г) у исследованных сразу после стресса крыс наблюдается сужение артериол (стрелка) и венул.Через 24 часа после стресса (Д) выявляются обрывчатые капилляры почти во всем поле зрения. При 7-дневном же воздействии таурина (Ж) сосуды всех звеньев микроциркуляторного русла полностью регенерируют, становясь схожими с интактными капиллярами (А) и по диаметру, и по беспрерывности. Кальций аденозинтрифосфатный безинъекционный гистоангиологический метод. При введении таурина в течение 7-и дней после стресса показатели просвета капилляров мозга приближаются к норме и сужение составляет 2.46%, отмечается увеличение плотности капиллярного звена. Полученные данные указывают на сосудорасширяющий эффект таурина на капиллярное звено МЦР русла мозга. Таким образом, имеют место компенсаторно-приспособительные изменения капиллярного звена МЦР мозга крыс в динамике после ИМО стресса, и особенно при введении таурина, в результате которого просвет капилляров иногда превышает показатели диаметра капилляров, выявляемые через 2 месяца после стресса. Эти данные указывают воздействие таурина на ускорение компенсаторно-приспособительных механизмов и, таким образом, на раннее облегчение стрессового состояния. Таурин может модулировать процесс нейродегенеративных болезней, в данном случае оказывая влияние на синаптическую активность, выживаемость нервных структур, функцию эндотелиальных клеток и, в целом, на восстановление функции мозга. Таким образом, специфичность и потенциальная возможность таурина указывают на потенциальную мишень для терапевтического вмешательства при нейродегенеративных заболеваниях. ВЫВОДЫ 1. 2. Электрофизиологически установлено, что стресс приводит как в голубом пятне, так и aмигдале к мощному усилению тетанических возбудительных эффектов в средние сроки после стресса, при сочетании с таурином, в то время как в амигдале наблюдается такое же мощное усиление и тетанических депрессорных эффектов в поздние сроки, в отличие от голубого пятна, в котором отмечалось относительно значительное их ослабление как в поздние, так и средние сроки после стресса (в сочетании с таурином), не достигающее нормы. По результатам морфофункционального изучения клеточных структур мозга крыс, подвергнутых иммобилизационному (психоэмоциональному) стрессу и изученных в разные постстрессовые сроки, в определенных стресс-отвественных отделах, в сравнении с интактными животными, выявлены дегенирующие гипертрофированные, потерявшие отростки нейроны с эктопированными ядрами, центральным 22 3. 4. 5. 6. хроматолизом, а также с преципитатом фосфата свинца различных размеров и форм с разной интенсивностью фосфатазной активности. Установлено, что при более отдалѐнных сроках воздействия стресса в исследуемых нами отделах мозга выявлена регенерация и выживаемость нейронов той или иной степени, указывая на наличие защитных свойств нейронов, ведущих к их морфофизиологическому восстановлению. На моделях данной нейродегенерации при введении таурина выявлен его протекторный эффект вследствие воздействия на регенерацию и выживаемость нейронов, а также на регулирование фосфатазной активности и усиление метаболизма. Иммуногистохимически продемонстрирована активация реагирующих на стресс нейронов в течение одного часа с выявлением ядер клеток, позитивных для кислой фосфатазы и стресс-вызванного пептида c-fos, что подтверждает роль кислой фосфатазы в процессе фосфорилирования, как одного из путей, предшествующих образованию c-fos. Морфометрическими исследованиями выявлены ангиогенные свойства таурина в условиях данного нейронального нарушения. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. Даниелян М.А., Папоян Т.Э., Назарян О.A. Морфофункциональное состояние капилляров мозга крыс после иммобилизационного стрессa / Доклады. Научная конференция института физиологии им.Орбели НАН Армении,посвященная 60-летию основания института, 6-7 октября, 2003, с. 79-81. Danielyan M. A. Reaction of Rat Brain Capillaries to Immobilization Stress / Neuroscience and Behavioral Physiology, 2008, vol. 38, № 9, p.929-931. Даниелян М.А., Саакян И.К., Тумасян Н.В., Абрамян С.С., Меликсетян И.Б.. Морфогистохимическое и иммуноцитохимическое изучение клеточных структур мозга крыс при иммобилизационном стрессе/ Сборник трудов международной II научной конференции Горисского государственного университета, 26-27 мая, 2011, с.146-151. Меликсетян И.Б., Даниелян М.А., Саакян И.К., Тумасян Н.В., Абрамян С.С. Морфогистохимическое и иммуноцитохимическое изучение клеточных структур мозга крыс при иммобилизационном стрессе / 3-ий Международный медицинский конгресс Армении ''Вместе во имя здоровья'', Ереван, 7-9 июля, 2011, Basic Medicine, тезис 108, с. 130-131. Даниелян М.А., Меликсетян И.Б., Саакян И. К, Абрамян С.С., Тумасян Н.В. Динамика морфометрических показателей диаметра капилляров мозга после иммобилизационного стрессa / Научные труды III съезда физиологов СНГ, Ялта, 1-6 октября, 2011, с.259. Даниелян М.А. Влияния таурина на капилляры и на морфофункциональное состояние клеточных структур мозга крыс после иммобилизационного стресса / Материалы Международной конференции студентов, аспирантов и молодых учѐных «Ломоносов2013», Москва, 8-13 апреля, 2013, с.323-324. Даниелян М.А., Чавушян В.А. Электрофизиологическое исследование синаптической активности центральных норадренэргических нейронов при стимуляции гипоталамического ядра на модели иммобилизационного стресса / Доклады Национальной Академии Наук, 2013, т. 113, № 2, с. 203-208. Danielyan M.H., Abrahamyan S.S., Nazaryan O.A. Study of morphofunctional state of the cell structures in the brain after immobilization stress / Third Jubilee International Conference of Neuroscience and Biological Psychiatry,Yerevan,22-24 september, 2013, p. 47-49. 23 ԴԱՆԻԵԼՅԱՆ Մ.Հ. ԱՌՆԵՏՆԵՐԻ ՈՒՂԵՂԻ ԲՋՋԱՅԻՆ ԿԱՌՈՒՅՑՆԵՐԻ ՄՈՐՖՈՖՈՒՆԿՑԻՈՆԱԼ ՀԵՏԱԶՈՏՈՒԹՅՈՒՆԸ ԻՄՈԲԻԼԻԶԱՑԻՈՆ ՍԹՐԵՍԻ և ՏԱՈՒՐԻՆԻ ԱԶԴԵՑՈՒԹՅԱՆ ՊԱՅՄԱՆՆԵՐՈՒՄ ԱՄՓՈՓԱԳԻՐ Ինտակտ առնետների մեծ կիսագնդերի կեղևում, ենթատեսաթմբի կորիզներում, ուղեղիկում և մեր կողմից ուսումնասիրվող այլ հատվածներում նեյրոնները հիմնականում ունեն կենտրոնական տեղայնացված նորմալ չափսերի կորիզներ, թթու ֆոսֆատազայի չափավոր ակտիվություն և հետազոտվող կառույցների համար բնորոշ ելուստներ: Երկժամյա իմոբիլիզացիոն սթրեսի ենթարկված և տարբեր հետսթրեսային ժամկետներում ուսումնասիրված առնետների գլխուղեղի բջջային կառույցների մորֆոհիստոքիմիական ուսումնասիրությունը հայտնաբերել է նեյրոնային վնասվածքներին ոչ բնորոշ դեգեներատիվ փոփոխություններ: Ներկա հետազոտության տվյալները հիմնականում վերաբերվում են նեյրոնների մարմինների կառուցվածքին, չափսերի փոփոխությանը, ելուստնրի պատասխանի բնույթին՝ ի հակադրություն ինտակտ բջիջների: Նեյրոնների վնասվածքն ընթանում է կենտրոնական քրոմատոլիզի ձևով: Քիչ դեր չեն խաղում նաև կապարի ֆոսֆատի նստվածքի բնույթի տարբերությունները և նյարդային բջիջների ներկման ինտենսիվության աստիճանը: Մորֆոլոգիական պատկերը հիշեցնում է նյարդային բջիջների գերաճ, որը պատկանում է բջջային ախտաբանության բավականին տարածված տեսակին և հանդիսանում է դարձելի գործընթաց: Ինտակտ կենդանիների հետ համեմատած՝ առնետների ուղեղի որոշակի սթրեսպատասխանատու բաժիններում հայտնաբերվել են ցածր ֆոսֆատազային ակտիվությամբ դեգեներացված՝ գերաճ, ելուստները կորցրած նեյրոններ տեղաշարժված կորիզներով և հիմնականում թթու ֆոսֆատազայով (ԹՖ) չափավոր ներկվող մանր գրանուլներով: Հատկանշական է, որ հետսթրեսային ավելի հեռավոր ժամանակահատվածում գլխուղեղի մեր կողմից հետազոտվող հատվածներում, հայտնաբերվում են որոշ վերականգնվող նեյրոններ, շատ դեպքերում ԹՖ-ի բարձր ակտիվությամբ, ինչը թույլ է տալիս ենթադրել հնարավոր պաշտպանական ռեակտիվ հատկանիշների առկայության մասին, որոնք նպաստում են դրանց մորֆոֆիզիոլոգիական վերականգմանը: Վերը նշված նեյրոդեգեներացիայի մոդելի վրա տաուրինի ներարկումից հետո առնետների մոտ ի հայտ է եկել այդ ամինաթթվի պաշտպանիչ ազդեցությունը, որը ուղեղի որոշակի հատվածներում ապահովում է նեյրոնների վերականգնումն ու ապրելունակության բարձրացումը, ինչպես նաև նյութափոխանակության, հատկապես ֆոսֆատազային ակտիվության ուժեղացումը: Վնասված նեյրոնների ամբողջական վերականգման համար, անշուշտ, անհրաժեշտ է վաղ միջամտություն, տաուրինի սիստեմատիկ և ավելի երկարատև ներարկմամբֈ Բացի այդ, իմոբիլիզացիոն սթրեսի ազդեցությունից հետո, հատկապես տաուրինի ազդեցության 24 ներքո, ուղեղի միկրոցիրկուլյատոր հունի մազանոթային օղակի մորֆոմետրիկ հետազոտությունները բացահայտել են կոմպենսատոր-հարմարողական փոփոխություններ` տաուրինի անոթալայնիչ, անգիոպաշտպանիչ ազդեցության դրսևորմամբ: Սթրեսից վնասված և տաուրինով ներարկված առնետների ուղեղի տարբեր բաժիններում հայտնաբերվել են մուգ ներկված պերիցիտներով շրջապատված մազանոթներ, որոնք, ինչպես հայտնի է, հանդիսանում են ցողունային բջիջներ և վնասված հյուսվածքներում մասնակցում են անգիոգենեզի գործընթացին: Հիմնվելով վերը նշվածի վրա, արվել է ենթադրություն՝ նոր արյունատար անոթների առաջացման գործընթացում տաուրինի մասնակցության վերաբերյալ: Իմունահիստոքիմիորեն ցույց է տրված, որ հիպոթալամուսի սուպրաօպտիկ և պարավենտրիկուլյար կորիզներում, ինչպես նաև մեծ կիսագնդերի կեղևում իմոբիլիզացիոն սթրեսը մեկ ժամվա ընթացքում հանգեցնում է սթրեսին պատասխանող նեյրոնների ակտիվացման՝ սթրես-կախյալ պեպտիդ c-fos-ի (սպիտակուց սինթեզող նույնանուն գեն) առաջացմամբ բջիջների կորիզներում, ինչը և հանդիսանում է սթրես-կախյալ պատասխանի մորֆոլոգիական ցուցանիշ: Անմիջապես սթրեսից հետո գլխուղեղի կեղևի բրգաձև նեյրոնների, հիպոթալամուսի և ուղեղի սթրես-պատասխանատու այլ հատվածների նեյրոնների կորիզներում ԹՖ ակտիվության ավելի շուտ բացահայտումը մատնանշում է ֆոսֆորիլացման պրոցեսի առկայությունը՝ հայտնի գործընթաց որպես c-fos-ի առաջացմանը նախորդող ուղի: Նորմայում, սթրեսի պայմաններում, ինչպես նաև տաուրինի կիրառման պայմաններում երկնագույն բծի և նշաձև համալիրի առանձին նեյրոնների իմպուլսային ակտիվության ծրագրավորված մաթեմատիկական վերլուծությամբ տետանիկ պոտենցիացիայի և դեպրեսիայի (համապատասխանաբար ՏՊ և ՏԴ) տեսքով երկնագույն բծում` հիպոթալամուսի պարավենտրիկուլյար կորիզի և նշաձև համալիրում` հիպոկամպի բարձր հաճախականությամբ դրդման պայմաններում բացահայտվել է պատասխանների ձևավորում` հաջորդիվ ակտիվության հետտետանիկ արտահայտվածությամբ` ՀՏՊ և ՀՏԴ տեսքով: Էլեկտրաֆիզիոլոգիական ուսումնասիրությունները թույլ են տալիս եզրահանգել, որ սթրեսից 7 օր անց `համակցված տաուրինի հետ, երկնագույն բծում և նշաձև համալիրում սթրեսը բերում է տետանիկ դրդիչ ազդեցության կտրուկ ուժեղացման: Նշաձև համալիրում գրանցվել է նմանատիպ կտրուկ ուժեղացում և տետանիկ դեպրեսիվ ազդեցություններ 90-րդ օրը ` ի տարբերություն երկնագույն բծի, որում նկատվել է դրանց զգալի թուլացում ինչպես ` 90-րդ օրը, այնպես էլ 7-րդ օրերի ընթացքւմ (համակցված տաուրինի հետ)` չհասնելով նորմային: Էլեկտրաֆիզիոլոգիական եղանակով հաստատված է, որ տաուրինը նշաձև համալիրի և կապույտ բծի նեյրոններում ցուցաբերում է նյարդապաշտպան ակտիվություն: Վերը նշվածը ենթադրում է տաուրինի հնարավոր կիրառումը կլինիկական պրակտիկայում կենտրոնական նյարդային համակարգի և ուղեղի արյան շրջանառության տարբեր խախտումների ժամանակ` շնորհիվ նրա պաշտպանիչ հատկությունների: 25 DANIELYAN M.H. MORPHOFUNCTIONAL STUDY OF CELLULAR STRUCTURES IN THE RAT’S BRAIN IN CONDITION OF IMMOBILIZATION STRESS AND UNDER THE INFLUENCE OF TAURINE SUMMARY Neurons in the cerebral cortex, hypothalamic nuclei, and other brain regions of intact rats under our investigation generally have centrally located nuclei of normal sizes and demonstrate moderate acid phosphotase activity in the intact rats. Morphohistochemical studies of brain cellular structures of rats exposed to 2-hour immobilization stress and investigated in different post-stress periods revealed degenerative changes inherent in non-specific neuronal lesions. The data in this study primarily relate the changes in size and shape of the neuronal bodies and the nature of response of their processes, which has significant implications for comparison to the affected cells with those in the preparations obtained in intact animals. The differences in the nature of lead phosphate precipitate and the degree of staining intensity of nerve cells played an important role. The neuronal injury occurs by the type of central chromatolysis. Morphological pattern is similar to the acute swelling of the nerve cells, which is related to a rather typical form of cellular pathology and is a reversible process. In contrast to the intact animals, degenerative hypertrophied neurons without processes with ectopied nuclei and, mostly, moderately colored acid phosphatase (AP) small granules are identified in certain stress-responsible regions of the brain. It is remarkable that our study revealed some regenerated neurons, mostly with high AP activity, in the later post-stress periods in the studied brain regions (based on the above mentioned). Taking account above mentioned, possibility of existence of the protective properties of the neurons that could lead to their morphophysiological recovery was assumed. On the models of neurodegeneration in rats in combination with the administration of taurine, we revealed the protective effect of taurine due to boosting metabolism, resulting in the regulation of the phosphatase activity and the regeneration and survival of neurons in certain areas of the brain. For the complete regeneration of the damaged neurons, of course, promt intervention with systematic administration of taurine over longer periods of time is necessary.Considering the small impact on the stress-induced pathological effects, our study of administering taurine after the stress tends to demonstrate favorable potential for the prompt and energetic treatment reversing significant cellular changes in short period of time. By the analysis of the morphometric studies of the capillary link of the microcirculatory bed in rat brain in dynamics after the immobilization stress and under the 26 action of taurine revealed the compensatory-adaptive changes of the capillaries of the sensorimotor cortex of the brain due to the vasodilatory angioprotective effect of taurine. Acid phosphatase-positive capillaries with darkly colored pericytes were found in the affected areas of the brain, especially after the action of taurine. Pericytes are stem cells and are involved in the angiogenesis process in the injured tissue, which was the reason to assume the participation of taurine in the mechanism of formation of the new blood vessels. The activation of the stress-responsive neurons within one hour, especially in the paraventricular and supraoptic nuclei of the hypothalamus, as well as in the cerebral cortex, was immonohistochemically demonstrated, by the identification of stress-induced c-fos protein in the cell nuclei, which serves as the morphological confirmation of the stressinduced response. Earlier detection of the acid phosphatase activity in the nuclei of the pyramidal neurons in the cortex, hypothalamus, and the neurons in the number of stress-responsible areas in the brain immediately after the stress, pointed to phosphorylation as one of the ways preceding c-fos formation. Program mathematical analysis of impulse activity of single neurons of locus coeruleus and the amygdala in norm, under stress, combined with taurine was revealed the formation of the responses under high frequency stimulation of PVN in locus coeruleus and under high frequency stimulation of hippocampus in the amygdala in the form of tetanic potentiation and depression (TP and TD, respectively) with subsequent post-tetanic manifestations of activity in the form of PTP and PTD. Electrophysiological studies suggest that stress leads to high increase of tetanic excitatory effects on the 7th day following stress in combination with taurine in locus coeruleus and in the amygdala. In the amygdala was recorded the similar intense strengthening and tetanic depression effects on the 90th day in contrast to locus coeruleus which revealed a relative significant decrease both on the 90th and 7th days (in combination with taurine) and has not reached to norm. Electrophysiologically, taurine was demonstrated to have neuroprotective effect on the neurons in the locus coeruleus and the amygdala, since increased excitatory and strong weakening of the inhibitory effects were observed under the influence of taurine compared to immobilization. The results of the electrophysiological studies suggest that prompt and energetic taurine therapy can prevent the significant share of the cellular changes induced by the psychoemotional stress due to reversibility of the morphological and functional anomalities. The study indicates possible application of taurine in the clinical practice for the treatment of various pathologies of the central nervous system and the cerebral blood flow. 27
